Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Frakcjonowanie komórek U937 przy braku wirowania z dużą prędkością

13.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59022

⸱

18 stycznia 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół izolacji błony plazmatycznej, cytoplazmy i mitochondriów komórek U937 bez użycia szybkiego wirowania. Technika ta może być stosowana do oczyszczania frakcji subkomórkowych w celu późniejszego zbadania lokalizacji białka za pomocą immunoblottingu.

Streszczenie

W tym protokole szczegółowo opisujemy metodę uzyskiwania subkomórkowych frakcji komórek U937 bez użycia ultrawirowania czy bezkrytycznych detergentów. Metoda ta wykorzystuje hipotoniczne, digitoninę, lizę mechaniczną i wirowanie różnicowe w celu wyizolowania cytoplazmy, mitochondriów i błony plazmatycznej. Proces ten można skalować w celu dostosowania do potrzeb badaczy, jest niedrogi i prosty. Metoda ta pozwoli naukowcom określić lokalizację białek w komórkach bez specjalistycznych wirówek i bez użycia komercyjnych zestawów, które mogą być zbyt drogie. Z powodzeniem zastosowaliśmy tę metodę do separacji białek cytozolowych, błony plazmatycznej i mitochondriów w ludzkiej linii komórkowej monocytów U937.

Wprowadzenie

Niezawodna identyfikacja lokalizacji białek jest często konieczna podczas badania szlaków molekularnych w komórkach eukariotycznych. Metody uzyskiwania frakcji subkomórkowych są wykorzystywane przez naukowców do dokładniejszego zbadania składników komórkowych będących przedmiotem zainteresowania.

Większość istniejących metod frakcjonowania komórek generalnie dzieli się na dwie szerokie kategorie, detergent-based1,2 i ultrawirówkowanie3,4,5, które można rozróżnić na podstawie szybkości, precyzji i kosztów. Protokoły oparte na detergentach polegają na użyciu o rosnącej sile detergentu w celu rozpuszczania różnych składników komórki. Jest to szybka i wygodna metoda przetwarzania próbek i może być opłacalna, jeśli liczba i rozmiar próbek są małe. Zestawy na bazie detergentów można zakupić w celu wyizolowania frakcji cytoplazmatycznych, błonowych/organelli (frakcja mieszana) i jądrowych z komórek. Jednak kilka wad związanych z tymi zestawami ogranicza ich przydatność dla badaczy. Są one zaprojektowane tak, aby łatwo wyizolować jeden lub dwa składniki komórki, ale nie są w stanie wyizolować wszystkich frakcji z próbki jednocześnie. Stosowanie detergentów oznacza, że błona plazmatyczna i organelle otoczone błoną będą jednakowo rozpuszczone, a zatem nie będzie można ich od siebie oddzielić. Dodatkową komplikacją są zastrzeżone komponenty w tych zestawach, które uniemożliwiają badaczom zmianę warunków dla określonych zastosowań. Wreszcie, są one ograniczone pod względem liczby zastosowań i mogą być zbyt drogie w przypadku eksperymentów na większą skalę. Istnieją zestawy nieoparte na detergentach do izolacji mitochondriów, jednak nie są one przeznaczone do izolowania błony plazmatycznej, a wydajność próbki jest znacznie mniejsza niż w przypadku protokołów izolacji opartych na wirowaniu gęstości6,7.

Metody, które wykorzystują ultrawirowanie do uzyskania frakcji, są bardziej czasochłonne, ale często dają czystsze frakcje niż zestawy na bazie detergentów. Wyizolowanie błon plazmatycznych z komórek bez ich uprzedniej solubilizacji (co powoduje zanieczyszczenie organellami błonowymi) wymaga ich lizy metodą bez detergentów, a następnie oddzielenia składników komórkowych poprzez wirowanie różnicowe - przy czym izolacja błony plazmatycznej wymaga prędkości 100 000 × g. W wielu przypadkach po wirowaniu różnicowym musi nastąpić wirowanie w gradientzie gęstości izopikowej w celu dalszego oddzielenia frakcji komórkowych lub usunięcia zanieczyszczeń. Chociaż metody te są dokładne i modyfikowalne, wady obejmują koszty, czasochłonność i potrzebę ultrawirówki do oddzielania frakcji i dalszego oczyszczania za pomocą wirowania w gradicynie gęstości. Większość wirówek szybkoobrotowych ma koszt, który jest zaporowy dla indywidualnych badaczy i często są współdzielonym, podstawowym wyposażeniem w instytucjach akademickich. W związku z tym dostępność ultrawirówek staje się w takich sytuacjach zaporowa

.

W tym protokole frakcjonowania demonstrujemy izolację frakcji subkomórkowych bez użycia detergentów rozpuszczających i bez wirowania z dużą prędkością. Metoda ta pozwoli naukowcom wyizolować błonę plazmatyczną, mitochondria i składniki cytoplazmatyczne komórki eukariotycznej przy minimalnym zanieczyszczeniu między frakcjami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie i odczynników

UWAGA: Zobacz Tabelę 1.

  1. Przygotować roztwory buforu A, buforu do lizy B, buforu próbki i digitoniny.
    1. Przygotować bufor A, dodając 8,77 g NaCl i 50 ml HEPES (1 M, pH 7,4) do 900 ml wody dejonizowanej, dostosować końcową objętość do 1 l wodą dejonizowaną.
      UWAGA: Stężenia końcowe to 150 mM NaCl i 50 mM HEPES.
    2. Przygotować bufor do lizy B, dodając 20 ml kwasu HEPES (1 M, pH 7,4), 0,75 g KCl, 0,19 g MgCl2, 2 ml kwasu etylenodiaminotetraoctowego (0,5 M EDTA), 2 ml glikolu etylenowego-bis(β-aminoetyloeter)-N,N,N',N'-tetraoctowego (0,5 M EGTA), 38,26 g mannitolu i 23,96 g sacharozy do 900 ml wody dejonizowanej, dostosować końcową objętość do 1 l za pomocą wody dejonizowanej.
      UWAGA: Stężenia końcowe to 20 mM HEPES, 10 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 210 mM mannitol i 70 mM sacharozy.
    3. Przygotować bufor do próbki, dodając 0,01 g dodecylosiarczanu sodu (SDS) do 10 ml soli fizjologicznej z tris-buforem (TBS) do końcowego stężenia 0,1% SDS.
    4. Przygotować roztwór podstawowy digitoniny, dodając 25 mg digitoniny do 100 ml wody dejonizowanej (końcowe stężenie wynosi 250 μg/ml).
    5. Przechowywać wszystkie roztwory buforowe w temperaturze 4 °C, a digitoninę w temperaturze -20 °C do czasu rozpoczęcia doświadczenia.
  2. Przygotować świeże roztwory inhibitorów proteazy i fosfatazy, które zostaną dodane do roztworów buforowych przed dodaniem do komórek.
    1. Przygotować roztwór podstawowy fluorku fenylometanosulfonylu (PMSF), dodając 17,4 mg PMSF do 1 ml 100% etanolu (końcowe stężenie wynosi 100 mM).
      UWAGA: Nosić odpowiedni sprzęt ochronny i zachować ostrożność podczas obchodzenia się z PMSF. PMSF jest niebezpieczny w przypadku spożycia i lekko niebezpieczny w przypadku kontaktu ze skórą (działanie drażniące), kontaktu z oczami (działanie drażniące) lub wdychanie; Działa żrąco na oczy i skórę.
    2. Przygotuj dostępny w handlu koktajl inhibitorów proteazy (100×) zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela Materiałów).
    3. Przygotować roztwór podstawowy ortowanadanu sodu (SOV), dodając 92 mg SOV do 1 ml wody dejonizowanej (końcowe stężenie wynosi 500 mM).
      UWAGA: Nosić odpowiedni sprzęt ochronny i zachować ostrożność podczas obsługi. SOV jest niebezpieczny w przypadku kontaktu z oczami (działa drażniąco), po spożyciu lub wdychaniu leku. Poważne nadmierne narażenie może spowodować śmierć.

2. Mycie PBS

  1. Zagęścić i przemyć komórki w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) przed frakcjonowaniem.
    1. Odwirować zawiesinę komórek z odpowiednią prędkością, aby uzyskać osad. Na przykład odwirować zawiesinę komórek U937 o stężeniu 400 × g przez 10 minut.
    2. Usunąć supernatant, ponownie zawiesić osad komórek w PBS o temperaturze pokojowej o końcowym stężeniu 4 × 106 komórek/ml i delikatnie odpipetować, aby rozbić grudki.
    3. Odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 400 × g przez 10 minut w celu osadzenia komórek.
    4. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w lodowatym buforze A w końcowym stężeniu 2 × 107 komórek/ml.
      UWAGA: Wszystkie kolejne kroki należy wykonywać w temperaturze 4 °C lub na lodzie, a wszystkie powinny być wstępnie schłodzone.

3. Izolacja białka cytozolowego

  1. Ekstrahować białka cytozolowe przez inkubację z detergentem digitoniną.
    1. Bezpośrednio przed ponownym zawieszeniem komórek (etap 3.1.3) dodać 10 μl podstawowego PMSF (100 mM), 10 μl inhibitora proteazy (100×), 2 μl podstawowego SOV (500 mM) i 100 μl podstawowej digitoniny (250 μg/ml) do 878 μl buforu A (końcowe stężenie wynosi 1 mM PMSF, 1× inhibitor proteazy, 1 mM SOV i 25 μg/ml digitoniny; Dostosuj końcową głośność zgodnie z liczbą używanych komórek). Utrzymuj roztwór na lodzie do momentu dodania do osadu komórkowego.
    2. Odwirować zawiesinę komórek o masie 400 × g przez 10 minut i usunąć supernatant.
    3. Zawiesić osad komórkowy w roztworze buforowym A zawierającym inhibitory i digitoninę (przygotowanym w kroku 3.1.1) o końcowym stężeniu 2 × 107 komórek/ml, delikatnie odpipetować w celu rozbicia grudek.
    4. Inkubować zawiesinę komórek na rotatorze typu end -end w temperaturze 4 °C przez 20 minut.
    5. Odwirować zawiesinę komórkową o masie 400 × g przez 10 minut. Zebrać supernatant i umieścić go w czystej probówce wirówkowej.
    6. Odwirować zebrany supernatant o stężeniu 18 000 × g przez 20 minut w celu osadzenia szczątków komórkowych.
    7. Przenieść supernatant do czystej probówki wirówkowej.
    8. Powtarzać kroki 3.1.5 i 3.1.6 aż do momentu, gdy po odwirowaniu nie zostanie otrzymany osad
      9. .
    9. Zebrać supernatant zawierający białka cytozolowe i przechowywać go w temperaturze 4 °C (krótkotrwale) lub -20 °C (długotrwale).
  2. Usunąć nadmiar digitoniny i białek cytozolowych przez odwirowanie.
    1. Zawiesić osad komórkowy przesycony digitoniną (od kroku 3.1.5) w buforze A o końcowym stężeniu 4 × 106 komórek/ml i delikatnie odpipetować w celu rozbicia grudek.
    2. Odwirować zawiesinę komórkową przepuszczalną digitoniną o stężeniu 400 × g przez 10 minut i usunąć supernatant.
      UWAGA: Można wykonać wielokrotne płukanie w buforze A w celu usunięcia nadmiaru zanieczyszczeń cytozolowych.

4. Homogenizacja komórek

  1. Inkubować komórki na lodzie w buforze do lizy B i lizować je metodami mechanicznymi.
    1. Bezpośrednio przed ponownym zawieszeniem komórek (etap 4.1.2) dodać 10 μl podstawowego PMSF (100 mM) i 2 μl podstawowego SOV (500 mM) do 988 μl buforu do lizy B (końcowe stężenia to 1 mM PMSF i 1 mM SOV; dostosować końcową objętość do liczby komórek poddawanych lizie) i utrzymywać roztwór na lodzie do czasu dodania do osadu komórkowego.
    2. Zawiesić osad komórkowy (z kroku 3.2.2) w lodowatym roztworze B buforu do lizy zawierającym PMSF i SOV (przygotowanym w kroku 4.1.1) w końcowym stężeniu 4 ×10,6 komórek/ml.
    3. Inkubować zawiesinę komórkową na lodzie przez 30 minut.
    4. Przenieś zawiesinę komórkową do wstępnie schłodzonego homogenizatora Dounce (z ciasno dopasowanym tłuczkiem B) na lodzie i wykonaj 40 przejść tłuczkiem homogenizatora, wykonując powolne, równomierne ruchy.
      UWAGA: Alternatywnie można zastosować inne środki mechanicznej lizy komórek, jak opisano w sekcji dyskusji.
    5. Zebrać homogenat i przenieść go do czystej probówki wirówkowej.
    6. Umyć tłuczek homogenizatora i probówkę niewielką objętością (1 do 2 ml) buforu do lizy B i dodać go do homogenatu.
    7. Odwirować homogenat o masie 400 × g (lub przy minimalnej prędkości wymaganej do osadzania nieuszkodzonych komórek) przez 10 minut.
    8. Przenieść supernatant do czystej probówki wirówkowej.
      Uwaga: Jeśli pozostanie znaczna ilość osadu, powtórz kroki od 4.1.4 do 4.1.6, aby zwiększyć wydajność frakcji, jak opisano w sekcji dyskusji. W tym miejscu można wstrzymać działanie protokołu, a homogenat przechowywać w temperaturze 4 °C przez krótki okres (24 godziny).

5. Wirowanie różnicowe

  1. Odwirować homogenat ze zwiększoną prędkością, aby usunąć resztki komórkowe, wyizolować mitochondria i frakcje błonowe.
    1. Odwirować sklarowany nad osadem (od etapu 4.1.8) w temperaturze 500 × g przez 10 minut. Przenieść supernatant do czystej probówki wirówkowej i wyrzucić wszelkie osady.
    2. Odwirować supernatant (od kroku 5.1.1) w stężeniu 1 000 × g przez 10 minut. Przenieść supernatant do czystej probówki wirówkowej i wyrzucić wszelkie osady.
    3. Odwirować sklarowany nad osadem (od etapu 5.1.2) w ilości 2 000 × g przez 10 minut. Przenieść supernatant do czystej probówki wirówkowej i wyrzucić wszelkie osady.
    4. Odwirować sklarowany nad osadem (z kroku 5.1.3) w temperaturze 4 000 × g przez 15 minut. Przenieść supernatant do czystej probówki wirówkowej, przechowywać osad zawierający mitochondria.
    5. Zawiesić osad mitochondriów w małej objętości (0,5\u20121 ml) buforu do lizy B.
    6. Odwirować zawieszony osad o masie 4 000 × g przez 15 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad mitochondrialny w żądanej końcowej objętości buforu próbki (np. 250 do 500 μl, w zależności od wielkości osadu i pożądanego stężenia).
    7. Odwirować sklarowany nad osadem (od etapu 5.1.4) do 4 000 × g przez 15 minut. Przenieść supernatant do czystej probówki wirówkowej. Powtarzaj ten krok, aż po odwirowaniu nie uzyskasz osadu.
    8. Wirować supernatant w temperaturze 18 000 × g przez 3 godziny.
    9. Usunąć sklarowany osad i pozostawić osad zawierający białka błonowe. Zawiesić osad membranowy w małej objętości (0,5–1 ml) buforu do lizy B.
    10. Zawiesinę osadu odwirować w ilości 18 000 × g przez 1 godzinę.
    11. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad membranowy w żądanej końcowej objętości buforu próbki (250 do 500 μl, w zależności od wielkości osadu i pożądanego stężenia).
  2. Sonikować osady próbki przez 3 s w łaźni lodowej przy ustawieniu mocy 5 (50% maksymalnej mocy 125 W przy 20 kHz, patrz Tabela Materiałów).
  3. Próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C (krótkotrwale) lub -20 °C (długotrwale).
  4. Zbadaj próbki pod kątem czystości frakcjonowania, wykonując western blot z wykorzystaniem przeciwciał przeciwko markerom białkowym znajdującym się w cytoplazmie, mitochondriach i przedziałach błonowych komórki (patrz sekcja dotycząca reprezentatywnych wyników).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Pomyślne frakcjonowanie nieróżnicujących się komórek U9378 hodowanych w zawiesinie zostało przeprowadzone zgodnie z protokołem opisanym powyżej i zilustrowanym na Rysunku 1. Próbki otrzymane tą metodą poddano analizie western blotting9 z wykorzystaniem metody transferu mokrego na membranę z polifluorku winylidenu (PVDF). Membranę poddano następnie inkubacji z przeciwciałami przeciwko markerom białkowym zlokalizo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opracowanie tego protokołu wynikało z niemożności oddzielenia próbek mitochondrialnych i błonowych, przy użyciu dostępnych na rynku zestawów, do analizy lokalizacji białek podczas nekroptozy14. Podstawowymi ograniczeniami gotowych zestawów jest brak możliwości dostosowania ich do potrzeb poszczególnych badaczy, koszt w przeliczeniu na próbkę oraz ograniczona liczba próbek, które można przetworzyć. Przedstawiona tu metoda może być wykonana bez użycia drogich odczynników i bez konieczności stosowani...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów

Podziękowania

Praca została wsparta przez NIH-1R15HL135675-01 do Timothy'ego J. LaRocca

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DigitoninaTCI ChemicalsD0540Do ekstrakcji cytoplazmowej
D-MannitolSigma-AldrichM4125Do buforu do lizy B
Homogenizator odbityVWR22877-282Do homogenizacji
rotator end-over-endBarnsteadN/ADo ekstrakcji cytoplazmowej
Glikol etylenowy-bis(β-aminoetylowy eter)-N,N,N' ,Kwas N'-tetraoctowy (EGTA)Alfa AesarJ61721Do buforu do lizy B
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)Sigma-AldrichE7889Do buforu do lizy B
GAPDH (14C10)Technologie sygnalizacji komórkowej2118Do wykrywania frakcji cytoplazmatycznych na Western blot, rozcieńczenie: 1:10000
HEPESVWRJ848Do do lizy A i B
KClSigma-AldrichP9541Do buforu do lizy B
MgCl2Alfa Aesar12315Do buforu do lizy B
Na, K-ATPaza a1 (D4Y7E)Technologie sygnalizacji komórkowej23565Do wykrywania frakcji błony plazmatycznej na Western blot, rozcieńczenie: 1:1000
NaClSigma-Aldrich793566Do buforu do lizy A
fluorek fenylometanosulfonylu (PMSF)VWRM145do ekstrakcji cytoplazmy i homogenizacji Sonda buforowa
sonikatorQsonicaQ125-110do próbek końcowych
Koktajl inhibitorów proteazy, ogólnego zastosowaniaVWRM221-1MLdo ekstrakcji cytoplazmy
z chłodzeniemBeckman-CoulterN/A
Dodecylosiarczan sodu (SDS)VWR227Do buforu próbki
Ortowanadan sodu (SOV)Sigma-Aldrich450243Do do lizy A i B
SacharozaSigma-AldrichS0389Do buforu do lizy B
Sól fizjologiczna buforowana trisem (TBS)VWR788Do buforu próbki
VDAC (D73D12)Technologiesygnalizacji komórkowej4661Do wykrywania frakcji mitochondrialnych na Western blot, rozcieńczenie: 1:1000
wirówka

Bibliografia

  1. Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells. MethodsX. 2, e440-e445 (2015).
  2. Hwang, S. II, Han, D. K. Subcellular fractionation for identification of biomarkers: Serial detergent extraction by subcellular accessibility and solubility. Methods in Molecular Biology. 1002, 25-35 (2013).
  3. Song, Y., Hao, Y., et al. Sample preparation project for the subcellular proteome of mouse liver. Proteomics. 6 (19), 5269-5277 (2006).
  4. Lenstra, J. A., Bloemendal, H. Topography of the total protein population from cultured cells upon fractionation by chemical extractions. European Journal of Biochemistry. 135 (3), 413-423 (1983).
  5. Michelsen, U., von Hagen, J. Chapter 19 Isolation of Subcellular Organelles and Structures. Methods in Enzymology. 463 (C), 305-328 (2009).
  6. Stimpson, S. E., Coorssen, J. R., Myers, S. J. Optimal isolation of mitochondria for proteomic analyses). Analytical Biochemistry. 475, 1-3 (2015).
  7. Williamson, C. D., Wong, D. S., Bozidis, P., Zhang, A., Colberg-Poley, A. M. Isolation of Endoplasmic Reticulum, Mitochondria, and Mitochondria-Associated Membrane and Detergent Resistant Membrane Fractions from Transfected Cells and from Human Cytomegalovirus-Infected Primary Fibroblasts. Current protocols in cell biology. 68, 3.27.1-3.27.33 (2015).
  8. Sundström, C., Nilsson, K. Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937). International Journal of Cancer. 17 (5), 565-577 (1976).
  9. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  10. Barber, R. D., Harmer, D. W., Coleman, R. A., Clark, B. J. GAPDH as a housekeeping gene: analysis of GAPDH mRNA expression in a panel of 72 human tissues. Physiological Genomics. 21 (3), 389-395 (2005).
  11. Hodge, T., Colombini, M. Regulation of metabolite flux through voltage-gating of VDAC channels. Journal of Membrane Biology. 157 (3), 271-279 (1997).
  12. Therien, aG., Blostein, R. Mechanisms of sodium pump regulation. American journal of physiology. Cell physiology. 279 (3), C541-C566 (2000).
  13. Devarajan, P., Stabach, P. R., De Matteis, M. A., Morrow, J. S. Na,K-ATPase transport from endoplasmic reticulum to Golgi requires the Golgi spectrin-ankyrin G119 skeleton in Madin Darby canine kidney cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (20), 10711-10716 (1997).
  14. McCaig, W. D., Patel, P. S., et al. Hyperglycemia potentiates a shift from apoptosis to RIP1-dependent necroptosis. Cell Death Discovery. 4, 55(2018).
  15. Simpson, R. J. Homogenization of Mammalian Tissue. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (7), (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

bufor hipotonicznyliza digitoninemr nicowanie wirowaniaizolacja cytoplazmyizolacja mitochondri wizolacja b ony plazmatycznejlokalizacja bia ekfrakcje subkom rkowe
Frakcjonowanie komórek U937 przy braku wirowania z dużą prędkością
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.