Spontaniczne i wywołane pomiary bólu w mysich modelach jednostawowego bólu kolana

Podsumowanie

Opracowaliśmy wywołaną miarę bólu stawów i połączyliśmy ją ze standardową metodą pomiaru spontanicznego bólu w różnych mysich modelach chemicznie wywołanego zapalenia stawów. Miary te są czułe i powtarzalne dla różnych rodzajów bólu stawów.

Streszczenie

Ból jest główną przyczyną niepełnosprawności spowodowanej zapaleniem stawów. Obecnie istnieje niezaspokojona potrzeba odpowiedniego leczenia bólu stawów. Modele przedkliniczne są niezbędne i przydatne do badania mechanizmów bólu i oceny skuteczności terapii zapalenia stawów. Pomiar bólu w zwierzęcych modelach zapalenia stawów jest wyzwaniem. Opracowaliśmy metody pomiaru bólu wywołanego i spontanicznego w trzech modelach mysiego zapalenia stawów. Określamy ilościowo wywołane reakcje bólowe myszy poddanych twardemu badaniu palpacyjnemu bolesnego kolana. Oceniamy również ból samoistny na podstawie proporcji masy ciała i ilości czasu umieszczonego na każdej z ich 4 kończyn po indukcji bólu stawów w jednym kolanie. Ból stawów w tych modelach mysich powoduje znaczny wzrost wywołanych reakcji bólowych i zmianę w przenoszeniu ciężaru. Ponieważ myszy są czworonogami, przeładowują bolesną kończynę na kończynę przeciwległą, na kończyny przednie lub jakąś kombinację. Metody te są proste, wymagają minimalnego sprzętu, są powtarzalne i czułe w wykrywaniu bólu. Są one przydatne do badania zarówno metod leczenia zapalenia stawów modyfikujących przebieg choroby, jak i leków przeciwbólowych u myszy.

Wprowadzenie

Ból jest główną przyczyną niepełnosprawności spowodowanej artretyzmem^1,2. Obecnie dostępne leki przeciwbólowe są często nieskuteczne, toksyczne i potencjalnie przyczyniają się do ogólnokrajowego problemu narkotykowego³. Operacja nie zawsze jest opcją w końcowym stadium zapalenia stawów, szczególnie u osób starszych, które mogą mieć wiele chorób współistniejących. Steroidy dostawowe i wiskosuplementacja mogą być skuteczne we wczesnym stadium choroby, ale zazwyczaj tracą swoją skuteczność w późnym stadium choroby⁴. Istnieje ogromne niezaspokojone zapotrzebowanie na skuteczne leki przeciwbólowe na ból stawów, którego nie można rozwiązać za pomocą obecnie dostępnych metod leczenia.

Modele przedkliniczne są przydatne do zrozumienia mechanizmu działania terapii przeciwbólowych i przewidywania ograniczających toksyczności, ale pomiar bólu u zwierząt jest wyzwaniem⁵. Miary bólu mogą być bezpośrednie i spontaniczne (statyczne lub dynamiczne przenoszenie ciężaru, postawa stopy, analiza chodu, spontaniczne ruchy i wrażliwość mechaniczna lub termiczna) lub pośrednie/wywołane (test wycofania kończyn tylnych, siła ucisku kolana lub obrazowanie mózgu)⁶. W przypadku łagodnych postaci zapalenia stawów analiza chodu jest niewrażliwa i brakuje jej spójności⁷. Statyczne przenoszenie ciężaru jest przydatne do pomiaru bólu tylnych kończyn szczura, ale może być trudne u myszy. Mechaniczne pomiary czułości, takie jak test von Freya, pośrednio wykrywają uczulenie opuszki stopy w przypadku zapalenia stawów kolanowych, ale nie mierzą bezpośrednio bólu kolana i są kłopotliwe do wykonania. Siła ucisku kolana mierzona za pomocą urządzenia P.A.M. (Pressure Application Measurement) może być stosowana u szczurów, ale duże urządzenie jest trudne do użycia u myszy bez wywoływania negatywnych zachowań, które niekoniecznie odzwierciedlają ból⁸.

Opracowaliśmy metody pomiaru bólu spontanicznego i wywołanego w trzech różnych modelach mysiego zapalenia stawów, które są czułe i powtarzalne do pomiaru nasilenia bólu i przeciwbólowych efektów terapii dostawowych^9,10. Możemy również skorelować uśmierzanie bólu z innymi histologicznymi markerami bólu i badać badane leki, które nie byłyby możliwe u ludzi. Możemy ocenić synergizm umiarkowanie skutecznych leków przeciwbólowych w celu zidentyfikowania skuteczniejszych terapii skojarzonych. Wykorzystując sprawdzone metody zarówno w przypadku bólu wywołanego, jak i spontanicznego, unikamy pułapki polegającej na niezidentyfikowaniu bólu, który jest odzwierciedlony w jednym typie zachowania bólowego, ale nie w drugim, i bardziej zbliżono do pomiaru bólu u ludzi¹¹. Ograniczając ocenę bólu do dwóch metodologii, minimalizujemy stres u zwierząt, który może wpływać na zachowanie związane z bólem, i maksymalizujemy produktywność laboratorium.

Protokół

Wszystkie procedury i protokoły dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Minneapolis Veterans Affairs Health Care System (VAHCS) Institutional Animal Care and Use Committee i zgodne z "Przewodnikiem po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych" (The National Academic Press, USA)¹².

1. Wybór zwierząt

UWAGA: Myszy C57Bl6 są używane we wszystkich trzech modelach zapalenia stawów.

1. Użyj myszy płci męskiej lub żeńskiej, ale należy pamiętać, że reakcja na ból stawów może się różnić w zależności od płci i patogenezy testowanego modelu.
2. Wybierz myszy, które osiągnęły dojrzałość płciową, nie rosną już szybko i nie są wystarczająco duże, aby rozwinąć samoistne zapalenie stawów, które może zakłócić pomiary bólu.
   UWAGA: Dwanaście tygodni to idealny wiek do pomiaru bólu w opisanych modelach, ale zależy to od projektu badania. Wiek w momencie rozpoczęcia zapalenia stawów zależy od czasu potrzebnego na rozwój modelu. Ostre zapalenie stawów (model karagenu) wymaga 3 godzin, aby się rozwinąć, dlatego w momencie indukcji zwierzęta mają 12 tygodni. Przewlekłe zapalenie stawów (model CFA) potrzebuje 3 tygodni, aby się rozwinąć, dlatego zwierzęta mają 9 tygodni w momencie indukcji. Przewlekłe zwyrodnieniowe zapalenie stawów (model kolagenazy) wymaga 4 tygodni rozwoju, dlatego zwierzęta mają 8 tygodni w momencie indukcji. Bardziej przewlekły model zwyrodnieniowego zapalenia stawów można zastosować, wywołując zapalenie stawów w wieku 6 tygodni. Pozwala to na 6 tygodni rozwoju uszkodzenia stawów. Jednak przewlekłe zwyrodnieniowe zapalenie stawów u myszy nie powoduje znaczącego bólu wywołanego.
3. Pozyskaj zwierzęta z krajowego komercyjnego źródła hodowlanego.
4. Zwierzęta trzymane w grupach do 8 sztuk w standardowych klatkach z poliwęglanu z dietą dla gryzoni ad libitum i wodą.
5. Utrzymuj warunki środowiskowe na poziomie 72 °C ± 1 °C i wilgotności 33% ± 1% przy 12 godzinach cykli światła/ciemności.

2. Iniekcje dostawowe do kolana

1. Stwórz sterylną igłę o gramaturze 30 G i średnicy 2,5 mm, pokrywając długość igły 0,5 cala osłonką wykonaną z rurki polietylenowej o średnicy wewnętrznej 0,38 mm i średnicy zewnętrznej 1,09 mm, pozostawiając wystające tylko 2,5 mm igły. Zapobiega to zbyt głębokiemu wkłuciu igły i wyjściu ze stawu do tyłu.
2. Wybierz jedno kolano do wstrzyknięcia, ogol je za pomocą dowolnego dostępnego na rynku elektrycznego trymera do zarostu i wysterylizuj za pomocą peelingu prowidonowo-jodowego.
3. Znieczulić mysz 3% izofluranem w 100% O2 w dawce 1 l/min przez 3 min ± 1 min. Podczas zabiegu utrzymuj znieczulenie za pomocą nosa. Potwierdź głębokość znieczulenia przez uszczypnięcie palca u nogi. Należy pamiętać o monitorowaniu stanu oddychania i zminimalizowaniu ekspozycji na znieczulenie, aby utrzymać odpowiednie oddychanie.
4. Wprowadź staw w linii środkowej przez ścięgno rzepki tuż poniżej dolnej krawędzi rzepki za pomocą sterylnej igły osłonkowej, gdy mysz jest w pełni znieczulona. To podejście do przedniej linii środkowej maksymalizuje dokładność wprowadzania do stawu i wstrzykiwania interesującej substancji.
5. Stosuj to samo podejście do wstrzykiwania zarówno substancji wywołujących zapalenie stawów, jak i substancji przeciwbólowych. Kontrole pozorowane są wytwarzane przez wkłucie igły jak wyżej, ale bez wstrzykiwania jakiejkolwiek substancji.

3. Wytwarzanie zapalenia stawów

1. Znieczulić zwierzę jak w kroku 2.3 powyżej.
2. Zważyć odpowiednie ilości (patrz poniżej) karagenu, kompletnego adiuwantu Freunda i kolagenazy typu IV i rozcieńczyć do odpowiedniego stężenia roztworem soli fizjologicznej w okapie z przepływem laminarnym dla bezpieczeństwa i sterylności.
3. Wstrzyknąć 10 μl 2,5% karagenu rozcieńczonego w 0,9% sterylnym roztworze soli fizjologicznej do kolana, jak powyżej, za pomocą strzykawki Hamiltona, aby wywołać ostre zapalenie stawów. Zapalenie stawów osiąga szczyt 3 godziny po wstrzyknięciu.
4. Wstrzyknąć 30 μl (30 μg) Complete Freund's Adjuvant (CFA) do kolana w celu wywołania przewlekłego zapalenia stawów. Istnieje początkowa ostra faza zapalna, która osiąga szczyt po 1 tygodniu, a następnie faza przewlekła, która osiąga szczyt po 3 tygodniach od wstrzyknięcia.
5. Wstrzyknąć 10 μl zawierających 10 j.m. kolagenazy typu IV w celu wytworzenia przewlekłego zwyrodnieniowego zapalenia stawów. Ból stawów osiąga szczyt 4 tygodnie po wstrzyknięciu.

4. Pomiar wywołanego bólu stawów

1. Zawsze najpierw sprawdzaj normalne kolano porównawcze, aby zminimalizować reakcję na ból krzyżowy (windup) z bolesnego kolana¹³.
2. Przeszkolić egzaminatora, aby stosował stały i mocny nacisk 700 gf/cm² = 10 psi za pomocą palpometru na poziomie 4; urządzenie wyemituje 4 sygnały dźwiękowe po zastosowaniu tego poziomu nacisku. Taka ilość nacisku będzie konsekwentnie wywoływać większą reakcję bólową ze stawu artretycznego niż ze stawu normalnego.
   UWAGA: Urządzenie jest fabrycznie skalibrowane tak, aby wywoływać 4 sygnały dźwiękowe po zastosowaniu odpowiedniego poziomu ciśnienia. Używaj urządzenia wyłącznie do treningu; Nie stosować na zwierzętach, ale podczas badania zwierząt należy wywierać presję wyuczoną podczas treningu.
3. Utrzymuj mysz na tyle mocno, aby zapobiec swobodnemu ruchowi, przytrzymując kark palca wskazującego i kciuka oraz używając 4 i 5 palca do przytrzymania ogona. Mysz powinna być w stanie wykonywać dyskretne, krótkie ruchy przy wysiłku i po stymulacji, ale nie powinna być w stanie poruszać się swobodnie lub w sposób ciągły.
4. Podawać powtarzające się mocne (palpometr na poziomie 4) palpacje palpacyjne jednocześnie po bocznej i przyśrodkowej stronie każdego kolana w przybliżeniu na linii stawu kciukiem i palcem wskazującym wolnej ręki raz na sekundę przez jedną minutę, jednocześnie przytrzymując mysz. Nie używaj palpometru do badania na myszach; Służy wyłącznie do treningu.
5. Niech drugi obserwator policzy, ile razy zwierzę wokalizuje i walczy, aby uciec z więzów w ciągu tej jednej minuty. Suma walk i wokalizacji to Evoked Pain Score.
6. Zawsze jesteśmy tym samym egzaminatorem przez cały czas trwania badania i potwierdzamy, że egzaminator i obserwator są ślepi co do warunków eksperymentalnych.

5. Pomiar spontanicznego bólu stawów.

UWAGA: Urządzenie Advanced Dynamic Weight Bearing (ADWB) oblicza procent całkowitego czasu, jaki zwierzę spędza na każdej kończynie i procent całkowitego ciężaru przenoszonego na każdej kończynie.

1. Napełnij plastikową zlewkę 2 litrami wody. Umieść podkładkę piankową i płytę pilśniową o średniej gęstości, które są dołączone do urządzenia, wraz z napełnioną zlewką na wadze laboratoryjnej i zapisz łączną wagę.
2. Otwórz program ADWB i wybierz typ czujnika myszy.
3. Kalibruj system przed każdym eksperymentem:
   1. Wybierz opcję Pełna kalibracja w menu Kalibracja. Wprowadź 0,00 jako wartość tary i wagę podkładki piankowej, płyty pilśniowej o średniej gęstości, plastikowej zlewki i wody jako odważnik kalibracyjny, a następnie wybierz przycisk Dalej.
   2. Wybierz Tarowanie przed umieszczeniem czegokolwiek na czujniku. Przed wybraniem podglądu wzmocnienia przykryj podkładkę czujnika dostarczoną podkładką piankową, płytą pilśniową o średniej gęstości i plastikową zlewką wypełnioną 2 litrami wody, w tej kolejności. Wybierz opcję Gain preview (Podgląd wzmocnienia), gdy wzorzec wzorcowy znajdzie się na czujniku.
   3. Dostosuj masę kalibracyjną tak, aby była równomiernie rozłożona na poszczególne czujniki, a gdy wartość wskaźnika kalibracji przekroczy 95, wybierz opcję Definicja wzmocnienia. W wyniku tego procesu uzyskuje się znormalizowaną średnią dla poszczególnych czujników i potwierdza integralność poszczególnych czujników. Na koniec wybierz pozycję Dalej.
   4. Zapisz plik kalibracji w folderze kalibracji.
4. Wybierz pozycję Nowa i tam, gdzie to możliwe, wprowadź nazwę projektu i nazwę zwierzęcia dla pierwszej myszy, która ma zostać przetestowana.
5. Wybierz pozycję Przeglądaj i otwórz plik kalibracji, który został utworzony dla projektu. Wybierz pozycję Dalej, upewnij się, że wybrano opcję Włącz przechwytywanie wideo, a następnie wybierz przycisk OK.
6. Zważ zwierzę, wybierz opcję Capture (Schwytaj) i zapisz wagę w oprogramowaniu. Wybierz przycisk OK.
7. Nie należy aklimatyzować myszy w komorze przed zebraniem danych, ponieważ to urządzenie mierzy spontaniczne zachowanie.
8. Umieść mysz w komorze na okres 5 minut testowania. Gdy zwierzę znajdzie się w komorze, wybierz opcję Launch. Oprogramowanie zarejestruje aktywność zwierzęcia w tym czasie, przechwyci wideo i zsynchronizuje się z danymi z czujnika, a następnie automatycznie podzieli ten film na segmenty, które można analizować i których nie można analizować.
   UWAGA: Oprogramowanie uznaje segmenty za możliwe do analizy, gdy zostanie wykryta co najmniej jedna stabilna strefa. Stabilna strefa powstaje, gdy czujniki wykrywają ≥2 g na jednym czujniku, przy czym co najmniej jeden sąsiedni czujnik wykrywa ≥1 g i gdy rozkład masy strefy jest stabilny przez więcej niż 0,38 s.
9. Przed pierwszą analizą z serii wybierz ustawienie Easy scoring i Independent paws (Łatwe punktowanie) i Independent paws (Łatwe punktowanie) i niezależne łapy.
   UWAGA: Łatwe ocenianie umożliwia iteracyjną walidację segmentów, w których stabilna strefa nie zmienia się na podstawie walidacji pierwszej stabilnej strefy tego segmentu. Niezależne ustawienie łap zapewnia obserwatorowi dostęp do skrótów klawiaturowych, które umożliwiają indywidualną identyfikację każdej łapy. Obserwator przypisuje strefy, które spełniają minimalne kryteria, takie jak prawa tylna, lewa tylna, prawa przednia, lewa przód, obie przednie łapy, inna część ciała lub strefa ignorowania za pomocą skrótów klawiaturowych, przytrzymując kursor nad segmentem na wideo i skalowaną mapę aktywowanych czujników.
10. Wybierz >>, aby przejść do pierwszego segmentu, który można analizować. Jeśli w stabilnej strefie nie zidentyfikowano właściwej łapy, przytrzymaj kursor nad tą strefą i naciśnij skrót (prawy tył, s; lewy tylny, a; prawy przód, w; lewy przód, q; obie przednie łapy, e; inna część ciała, z, strefa ignorowania, x), który odpowiada właściwej części ciała.
    UWAGA: Do osiągnięcia progów analizy wymagane jest co najmniej 1,5 minuty czasu analizy. Analizowane segmenty są automatycznie dodawane i uśredniane dla wydajności na łapę (łapy) przez oprogramowanie.
11. Następnie oprogramowanie ADWB automatycznie oblicza procent spędzonego czasu i procent masy ciała (g) przypadający na każdą z czterech opcji kończyn. Wyeksportuj te wartości do nowego arkusza kalkulacyjnego, wybierając pozycję Wyniki, Eksportuj, wybierając pozycję Tak w odpowiedzi na pytanie z pytaniem, czy należy wyeksportować tylko pierwsze pięć wierszy podsumowania, i wybierając lokalizację danych wyjściowych.
12. Eutanazja zwierząt poprzez wdychanie CO2, a następnie torakotomia pod koniec okresu badania.
13. Dla każdego dodatkowego zwierzęcia w tej samej grupie wybierz opcję Nowe i wprowadź unikatową nazwę zwierzęcia, ale nie zmieniaj nazwy projektu. Wybierz pozycję Dalej, upewnij się, że wybrano opcję Włącz przechwytywanie wideo, a następnie wybierz przycisk OK. Wykonaj kroki od 5.5 do 5.12, jak w przypadku pierwszego zwierzęcia.

Wyniki

Ostry i przewlekły ból zapalny oraz przewlekły ból zwyrodnieniowy stawów wywołano poprzez wstrzyknięcie IA do lewego kolana samców i samic myszy C57BL/6J przed oceną bólu zgodnie z opisanym powyżej protokołem. Ból stawów mierzono jako wskaźniki bólu wywołanego (EPS) oraz spontaniczne zachowania bólowe za pomocą urządzenia do zaawansowanego dynamicznego pomiaru obciążenia (ADWB). Na potrzeby niniejszego raportu porównania indywidualne przeprowadzono za pomocą testów t Studenta. W przypadku eksperymentów, w których porównywane są dawki przeciwbólowe, bardziej odpowiednim porównaniem statystycznym może być ANOVA.

Wskaźnik EPS (suma zliczonych walk oraz wokalizacji) wzrósł w przypadku wszystkich trzech rodzajów bólu stawów (Rycina 1). Pomiary ADWB dotyczące procentowego obciążenia lewej tylnej kończyny w porównaniu z myszami naiwnymi były obniżone w przypadku ostrego i przewlekłego zapalnego bólu stawów. Samice, ale nie samce z przewlekłym degeneracyjnym bólem stawów (COL), wykazały podobne obniżenia w pomiarach ADWB (Rycina 2A). Samce z ostrym zapalnym bólem stawów przenosiły większy ciężar na kończyny przednie niż zwierzęta naiwne. Obciążenie kończyn przednich wzrosło u samic w porównaniu z grupą naiwną, ale nie u samców z przewlekłym degeneracyjnym bólem stawów (COL) (Rycina 2B). Pomiary ADWB dotyczące procentowego czasu spędzonego na dotkniętej lewej tylnej kończynie spadły w porównaniu z grupą naiwną u myszy z ostrym i przewlekłym zapalnym bólem stawów, jednak nie było to istotne statystycznie. Zwierzęta te spędzały istotnie mniej czasu na lewej tylnej kończynie niż na prawej tylnej kończynie. Zarówno u samców, jak i u samic z przewlekłym degeneracyjnym bólem stawów nie stwierdzono różnic w czasie spędzonym na lewych tylnych kończynach w porównaniu z grupą naiwną. Samice z przewlekłym degeneracyjnym bólem stawów spędzały więcej czasu na nieartrytycznej prawej tylnej kończynie w porównaniu z grupą naiwną (Rycina 3A). Myszy z ostrym zapalnym bólem stawów oraz samice z przewlekłym degeneracyjnym bólem stawów spędzały istotnie więcej czasu na kończynach przednich niż zwierzęta naiwne (Rycina 3B).

Rycina 1. Wyniki bólu wywołanego dla lewej (niebieski słupek) i prawej (czerwony słupek) kończyny tylnej. Prawe kończyny tylne służyły jako kontrole wewnętrzne i nie poddawano ich żadnym wstrzyknięciom IA. Pomiary wykonano w następujących warunkach: naiwne zwierzęta niepoddane wstrzyknięciom (samce i samice), ostre zapalenie stawów indukowane karagenanem (CAR), przewlekłe zapalne zapalenie stawów indukowane pełnym adjuwantem Freunda (CFA) oraz przewlekłe niezapalne zapalenie stawów indukowane kolagenazą (COL – samce i samice). U zwierząt naiwnych EPS lewego kolana tylnego nie różnił się statystycznie od prawego u samców i różnił się tylko minimalnie u samic (**P = 0,038), prawdopodobnie ze względu na pewien zwiększony odruch bólowy w kolanie badanym jako drugim (lewym) wynikający z krzyżowej reakcji bólowej. we wszystkich grupach z zapaleniem stawów EPS lewego kolana z zapaleniem był istotnie wyższy niż w nieobjętym zapaleniem przeciwległym kolanie prawym. Porównując EPS lewego kolana w grupach z zapaleniem stawów z zwierzętami naiwnymi, wszystkie grupy z zapaleniem stawów wykazywały istotnie wyższe wyniki EPS w lewym kolanie z zapaleniem w porównaniu do lewych kolan zwierząt naiwnych. Dotyczyło to zarówno samców, jak i samic. *P < 0,05 w porównaniu do naiwnych samców, #P < 0,05 w porównaniu do naiwnych samic. Wszystkie słupki błędów na wszystkich rycinach przedstawiają SEM. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Rysunek 2: Spontaniczne zachowania bólowe mierzone procentowym obciążeniem kończyn masą ciała. (A) Spontaniczne zachowania bólowe mierzone całkowitym procentem masy ciała przypadającym na lewą (słupek niebieski) i prawą (słupek czerwony) kończynę tylną. U naiwnych zwierząt obu płci nie stwierdzono istotnych różnic między procentowym obciążeniem lewej i prawej kończyny tylnej. Samce myszy z bólem stawów wywołanym przez CAR i CFA oraz samice z bólem stawów wywołanym przez COL obciążały lewą kończynę tylną w stopniu istotnie mniejszym w porównaniu do grupy naiwnej. *P < 0.05 w porównaniu do naiwnych samców, #P < 0.05 w porównaniu do naiwnych samic. (B) Spontaniczne zachowania bólowe mierzone całkowitym procentem masy ciała przypadającym na kończyny przednie. U samców z ostrym bólem stawów wywołanym przez CAR oraz u samic z przewlekłym bólem stawów wywołanym przez COL odnotowano istotny wzrost masy ciała spoczywającej na kończynach przednich. Zjawisko to nie wystąpiło u samców z bólem stawów wywołanym przez CFA lub COL. Samice naiwne miały tendencję do większego obciążania kończyn przednich niż samce naiwne (P = 0.02). Dodatkowy ciężar mógł być przenoszony przez inne części ciała, takie jak ogon lub tył ciała. Wartości te były zazwyczaj minimalne i nie wnosiły istotnego wkładu w zrozumienie reakcji bólowej, dlatego nie zostały przedstawione. *P < 0.05 w porównaniu do naiwnych samców, #P < 0.05 w porównaniu do naiwnych samic oraz do samców w grupie COL 4 tygodnie w zakresie obciążenia kończyn przednich. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 3: Spontaniczne zachowania bólowe mierzone procentowym czasem spędzonym na kończynach. (A) Spontaniczne zachowania bólowe mierzone całkowitym procentowym czasem spędzonym na lewej (słupek niebieski) i prawej (słupek czerwony) kończynie tylnej. Nie stwierdzono istotnej różnicy między prawą a lewą kończyną tylną u naiwnych myszy samców i samic w odniesieniu do czasu spędzonego na kończynie. Samce z zapaleniem stawów indukowanym CAR i CFA wydawały się spędzać mniej czasu na obciążeniu zapalnej lewej kończyny tylnej w porównaniu do grupy naiwnej, jednak nie było to istotne statystycznie i prawdopodobnie wynikało ze zwiększonej zmienności tego pomiaru u tych myszy. U tych zwierząt wystąpiła istotna różnica przy porównaniu prawej i lewej kończyny, gdyż prawa kończyna tylna była obciążona przez dłuższy całkowity czas niż lewa. U samic z zapaleniem stawów indukowanym COL prawa kończyna tylna była obciążona przez większą część czasu niż u naiwnych samic. *P < 0.05 w porównaniu prawej do lewej, #P < 0.05 w porównaniu do naiwnych samic oraz do samców z 4-tygodniowym COL w czasie spędzonym na kończynach przednich. (B) Spontaniczne zachowania bólowe mierzone całkowitym czasem spędzonym na kończynach przednich. Samce z zapaleniem stawów indukowanym CAR oraz samice z zapaleniem stawów indukowanym COL spędzały istotnie więcej czasu na obciążeniu kończyn przednich niż zwierzęta naiwne. Naiwne samice spędzały więcej czasu na kończynach przednich niż naiwne samce. *P < 0.05 w porównaniu do naiwnych samców, #P < 0.05 w porównaniu do naiwnych samic. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Pomiar bólu stawów w przedklinicznych modelach zapalenia stawów i choroby zwyrodnieniowej stawów jest coraz cenniejszym narzędziem do oceny nowych metod leczenia bólu stawów i przywracania funkcji stawów ^9,10. Pomiar zachowań bólowych u myszy z przewlekłą chorobą zwyrodnieniową stawów jest wyzwaniem. Jako czworonogi mogą przerzucić bolesną kończynę na dowolną kombinację pozostałych trzech kończyn lub ogona. Zmniejszona funkcja jednej kończyny może nie objawiać się tak wyraźnie, jak u dwunożnych ludzi. Jako zwierzęta drapieżne, myszy mają korzyści w zakresie przetrwania, aby zminimalizować zachowania bólowe.

Raport ten pokazuje, że ból stawów spowodowany różnymi mechanizmami patologicznymi można zmierzyć u myszy za pomocą prostych i stosunkowo niedrogich metod. Zapalny ból stawów powoduje większe zmiany w czasie i rozkładzie ciężaru, a zatem może być bardziej czułym modelem do wykrywania analgezji. Jednak inne modele bólu stawów będą ważne przy ocenie nowych potencjalnych leków przeciwbólowych, ponieważ mechanizmy inicjacji i utrzymywania bólu są prawdopodobnie różne w zależności od patologii. Znaleźliśmy różnice we wzorcach odciążania między mężczyznami i kobietami oraz między różnymi modelami bólu stawów.

Ważne jest, aby zdać sobie sprawę, że u myszy mogą występować różnice w zachowaniu bólowym zarówno pod względem napięcia, jak i płci 14,15,16. Wiadomo również, że istnieją wyraźne różnice w progach bólu. Odkryliśmy, że u myszy C57 / Bl6 samice wykazywały znacznie więcej spontanicznych zachowań bólowych (zwiększona waga i czas na kończynach przednich) niż samce myszy z przewlekłym zwyrodnieniowym bólem stawów (ryc. 2 i ryc. 3). Nie określiliśmy fazy rui dla tych samic myszy, więc nie możemy powiedzieć, czy miało to jakikolwiek wpływ na nasze wyniki, ale inni ustalili, że faza rui nie wyjaśnia obserwowanych różnic płci u myszy C57 / Bl6¹⁷.

Zachowanie związane z bólem wywołanym jest wrażliwe na wszystkie testowane rodzaje bólu stawów i ma dobrą odtwarzalność. Bardzo ważne jest, aby egzaminator był przeszkolony w zakresie stałego, ustandaryzowanego ciśnienia palpacyjnego i stosowania spójnych metod ograniczania, które pozwalają na wykrycie zarówno bólu, jak i analgezji w szerokim zakresie zachowań. Ważne jest, aby zawsze najpierw zbadać normalne kolano, aby zminimalizować reakcję na ból w normalnym kolanie z powodu efektu skrzyżowania i zmaksymalizować różnicę w reakcji na ból między normalnym a bolesnym kolanem. Użycie drugiego obserwatora do zliczenia reakcji bólowych, które składają się na EPS, jest konieczne, aby badający skupił się na konsekwentnym badaniu palpacyjnym i aby wokalizacje i walki były konsekwentnie zliczane. Konieczne może być zastosowanie metody krępowania, w szczególności w celu zapewnienia, że zwierzę może odpowiednio reagować na ból, ale nie reaguje zbyt łatwo, aby osłabić reakcję bólową. Zaletą pomiaru EPS jest to, że jest on analogiczny do pomiaru tkliwości stawów u ludzi.

Uważamy, że te metody są lepsze od istniejących metod, ponieważ bezpośrednio mierzą ból pochodzący ze stawów kolanowych myszy, mogą być stosowane w różnych modelach bólu jednostawowego, obejmują zarówno spontaniczne, jak i wywołane reakcje bólowe i są stosunkowo niedrogie, ale niezawodne i powtarzalne. W miarę opracowywania terapii w celu skuteczniejszego leczenia zapalenia stawów, metody te będą przydatne do potwierdzenia, czy leczenie jest rzeczywiście skuteczne w przypadku najbardziej upośledzającego wyniku zapalenia stawów, bólu.

Nasze metody mają pewne ograniczenia. Przede wszystkim środek EPS jest ograniczony ze względu na wymóg jednego egzaminatora i obserwatora oraz potrzebę bardzo spójnej techniki. Wywołane miary bólu są bardziej zautomatyzowane i nie podlegają tak dużym różnicom między obserwatorami. Dalsze udoskonalenie miary EPS może obejmować zautomatyzowane metody liczenia wokalizacji w odpowiedzi na badanie palpacyjne, takie jak użycie ultradźwiękowego detektora nietoperzy do liczenia wokalizacji. Metoda ta musiałaby zostać porównana z naszą obecną metodą, aby potwierdzić czułość i swoistość, zanim będzie mogła zostać powszechnie wdrożona.

Podsumowując, opisujemy dwie różne miary zachowania bólowego do ilościowego określania bólu stawów u myszy. Przed wyborem modelu eksperymentalnego należy wziąć pod uwagę różnice między płcią a szczepem. Pomiary bólu wywołanego wymagają starannego treningu i konsekwentnego wdrażania przez badającego. Zarówno spontaniczne, jak i wywołane zachowania bólowe są zalecane do oceny nasilenia bólu i ograniczenia funkcjonalnego i powinny być wykorzystywane do pełnej oceny skutków nowych potencjalnych leków przeciwbólowych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zaawansowane dynamiczne urządzenie do przenoszenia ciężarów	Bioseb In Vivo Research Instruments, Vitrolles, Francja	Model: BIO-DWB-M - Dla myszy
myszy C57 / Bl6 (samce i samice)	Jackson Labs, Bar Harbor ME	Nr magazynowy:  000664 |  Black 6
Carrageenan	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	22049-5G-F
Kompletny adiuwant Freunda	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	F5881
Palpometr	Palpometer Systems, Inc. Victoria, BC	Niedostępne - już nie działa
Type IV Collagenase	Worthington Biomedical Corp, Lakeville, NJ	LS004210