Artykuł metodologiczny

Ulepszony i wysokoprzepustowy test mikroneutralizacji syncytialnego wirusa oddechowego (RSV)

10.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59025

⸱

26 stycznia 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Murdoch Children's Research Institute, 2Department of Paediatrics, University of Melbourne, 3School of Chemistry and Molecular Bioscience, University of Queensland, 4London School of Hygiene and Tropical Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

To badanie opisuje wysokoprzepustowy, oparty na obrazowaniu test mikroneutralizacji w celu określenia miana przeciwciał neutralizujących specyficznych dla syncytialnego wirusa oddechowego (RSV). Ten format testu został przetestowany na różnych typach próbek.

Streszczenie

Przeciwciała neutralizujące specyficzne dla syncytialnego wirusa oddechowego (NAbs RSV) są ważnym markerem ochrony przed RSV. Obecnie na całym świecie stosuje się wiele różnych formatów testów, dlatego istnieje zapotrzebowanie na dokładną i wysokowydajną metodę pomiaru NAb RSV. Opisujemy tutaj test mikroneutralizacji oparty na obrazowaniu, który został przetestowany na podgrupie A RSV i może być również dostosowany do podgrupy B RSV i różnych typów próbek. Metoda ta jest wysoce powtarzalna, a różnice między testami dla referencyjnej surowicy odpornościowej są mniejsze niż 10%. Wierzymy, że ten test można łatwo wprowadzić do wielu laboratoriów na całym świecie przy stosunkowo niskich kosztach. Opracowanie ulepszonego, wysokoprzepustowego testu, który mierzy NAbs wirusa RSV, stanowi znaczący krok naprzód w standaryzacji tej metody na arenie międzynarodowej, a także ma kluczowe znaczenie dla oceny nowych kandydatów na szczepionki przeciwko RSV w przyszłości.

Wprowadzenie

Syncytialny wirus oddechowy (RSV) jest główną przyczyną infekcji dolnych dróg oddechowych w populacji pediatrycznej na całym świecie1. Pomimo dużego obciążenia nadal nie ma dostępnej szczepionki ani leczenia. Od 2013 roku Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) uznała opracowanie szczepionki przeciwko RSV za główny priorytet badawczy, organizując coroczne spotkania konsultacyjne WHO2,3. Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) zgodziła się na wykorzystanie pomiaru przeciwciał neutralizujących RSV (NAb) do monitorowania immunogenności szczepionki, ponieważ jest ona uznawana za główny serologiczny marker ochrony4. W wielu badaniach, jak również w próbach klinicznych wykazano, że NAb chronią przed ciężkim zakażeniem RSV przeciwciałem monoklonalnym paliwizumabem, obecnie jedyną dostępną strategią profilaktyczną4.

Istnieje wiele formatów testów NAb używanych przez laboratoria na całym świecie, w tym testy komórkowe i molekularne, które utrudniły standaryzację5,6,7,8. Jednak konwencjonalny test neutralizacji z redukcją blaszki miażdżycowej (PRN), który mierzy liczbę zredukowanych jednostek tworzących płytki miażdżycowej (PFU) na podstawie obecności przeciwciała specyficznego dla RSV, nadal pozostaje złotym standardem9. W tym miejscu przedstawiamy ulepszony, uproszczony i wysokoprzepustowy protokół PRN, który może być stosowany na wielu liniach komórkowych, dla różnych szczepów RSV i przy zwiększonej przepustowości testów. Protokół ten został przetestowany przy użyciu próbek klinicznych z różnych środowisk, a także na próbkach z eksperymentów na modelach zwierzęcych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Wszystkie kroki muszą być wykonane w okapie BSL2, chyba że zaznaczono inaczej. Miareczkowanie wirusa jest wymagane przed testem PRN w celu określenia optymalnego stężenia RSV stosowanego w teście PRN. Zaleca się podwielokrotnienie zapasów wirusa w małej objętości, która zostanie jednokrotnie rozmrożona i wykorzystana do każdego testu NAb. Zaleca się również stosowanie tego samego szczepu wirusa dla wszystkich testów NAb wykonanych dla wszystkich próbek z jednego badania. Upewnij się, że pożywki hodowlane i sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) są podgrzane w temperaturze 37 °C przed dodaniem do płytek komórkowych.

1. Miareczkowanie wirusa RSV

UWAGA: W zależności od liczby zapasów wirusa i liczby duplikatów, płytka testowa może być ustawiona zgodnie z Rysunek 1. Każdy zapas wirusa powinien być miareczkowany trzykrotnie na płytce testowej, zaczynając od najwyższego stężenia wirusa (tj. 1:10). Miareczkowanie seryjne może wynosić zazwyczaj 1:10. Hodowla i utrzymanie komórek A549 oraz procedura hodowli RSV są wykonywane przy użyciu standardowych procedur i nie są objęte niniejszym protokołem.

  1. Talerze wysiewające (dzień 1)
    1. Ponownie zawiesić komórki A549 w zmodyfikowanym pożywce Dulbecco Eagles (DMEM) + 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS) + 1000 IU penicyliny/streptomycyny (pióro/paciorkowca) przy 4 x 105/ml. Wysiewaj 96-dołkowe sterylne płytki z płaskim dnem o pojemności 100 μl/basenik, zawierające 4 x 104 komórki A459.
    2. Inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C, 5% CO2 (komórki będą w fazie logarytmicznej).
      nuta: Użyć nowej fiolki z komórkami A549 po 23 pasażach. Zaleca się, aby nie rozpoczynać eksperymentów, gdy nowa fiolka z komórkami znajduje się jeszcze w pierwszych trzech pasażach.
  2. Zakażenie wirusem (dzień 2)
    1. Przygotowanie seryjnego rozcieńczania wirusa
      1. Szybko rozmrozić pojedynczą zamrożoną fiolkę z RSV w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C aż do prawie całkowitego rozmrożenia i natychmiast umieścić na lodzie. Przygotować 3 powtórzenia dla każdego stada wirusa RSV, które ma być oznaczone, użyć początkowego rozcieńczenia zapasu wirusa w stosunku 1:10 ze 100 μl rozcieńczonego wirusa/basenika i zarezerwować co najmniej jedną kolumnę do kontroli ujemnej.
        UWAGA: Rysunek 1 pokazuje kontrolę negatywną w trzech egzemplarzach.
      2. Dodać 100 μl każdego rozcieńczonego wirusa w stosunku 1:10 w trzech powtórzeniach rzędu A sterylnej płytki z 96-dołkowym dnem w kształcie litery U. Dodać 90 μl/basenik DMEM + 1000 j.m. długopisu/paciorkowca bez FCS do rzędów od B do H.
      3. Wykonać seryjne rozcieńczenia 1:10 w dół płytki, przenosząc 10 μl z rzędu A do rzędu B. Wymieszać roztwór, pipetując zawartość w górę i w dół 5 razy i kontynuować dziesięciokrotne rozcieńczenia aż do rzędu H. Wyrzucić ostatnie 10 μl, tak aby końcowa objętość w każdym studzience wynosiła 90 μL.
        nuta: Ważne jest, aby używać nowych końcówek do każdego rozcieńczenia.
    2. Inokulacja wirusa do komórek A549
      1. Pobrać płytkę (płytki) komórkowe A549 przygotowaną poprzedniego dnia. Upewnij się, że monowarstwy komórek A549 w płytkach 96-dołkowych są w ~ 80% zlewne. Wyrzuć podłoże, delikatnie odwracając płytkę i lekko osuszając sterylny, chłonny ręcznik papierowy.
      2. Umyj wszystkie studzienki dwukrotnie 100 μl PBS, wyrzuć nadmiar PBS, delikatnie odwracając płytkę i lekko osuszając sterylny, chłonny ręcznik papierowy po każdym myciu. Nie dopuścić do wyschnięcia talerzy.
      3. Przenieś rozcieńczenia wirusa z płytki miareczkowania wirusa (Rysunek 1) do odpowiednich studzienek na płytce komórkowej A549. Inkubować płytkę przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Po 1 godzinie inkubacji zdekantować supernatanty za pomocą pipety (aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego). Wyjmij 90 μl/studzienkę.
      4. Do każdej studzienki dodać 100 μL 1x pożywki 199 (M199, patrz tabela materiałów) + 1,5% sól sodowa karboksymetylocelulozy (CMC) o niskiej lepkości + 2% FCS zawierająca długopis/paciorkowiec.
        UWAGA: 2x M199 + 4% FCS + 2% pen/strep i 3% CMC roztwory muszą być wcześniej przygotowane i przechowywane w temperaturze 4 °C do wykorzystania w przyszłości. Upewnij się, że roztwór jest podgrzany w temperaturze 37 °C przed dodaniem do talerzy.
        1. Przygotuj 2x roztwór M199: 1 saszetka/500 ml wody destylowanej + 20 ml FCS + 10 ml wstrzykiwacza/paciorkowca (do uzupełnienia 2x MI99). Przefiltruj roztwór za pomocą jednostki filtrującej 0,22 μm.
        2. W celu przygotowania 3% CMC, powoli dodawać 15 g CMC do 500 ml wody destylowanej. Rozpuścić CMC w wodzie za pomocą metalowego mieszadła o temperaturze 50 °C, co zajmuje około 1 godziny przygotowania. Dobrze wymieszaj, aby uzyskać 3% CMC i autoklawuj roztwór.
          nuta: Ciało stałe CMC musi zostać dodane do wody w celu rozpuszczenia; Dodanie wody do suchej bryły tworzy "grudkę" ciała stałego, która jest bardzo trudna do rozpuszczenia.
        3. Przygotować 1x M199 + 1,5% CMC o niskiej lepkości + 2% FCS zawierający wstrzykiwacz/paciorkowiec, mieszając 1:1 2x M199 i 3% CMC przygotowanych w kroku 1.2.2.4.2.
      5. Inkubować płytkę przez 3 dni w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  3. Opracowanie płytki testowej i analiza (dzień 5)
    1. Utrwalanie i wywoływanie płytki testowej
      1. Odrzucić M199 + CMC + 2% FCS zawierające wstrzykiwacz/paciorkowiec, delikatnie odwracając płytkę. Dodawać powoli (w celu uniknięcia naruszenia warstwy komórkowej) 200 μl buforu utrwalającego (80% acetonu, 20% PBS, przechowywanego w temperaturze -20 °C) w celu utrwalenia komórek. Inkubować w temperaturze -20 °C przez 20 minut.
      2. Wyrzuć bufor utrwalający i delikatnie osusz chłonny ręcznik papierowy. Pozostaw talerz do wyschnięcia stroną zadrukowaną do dołu na 10 minut.
        nuta: Od tego kroku test można przeprowadzić na zewnątrz okapu BSL2.
      3. Przygotować 5% roztwór blokujący rozcieńczalnik do mleka w przefiltrowanym PBS zawierającym 0,05% polisorbatu 20 (PBS-polisorbat, patrz Tabela Materiałów). Dla jednej płytki oblicz objętość potrzebną do zablokowania na podstawie 200 / studzienka i 110 dołków: 200 / studzienka x 110 dołków = 22 ml (1,1 ml skoncentrowanego rozcieńczalnika do mleka w 20,9 ml przefiltrowanego polisorbatu PBS). Na tym etapie należy również przygotować wystarczającą ilość roztworu blokującego dla przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych. Dla jednej płytki oblicz objętość potrzebną dla każdego roztworu przeciwciała na podstawie 50 / studzienki i 110 dołków: 50 / studzienka x 110 dołków = 5,5 ml. W związku z tym całkowita objętość roztworu blokującego rozcieńczalnik do mleka wymagana do testu na pojedynczej płytce wynosi 33 ml.
      4. Dodać 200 / studzienkę roztworu blokującego. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej (RT) przez 30 minut. Wylej roztwór, delikatnie odwracając płytkę i osuszając chłonny ręcznik papierowy.
      5. Przygotować przeciwciało 1:500 Goat X RSV (mAb – przeciwciało pierwszorzędowe) rozcieńczone w roztworze blokującym. Dodać 50 /basenik roztworu mAb i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Umyj płytkę 3 razy przefiltrowanym polisorbatem PBS.
      6. Przygotuj 1:5 000 Alexa-Fluor anty-kozi IgG (przeciwciało drugorzędowe) rozcieńczone w roztworze blokującym. Dodać 50 baseników roztworu przeciwciał drugorzędowych i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Umyj płytkę 5 razy przefiltrowanym polisorbatem PBS.
      7. Odczyt płytki na automatycznym czytniku punktowym przy użyciu kanału izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC) i ustawień zliczania, jak pokazano w Rysunek 2. Owinąć płytkę w folię i przechowywać w temperaturze 4 °C. Skalibrować przyrząd przy użyciu nieużywanej 96-dołkowej płytki hodowlanej i wprowadzić ustawienia liczby przed testem.
        nuta: W razie potrzeby możliwe jest ponowne skanowanie w ciągu kilku dni. Ustawienia kalibracji i zliczania można zapisać i wykorzystać do przyszłego skanowania, jeśli test wykorzystuje ten sam typ płytki, który został użyty do kalibracji.
      8. Sprawdź zdjęcia studni pod kątem płytek artefaktów lub uszkodzonych monowarstw komórkowych (Rysunek 3). Wyklucz studzienki z przerwanymi monowarstwami komórek.
        nuta: W zależności od wielkości tabliczek z artefaktami, może być konieczne ręczne zliczanie tych studni lub może być konieczne odrzucenie tych studni z analizy danych. Kryteria prawidłowego wyniku obejmują brak wykrytych uszkodzonych monowarstwowych komórek lub płytek artefaktów w więcej niż jednym dołku replikacji oraz brak PFU wykrytego w dołkach ujemnych (studzienkach bez dodatku wirusa).
    2. Określanie stężeń wirusa
      1. Wybierz dwa ostatnie rozcieńczenia, w których plamy można wyraźnie policzyć. Obliczyć średnią liczbę plamek z powtórzonych studzienek przy tym samym rozcieńczeniu. Obliczyć miano wirusa (PFU na ml) próbki podstawowej, korzystając z poniższego wzoru:
        PFU/ml = średnia liczba blaszek/(współczynnik rozcieńczenia × objętość rozcieńczonego wirusa dodanego do studzienki)
        UWAGA: Stężenie wirusa określone dla każdego stada RSV można teraz wykorzystać w teście PRN (krok 2).

2. Test neutralizacji RSV

  1. Talerze wysiewające (dzień 1)
    1. Ponownie zawieś komórki A549 w DMEM + 10% FCS + 1000 IU długopis/paciorkowiec przy 4 x 105/ml. Wysiewaj 96-dołkowe sterylne płytki z płaskim dnem o stężeniu 100 μl/basenik zawierające 4 x 104 komórki A459 i inkubuj płytki przez noc w temperaturze 37 °C, 5% CO2 (komórki będą w fazie logarytmicznej wzrostu).
      nuta: Użyć nowej fiolki z komórkami A549 po 23 pasażach. Nie zaleca się stosowania komórek A549 przed pasażem numer 3.
  2. Przygotowanie wirusa i surowicy (dzień 2)
    nuta: W zależności od rodzaju próbki wymagane są etapy wstępnego przetwarzania próbek przed testem NAb. Zaleca się stosowanie międzynarodowych standardowych surowic RSV, które są obecnie dostępne na żądanie w Narodowym Instytucie Norm Biologicznych i Kontroli (NIBSC).
    1. Przygotowanie rozcieńczenia surowicy
      1. Rozmrozić ludzką referencyjną surowicę odpornościową przeciwko wirusowi RSV (surowicę referencyjną, REF) i próbki testowe surowicy w temperaturze pokojowej. Próbki surowicy i surowicę referencyjną należy inaktywować termicznie w łaźni wodnej w temperaturze 56 °C przez 30 minut przed użyciem. Przygotuj rozcieńczenia zgodnie z szablonem płytki (Rysunek 4).
      2. Przygotować rozcieńczenie REF w stosunku 1:100. Przygotować co najmniej 110 μl REF rozcieńczonego w DMEM + długopis/paciorkowiec bez FCS na płytkę testową (np. 1,5 μl REF w całkowitej objętości 150 μL). Dodać 110 μl rozcieńczonego REF w stosunku 1:100 do dołka A12 sterylnej płytki z 96-dołkowym dnem w kształcie litery U.
      3. Dodać 55 μl DMEM + wstrzykiwacz/paciorkowiec bez FCS do studzienek B12 do H12 w kolumnie 12. Wykonać seryjne rozcieńczenia 1:2 w dół płytki, przenosząc 55 μl z rzędu A do rzędu B, mieszając roztwór przez pipetowanie zawartości w górę i w dół 5 razy i kontynuując do rzędu H. Odrzucić ostatnie 55 μl pożywki, tak aby końcowa objętość w każdym dołku wynosiła 55 μl. Do każdego rozcieńczenia należy stosować nowe końcówki.
      4. Przygotować próbki do badania surowicy w rozcieńczeniu 1:100. Ponieważ wszystkie próbki surowicy są oznaczane w trzech egzemplarzach, należy przygotować minimalną objętość 110 μl/basenik x 3 = 330 μl na próbkę testową surowicy.
      5. Dodać 110 μl każdej rozcieńczonej próbki testowej surowicy (1:100; S1 = surowica 1, S2 = surowica 2 itd.) do odpowiednich dołków od A1 do A9, a także od E1 do E9 96-dołkowej sterylnej płytki zgodnie z Rysunek 4.
      6. Dodać 55 μl DMEM + wstrzykiwacz/paciorkowiec bez FCS do wszystkich studzienek oznaczonych X. Wykonać seryjne rozcieńczenia 1:2 zgodnie z krokiem 2.2.1.3 do rzędu D (dla próbek 1, 2 i 3). Odrzucić ostatnie 55 μl pożywki, tak aby końcowa objętość w każdym studzience wynosiła 55 μl. Podobnie przeprowadzić seryjne rozcieńczenia 1:2 dla próbek 4, 5 i 6 dla rzędów od E do H.
        nuta: Ważne jest, aby używać nowych końcówek do każdego rozcieńczenia.
      7. Dodać 55 μl DMEM + wstrzykiwacz/paciorkowiec bez FCS do studzienek w kolumnach 10 i 11.
    2. Przygotowanie wirusa
      1. Szybko rozmrozić pojedynczą zamrożoną fiolkę z RSV w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C aż do prawie całkowitego rozmrożenia i natychmiast umieścić na lodzie.
      2. Rozcieńczyć wirusa w DMEM + długopisie/paciorkowca bez FCS w oparciu o stężenie podwielokrotności RSV określone w kroku 1.3.2. Zastosować rozcieńczenie, które daje około 200 PFU/studzienkę. Przygotuj całkowitą objętość 5,5 ml (na 100 dołków).
    3. Przygotowanie mieszaniny wirusa i surowicy
      1. Dodać 55 rozcieńczonego wirusa do wszystkich studzienek w kolumnach 1-9 i studzienek w rzędach E-H w kolumnach 10 i 11 (kontrola dodatnia) zgodnie z szablonem płytki (Rysunek 4).
      2. Dodać 55 DMEM + długopis/paciorkowiec bez FCS do wszystkich studzienek w wierszach A-D kolumn 10 i 11 (kontrola ujemna). Inkubować płytkę przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
    4. Inokulacja wirusa do komórek A549
      1. Przed zakończeniem okresu inkubacji pobrać płytkę (płytki) komórkowe A549 przygotowane w kroku 2.1.1. Upewnij się, że monowarstwy komórek A549 w płytkach 96-dołkowych są w ~ 80% zlewne.
      2. Wyrzuć podłoże, delikatnie odwracając płytkę i lekko osuszając sterylny, chłonny ręcznik papierowy. Umyj wszystkie studzienki dwukrotnie 100 μl PBS, wyrzuć nadmiar PBS, delikatnie odwracając płytkę i lekko osuszając sterylny, chłonny ręcznik papierowy po każdym myciu. Nie dopuścić do wyschnięcia talerzy.
      3. Przenieść 100 / basenik mieszaniny wirus-surowica do odpowiednich studzienek na płytce komórkowej A549 zgodnie z szablonem płytki Inkubować płytkę przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
      4. Po 1 godzinie, za pomocą pipety, wyjąć 90 / studzienka i dodać 100 wstępnie podgrzanego 1x M199 + 1,5% CMC + 2% FCS + wstrzykiwacz/paciorkowiec. Inkubować płytkę przez 3 dni w temperaturze 37 °C, 5% CO2,
        nuta: Upewnij się, że roztwór jest podgrzany w temperaturze 37 °C przed dodaniem do talerzy.
  3. Opracowanie płytki testowej i analiza (dzień 5)
    1. Sporządzić płytkę mocującą i oznaczającą, wykonując czynności od 1.3.1.1 do 1.3.1.8.
    2. Określ 50% miano neutralizacji
      1. Oznaczyć 50% miano neutralizacji, obliczając proporcjonalną odległość między wzajemnymi rozcieńczeniami surowicy powyżej i poniżej 50% studzienek kontrolnych "bez surowicy" (dodatnia kontrola wirusa - kolumna 10, wiersze E-H).
      2. Policz liczbę PFU (tj. blaszek miażdżycowych) powstałych w wyniku poszczególnych infekcji wirusowych w studzienkach surowicy i bez studzienek kontrolnych surowicy. Obliczyć średnią liczbę PFU w studzienkach kontrolnych bez surowicy i określić wartość 50%.
      3. Zidentyfikować rozcieńczenia surowicy z liczbami, które są bezpośrednio powyżej i poniżej 50% wartości studzienki kontrolnej bez surowicy. Korzystając z wykresu półlogarytmicznego lub szablonu arkusza kalkulacyjnego, wykreśl liczbę PFU na osi x (skala liniowa) i odwrotne rozcieńczenie surowicy na osi y (skala logarytmu10). Narysuj linię między tymi dwoma punktami i odczytaj 50% miano neutralizacji próbek surowicy testowej z tej linii.
        nuta: Arkusz testu RSV PRN (arkusz uzupełniający) służy do określenia 50% miana neutralizacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Miareczkowanie zapasu wirusa przeprowadzono w rozcieńczeniach od 1:10 do 1:108 , aby określić stężenie zapasu wirusa przed testem PRN (reprezentatywne wyniki przedstawiono na Rysunku 5). Z Rysunku 5 wynika, że PFU można wiarygodnie policzyć przy rozcieńczeniach 1:104 oraz 1:105. Obliczono średnią liczbę PFU z trzech powtórzeń w tym samym rozcieńczeniu. Ponieważ średnia liczba plam przy rozcieńczen...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opracowaliśmy i zoptymalizowaliśmy prosty i skuteczny test mikroneutralizacji RSV, który można łatwo dostosować do większości laboratoriów. Test ten jest w stanie zmierzyć zdolność infekcji wirusowej, a także zmierzyć hamowanie infekcji wirusowej przez NAb na poziomie komórkowym za pomocą skomputeryzowanego skanowania obrazu. Zastosowanie platformy obrazowania i specyficznych systemów opartych na przeciwciałach zwiększyło swoistość i czułość wykrywania plamek w porównaniu z tradycyjnymi metodami wykrywania blaszek miażdż...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują wszystkim zaangażowanym uczestnikom. Przyjmujemy do wiadomości Program Wsparcia Infrastruktury Operacyjnej rządu stanu Wiktoria. PVL jest stypendystą stypendium NHMRC Career Development Fellowship.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Cell line
A549ATCCCCL-185dostarczone przez dr Keitha Chappella, University of Queensland
Szczepy wirusowe
RSV A2ATCCVR-1540numer partii 60430286
Reodczynniki
AcetonMerck1000142511
Alexa-Fluor osła anty-kozioł IgG (przechowywany w temperaturze 4 & C)Life TechnologiesA11055
CMC sól sodowa w proszkuSigma-AldrichC5678-500G
DMEM (bez surowicy, 3,7 g / L NaHC, P / S) (przechowywana w temperaturze 4 & stopni; C)Usługi naukowe – Posiewtkankowy MCRI w domu
Surowica cielęca płodu (przechowywana w 50 ml podwielokrotnościach w temperaturze -20 & deg; C)Międzyścieżkoweprzeciwciało SFBS-F
Goat X RSVMerckAB1128
ludzka surowica poliklonalna przeciwko syncytialnemu wirusowi oddechowemu (RSV) (przechowywana w 45 &mikro; L podwielokrotności przy -20 ° C)BEI ResourcesNR-4022Bezpłatne zamówienie za pośrednictwem BEI Resources po rejestracji. Surowica ta należy do panelu ludzkiej surowicy przeciw i immunoglobuliny do RSV (NR-32832)
M199 w proszkuLife Technologies31100035
Roztwór blokujący rozcieńczalnik do mleka (przechowywany w temperaturze 4 & stopni; C)Australian Biosearch50-82-01
Penicylina/Streptomycyna (przechowywana w 6 ml podwielokrotnościach w temperaturze -20 & deg; C)Life Technologies15140122
s.d.H2O z dozownika Milli-QMerckDyspensa wewnętrzna
Sterylny 1x PBS do hodowli (przechowywany w temperaturze 4 & stopni; C)Usługi naukowe – Hodowlatkankowa MCRI w domu Tween
20 polisorbatSigma-Aldrich9005-64-5
Ogólne materiały eksploatacyjne
Stożkowe probówki Falcon (50 ml)Invitro TechnologiesFAL352070
Jednostka filtrująca 0,22 μ m (500 mL)Thermo FisherNAL5660020
Sterylne probówki Eppendorf (1,5 ml)Australia PLAM12400
Sterylne płytki z płaskim dnem (96-dołkowe z pokrywką)Interpath655180
Sterylne płytki dolne w kształcie litery U (96-dołkowe z pokrywką)Pipeta650180
mlSigma-AldrichCLS4487-200EA
Pipeta serologiczna 10 mlInterpath607180
Pipeta serologiczna 25 mlSigma-AldrichCLS4251-200EA
Pipeta z końcówką 1-200 µ L Clear Maxymum Recovery Racked Wstępnie sterylizowane 10 STOJAKÓW x 96 KOŃCÓWEK PKG960Fisher BiotecTF-200-L-R-S
Pipeta z końcówką 5-20 i mikro; L Clear Maxymum Recovery Racked Wstępnie sterylizowane 10 STOJAKÓW x 96 KOŃCÓWEK PKG960Fisher BiotecTF-20-L-R-S
100-1,000 i mikro; LClear Maxymum Recovery Racked Wstępnie sterylizowane 10RACKS x 100TIPS PKG1000Fisher BiotecTF-1000-L-R-S
Pipeta z końcówką 1-10 i mikro; L Clear Maxymum Recovery Racked Wstępnie sterylizowany 10RACKS x 100TIPS PKG1001Fisher BiotecTXLF-10-L-R-S
Sprzęt i oprogramowanie
System czytników ELISpotAID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Niemcy
Oprogramowanie AID ELISpot w wersji 5.0AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Niemcy
Program Microsoft Excel 2007
serologiczna Interpath 5 Pipeta z końcówką

Bibliografia

  1. Shi, T., et al. Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study. Lancet. 390 (10098), 946-958 (2017).
  2. Modjarrad, K., et al. WHO consultation on Respiratory Syncytial Virus Vaccine Development Report from a World Health Organization Meeting held on 23-24 March 2015. Vaccine. 34 (2), 190-197 (2016).
  3. Giersing, B. K., Karron, R. A., Vekemans, J., Kaslow, D. C., Moorthy, V. S. Meeting report: WHO consultation on Respiratory Syncytial Virus (RSV) vaccine development, Geneva, 25-26 April 2016. Vaccine. , (2017).
  4. Mazur, N. I., et al. The respiratory syncytial virus vaccine landscape: lessons from the graveyard and promising candidates. Lancet Infect Diseases. 18 (10), e295-e311 (2018).
  5. Hosken, N., et al. A multi-laboratory study of diverse RSV neutralization assays indicates feasibility for harmonization with an international standard. Vaccine. 35 (23), 3082-3088 (2017).
  6. Zielinska, E., et al. Development of an improved microneutralization assay for respiratory syncytial virus by automated plaque counting using imaging analysis. Virology Journal. 2, 84(2005).
  7. van Remmerden, Y., et al. An improved respiratory syncytial virus neutralization assay based on the detection of green fluorescent protein expression and automated plaque counting. Virology Journal. 9, 253(2012).
  8. Varada, J. C., et al. A neutralization assay for respiratory syncytial virus using a quantitative PCR-based endpoint assessment. Virology Journal. 10, 195(2013).
  9. Tripp, R. A., Jorquera, P. A. Human respiratory syncytial virus: methods and protocols. , Humana Press. (2016).
  10. Suara, R. O., et al. Prevalence of neutralizing antibody to respiratory syncytial virus in sera from mothers and newborns residing in the Gambia and in The United States. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 3 (4), 477-479 (1996).
  11. McDonald, J. U., Rigsby, P., Dougall, T., Engelhardt, O. Report on the WHO collaborative study to establish the 1st International Standard for antiserum to Respiratory Syncytial Virus. , Available from: http://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/260488/WHO-BS-2017.2318-eng.pdf?sequence=1&isAllowed=y (2017).
  12. Wang, J. W., et al. Measurement of neutralizing serum antibodies of patients vaccinated with human papillomavirus L1 or L2-based immunogens using furin-cleaved HPV Pseudovirions. PLoS One. 9 (7), e101576(2014).
  13. Magnus, C., Reh, L., Trkola, A. HIV-1 resistance to neutralizing antibodies: Determination of antibody concentrations leading to escape mutant evolution. Virus Research. 218, 57-70 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Test neutralizacji RSVtest oparty na obrazowaniuRSV podgrupa ARSV podgrupa Brozcie czenie surowicyprzygotowanie zapasu wirusatest redukcji plack wzautomatyzowany czytnik plamekanaliza wykresu p logarytmicznego

Powiązane artykuły