Pomiar przebudowy kości i odtworzenie mikrośrodowiska guz-kość przy użyciu kokultury kalwarii i histomorfometrii

Summary

Hodowla ex vivo eksplantatów kostnych może być cennym narzędziem do badania fizjologii kości i potencjalnej oceny leków w przebudowie kości i chorobach kości. Prezentowany protokół opisuje przygotowanie i hodowlę kalwarii wyizolowanych z czaszek nowonarodzonych myszy, a także jej zastosowania.

Abstract

Kość to tkanka łączna składająca się z osteoblastów, osteocytów i osteoklastów oraz zmineralizowanej macierzy zewnątrzkomórkowej, co nadaje jej wytrzymałość i elastyczność oraz pozwala spełniać jej funkcje. Kość jest stale narażona na różnorodne bodźce, które w stanach patologicznych mogą deregulować przebudowę kości. Aby zbadać biologię i choroby kości oraz ocenić potencjalne środki terapeutyczne, konieczne było opracowanie modeli in vitro i in vivo.

Ten manuskrypt opisuje proces preparacji i warunki hodowli kalwarii wyizolowanych od noworodków myszy w celu zbadania procesu tworzenia kości i mikrośrodowiska guza kości. W przeciwieństwie do modeli in vitro i in vivo, ten model ex vivo pozwala na zachowanie trójwymiarowego środowiska tkanki, a także różnorodności komórkowej kości podczas hodowli w określonych warunkach w celu symulacji pożądanego mikrośrodowiska. W związku z tym możliwe jest zbadanie przebudowy kości i jej mechanizmów, a także interakcji z innymi typami komórek, takich jak interakcje między komórkami nowotworowymi a kością.

Testy opisane tutaj używają kalwarii od 5-7 dniowych myszy BALB/C. Uzyskane półkawarie są hodowane w obecności insuliny, komórek raka piersi (MDA-MB-231) lub kondycjonowanej pożywki z hodowli komórek raka piersi. Po analizie ustalono, że insulina indukuje tworzenie nowych kości, podczas gdy komórki nowotworowe i ich kondycjonowane podłoże indukują resorpcję kości. Model kalwaryczny jest z powodzeniem stosowany w badaniach podstawowych i stosowanych do badania rozwoju kości i chorób kości wywołanych rakiem. Ogólnie rzecz biorąc, jest to doskonała opcja do łatwego, pouczającego i taniego testu.

Introduction

Kość to dynamiczna tkanka łączna, która pełni kilka funkcji, w tym wspieranie mięśni, ochronę narządów wewnętrznych i szpiku kostnego oraz magazynowanie i uwalnianie wapnia i czynników wzrostu^1,2. Aby zachować swoją integralność i prawidłowe funkcjonowanie, tkanka kostna jest stale poddawana procesowi przebudowy. Ogólnie rzecz biorąc, cykl przebudowy kości można podzielić na resorpcję kości i tworzenie kości¹. Brak równowagi między tymi dwiema fazami przebudowy kości może prowadzić do rozwoju patologii kości. Ponadto choroby takie jak rak piersi często wpływają na integralność kości; Około 70% pacjentów w zaawansowanych stadiach ma lub będzie miało przerzuty do kości. Kiedy komórki raka piersi dostają się do kości, wpływają na metabolizm kostny, powodując nadmierną resorpcję (zmiany osteoklastyczne) i/lub powstawanie (zmiany osteoblastyczne)³.

Aby zrozumieć biologię chorób kości i opracować nowe metody leczenia, konieczne jest zrozumienie mechanizmów związanych z przebudową kości. W badaniach nad rakiem konieczne jest zbadanie procesu przerzutów do kości i jego związku z mikrośrodowiskiem przerzutowym. W 1889 roku Stephen Paget wysunął hipotezę, że przerzuty występują, gdy istnieje zgodność między komórkami nowotworowymi a tkanką docelową i zasugerował, że miejsce przerzutu zależy od powinowactwa guza do mikrośrodowiska⁴. W 1997 roku Mundy i Guise wprowadzili koncepcję "błędnego koła przerzutów do kości", aby wyjaśnić, w jaki sposób komórki nowotworowe modyfikują mikrośrodowisko kości, aby osiągnąć swoje przetrwanie i wzrost, oraz jak mikrośrodowisko kości sprzyja ich wzrostowi, dostarczając wapń i czynniki wzrostu^5,6,7.

Aby scharakteryzować mechanizmy związane z przebudową kości i przerzutami do kości oraz ocenić cząsteczki o możliwym potencjale terapeutycznym, konieczne było opracowanie modeli in vitro i in vivo. Jednak modele te mają obecnie wiele ograniczeń, takich jak uproszczona reprezentacja mikrośrodowiska kości i ich koszt^8,9. Hodowla eksplantatów kostnych ex vivo ma tę zaletę, że zachowuje trójwymiarową organizację, a także różnorodność komórek kostnych. Ponadto można kontrolować warunki eksperymentalne. Modele eksplantatów obejmują hodowlę kości śródstopia, głów kości udowych, kalwarii oraz rdzeni żuchwy lub beleczkowania¹⁰. Zalety modeli ex vivo zostały wykazane w różnych badaniach. W 2009 roku Nordstrand i jego współpracownicy poinformowali o stworzeniu modelu kokultury opartego na interakcjach między komórkami raka kości i prostaty¹¹. Również w 2012 roku Curtin i współpracownicy poinformowali o opracowaniu trójwymiarowego modelu przy użyciu kokultur ex vivo¹². Celem takich modeli ex vivo jest jak najdokładniejsze odtworzenie warunków mikrośrodowiska kości, aby móc scharakteryzować mechanizmy zaangażowane w normalną lub patologiczną przebudowę kości i ocenić skuteczność nowych środków terapeutycznych.

Obecny protokół opiera się na procedurach opublikowanych przez Garrett¹³ oraz Mohammad et al.¹⁴. Hodowle kalwarii nowonarodzonych myszy zostały wykorzystane jako model eksperymentalny, ponieważ zachowują trójwymiarową architekturę rozwijanej kości i komórki kostne, w tym komórki na wszystkich etapach różnicowania (tj. osteoblasty, osteoklasty, osteocyty, komórki zrębu), które prowadzą do dojrzałych osteoklastów i osteoblastów, a także zmineralizowaną matrix¹⁴. Model ex vivo nie reprezentuje całkowicie patologicznego procesu chorób kości. Jednak wpływ na przebudowę kości lub osteolizę kości wywołaną rakiem można dokładnie zmierzyć.

Krótko mówiąc, ten protokół składa się z następujących kroków: preparacja kalwarii od 5-7 dniowych myszy, prekultura kalwarii, zastosowania hodowli kalwaryjskiej (np. hodowla w obecności insuliny, komórek rakowych lub kondycjonowanej pożywki, a nawet środków o potencjale terapeutycznym, zgodnie z celem badania), utrwalenie kości i odwapnienie kalwarii, przetwarzanie tkanek, analiza histologiczna, i interpretacja wyników.

Protocol

Wszystkie myszy użyte w tych testach zostały uzyskane ze szczepów myszy BALB/c, używając myszy męskich i żeńskich bezkrytycznie. Poprzednie eksperymenty hodowlane przeprowadzono również przy użyciu innych szczepów, takich jak FVB, myszy szwajcarskie, CD-1 i myszy CsA^11,12,14. Wszystkie myszy były trzymane zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health (NIH), Załącznik Q. Procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) w Centrum Badań Naukowych i Szkolnictwa Wyższego w Ensenadzie (CICESE).

1. Rozwarstwienie kości kalwarycznej

1. Sterylizuj narzędzia preparacyjne (np. kleszczyki do tkanek z 1 x 2 zębami, proste nożyczki chirurgiczne, nożyczki preparacyjne, pęseta z cienką końcówką, kleszcze preparacyjne z cienką zakrzywioną końcówką, kleszcze preparacyjne, skalpel). Sterylna woda destylowana może być używana do czyszczenia narzędzi chirurgicznych między każdym rozwarstwieniem, a sterylna 1x PBS może być używana do czyszczenia każdej półkuli.
2. Umieść sterylne narzędzia do preparacji, wodę, 1x PBS i materiały wymagane do przeprowadzenia procedury (np. mikropipety, szklanki do wytrącania, sterylne szalki Petriego) w okapie z przepływem laminarnym.
   UWAGA: Całą procedurę należy przeprowadzić w sterylnych warunkach.
3. Dodaj 12 ml sterylnego 1x PBS do dwóch 10 cm szalek Petriego.
4. Wybierz szczenięta i umieść je w pobliżu kaptura.
   UWAGA: Wypreparuj kalwarie od 5-7 dniowych szczeniąt.
5. Ostrożnie podnieś i przytrzymaj mysz za pomocą kleszczy preparacyjnych.
6. Odetnij głowę myszy za pomocą nożyczek preparacyjnych i umieść głowę na szalce Petriego za pomocą PBS.
   UWAGA: Dekapitacja nie jest odpowiednia dla starszych myszy. Jeśli doświadczenie musi być przeprowadzone na starszych myszach, metoda eutanazji powinna zostać zmodyfikowana zgodnie z zasadami eksperymentów na zwierzętach.
7. Przytrzymaj mocno głowę za okolice nosa za pomocą kleszczy do tkanek 1 x 2 zęby i usuń skórę nad czaszką, aż kalwaria będzie widoczna.
8. Zidentyfikuj szwy (tj. strzałkowe, czołowe i lambdoidalne) czaszki na odsłoniętej kalwarii.
9. Wbić końcówką mikronożyczek około 2 mm za szew lambdoidalny i wykonać proste cięcie wzdłuż niego.
10. Włóż końcówkę mikronożyczek w tylną stronę czaszki. Wykonaj proste cięcie wzdłuż dystalnej strony szwu lambdoidalnego w kierunku szwu koronalnego. Podobnie postępować z drugim szwem lambdoidalnym.
11. Wykonaj kolejne cięcie (pod kątem 45°), aby połączyć koniec wykonanego cięcia z nacięciem ciemiączka przedniego.
12. Powtórz kroki 1.10 i 1.11 z drugim szwem lambdoidalnym.
    UWAGA: Ważne jest, aby zidentyfikować szwy, aby wykonać odpowiednie nacięcia i móc wykonać odpowiednie osadzenie i analizę danych.
13. Użyj kleszczyków z cienką końcówką, aby usunąć kalwarię i umieść ją na szalce Petriego. Za pomocą skalpela wykonaj proste cięcie od tylnego ciemiączka wzdłuż szwu strzałkowego przez szew koronalny i kończąc na ciemiączku przednim, aby uzyskać dwie półkalwarie.
14. Podnieś każdą z półwarii za pomocą pęsety z cienką końcówką i umieść ją na nowej szalce Petriego zawierającej PBS.

2. Kultura Kalwarii

1. Dodaj 1 ml pożywki DMEM o wysokiej zawartości glukozy uzupełnionej 0,1% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) i 1% antybiotykiem/antybiotykiem (tj. penicyliną i streptomycyną) do studzienek na płytce 24-dołkowej. Za pomocą kleszczyków z cienką końcówką podnieś każdą półkulwarię i umieść ją w studzience.
   UWAGA: Połóż półkawarię wklęsłą stroną do dołu.
2. Inkubować półkulwarie przez 24 godziny w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ .
3. Usunąć pożywkę hodowlaną z każdej studzienki i dodać 1 ml świeżej pożywki zawierającej związek do badania lub kondycjonowania pożywki z innych komórek.
   UWAGA: Stosować co najmniej trzy półkuloryczne dla każdej grupy badanej i stosować kontrole ujemne i pozytywne.
4. Inkubuj półkulwarie przez 7 dni, zmieniając pożywkę co 2-3 dni.

3. Hodowla z komórkami rakowymi

1. Wybierz szalkę Petriego z komórkami rakowymi o zbiegu 80-90% i trypsynizuj je. Aby poddać próbie pupsynizację, przemyj komórki rakowe 1x za pomocą PBS (5 ml na 75 cm² kolby), a następnie inkubuj w roztworze HBSS zawierającym 0,05% trypsyny i 0,53 mM EDTA (2 ml na 75 cm² kolba).
2. Przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 800 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT).
3. Usunąć i wyrzucić sklarowany osad.
4. Zawiesić osad w 2 ml DMEM zawierającym 2% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% antybiotyku/antybiotyku/antybiotyku. Policz żywe komórki.
5. Przypisz półwarie do każdej grupy badanej (tj. grupy kontroli negatywnej i kokultury do analizy RNA lub histologicznej).
6. Usuń pożywkę hodowlaną z półkalwarii i dodaj 1 ml DMEM zawierającego 2% FBS i 1% antybiotyku/antybiotyku uzupełnionego lub nieuzupełnionego komórkami rakowymi.
   UWAGA: Ilość komórek do dodania może się zmieniać w zależności od testowanej linii komórkowej. W przypadku komórek rakowych, takich jak MDA-MB-231 lub PC-3, 500 000 komórek na studnię działa prawidłowo.
7. Inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ . Przełóż każdą półkulę kalwaryczną do nowej studzienki, aby zatrzymać tylko komórki rakowe, które przylegały do tkanki kostnej.
8. Inkubować przez 7 dni w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ i zmieniać pożywkę co 2-3 dni.

4. Fiksacja

1. Wytnij kwadraty bibuły, aby owinąć półkulwarię.
   UWAGA: Można również stosować podkładki piankowe do biopsji lub stalowe kapsułki do małych biopsji.
2. Użyj prostych kleszczyków z cienką końcówką, aby podnieść każdą pół-kalwarię ze szwu strzałkowego, umieść na bibułce i zawiń.
3. Umieść owiniętą półkalwarię w oznaczonej kasecie do zatapiania.
4. Umieść kasetę w pojemniku z 10% formaliną buforowaną fosforanami.
5. Utrwalać na 24 h w temperaturze 4 °C.

5. Odwapnienie

1. Usuń formalinę, dodaj 1x PBS i mieszaj tkanki przez 30 minut, aby spłukać półkulory.
2. Usunąć PBS i dodać 10% EDTA (pH = 8, 0,34 M).
   UWAGA: Sprawdź, czy roztwór całkowicie pokrywa tkanki.
3. Odwapniać tkanki przez 48 godzin w temperaturze 4 °C.
4. Wyrzuć roztwór EDTA i dodaj 1x PBS, aby przepłukać tkankę.
5. Przechowuj półkulwarie w 70% etanolu do czasu przetwarzania histologicznego.

6. Przetwarzanie tkanek

1. Odwodnić tkanki krążkami 96% etanolu, 60 min (3x), a następnie 100% etanolem, 60 min (3x).
2. Zastąp etanol 100% ksylenem, 60 min (3x).
3. Inkubować kasety w wosku parafinowym, 60 min (2x).

7. Osadzanie

1. Otwórz kasety, ostrożnie wyjmij bibułę i rozwiń kalwarię.
2. Ostrożnie podnieś każdą kalwarię i ułóż wszystkie półkulwarie z tej samej grupy w tej samej orientacji.
3. Wlej trochę parafiny do formy.
4. Podnieś wszystkie połowicze za pomocą kleszczy i umieść je w formie szwem strzałkowym w dół w kierunku podstawy formy.
   UWAGA: Orientacja połowiczo-kalabwarii w pleśni podczas włączania ma kluczowe znaczenie dla uzyskania spójnych przekrojów histologicznych i powtarzalnych wyników, ponieważ ta orientacja pozwoli na tylną identyfikację kości przedniej i ciemieniowej od kalwarii oraz szwu koronalnego, ułatwiając ocenę ilościową.
5. Zwolnij kleszcze i sprawdź, czy półkawaria pozostaje na swoim miejscu.
6. Umieść oznaczoną kasetę na wierzchu formy i napełnij ją większą ilością parafiny, aby pokryć półkulwarię.
7. Przenieś foremki na zimną powierzchnię.

8. Podział na sekcje

1. Przyciąć 500-600 μm szwu strzałkowego za pomocą mikrotomu.
2. Wytnij odcinki o grubości 4 μm i zbierz potrzebne sekcje.
3. Przytnij kolejne 300 μm.
4. Wytnij i zbierz kolejne sześć odcinków o grubości 4 μm.
5. Przytnij blok o 300 μm dalej i zbierz więcej sekcji.
6. Zamontuj sekcje na szklanych szkiełkach mikroskopowych.
7. Wysuszyć szkiełka w temperaturze RT.

9. Barwienie

1. Zanurz sekcje w 100% ksylenie na 3 minuty.
2. Zanurz w 100% etanolu na 1 min.
3. Mieszaj z 96% etanolem przez 1 minutę.
4. Zanurz w 80% etanolu na 1 min.
5. Zanurz w 70% etanolu na 1 min.
6. Płukać w wodzie przez 3 min.
7. Zanurz w hematoksylinie na 3 minuty.
8. Spłucz w wodzie, aż sekcja będzie czysta.
9. Zanurzyć w nasyconym roztworze węglanu litu na 10 sekund.
10. Płukać w wodzie przez 3 min.
11. Zanurz w 96% etanolu na 1 min.
12. Zanurz się w eozynie na 3 minuty.
13. Zanurz w 96% etanolu na 1 min.
14. Zanurz w 100% etanolu na 1 min.
15. Zanurz w 100% ksylenie na 3 minuty.
16. Dodaj trochę na nośnik do montażu na suwaku i zabezpiecz go szkiełkiem nakrywkowym.
    UWAGA: Barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E) można uzupełnić barwieniem kwaśną fosfatazą odporną na winian (TRAP) w celu oceny osteoklastów i osteolizy.

10. Ocena ilościowa: definiowanie obszaru do analizy

1. Zbadaj skrawki pod niską mocą (tj. 4x), aby określić orientację i szwy.
2. Zdefiniuj szew koronalny i zidentyfikuj długą powierzchnię kości po jednej stronie i krótką powierzchnię po drugiej.
3. Zidentyfikuj szew koronalny pod 40-krotnym powiększeniem i odsuń dwa lub trzy pola optyczne od szwu wzdłuż długiej powierzchni. Zrób zdjęcia tego obszaru do analizy.
4. Zdefiniuj stary obszar kości i nowy obszar kości. Eozyna Y z pomarańczowym G barwi starą kość na ciemniej, a nową kość jaśniej
.
5. Zmierz całkowitą powierzchnię starej i nowej kości za pomocą oprogramowania Image J za pomocą narzędzia do pomiaru progu kolorów. Wyraż wyniki jako μm².

11. Analiza danych

1. Analizuj wyniki za pomocą oprogramowania statystycznego. Istotne różnice między grupami można określić za pomocą odpowiednich testów (np. nieparametrycznego testu U Manna-Whitneya, jak to jest wykonywane tutaj).

Results

Aby ocenić tworzenie się kości w modelu kalwarycznym, uprawialiśmy półkulwarię w pożywce z lub bez 50 μg/ml insuliny. Wycinki tkanek przygotowano i wybarwiono preparatem H&E. W tych warunkach histologia wykazała, że integralność strukturalna kości calwarialnej została zachowana, co pozwoliło na identyfikację jej różnych składników (Ryc. 1). Kalwaria leczona insuliną wykazywała wzrost ilości tkanki kostnej w porównaniu z grupą kontrolną (Rysunek ...

Discussion

W tym miejscu opisujemy protokół dla kalwaryjnego modelu ex vivo do oceny tworzenia lub resorpcji kości oraz do badania interakcji komórek rakowych z kością myszy kalwarycznej. Krytycznymi etapami tej techniki są sekcja, hodowla, osadzanie i analiza histomorfometryczna kalwarii. Podczas preparowania kalwarii kluczowe jest pocięcie półkalwarii na trapez, ponieważ znacznie ułatwi to orientację podczas wtrącania parafiny. Podczas badania interakcji komórek rakowych z kalwarią ważne jest, aby używać płytek wielodołk...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-dołkowa hodowla komórkowa	Corning	CLS3524
24-dołkowa hodowla nietkankowa	Falcon	15705-060
2 mL cryovial	SSI	2341-S0S
	Corning	30-004-CI
BSA	Biowest	P6154-100GR
Wirówka	Eppendorf	22628188	Wirówka 5810R
Szkiełka nakrywkowe	Corning	2935-24X50
Żywica Cytoseal	Richard Allen	8310-10
DMSO		D2650-100ML
Modyfikacja Dulbecco's Eagles Medium, z 4,5 g/L glukozy i L-glutaminą, bez pirogronianu sodu	Corning	10-017-CV
Dulbecco's PBS (10X)	Corning	20-031-CV
Kasety do ebedingu	Sigma	Z672122-500EA
EDTA	Złota	26400
Stacja robocza do zatapiania	Thermo Scientific A81000001
Eosin	Golden	60600
Absolut etanolu	JALMEK	E5325-17P
Surowica bydlęca	płodu Biowest	BIO-S1650-500
Filtry	Corning	CLS431229
Kleszcze i nożyczki	LANCETA HG	74165
Formalina buforowana 10%	Sigma	HT501320
Szkiełka szklane 25 x 75 mm	Premiere	9105
Harris's Hematoxylin	Jalmek	SH025-13
Ostrza wysokoprofilowe	Thermo Scientific	1001259
Histoquinet	Thermo Scientific	813150	STP 120
Insulina z trzustki bydlęcej	Sigma	16634
Mikroskop	ZEISS	Axio Scope.A1
Microtome	Thermo Scientific	905200	MICROM HM 355S
Karma dla myszy, 18% prot, 2018S	Harlan	T.2018S.15
Neubauer	VWR	631-0696
Pomarańczowy G	Biobasic	OB0674-25G
Parafina	Paraplast	39601006
Sekcja parafinowa Kąpiel flotacyjna	Elektrotermiczna	MH8517X1
szalka Petriego	Corning	CLS430167
Floksyna B	Probiotek	166-02072
Trypan Blue	Sigma	T8154
Trypsin-EDTA	Corning	25-051-CI
Dozownik wosku	Elektrotermiczny	MH8523BX1
Ksylen	Złoty	534056-500ML