W pełni autonomiczna charakterystyka i zbieranie danych z kryształów makrocząsteczek biologicznych

Summary

Tutaj opisujemy, jak korzystać z opcji automatycznego badania przesiewowego i zbierania danych dostępnych na niektórych liniach synchrotronowych. Naukowcy wysyłają próbki chłodzone kriogenicznie do synchrotronu, gdzie badane są właściwości dyfrakcyjne, zestawy danych są zbierane i przetwarzane, a tam, gdzie to możliwe, przeprowadzane jest rozwiązanie strukturalne – a wszystko to bez interwencji człowieka.

Abstract

Promienie rentgenowskie o wysokiej jasności w połączeniu z automatyzacją doprowadziły do wykorzystania linii badawczych makromolekularnej krystalografii rentgenowskiej (MX) opartych na synchrotronie nawet do najbardziej wymagających projektów w biologii strukturalnej. Jednak większość obiektów nadal wymaga obecności naukowca na miejscu w celu przeprowadzenia eksperymentów. Niedawno opracowano nową generację zautomatyzowanych linii badawczych przeznaczonych do w pełni automatycznego charakteryzowania i zbierania danych z kryształów makrocząsteczek biologicznych. Te linie badawcze stanowią nowe narzędzie dla biologów strukturalnych do badania przesiewowego wyników wstępnych prób krystalizacji i/lub gromadzenia dużej liczby zestawów danych dyfrakcyjnych, bez konieczności samodzielnego kontrolowania linii badawczej przez użytkowników. Tutaj pokazujemy, jak skonfigurować eksperyment do automatycznego badania przesiewowego i zbierania danych, jak przeprowadza się eksperyment na linii badawczej, jak przetwarzane są wynikowe zestawy danych oraz jak, jeśli to możliwe, rozwiązuje się strukturę krystaliczną makrocząsteczki biologicznej.

Introduction

Określenie trójwymiarowej struktury określonych białek jest kluczowe w biologii. Uzyskane w ten sposób informacje rzucają światło na funkcję biologiczną oraz na kształt i specyficzność miejsc aktywnych i/lub wiążących zawartych w badanej cząsteczce. W wielu przypadkach pozwala to na określenie mechanizmów działania lub, w stosownych przypadkach, na opracowanie potencjalnych cząsteczek terapeutycznych. MX jest techniką najczęściej stosowaną do uzyskiwania informacji strukturalnych, ale wąskim gardłem jest określenie optymalnych warunków do uzyskania dobrze dyfrakcyjnych kryształów. Dlatego próby krystalizacji są przeprowadzane w wielu różnych warunkach, a następnie są przesiewane, aby znaleźć najlepsze kryształy do wykorzystania do zbierania danych dyfrakcyjnych. Automatyzacja konfiguracji prób krystalizacji ¹ wyraźnie pomogła w tym względzie. Jednak kolejne etapy (tj. montaż kryształów, badanie dyfrakcyjne i zbieranie danych dyfrakcyjnych) są zwykle wykonywane ręcznie, co zajmuje dużo czasu, wysiłku i zasobów. Automatyzacja badań przesiewowych dyfrakcyjnych i gromadzenia danych oznaczałaby zatem ogromny przyrost czasu i efektywność.

Badania dyfrakcyjne i zbieranie danych w MX są najczęściej przeprowadzane na synchrotronowych liniach badawczych MX, na których automatyzacja znacznie ułatwiła ten proces. Jednak w większości przypadków konieczne jest, aby naukowiec był obecny na linii badawczej podczas eksperymentu lub obsługiwał ją zdalnie. Niedawno opracowano nową generację całkowicie zautomatyzowanych linii badawczych MX². W tym przypadku użytkownicy nie muszą być obecni, ani fizycznie, ani zdalnie, podczas sesji eksperymentalnej. Dzięki temu naukowcy mogą spędzać więcej czasu na mniej rutynowych zadaniach, zamiast spędzać całe dni, a często noce, na badaniu kryształów i zbieraniu danych dyfrakcyjnych. Pierwszą na świecie w pełni zautomatyzowaną linią badawczą jest Massively Automated Sample Selection Integrated Facility (MASSIF-1, ID30A-1)^2,3 w Europejskim Ośrodku Promieniowania Synchrotronowego (ESRF). Ma unikalne środowisko próbkowania, w którym dewar o dużej pojemności zawiera próbkę działa w tandemie z robotycznym zmieniaczem próbek, który działa również jako goniometr linii badawczej^4,5. MASSIF-1 to falująca linia badawcza wyposażona w hybrydowy detektor pikseli zliczający pojedyncze fotony⁶, który działa na stałej długości fali 0,969 A (12,84 keV) z intensywną wiązką promieniowania rentgenowskiego (2 x 10¹² fotonów/s). Wielkość wiązki w miejscu pobierania próbki można regulować w zakresie od minimum 10 μm (wiązka okrągła) do maksimum 100 μm x 65 μm (wielkość wiązki poziomej przez pionową). Średnio linia badawcza może przetworzyć, w sposób całkowicie automatyczny (patrz poniżej), 120 kryształów w ciągu 24 godzin. Działanie linii badawczej opiera się na serii przepływów pracy⁷, z których każdy podejmuje inteligentne decyzje w oparciu o wynik poprzednich kroków w przepływie pracy, aby zapewnić pomiar jak najlepszych danych z badanej próby. W szczególności ocena charakterystyki dyfrakcyjnej pojedynczej próbki uwzględnia objętość i strumień kryształów oraz zapewnia, w przypadku gdy kryształ jest większy niż wiązka promieniowania rentgenowskiego, do późniejszego gromadzenia danych wykorzystywany jest tylko najlepszy obszar kryształu. Zestawy danych dyfrakcyjnych są zatem zoptymalizowane pod kątem maksymalnej rozdzielczości przy zminimalizowanych uszkodzeniach spowodowanych promieniowaniem^2,3. Dostępne są również wymagające protokoły zbierania danych, takie jak strategie zbierania danych pseudo-helikalnych (wielopozycyjnych) zarówno dla natywnego, jak i jednofalowego dyfrakcji anomalnej (SAD), są również dostępne⁸.

Całkowicie automatyczne eksperymenty w MASSIF-1 polegają na kriochłodzeniu i montażu kryształów na magnetycznym uchwycie próbki odpowiednim dla pożądanego wyposażenia linii badawczej standardowe piny SPINE⁹, wprowadzając pożądane parametry eksperymentalne do tabeli 'plan dyfrakcji' w Zintegrowanym Systemie Krystalografii Białek (ISPyB)¹⁰, internetowy system zarządzania informacjami dla eksperymentów MX i wysyłania próbek na linię badawczą. W ESRF wszystkie koszty transportu próbek do/z linii badawczej są pokrywane przez Biuro Użytkownika ESRF (szczegóły na stronie ESRF¹¹). W MASSIF-1 nie ma żadnych ograniczeń co do rozmiaru pętli ani jakości kryształów. Wybierając plan dyfrakcji dla danego kryształu, użytkownik może skorzystać z ustawień domyślnych lub wybrać jeden z określonych przepływów pracy, które można dostosować do każdej próbki. Dostępnych jest kilka wstępnie zaprogramowanych przepływów pracy. W przepływie pracy MXPressE³ pętla zawierająca próbkę jest najpierw wyrównywana do pozycji próbki za pomocą centrowania optycznego. Następnie centrowanie oparte na promieniowaniu rentgenowskim zapewnia, że najlepszy obszar kryształu jest wyśrodkowany do wiązki promieniowania rentgenowskiego. Strategie gromadzenia danych są następnie obliczane przy użyciu eEDNA, platformy do tworzenia aplikacji opartych na wtyczkach, specjalnie do analizy danych online w dziedzinie eksperymentów rentgenowskich, biorąc pod uwagę objętość kryształów i strumień w czasie rzeczywistym na linii badawczej. Po zebraniu pełnego zestawu danych dyfrakcyjnych, jest on następnie przetwarzany za pomocą serii automatycznych potoków przetwarzania danych¹², a wyniki są udostępniane do wglądu i pobierania w ISPyB. Przepływ pracy MXPressE SAD³ jest ukierunkowany na kryształy białka docelowego zawierające selenometioninę i wykorzystuje fakt, że energia robocza MASSIF-1 znajduje się tuż powyżej krawędzi Se K. W tym przypadku strategia zbierania danych MXPressE eEDNA jest zoptymalizowana pod kątem gromadzenia danych SAD (tj. wysoka redundancja i rozdzielczość ustawiona na miejsce, w którym_połączenie R między parami Bijvoet wynosi poniżej 5%). Aby przebadać właściwości dyfrakcyjne serii kryształów bez późniejszego zbierania danych, można użyć przepływu pracy MXScore³ w celu uzyskania pełnej oceny jakości analizowanych kryształów. W przepływie pracy MXPressI³ dane obrotu 180° są zbierane przy użyciu oscylacji 0,2° i przy użyciu początkowego kąta phi oraz rozdzielczości określonej przez strategię eEDNA. MXPressO³ dołącza wstępnie zaobserwowaną rozdzielczość do przepływu pracy (domyślnie: d_min = 2 A). Aby dokonać wstępnej oceny kryształów powstałych w wyniku próby krystalizacji, oferowany jest przepływ pracy MXPressM³. Wykonuje to skanowanie siatki o wysokiej dawce w najszerszej orientacji nośnika próbki bez zbierania danych lub centrowania. Ostatnio zaimplementowano dwa nowe przepływy pracy eksperymentów, MXPressP i MXPressP_SAD, które wykonują zbieranie danych pseudohelikalnych⁸. Wykonanie wszystkich kroków we wszystkich przepływach pracy może być śledzone online i w czasie rzeczywistym przez użytkownika za pośrednictwem ISPyB.

Tutaj pokazujemy, jak przygotować w pełni zautomatyzowany eksperyment MX w MASSIF-1 oraz jak pobrać i przeanalizować dane wynikające z eksperymentu. Jako przykład używamy ludzkiego białka H (GCSH) systemu cięcia glicyny mitochondrialnej. To białko zawierające kwas liponowy jest częścią systemu rozkładu glicyny odpowiedzialnego za degradację glicyny. System ten obejmuje ponadto białko P, dekarboksylazę glicyny zależną od fosforanu pirydoksalu, białko T, enzym wymagający tetrahydrofolianu oraz białko L, dehydrogenazę lipoamidową. GCSH przenosi grupę metyloaminową glicyny z białka P do białka T. Defekty białka H są przyczyną hiperglikemii nieketotycznej (NKH) u ludzi¹³.

Protocol

UWAGA: Produkcja, oczyszczanie i krystalizacja GCSH są opisane w Pliku Uzupełniającym 1.

1. Krótki opis przygotowania offline i montażu kryształów

1. Umieść nylonową pętlę lub inny wspornik montażowy kryształu już przymocowany do kołka SPINE pod jednym lub kilkoma kryształami i wyjmij je z roztworu strącającego (20 μl 0,5 M mrówczanu sodu, pH 4,0 + 25 μl roztworu białkowego).
   1. Usuń płyn luzem wokół kryształu (kryształów), dotykając uchwytu papierowym, aby odessać nadmiar płynu.
2. Zanurz kryształ(y) w roztworze krioprotekcyjnym zawierającym roztwór strącający plus 30% glicerolu; następnie usuń zarówno podporę kryształu, jak i kryształ(y).
   1. Usuń płyn luzem wokół kryształu (kryształów), dotykając uchwytu papierowym, aby odessać nadmiar płynu.
3. Zanurz uchwyt w fiolce SPINE wypełnionej ciekłym azotem i przechowuj go, wraz z innymi podobnie przygotowanymi kryształami, w zmieniaczu próbek Europejskiego Laboratorium Biologii Molekularnej (EMBL)/ESRF puck⁹ w temperaturze ciekłego azotu.
   UWAGA: Kryształ(y) są stabilne w tym stanie, dopóki czas wiązki nie będzie dostępny.

2. Prośba o czas probierczy na MASSIF-1

1. Zapytaj o czas jak najwcześniej na stronie głównej ESRF (pod adresem http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Applying).
   UWAGA: Istnieje kilka możliwych trybów dostępu do linii badawczych ESRF MX. Laboratoria mogą składać zbiorowe wnioski w ramach Grupy Alokacji Blokowej (BAG), aby mieć przydzielony czas badawczy na 2 lata. Jeśli grupy chcą złożyć wniosek indywidualnie, mogą ubiegać się o dostęp rolniczy, który umożliwia im szybki dostęp do linii badawczych po wzajemnej weryfikacji. Propozycja grupy zostanie rozpatrzona i zatwierdzona przez Grupę ds. Bezpieczeństwa ESRF, która może poprosić o dodatkowe szczegóły. Jeśli propozycja zostanie zaakceptowana, zostanie podany numer eksperymentu i hasło. Autorskie badania można przeprowadzić, kupując czas progeński.
2. Ukończ wymagane szkolenie w zakresie bezpieczeństwa online (pod adresem http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Preparing/SafetyTraining).
3. Zarezerwuj czas na czas w kalendarzu MASSIF-1.
   UWAGA: Możliwe jest zarezerwowanie maksymalnie 50 pojemników na próbki do analizy na zmianę.
4. Wypełnij formularz A, aby zadeklarować eksperyment wysyłkowy (http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Preparing/new-a-form), wraz z wymaganymi informacjami dotyczącymi bezpieczeństwa, dla próbek, które mają być mierzone.

3. Tworzenie planu dyfrakcyjnego w ISPyB

UWAGA: Plan dyfrakcji zawiera wszystkie informacje potrzebne do próbki w ISPyB i może zawierać dodatkowe informacje do dostosowania eksperymentu przeprowadzanego dla każdej próbki.

1. Otwórz ISPyB (w https://exi.esrf.fr/).
2. Wybierz Eksperymenty MX.
3. Zaloguj się za pomocą numeru eksperymentu i hasła.
4. Kliknij na Wysyłka | Dodaj nowe i podaj niezbędne informacje. Kliknij Zapisz.
5. Kliknij Dodaj paczkę i wypełnij wymagane informacje. Kliknij Zapisz.
6. Następnie kliknij Dodaj kontener, nadaj kod kreskowy krążka jako nazwę i wybierz opcję SPINE puck. Kliknij Zapisz.
7. Kliknij symbol pojemnika i Edytuj, a następnie wprowadź niezbędne informacje, takie jak nazwa białka, preferowany przepływ pracy, pozycja kryształu w krążku itp., dotyczące próbek.
8. Wybierz białko (na przykład GCSH lub lizozym), które zostało zatwierdzone przez grupę bezpieczeństwa ESRF.
9. Wprowadź unikatową nazwę próbki, aby zidentyfikować każdą pojedynczą próbkę. Opcjonalnie istnieje możliwość zeskanowania kodu kreskowego PIN. Pozostałe informacje poniżej są opcjonalne.
10. Wprowadź informacje opcjonalne.
    1. Dla każdej pojedynczej próbki wprowadź typ eksperymentu (tj. MXPressE_SAD, SCORE lub MXPressO itp., domyślnie MXPressE) w polu Exp. Type. Określa to, który automatyczny przepływ pracy będzie używany do przetwarzania każdego kryształu. Biorąc pod uwagę, że kryształy GCSH są igłami, wybierz MXPressP.
    2. Wprowadź grupę pomieszczeń (na przykład P1, C2 lub P2₁2_{1 21}), jeśli jest znana. Jeśli jest obecny, zostanie on wykorzystany do obliczeń strategii gromadzenia danych oraz przez dostępne potoki automatycznego przetwarzania danych.
    3. Wprowadź żądaną rozdzielczość (domyślnie: d_min = 2.0 A). Określa to odległość od kryształu do detektora dla początkowych skanów siatki, charakterystyki i domyślnego zbierania danych.
    4. Ustaw żądaną rozdzielczość progową (na przykład 1,5 A lub 2,3 A), aby zapobiec zbieraniu pełnych zestawów danych z kryształów, które nie ulegają dyfrakcji do tego limitu. Może to zaoszczędzić miejsce do przechowywania danych i czas analizy.
    5. Ustawia wymaganą kompletność (domyślnie: 0,99). Ustawia wymaganą krotność (domyślnie: 4). Jeśli na nośniku próbki znajduje się więcej niż jeden kryształ, należy ustawić maksymalną liczbę kryształów do analizy. Wartość domyślna to 1 lub 5 dla MXPressP.
    6. Wybierz odpowiedni rozmiar wiązki (domyślnie: 50 μm). Jeśli określona wartość nie zostanie wybrana, obliczenia strategii centrowania promieniowania rentgenowskiego i zbierania danych zostaną przeprowadzone przy rozmiarze wiązki 50 μm.
       UWAGA: Podczas każdego kolejnego zbierania kompletnych zestawów danych, rozmiar wiązki zostanie automatycznie dostosowany.
    7. Umieść grupę przestrzeni, jeśli jest znana, w kolumnie grupa wymuszonej przestrzeni. Ustaw czułość kryształów na promieniowanie (0,5–2,0 dla niskiej lub wysokiej czułości, z domyślną wartością 1).
11. W razie potrzeby ustaw całkowity kąt obrotu, który ma być zbierany dla całej kolekcji zestawów danych (domyślnie: całkowity kąt obrotu określony przez eEDNA).
12. Zapisz wartości. Kliknij Zwrot do przesyłek. Naciśnij przycisk Wyślij przesyłkę do ESRF.
13. Wydrukuj etykietę wysyłkową i wyślij próbki. Użytkownicy powinni umówić się na odbiór z kurierem, korzystając z danych konta ESRF.
    UWAGA: Bardzo ważne jest, aby wybrać opcję Dołącz etykietę zwrotną, aby umożliwić bezproblemowy zwrot próbek (patrz https://www.esrf.eu/MXDewarReimbursement).

4. Zbieranie, przeglądanie i pobieranie danych

UWAGA: W dniu eksperymentu, próbki są przenoszone do MASSIF-1 High Capacity Dewar (HCD). Następnie naukowcy zajmujący się linią badawczą uruchamiają zbieranie danych, które mogą być zdalnie śledzone przez użytkowników. Dla każdego typu próbki użytkownicy otrzymują wiadomość e-mail z informacją, że zbieranie danych zostało rozpoczęte. Jak wspomniano wcześniej, wykonanie wszystkich kroków we wszystkich przepływach pracy może być śledzone online i w czasie rzeczywistym przez użytkownika za pośrednictwem ISPyB, z którego można przeglądać i pobierać wyniki.

1. Dla każdej analizowanej próbki należy sprawdzić wyniki automatycznego eksperymentu w ISPyB (https://exi.esrf.fr/).
   1. Zaloguj się, używając numeru eksperymentu i hasła, a następnie kliknij żądaną sesję eksperymentalną pod adresem ID30A-1.
   2. Wybierz preferowany (najwyżej oceniany) potok automatycznego przetwarzania (na przykład Granaty lub XDS_APP) i pobierz dane zapisane w odpowiedniej grupie przestrzeni z najwyższą kompletnością i najwyższą rozdzielczością, klikając Ostatnie wyniki zbierania, a następnie Pobierz.
      UWAGA: Wszystkie obrazy siatki, linii i charakterystyki znajdują się w podkatalogu dla każdej próbki o nazwie /MXPressE_01. ESRF automatycznie uruchamia pięć oddzielnych pakietów przetwarzających, a mianowicie EDNA_proc¹², Grenades¹², XDS_APP¹⁴, autoPROC¹⁵ i XIA2¹⁶. Integracja danych jest oparta na XDS, z wyjątkiem XIA2, który jest oparty na DIALS. Wszystkie pakiety są również uruchamiane w trybach anomalnych i nienanomalnych, co pozwala na automatyczne wykrywanie nietypowego sygnału, jeśli jest obecny w danych, do wykorzystania w protokołach fazowych SAD. Każdy pakiet używa innych parametrów i drzew decyzyjnych, co oznacza, że niektóre pakiety działają lepiej z określonymi próbkami. Może to jednak prowadzić do uzyskania dużej liczby wyników, gdy weźmie się pod uwagę liczbę pakietów i możliwych grup przestrzeni. Wyniki są zatem uszeregowane w przybliżeniu na podstawie rozdzielczości i innych wskaźników jakości, takich jak_scalanie R w powłoce o najniższej rozdzielczości, CC(1/2) i kompletność. Ma to na celu naprowadzenie użytkownika na najlepsze zestawy danych, ale wszystkie możliwe grupy przestrzeni i wyniki powinny być dokładnie sprawdzone.
2. Rozpakuj pobrany folder, który będzie zawierał wszystkie pliki dziennika i niescalone XDS_ASCII. HKL oraz scalone i przeskalowane pliki .mtz.
   UWAGA: W przypadku, gdy struktura (w formacie PDB) białka będącego przedmiotem zainteresowania lub bliski homolog został przesłany do ISPyB na początku eksperymentu, potok automatycznego przetwarzania w ESRF automatycznie przeprowadzi proces wymiany molekularnej (MR) przy użyciu tej struktury jako modelu wyszukiwania najlepszego rozwiązania punktacji. Wyniki potoku MR są wyświetlane w ISPyB i można je znaleźć w folderze przetworzonych danych (na przykład /data/visitor/mx2112/id30a1/20180711/PROCESSED_DATA/GCSH/GCSH-x5/autoprocessing_GCSH-x5_run1_1/grenades_fastproc/user_nohet.pdb_mrpipe_dir/). W tym przypadku ostateczny model będzie nosił nazwę coot1.pdb, a dane odbicia łańcuchy boczne.mtz. Należy pamiętać, że potok może zmniejszyć symetrię komórki (prymitywna redukcja komórki) w celu zwiększenia prawdopodobieństwa znalezienia rozwiązania. W tym przypadku potok MR zapisywał roztwór w komórce jednoskośnej (C2), a nie w komórce rombowej (C222₁). Szczegółowe informacje na temat ręcznego wykonywania procesu wymiany molekularnej (przykład dla drugiego najlepiej ocenianego rozwiązania do automatycznego przetwarzania) znajdują się w plikach uzupełniających.

Results

Przepływ pracy MXPressP został wykorzystany na linii badawczej ESRF MASSIF-1 do, w pełni automatycznie, zamontowania, wyśrodkowania wiązki rentgenowskiej, scharakteryzowania i zebrania pełnych zestawów danych dyfrakcyjnych z serii kryształów ludzkiego GCSH. Próbki zostały zamontowane, a pętla przeanalizowana pod kątem obszaru do skanowania (Rysunek 1, po lewej). Po analizie dyfrakcyjnej wybrano cztery punkty w krysztale do zbierania danych (Rysunek 1, po prawej). Późniejsze przetwarzanie za pomocą zautomatyzowanych potoków analizy danych, w tym potoku MR, zaowocowało wysokiej jakości zestawami danych (tabela 1), dla których znaleziono rozwiązanie MR. To ostatnie pozwala użytkownikom szybko ocenić, czy uzyskany zestaw danych i zastosowany model wyszukiwania nadają się do etapowania przez wymianę molekularną. Ponadto można ocenić obecność ligandów, co pozwala użytkownikowi skupić się tylko na najbardziej obiecujących zestawach danych do dalszej analizy. Ręczne wyznaczanie struktury za pomocą rezonansu magnetycznego pozwoliło uzyskać wysokiej jakości mapę gęstości elektronów po pojedynczym automatycznym cyklu uszlachetniania (Rysunek 2a). W przypadku tego zestawu danych zautomatyzowany potok przycina dane w rozdzielczości 1,32 A; jednak użytkownicy nadal mogą zdecydować się na cięcie danych w niższej rozdzielczości, aby uzyskać różne statystyki jakości (CC_1/2, , R_mierzy) w powłoce o najwyższej rozdzielczości. Struktura krystaliczna ludzkiej struktury GCSH jest podobna do struktury białka bydlęcego (3KlR)¹⁶.

Ciągła gęstość elektronów jest widoczna dla całego łańcucha aminokwasów, z wyjątkiem znacznika N-końcowej histydyny. Spośród czterech podstawień, które odróżniają GCSH człowieka i bydła, trzy są łatwo identyfikowalne w gęstości elektronów (Ile/Val66, Asp/Glu98 i Leu/Phe149; Rysunek 2b-d). Jest to mniej jasne w przypadku podstawienia Asp/Lys125, dla którego gęstość elektronowa łańcucha bocznego jest tylko częściowo rozwiązana ze względu na elastyczność (Rysunek 1e). Obecnie uzyskany model ma wartości_pracy R i_wolności R wynoszące odpowiednio 20,4% i 23,8% i może być dalej optymalizowany przez kolejne cykle automatycznego i ręcznego budowania i udoskonalania modelu.

zł szt. Rozdział pkt. pkt.

	Rurociąg GRANATY	XDS_APP rurociąg
Gromadzenie i przetwarzanie danych
Źródło promieniowania rentgenowskiego / Linia wiązki	ESRF / MASSIF-1
Długość fali (A)	0.966
Rozdzielczość (Å)	41,88 – 1,48 (1,53 – 1,48)	41,86 - 1,32 (1,39 – 1,32)
Całkowite/Unikalne odbicia	127670 / 28644	177332 / 40134
	Tel. żel 12178 / 2775	Tel. Tel. (23772 / 5714)
Grupa przestrzeni do indeksowania, skalowania i scalania	Zobacz materiał C222	Zobacz materiał C2221
Wymiary komórki
a, b, c (A)	42,20, 83,75, 95,85	42.19, 83.72, 95,82
Mozaikowatość	0,05	0,05
Rmeas (%)	10,0 (110,7)	11,1 (198,2)
	9,6 (1,3)	7,6 (0,7)
CC1/2 (%)	99,7 (53,9)	99,7 (19,1)
Kompletność (%)	99,6 (99,6)	99,5 (98,6)
Liczebność	4,5 (4,4)	4,4 (4,2)
Wymiana molekularna i wstępne udoskonalenie modelu
Grupa przestrzenna do fazowania	Klasa C2	Zobacz materiał C2221
Wymiary komórki
a, b, c (A)	83,74, 42,18, 95,82	42.19, 83.72, 95,82
α, β, γ (°)	90, 90.03, 90	90, 90, 90
Model wyszukiwania dla MR (PDB)	3KLR	3KLR
Cząsteczki białek / ASU	cyfra arabska	1
Reszty białkowe	Z kolei 250	125
Rpraca/Rbez (%) po 1. uściśleniu	24,3 / 26,5	20.4 / 23.8
Długość wiązania RMSD (A) po 1. uściśleniu	0,01	0,01
Kąt wiązania RMSD (°) po 1. zagęszczeniu	Rozdział 1.2	Rejon 1,83
Wartość odstająca rotamera (%) po 1. uściśleniu	1,07	Norma 4,29
Ramachandran faworyzowany/dozwolony/niedozwolony (%) po 1. doprecyzowaniu	95.93 / 4.07 / 0	95,12 / 4,88 / 0

Tabela 1: Statystyki zbierania, udoskonalania i walidacji danych dyfrakcji rentgenowskiej. Wartości dla powłoki o najwyższej rozdzielczości podano w nawiasach.

Rysunek 1: Analiza próbki przed zebraniem danych. (A) Region wybrany do skanowania jest oznaczony czerwoną ramką. (B) Analiza obrazów dyfrakcyjnych jest przedstawiona jako mapa cieplna. Do zbierania danych wybrano cztery pozycje w obrębie zlokalizowanego kryształu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Wizualna walidacja map gęstości elektronów uzyskanych po udoskonaleniu. Mapy gęstości elektronów wyprofilowane na poziomie 2x r.m.s. wokół (a) Trp143, (b) Val66 (Ile w ludzkim GCSH) i (c) Glu98 (Asp u ludzkiego GCSH) oraz mapy wyprofilowane na poziomie 1x r.m.s wokół (d) Phe149 (Leu w ludzkim GCSH) i (e) Lys125 (Asp w ludzkim GCSH). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

W pełni automatyczne linie badawcze zapewniają zautomatyzowaną charakterystykę i gromadzenie danych z dużej liczby kryształów makromolekularnych bez konieczności obecności naukowca, zarówno na linii badawczej, jak i zdalnie. Korzystanie z całkowicie zautomatyzowanych linii badawczych ma wiele zalet w porównaniu z obsługą ręczną. Na przykład automatyczne centrowanie próbki, oparte na siatce rentgenowskiej i skanach liniowych, jest bardziej precyzyjne niż to wykonywane za pomocą ludzkiego oka, ponieważ nie ma na nie wpływu efekty termiczne ani optyczne. Rzeczywiście, te skany siatkowe i liniowe dostarczają dodatkowych danych (tj. szczegółowych wymiarów kryształu i najlepszego obszaru dyfrakcyjnego kryształu), które są ważne w określeniu prawidłowego rozmiaru wiązki do wykorzystania do zbierania danych - szczególnie w przypadku małych kryształów¹⁸ - i często skutkują poprawą jakości uzyskanych danych dyfrakcyjnych. Co więcej, wykorzystując parametry zdefiniowane przez użytkownika w konfiguracji eksperymentów automatycznych, kroki w określonych przepływach pracy można dostosować tak, aby jak najlepiej pasowały do badanego systemu, optymalizując w ten sposób wskaźnik powodzenia eksperymentu.

Biorąc pod uwagę niezawodność dostępnych przepływów pracy, prosty dostęp do linii badawczej (użytkownicy samodzielnie planują, korzystając z kalendarza [patrz wyżej]) oraz w pełni zautomatyzowane podejście MASSIF-1 zapewniają rygorystyczną, wysokowydajną i oszczędzającą czas alternatywę dla klasycznych praktycznych eksperymentów MX oraz potencjał do wdrażania bardziej zaawansowanych procedur i aplikacji do automatycznych przepływów pracy. W niedalekiej przyszłości kartografia krystaliczna w 3D¹⁹ zostanie wdrożona w celu poprawy dokładności centrowania rentgenowskiego, podczas gdy bardziej złożone protokoły, takie jak eksperymenty z odwadnianiem kryształów²⁰, zostaną zautomatyzowane. Oczekuje się, że w pełni autonomiczne gromadzenie danych stanie się standardową metodą w MX, dostarczając wysokiej jakości danych do badań przesiewowych fragmentów małych cząsteczek, optymalizując badania przesiewowe dużej liczby słabo dyfrakcyjnych kryształów i automatycznie dostarczając informacji o fazie w celu rozwiązania struktur krystalicznych de novo. W połączeniu z postępem w dziedzinie zautomatyzowanego zbierania kryształów²¹, możliwość rozwiązania struktury krystalicznej białka jako zautomatyzowanej usługi może stać się rzeczywistością.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Linia badawcza MASSIF-1	ESRF
BL21DE3	Nowa Anglia Biolabs	C2527I
chloramfenikol	Roth	3886.1
Koncentratory: Amicon Ultra-4 Ultracel -30K	Merck Millipore	UFC803024
Membrana dializacyjna	Spectrumlabs	132655
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
Dnase	Roche	11284932001
DTT	Euromedex	EU0006-B
Inhibitory proteazy wolne od EDTA	Roche	4,693,159,001
glicerol	VWR Chemicals Prolabo	14388.29T
His-pułapka HP	GE healthcare	17-5247-01
imidazol	Sigma-Aldrich	56750-500G
IPTG	Euromedex	EU0008-B
LB medium	Sigma-Aldrich	L3022
kwas liponowy	pętla Sigma-Aldrich	T5625
	Hampton Research	HR8-124
lizozym	Roche	10 837 059 001
MonoQ 5/50 GL	GE healthcare	17-5166-01
NaCl	Fisher Chemical	S/3160/60
Sonicator Vibra cell 75/15	SONICS
krążki SPINE	MiTeGen	SKU: M-CSM003-0001A
Baza Tris	Euromedex	26-128-3094-B
Morczówczan sodu	Sigma-Aldrich	1064430500
bufor oczyszczający GCSH	20 mM TRIS pH 8, 200 mM NaCl
GCSH bufor krioochronny	0,25 M Mrówczan sodu pH 4, 30% glicerol
Programs:
MxCube		Gabadinho, J. et al. MxCuBE : synchrotronowe środowisko sterowania linią badawczą dostosowane do eksperymentów krystalografii makromolekularnej. Dziennik Promieniowania Synchrotronowego. 17 (5), 700-707, doi: 10.1107/S0909049510020005 (2010)	rozwój lokalny
ISPyB	ESRF	Solange Delageniè re, Patrice Brenchereau, Ludovic Launer, Alun W. Ashton, Ricardo Leal, Sté phanie Veyrier, José Gabadinho, Elspeth J. Gordon, Samuel D. Jones, Karl Erik Levik, Seá n M. McSweeney, Sté phanie Monaco, Max Nanao, Darren Spruce, Olof Svensson, Martin A. Walsh, Gordon A. Leonard; ISPyB: system zarządzania informacją dla synchrotronowej krystalografii makromolekularnej, Bioinformatyka, tom 27, wydanie 22, 15 listopada 2011 r., strony 3186-3192, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btr535	rozwoju lokalnego
MXCube2	ESRF	Gabadinho, J. et al. MxCuBE : środowisko sterowania synchrotronową linią badawczą dostosowane do eksperymentów krystalografii makromolekularnej. Journal of Synchrotron Promieniowanie. 17 (5), 700-707, doi: 10.1107/S0909049510020005 (2010). De Santis, D., Leonard, G. Notiziario Neutroni e Luce di Sincrotrone,Consiglio Nazionale delle Ricerche. (19), 24-226 (2014).	Rozwój lokalny
	przepływu pracy BES	Brockhauser, S. i wsp. Wykorzystanie przepływów pracy w projektowaniu i realizacji złożonych eksperymentów z krystalografii makromolekularnej. Acta Crystallographica Sekcja D Krystalografia biologiczna. 68 (8), 975-984, doi: 10.1107/S090744491201863X (2012).
DOZOR	ESRF	Bourenkov i Popov, niepublikowany	rozwój lokalny
	linii badawczej BLISS	Guijarro, M. et al. BLISS - Experiments Control for ESRF EBS Beamlines. Proceedings of the 16th Int. Conf. on Accelerator and Large Experimental Control Systems, ICALEPCS2017, Barcelona, Hiszpania. DOI: 10.18429/jacow-icalepcs2017-webPL05 (2018).	Rozwój lokalny
Automatyczne przetwarzanie obrazów		Monaco, S. i wsp. Automatyczne przetwarzanie danych dyfrakcji rentgenowskiej krystalografii makromolekularnej w ESRF. Dziennik Krystalografii Stosowanej. 46 (3), 804-810, doi: 10.1107/S0021889813006195 (2013)	rozwój lokalny
BEST i EDNA		Incardona, M.-F., Bourenkov, G.P., Levik, K., Pieritz, R.A., Popov, A.N., Svensson, O. EDNA : framework dla aplikacji opartych na wtyczkach stosowanych do analizy danych online w eksperymencie rentgenowskim. Dziennik Promieniowania Synchrotronowego. 16 (6), 872-879, doi: 10.1107/S0909049509036681 (2009).	Rozwój lokalny
CCP4		Winn, M.D. et al. Przegląd pakietu CCP 4 i bieżących zmian. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (4), 235-242, doi: 10.1107/S0907444910045749 (2011).
Phaser MR		McCoy, A.J., Grosse-Kunstleve, R.W., Adams, P.D., Winn, M.D., Storoni, L.C., Read, R.J. Phaser oprogramowanie krystalograficzne. Journal of Applied Crystallography. 40 (4), 658-674, doi: 10.1107/S0021889807021206 (2007).
Coot		Emsley, P., Cowtan, K. Coot: narzędzia do budowania modeli dla grafiki molekularnej. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 60, 2126-32 (2004).
refmac5		Murshudov, G.N., Vagin, A.A., Dodson, E.J. Udoskonalanie struktur makromolekularnych metodą maksymalnego prawdopodobieństwa. Acta Crystallographica Sekcja D. 53, 240--255 (1997).
		Matthews, BW Zawartość rozpuszczalnika w kryształach białka. Dziennik Biologii Molekularnej. 33 (2), 491-497 (1968).