Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Stabilizowana tripeptydem nanoemulsja kwasu oleinowego

8.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59034

⸱

27 lutego 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Brooklyn College, The City University of New York, 2Ph.D. Program in Chemistry, The Graduate Center of The City University of New York, 3Ph.D. Program in Biochemistry, The Graduate Center of The City University of New York, 4Department of Genetics and Genomic Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 5Women's Health Research Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 6Laboratory for Translational Research, Western Connecticut Health Network

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje skuteczną metodę syntezy nanoemulsji koniugatu kwasów oleinowych i platyny(II) stabilizowanego tripeptydem lizyna-tyrozyna-fenyloalanina (KYF). Nanoemulsja powstaje w łagodnych warunkach syntetycznych poprzez samoorganizację KYF i koniugatu.

Streszczenie

Opisujemy metodę wytwarzania nanoemulsji składającej się z rdzenia z kwasów oleinowych-Pt(II) i powłoki lizynowo-tyrozynowo-fenyloalaninowej (KYF) (KYF-Pt-NE). KYF-Pt-NE hermetyzuje Pt(II) o masie 10 %, średnicy 107 ± 27 nm i ujemnym ładunku powierzchniowym. KYF-Pt-NE jest stabilny w wodzie i surowicy oraz jest biologicznie aktywny. Koniugacja fluoroforu z KYF pozwala na syntezę fluorescencyjnej nanoemulsji, która nadaje się do obrazowania biologicznego. Synteza nanoemulsji odbywa się w środowisku wodnym, a KYF-Pt-NE powstaje w wyniku samoorganizacji krótkiego peptydu KYF i koniugatu kwasów oleinowych z platyną(II). Proces samoorganizacji zależy od temperatury roztworu, stosunku molowego substratów i natężenia przepływu dodawanego substratu. Kluczowe kroki obejmują utrzymanie optymalnej szybkości mieszania podczas syntezy, zapewnienie wystarczającej ilości czasu na samoorganizację oraz stopniowe wstępne zagęszczanie nanoemulsji w koncentratorze odśrodkowym.

Wprowadzenie

W ostatnich latach obserwuje się rosnące zainteresowanie inżynierią nanocząsteczek do takich zastosowań biomedycznych, jak dostarczanie leków i bioobrazowanie1,2,3,4. Wielofunkcyjność systemów opartych na nanocząstkach często wymaga włączenia wielu komponentów w jednym preparacie. Elementy budulcowe, które są oparte na lipidach lub polimerach, często różnią się pod względem właściwości fizykochemicznych, a także biokompatybilności i biodegradowalności, co ostatecznie może wpłynąć na funkcję nanostruktury1,5,6. Materiały pochodzenia biologicznego, takie jak białka i peptydy, od dawna są uznawane za obiecujące składniki wielofunkcyjnych nanostruktur ze względu na ich elastyczność sekwencji7,8. Peptydy samoorganizują się w wysoce uporządkowane architektury supramolekularne, tworząc spiralne wstęgi9,10, rusztowania włókniste11,12, torując w ten sposób drogę do budowy hybrydowych nanostruktur opartych na biomolekułach przy użyciu podejścia oddolnego13.

Peptydy zostały zbadane pod kątem zastosowań w medycynie i biotechnologii, zwłaszcza w terapii przeciwnowotworowej14 i chorobach sercowo-naczyniowych15, a także do opracowywania antybiotyków16,17, zaburzeń metabolicznych18 i infekcji19. Istnieje ponad sto leków o małych peptydach, które są w trakcie badań klinicznych20. Peptydy są łatwe do modyfikacji i szybkie do syntezy przy niskich kosztach. Ponadto są biodegradowalne, co znacznie ułatwia ich biologiczne i farmaceutyczne zastosowania21,22. Wykorzystanie peptydów jako komponentów strukturalnych obejmuje inżynierię responsywnych nanocząstek na bazie peptydów i magazynów hydrożelu do kontrolowanego uwalniania23,24,25,26,27, biosensory oparte na peptydach28,29,30, 31, lub urządzenia bioelektroniczne32,33,34. Co ważne, stwierdzono, że nawet krótkie peptydy z dwiema lub trzema resztami aminokwasowymi, które zawierają fenyloalaninę, kierują procesami samoorganizacji35,36,37 i tworzą stabilizowane emulsje38.

Leki na bazie platyny, ze względu na ich wysoką skuteczność, są stosowane w wielu schematach leczenia raka, zarówno samodzielnie, jak i w połączeniu z innymi środkami39,40. Związki platyny indukują uszkodzenia DNA poprzez tworzenie monoadduktów i wiązań krzyżowych wewnątrzniciowych lub międzyniciowych. Zmiany Pt-DNA są rozpoznawane przez maszynerię komórkową i, jeśli nie zostaną naprawione, prowadzą do apoptozy komórkowej. Najważniejszym mechanizmem, za pomocą którego Pt(II) przyczynia się do śmierci komórek nowotworowych, jest hamowanie transkrypcji DNA41,42. Jednak korzyści płynące z terapii platyną są zmniejszone przez ogólnoustrojową toksyczność Pt(II), która wywołuje poważne skutki uboczne. Prowadzi to do niższych klinicznych dawek Pt(II)43, co często skutkuje subterapeutycznymi stężeniami platyny docierającymi do DNA. W konsekwencji następująca naprawa DNA przyczynia się do przeżycia komórek rakowych i nabycia oporności na Pt(II). Oporność na chemioterapię platyny jest poważnym problemem w terapii przeciwnowotworowej i główną przyczyną niepowodzenia leczenia44,45.

Opracowaliśmy stabilny nanosystem, który otacza czynnik Pt(II) w celu zapewnienia efektu ekranującego w krążeniu ogólnoustrojowym i zmniejszenia skutków ubocznych wywołanych przez Pt(II). System oparty jest na rdzeniu z kwasami oleinowymi-Pt(II) stabilizowanym tripeptydem KYF w celu utworzenia nanoemulsji (KYF-Pt-NE)46. Elementy budulcowe KYF-Pt-NE, aminokwasy tripeptydu oraz kwas oleinowy, mają status ogólnie uznanego za bezpieczny (GRAS) przez Agencję ds. Żywności i Leków (FDA). KYF-Pt-NE jest przygotowywany przy użyciu metody nanoprecypitacji47. Krótko mówiąc, koniugat kwasów oleinowych-Pt(II) rozpuszcza się w rozpuszczalniku organicznym, a następnie dodaje kroplami do wodnego roztworu KYF (Rysunek 1) w temperaturze 37 °C. Roztwór miesza się przez kilka godzin, aby umożliwić samodzielny montaż KYF-Pt-NE. Nanoemulsję zagęszcza się w koncentratorach odśrodkowych o sile 10 kDa i trzykrotnie przepłukuje wodą. Chemiczna modyfikacja KYF za pomocą fluoroforu pozwala na syntezę fluorescencyjnego FITC-KYF-Pt-NE odpowiedniego do obrazowania biomedycznego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Synteza koniugatu kwasów oleinowych i platyny(II)

  1. Aktywacja cisplatyny
    1. Zawiesić 50 mg (0,167 mmol) cisplatyny w 4 ml wody (np. nanoczystej) w temperaturze 60 °C.
    2. Dodać kroplami 55,2 mg (0,325 mmol) AgNO3 w 0,5 ml wody do roztworu cisplatyny i mieszać reakcję przez co najmniej 2 godziny w temperaturze 60 °C. Utworzy się biały osad AgCl wskazujący na postęp reakcji.
    3. Aby ustalić, czy reakcja aktywacji została zakończona, należy wykonać test z 10% HCl na obecność wolnego jonu Ag+ w roztworze. Test powinien być ujemny (nie powinien powstawać dodatkowy osad AgCl).
    4. Odwirować mieszaninę reakcyjną o stężeniu 3,220 x g przez 10 minut i usunąć biały osad AgCl.
    5. Zebrać supernatant i przefiltrować go przez filtr strzykawkowy 0,2 μm. Zbadać supernatant na obecność platyny, nakładając 2-3 krople roztworu za pomocą pipety Pasteura na kryształy SnCl2. Test jest pozytywny, jeśli kolor kompleksu współrzędnych cyny z platyną jest ciemnożółty/pomarańczowy.
    6. W drugim etapie należy użyć supernatantu z aktywowanym Pt(II).
  2. Reakcja kwasu oleinowego z aktywowanym Pt(II)
    1. Zawiesić 94,2 mg kwasu oleinowego (0,333 mmol) w 3 ml wody o temperaturze 60 °C.
    2. Dodać 13,3 mg (0,333 mmol) NaOH w 1 ml wody i wymieszać z roztworem aktywowanego Pt(II) z kroku 1.1
    3. Mieszać reakcję przez 2 godziny w temperaturze 60 °C, a następnie w temperaturze pokojowej przez noc. Produktem surowym jest oleisty brązowo-żółty osad.
    4. Odwirować mieszaninę reakcyjną o stężeniu 3,220 x g przez 10 minut i usunąć supernatant. Suszyć surowy produkt w temperaturze 25 °C za pomocą wyparki obrotowej. Oczyść produkt przez wielokrotne mycie acetonitrylem. Ostateczny kolor sprzężonego czystych kwasów oleinowych – Pt(II) jest bladożółty.

2. Synteza KYF-Pt-NE i nanoemulsji FITC-KYF-Pt-NE znakowanej FITC

  1. Synteza tripeptydu KYF i fluorescencyjnie znakowanego tripeptydu FITC-KYF
    1. Zsyntetyzuj KYF przy użyciu standardowej chemii peptydów w stanie stałym. Użyj następujących standardowych warunków sprzęgania, aby przyłączyć każdy aminokwas: żywica Wang (2,19 mmol), aminokwas chroniony Fmoc (4,38 mmol), 2-(1H-benzotriazolo-1-ylo)-1,1,3,3-tetrametyloaminowy tetrafluoroboran (TBTU) (4,38 mmol) i diizopropyloetyloamina (DIPEA) (8,76 mmol). Rozpuść aminokwasy z TBTU w dimetyloformamidzie (DMF) i DIPEA.
    2. Namocz 5,7 g żywicy alkoholowej Fmoc-L-Phe 4-alkoksybenzylowej (0,382 meq/g) w 25 ml DMF przez 1 godzinę przed użyciem.
    3. Zdeprotect grupę aminową aminokwasu L-fenyloalaniny za pomocą 15 ml 20% roztworu piperydyny/DMF przez 5 minut, wyrzucić rozpuszczalnik i powtórzyć płukanie w cyklu 20 minut.
    4. Myj żywicę przez 1 minutę następującymi rozpuszczalnikami: DMF, alkohol izopropylowy (IPA), DMF, IPA, DMF, IPA, DMF, DMF. Wyrzuć rozpuszczalnik po każdym praniu.
    5. Wykonaj test Kaisera, aby określić obecność wolnej grupy NH2 na żywicy (patrz podkroki) i jeśli jest dodatni (ziarno żywicy jest fioletowe), dodaj aminokwas Fmoc-L-tyrozyny i wykonaj sprzęganie przez noc.
      1. Przygotuj roztwory testowe Kaisera w osobnych butelkach.
      2. Rozpuścić 5 g ninhydryny w 100 ml etanolu.
      3. Rozpuścić 80 g fenolu w 20 ml etanolu.
      4. Zmieszać 2 ml 0,001 M wodnego roztworu cyjanku potasu z
        98 ml pirydyny.
      5. Dodaj 2-3 krople każdego roztworu testowego Kaisera do próbki i podgrzewaj we wrzącej wodzie przez 5 minut.
    6. Po pomyślnym sprzężeniu drugiego aminokwasu wykonaj test Kaisera, a jeśli wynik jest negatywny, postępuj zgodnie z protokołem deprotekcji (kroki od 2.1.3 do 2.1.5). Powtórz proces z aminokwasem Fmoc-fenyloalanina.
      1. Po sprzęgnięciu wszystkich aminokwasów przemyć żywicę przez 1 minutę 5 ml DMF, IPA, DMF, metanolu, dichlorometanu i eteru dietylowego, po każdym płukaniu wyrzucić rozpuszczalnik. Zachowaj żywicę do dalszej obróbki.
      2. Użyj połowy żywicy do następnych kroków (2.1.7-2.1.9), aby zmodyfikować peptyd za pomocą FITC. Aby uzyskać niezmodyfikowany tripeptyd KYF, postępuj zgodnie z procedurą rozpoczynającą się od 2.1.10.
    7. Zmodyfikuj N-końcowy aminokwas KYF do KYF-N3 za pomocą kwasu 6-azydoheksanowego. W tym celu należy zmieszać 1 g (0,382 mmol) żywicy KYF Wang i 120,1 mg (0,764 mmol) kwasu 6-azydoheksanowego z 245,2 mg (0,764 mmol) TBTU i 197,1 mg (1,528 mmol) DIPEA w 30 ml DMF. Mieszaj reakcję przez noc w temperaturze pokojowej.
    8. Otrzymać KYF-FITC z syntezy KYF-N3 z propargylowo-fluoresceiną w reakcji klikania. W tym celu należy zmieszać 253 mg (0,097 mmol) żywicy KYF-N3 Wang z 3,78 mg (0,019 mmol) CuI stałego, 71,9 mg (0,193 mmol) propargylu fluoresceiny i 2,24 mg (0,017 mmol) DIPEA. Reakcja powinna zmienić kolor z zielonego na brązowy.
    9. Po 24 godzinach płukać żywicę przez 1 minutę na przemian pięciokrotnie 5 ml DMF i IPA, trzykrotnie metanolem i wodą, trzykrotnie DMF i wodą oraz trzykrotnie dichlorometanem i eterem dietylowym. Wyrzuć rozpuszczalnik po każdym praniu.
    10. Rozszczepić peptyd KYF-FITC lub KYF z żywicy roztworem kwasu trifluorooctowego (TFA)/triizopropylosilanu (TIPS)/H2Ow stosunku 95/2,5/2,5 przez 3 godziny.
    11. Surowy peptyd wytrącić w zimnym eterze dietylowym, przemyć trzykrotnie zimnym eterem, a następnie wysuszyć w próżni.
  2. Synteza nanoemulsji stabilizowanej FITC-KYF z Pt(II) (FITC-KYF-Pt-NE) i KYF-Pt-NE
    1. Rozpuścić 10 mg (0,0126 mmol) koniugatu kwasów oleinowych – Pt(II) w 1,5 ml izopropanolu i umieścić w strzykawce o pojemności 5 ml.
    2. Umieścić strzykawkę ze sprzężonym kwasem oleinowym – Pt(II) w pompie strzykawkowej i ustawić przepływ na 0,1 ml/min.
    3. W celu syntezy FITC-KYF-Pt-NE należy rozpuścić 1 mg (0,00105 mmol) FITC-KYF i 1 mg (0,00219 mmol) KYF (stosunek molowy 1:2 FITC-KYF:KYF) w 20 ml wody i dostosować temperaturę roztworu do 37 °C. Przykryj ścianki pojemnika folią aluminiową, aby uniknąć fotowybielania fluoroforu FITC. Aby zsyntetyzować KYF-Pt-NE, rozpuścić 2 mg (0,0044 mmol) tripeptydu KYF w 20 ml wody i dostosować temperaturę roztworu do 37 °C.
    4. Dodawać kroplami koniugat kwasów oleinowych – Pt(II) do roztworu tripeptydu FITC-KYF/KYF lub KYF. Wykonaj ten krok pod maską.
    5. Mieszaj roztwór przez noc w temperaturze pokojowej, aby odparować rozpuszczalniki organiczne i umożliwić samoorganizację FITC-KYF-Pt-NE lub KYF-Pt-NE.
    6. Skoncentrować FITC-KYF-Pt-NE lub KYF-Pt-NE w koncentratorze odśrodkowym (10k MWCO) i przemyć trzykrotnie 4 ml wody nanoczystej.
    7. Roztwory wodne KYF-Pt-NE i FITC-KYF-Pt-NE należy przechowywać w temperaturze 4 °C.
    8. Analizuj zawartość platyny za pomocą atomowej spektroskopii absorpcyjnej (AAS), postępując zgodnie z przewodnikiem producenta48.
      1. Przygotuj wzorce platyny w 10% roztworze HCl dla krzywej kalibracyjnej (efektywny zakres dla AAS wynosi od 100 do 1 200 ppb (części na miliard)).
      2. Rozpuścić 50 μl roztworu KYF-Pt-NE z kroku 2.2 w 100 μl wody królewskiej (mieszanina stężonego kwasu solnego i kwasu azotowego w stosunku 3:1) i pozostawić na noc w temperaturze pokojowej. Dodać 850 μl wody, aby uzyskać końcową objętość próbki 1 ml. Przeanalizuj próbkę za pomocą usługi AAS. Końcowe stężenie kwasu powinno wynosić 10% we wszystkich analizowanych próbkach.
      3. Zapisać odczyt stężenia Pt w ppb i obliczyć końcową zawartość platyny w próbce (uwzględnić rozcieńczenie próbki i początkową objętość nanoemulsji).

3. Konfokalne obrazowanie wychwytu komórkowego FITC-KYF-Pt-NE

  1. Wysiewaj 6 linii komórkowych raka jajnika (A2780, CP70, SKOV3, OV90, TOV21G i ES2) do 4 dobrze komorowych naczyń konfokalnych o gęstości 4,7 x 104 komórek na komorę i wstępnie hoduj przez noc w temperaturze 37 °C.
  2. Po 24 godzinach przemyć komórki trzykrotnie roztworem soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) i inkubować z FITC-KYF-Pt-NE w pożywce do hodowli komórkowych (patrz krok 6.1 w celu uzyskania szczegółowych informacji dotyczących linii komórkowej) przez 15 minut w temperaturze 37 °C.
  3. Po inkubacji usunąć pożywkę i trzykrotnie przemyć komórki PBS.
  4. Utrwalić komórki zimnym metanolem przez 5 minut w temperaturze -20 °C i przemyć trzykrotnie 1 ml PBS.
  5. Przepuszczalność komórek za pomocą 1 ml 0,1% Triton-X przez 10 minut w temperaturze pokojowej i trzykrotne przemycie 1 ml PBS.
  6. Inkubować komórki przez 90 minut z przeciwciałem LAMP1 sprzężonym z Alexa Fluor 647 (1 ml) w rozcieńczeniu 1:50 w PBS w temperaturze pokojowej. Następnie umyj komórki 3 razy PBS.
  7. Rozcieńczyć roztwór podstawowy DAPI (1 mg/ml) do 1 μg/ml w PBS. Następnie dodaj 1 ml rozcieńczonego roztworu do każdej komory i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Umyj komórki 3 razy PBS.
  8. Zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełku podstawowym za pomocą medium montażowego.
  9. Zobrazuj komórki za pomocą mikroskopu konfokalnego na żywej komórce przy długości fali wzbudzenia 405 nm, 488 nm i 633 nm. Ustaw parametry detekcji w następujący sposób: moc lasera od 0,2% i nie więcej niż 1%, jednostka Pinole 1 Airy, Gain master 650-750, offset cyfrowy 0.
  10. Otwórz obraz w oprogramowaniu do obrazowania. W obszarze wyświetlany obraz wybierz opcję Grafika i wybierz opcję Wstaw podziałkę liniową, aby wstawić podziałkę liniową do obrazu.

4. Badania nad uwalnianiem leków

  1. Przeprowadzenie badań nad uwalnianiem leku w PBS. Dostosuj wartości pH trzech PBS odpowiednio do 7,4, 6,8 i 5,0.
  2. Rozcieńczyć 5 μl KYF-Pt-NE w 180 μl buforu PBS o odpowiednim pH, przenieść do mini kubka dializacyjnego MWCO o mocy 3,5 kDa i inkubować w temperaturze 37 °C w PBS.
  3. Usunąć bufor z każdych trzech mini probówek dializacyjnych po 2, 4, 6, 24, 48 i 140 godzinach i zmierzyć stężenie platyny za pomocą AAS. Przygotować wszystkie próbki zgodnie z krokiem 2.2.8, ale dostosować końcową objętość próbki do 500 μl.

5. Metody hodowli komórkowej

  1. Hodowla linii komórkowych A2780, CP70, SKOV-3, OV-90, TOV-21G, ES-2 w pożywce do hodowli komórkowych (DMEM) uzupełniona 10% (A2780, CP70, SKOV-3, ES-2) lub 15% (TOV-21G, OV-90) płodową surowicą bydlęcą (FBS), z L-glutaminą i penicyliną/streptomycyną. Hoduj wszystkie komórki w atmosferze nasyconej wodą o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C.
  2. Wysiewaj 3 x 105 komórek na każdej 96-dołkowej płytce i hoduj wstępnie przez noc do eksperymentów inkubacyjnych in vitro. Przygotuj roztwory KYF-Pt-NE, cisplatyny i karboplatyny w wodzie. Dostosuj stężenie Pt(II) w KYF-Pt-NE, aby dopasować stężenie karboplatyny i cisplatyny dla każdej linii komórkowej. Inkubować przez 72 godziny w temperaturze 37 °C.
  3. Po inkubacji oceń żywotność komórek za pomocą testu kolorymetrycznego (test proliferacji komórek MTT). Na krótko usunąć pożywkę i dodać 110 μl 10% MTT w pożywce do każdego dołka i inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C. Następnie dodać 100 μl detergentu do każdej studzienki i inkubować przez 5 godzin w temperaturze 37 °C.
  4. Sprawdzić absorbancję przy długości fali 570 nm za pomocą czytnika płytek. Analizuj wyniki za pomocą analizy statystycznej z testem Z i testem P.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Reprezentatywny obraz TEM KYF-Pt-NE przygotowanego zgodnie z tym protokołem przedstawiono na Ryc. 2A. KYF-Pt-NE mają morfologię sferyczną, są dobrze rozproszone i jednorodne pod względem rozmiaru. Średnica rdzenia KYF-Pt-NE, zmierzona bezpośrednio na trzech obrazach TEM przy wykonaniu minimum 20 pomiarów, wynosi 107 ± 27 nm. Średnica hydrodynamiczna KYF-Pt-NE, analizowana za pomocą dynamicznej spektroskopii rozproszenia światła (DLS), wyniosła 240 nm przy ind...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Krytyczne etapy syntezy nanoemulsji obejmują regulację stosunku molowego substratów, utrzymanie kontroli temperatury i natężenia przepływu podczas dodawania kwasów oleinowych do Pt(II), zapewnienie wystarczającej ilości czasu na samoorganizację oraz oczyszczanie produktu za pomocą kolumny koncentratora odśrodkowego. Parametry te wpływają na wielkość i morfologię KYF-Pt-NE; Dlatego szczególnie ważne jest utrzymanie odpowiedniego stosunku zębów trzonowych i prawidłowe dostosowanie warunków syntezy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają konfliktu interesów, który mogliby ujawnić.

Podziękowania

Z wdzięcznością dziękujemy za wsparcie finansowe od National Cancer Institute, grant SC2CA206194. Nie deklaruje się żadnych konkurencyjnych interesów finansowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2-(1H-benzotriazolo-1-ylo)-1,1,3,3-tetrametyloironium
tetrafluoroboran (TBTU)		ANASPEC INC.:AS-20376SPPS
4-dołkowa miska konfokalna komorowaLab-Tek II, Thermo Fisher Scientific154526Do obrazowania
kwasu 6-bromoheksanowegoChem-Impex INT' L INC.24477Modyfikacja kliknięcia dla peptydu
A2780Hojnie zaszczepiona przez profesora Johna Martignettiego z The Mount Sinai HospitalLinia komórkowa raka jajnika
Barnstead NanopureThermo FisherD11901system filtracji wody
BUCHI rotavapor R-3BuchiZ568090Do usuwania rozpuszczalnika i suszenia próbek
Wirówka 5810 Reppendorf5811FDo separacji kompleksu platyny
Cis-dichlorodiaminaplatyna (II) 99%Acros Organics19376-0050testy in vitro
CP70Hojnie zaszczepiony przez profesora Johna Martignettiego ze szpitalaLinia komórkowa raka jajnika
Cyfrowa kąpiel wodnaVWR97025-134Do podgrzewania pożywek do hodowli komórkowych
Dynamiczne rozpraszanie światła (DLS)Brookhaven Instrument CorporationDo pomiarów wielkości nanocząstek
ES-2ATCCCRL-1978linia komórkowa raka jajnika
Fmoc-L-Lys(Boc)-OH 99,79%Chem-Impex INT' L INC.00493SPPS
Fmoc-L-Phe Żywica alkoholowa 4-alkoksybenzylowa (0,382 meq/g),Chem-Impex INT' L INC.01914SPPS
Fmoc-LTyr(tBu)-OH 98%Alfa AesarH59730SPPS
Inkubator CO2 HERACELL 150iInkubatorThermo Scientific Fisher
Wysokociśnieniowa pompa strzykawkowaNew Era1010-USDo dodawania kompleksu platyny w syntezie nanocząstek
Płyta grzejna/mieszadłoVWR12365-382Do mieszania i podgrzewania próbek
Przeciwciało LAMP-1 (sprzężone z Alexa Fluor 647)Santa Cruz Biotechnologysc-18821 AF647Do obrazowania
N,N-diizopropyloetyloaminy (DIPEA)Oakwood Chemical005027
SPPS Ninhydrin 99%AlfaAesar A10409Test Kaisera
Kwas oleinowyChem-Impex INT' L INC.01421Do syntezy kompleksu platyny
OV90ATCCCRL-11732Linia komórkowa raka jajnika
PBSCorning21-031-CVDo mycia komórek
Podłoże montażowe PermountFisher ChemicalSP15-100Do obrazowania
PhenolFisher ChemicalA92500Test Kaisera
Kwas fosfowolframowyFisher ChemicalA248-25ujemne zabarwienie dla TEM
Piperydyna 99%BTC219260-2,5LSPPS
Platynowa standardowa rozdzielczość AASAlfa Aesar880861000ug / ml do krzywej kalibracyjnej
Bromek propargylu 97%Alfa AesarL10595Do alkinowej modyfikacji fluoresceiny
Naukowa szafka biologicznaThermo Scientific Fisher1385Bio-kaptur do hodowli komórkowych
Samoczyszczący system próżniowyWelch2028Pompa próżniowa do rotavapor
Azotan srebraAcros Organics19768-0250Aktywacja cisplatyny
SKOV3ATCCHTB-77Linia komórkowa raka jajnika
Wodorotlenek soduFisher ScientificS313-1Do syntezy kompleksu platyny
Chlorekcyny (II)Sigma Aldrich208256 Test na obecność platyny
TOV21GATCCCRL-11730Linia komórkowa raka jajnika
Kwas trifluorooctowy 99% (TFA)Alfa AesarL06374SPPS
Triizopropylosilan (TIPS)Chem-Impex INT' L INC.01966SPPS
Triton-XSigma AldrichT8787-100MLDo obrazowania
Uranina w proszku 40%Fisher ScientificS25328ADo alkinowej modyfikacji fluoresceiny
Vivaspin 20 (10000 MWCO)SartoriousVS2001Do mycia i kondensacji nanocząstek
Mikroskop odwrócony VWRVWR89404-462Do monitorowania kultur komórkowych
Mount Sinai CO2

Bibliografia

  1. Agrahari, V., Agrahari, V., Mitra, A. K. Nanocarrier fabrication and macromolecule drug delivery: challenges and opportunities. Therapeutic Delivery. 7 (4), 257-278 (2016).
  2. Anselmo, A. C., Mitragotri, S. Nanoparticles in the clinic. Bioengineering & Translational Medicine. 1 (1), 10-29 (2016).
  3. Peer, D., Karp, J. M., Hong, S., Farokhzad, O. C., Margalit, R., Langer, R. Nanocarriers as an emerging platform for cancer therapy. Nature Nanotechnology. 2 (12), 751-760 (2007).
  4. Roy Chowdhury, M., Schumann, C., Bhakta-Guha, D., Guha, G. Cancer nanotheranostics: Strategies, promises and impediments. Biomedicine & Pharmacotherapy. 84, 291-304 (2016).
  5. Jeevanandam, J., Chan, Y. S., Danquah, M. K. Nano-formulations of drugs: Recent developments, impact and challenges. Biochimie. , 99-112 (2016).
  6. Meerum Terwogt, J. M., Groenewegen, G., Pluim, D., Maliepaard, M., Tibben, M. M., Huisman, A., ten Bokkel Huinink, W. W., Schot, M., Welbank, H., Voest, E. E., Beijnen, J. H., Schellens, J. M. Phase I and pharmacokinetic study of SPI-77, a liposomal encapsulated dosage form of cisplatin. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 49 (3), 201-210 (2002).
  7. Fan, Z., Sun, L., Huang, Y., Wang, Y., Zhang, M. Bioinspired fluorescent dipeptide nanoparticles for targeted cancer cell imaging and real-time monitoring of drug release. Nature Nanotechnology. 11 (4), 388-394 (2016).
  8. Jeong, Y., et al. Enzymatically degradable temperature-sensitive polypeptide as a new in-situ gelling biomaterial. Journal of Controlled Release. 137 (1), 25-30 (2009).
  9. Uesaka, A., et al. Morphology control between twisted ribbon, helical ribbon, and nanotube self-assemblies with his-containing helical peptides in response to pH change. Langmuir. 30 (4), 1022-1028 (2014).
  10. Hwang, W., Marini, D. M., Kamm, R. D., Zhang, S. Supramolecular structure of helical ribbons self-assembled from a B-sheet peptide. Journal of Chemical Physics. 118 (1), 389-397 (2003).
  11. Svobodova, J., et al. Poly(amino acid)-based fibrous scaffolds modified with surface-pendant peptides for cartilage tissue engineering. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (3), 831-842 (2017).
  12. Kumar, V. A., et al. Highly angiogenic peptide nanofibers. ACS Nano. 9 (1), 860-868 (2015).
  13. Romera, D., Couleaud, P., Mejias, S. H., Aires, A., Cortajarena, A. L. Biomolecular templating of functional hybrid nanostructures using repeat protein scaffolds. Biochemical Society Transactions. 43 (5), 825-831 (2015).
  14. Medina, S. H., Schneider, J. P. Cancer cell surface induced peptide folding allows intracellular translocation of drug. Journal of Controlled Release. 209, 317-326 (2015).
  15. Recio, C., Maione, F., Iqbal, A. J., Mascolo, N., De Feo, V. The Potential Therapeutic Application of Peptides and Peptidomimetics in Cardiovascular Disease. Frontiers in Pharmacology. 7, 526(2016).
  16. McCarthy, K. A., et al. Phage Display of Dynamic Covalent Binding Motifs Enables Facile Development of Targeted Antibiotics. Journal of the American Chemical Society. 140 (19), 6137-6145 (2018).
  17. Lazar, V., et al. Antibiotic-resistant bacteria show widespread collateral sensitivity to antimicrobial peptides. Nature Microbiology. 3 (6), 718-731 (2018).
  18. Czeczor, J. K., McGee, S. L. Emerging roles for the amyloid precursor protein and derived peptides in the regulation of cellular and systemic metabolism. Journal of Neuroendocrinology. 29 (5), (2017).
  19. Branco, M. C., Sigano, D. M., Schneider, J. P. Materials from peptide assembly: towards the treatment of cancer and transmittable disease. Current Opinion in Chemical Biology. 15 (3), 427-434 (2011).
  20. Cheetham, A. G., et al. Targeting Tumors with Small Molecule Peptides. Current Cancer Drug Targets. 16 (6), 489-508 (2016).
  21. Ndinguri, M. W., Solipuram, R., Gambrell, R. P., Aggarwal, S., Hammer, R. P. Peptide targeting of platinum anti-cancer drugs. Bioconjugate Chemistry. 20 (10), 1869-1878 (2009).
  22. Eskandari, S., Guerin, T., Toth, I., Stephenson, R. J. Recent advances in self-assembled peptides: Implications for targeted drug delivery and vaccine engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 110, 169-187 (2017).
  23. Zhou, J., Du, X., Yamagata, N., Xu, B. Enzyme-Instructed Self-Assembly of Small D-Peptides as a Multiple-Step Process for Selectively Killing Cancer Cells. Journal of the American Chemical Society. 138 (11), 3813-3823 (2016).
  24. Sun, J. E., et al. Sustained release of active chemotherapeutics from injectable-solid beta-hairpin peptide hydrogel. Biomaterials Science. 4 (5), 839-848 (2016).
  25. Lock, L. L., Reyes, C. D., Zhang, P., Cui, H. Tuning Cellular Uptake of Molecular Probes by Rational Design of Their Assembly into Supramolecular Nanoprobes. Journal of the American Chemical Society. 138 (10), 3533-3540 (2016).
  26. Kalafatovic, D., Nobis, M., Son, J., Anderson, K. I., Ulijn, R. V. MMP-9 triggered self-assembly of doxorubicin nanofiber depots halts tumor growth. Biomaterials. 98, 192-202 (2016).
  27. Frederix, P. W., et al. Exploring the sequence space for (tri-)peptide self-assembly to design and discover new hydrogels. Nature Chemistry. 7 (1), 30-37 (2015).
  28. Horsley, J. R., et al. Photoswitchable peptide-based 'on-off' biosensor for electrochemical detection and control of protein-protein interactions. Biosensors and Bioelectronics. 118, 188-194 (2018).
  29. Hoyos-Nogues, M., Gil, F. J., Mas-Moruno, C. Antimicrobial Peptides: Powerful Biorecognition Elements to Detect Bacteria in Biosensing Technologies. Molecules. 23 (7), 1683(2018).
  30. Xiao, X., et al. Advancing Peptide-Based Biorecognition Elements for Biosensors Using in-Silico Evolution. ACS Sensors. 3 (5), 1024-1031 (2018).
  31. Puiu, M., Bala, C. Peptide-based biosensors: From self-assembled interfaces to molecular probes in electrochemical assays. Bioelectrochemistry. 120, 66-75 (2018).
  32. Wang, J., et al. Developing a capillary electrophoresis based method for dynamically monitoring enzyme cleavage activity using quantum dots-peptide assembly. Electrophoresis. 38 (19), 2530-2535 (2017).
  33. Etayash, H., Thundat, T., Kaur, K. Bacterial Detection Using Peptide-Based Platform and Impedance Spectroscopy. Methods in Molecular Biology. 1572, 113-124 (2017).
  34. Handelman, A., Apter, B., Shostak, T., Rosenman, G. Peptide Optical waveguides. Journal of Peptide Science. 23 (2), 95-103 (2017).
  35. Chen, C., Liu, K., Li, J., Yan, X. Functional architectures based on self-assembly of bio-inspired dipeptides: Structure modulation and its photoelectronic applications. Advances in Colloid and Interface Science. 225, 177-193 (2015).
  36. Reddy, S. M., Shanmugam, G. Role of Intramolecular Aromatic pi-pi Interactions in the Self-Assembly of Di-l-Phenylalanine Dipeptide Driven by Intermolecular Interactions: Effect of Alanine Substitution. Chemphyschem. 17 (18), 2897-2907 (2016).
  37. Marchesan, S., et al. Unzipping the role of chirality in nanoscale self-assembly of tripeptide hydrogels. Nanoscale. 4 (21), 6752-6760 (2012).
  38. Scott, G. G., McKnight, P. J., Tuttle, T., Ulijn, R. V. Tripeptide Emulsifiers. Advanced Materials. 28 (7), 1381-1386 (2016).
  39. Galanski, M., Jakupec, M. A., Keppler, B. K. Update of the preclinical situation of anticancer platinum complexes: novel design strategies and innovative analytical approaches. Current Medicinal Chemistry. 12 (18), 2075-2094 (2005).
  40. Wheate, N. J., Walker, S., Craig, G. E., Oun, R. The status of platinum anticancer drugs in the clinic and in clinical trials. Dalton Transactions. 39 (35), 8113-8127 (2010).
  41. Oberoi, H. S., Nukolova, N. V., Kabanov, A. V., Bronich, T. K. Nanocarriers for delivery of platinum anticancer drugs. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (13-14), 1667-1685 (2013).
  42. Fichtinger-Schepman, A. M., van Oosterom, A. T., Lohman, P. H., Berends, F. cis-Diamminedichloroplatinum(II)-induced DNA adducts in peripheral leukocytes from seven cancer patients: quantitative immunochemical detection of the adduct induction and removal after a single dose of cis-diamminedichloroplatinum(II). Cancer Research. 47 (11), 3000-3004 (1987).
  43. Englander, E. W. DNA damage response in peripheral nervous system: coping with cancer therapy-induced DNA lesions. DNA Repair. 12 (8), 685-690 (2013).
  44. Galluzzi, L., et al. Molecular mechanisms of cisplatin resistance. Oncogene. 31 (15), 1869-1883 (2012).
  45. Boeckman, H. J., Trego, K. S., Turchi, J. J. Cisplatin sensitizes cancer cells to ionizing radiation via inhibition of nonhomologous end joining. Molecular Cancer Research. 3 (5), 277-285 (2005).
  46. Dragulska, S. A., et al. Tripeptide-Stabilized Oil-in-Water Nanoemulsion of an Oleic Acids-Platinum(II) Conjugate as an Anticancer Nanomedicine. Bioconjugate Chemistry. 29 (8), 2514-2519 (2018).
  47. Martinez Rivas,, J, C., et al. Nanoprecipitation process: From encapsulation to drug delivery. International Journal of Pharmaceutics. 532 (1), 66-81 (2017).
  48. Agilent Technologies. Analytical Methods for Graphite Tube Atomizers, User's Guide Manual, 8th edition. , (2012).
  49. Park, S. Y., et al. A smart polysaccharide/drug conjugate for photodynamic therapy. Angewandte Chemie. 50 (7), 1644-1647 (2011).
  50. Canton, I., Battaglia, G. Endocytosis at the nanoscale. Chemical Society Reviews. 41 (7), 2718-2739 (2012).
  51. Lokich, J., Anderson, N. Carboplatin versus cisplatin in solid tumors: an analysis of the literature. Annals of Oncology. 9 (1), 13-21 (1998).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Koniugat kwasu oleinowego z platynąpowlekanie peptydem KYFproces samozgrupowaniakoncentracja odwirowaniemfluorescencyjna nanoemulsjauwalnianie platynykomórki raka jajnikatransmisyjna mikroskopia elektronowametoda z pompą strzykawkową
Stabilizowana tripeptydem nanoemulsja kwasu oleinowego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.