Artykuł metodologiczny

Jednoprzepustowe komplementarne techniki analityczne o wysokiej rozdzielczości do charakteryzowania złożonych mieszanin naturalnej materii organicznej

DOI:

10.3791/59035

⸱

7 stycznia 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Environmental Molecular Sciences Laboratory, Pacific Northwest National Laboratory, 2Department of Soil, Water and Environmental Science, University of Arizona, 3Department of Earth Ocean and Atmospheric Sciences, Florida State University, 4Bruker Daltonics Inc., 5Biological Sciences Division, Pacific Northwest National Laboratory

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje pojedynczą przepustowość dla uzupełniających technik analitycznych i omicznych, której kulminacją jest w pełni sparowana charakterystyka naturalnej materii organicznej i proteomiki mikrobiologicznej w różnych ekosystemach. Podejście to pozwala na solidne porównania w celu identyfikacji szlaków i przemian metabolicznych ważnych dla opisu produkcji gazów cieplarnianych i przewidywania reakcji na zmiany środowiskowe.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Naturalna materia organiczna (NOM) składa się z wysoce złożonej mieszaniny tysięcy związków organicznych, które historycznie okazały się trudne do scharakteryzowania. Jednakże, aby zrozumieć termodynamiczne i kinetyczne kontrole produkcji gazów cieplarnianych (dwutlenku węgla [CO2] i metanu [CH4]) wynikających z rozkładu NOM, konieczna jest charakterystyka na poziomie molekularnym w połączeniu z analizami proteomu mikrobiologicznego. Co więcej, oczekuje się, że zmiany klimatyczne i środowiskowe zakłócą naturalne ekosystemy, potencjalnie zakłócając złożone interakcje, które wpływają zarówno na dostarczanie substratów materii organicznej, jak i na mikroorganizmy dokonujące przemian. Szczegółowa charakterystyka molekularna materii organicznej, proteomiki drobnoustrojów oraz szlaków i przemian, w wyniku których materia organiczna ulega rozkładowi, będzie niezbędna do przewidzenia kierunku i wielkości skutków zmian środowiskowych. W artykule opisano metodologiczną przepustowość do kompleksowej charakterystyki metabolitów w pojedynczej próbce za pomocą spektrometrii mas rezonansu cyklotronowego z transformacją jonową Fouriera z bezpośrednim wtryskiem (FTICR-MS), chromatografii gazowej ze spektrometrią mas (GC-MS), spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR), spektrometrii mas chromatografii cieczowej (LC-MS) i analizy proteomicznej. Rezultatem tego podejścia jest w pełni sparowany zestaw danych, który zwiększa pewność statystyczną przy wnioskowaniu o szlakach rozkładu materii organicznej, wynikającym z tego tempie produkcji CO2 i CH4 oraz ich reakcjach na perturbacje środowiskowe. W niniejszej pracy przedstawiono wyniki zastosowania tej metody do próbek NOM pobranych z torfowisk; jednak protokół ma zastosowanie do każdej próbki NOM (np. torfu, gleb leśnych, osadów morskich itp.).

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szacuje się, że tereny podmokłe zawierają 529 Pg węgla (C), głównie w postaci organicznego węgla zakopanego w złożach torfu1. Obecnie takie torfowiska działają jak pochłaniacz C netto, sekwestrując 29 Tg C y-1 w samej Ameryce Północnej1. Jednak zakłócenia środowiskowe, takie jak drenaż, pożary, susze i wyższe temperatury, mogą zrównoważyć ten pochłaniacz C poprzez zwiększenie rozkładu materii organicznej, co skutkuje zwiększonymi stratami węgla w wyniku produkcji gazów cieplarnianych (dwutlenku węgla [CO2] i metanu [CH4]) 1,2. Zmiana klimatu może przyczyniać się do utraty węgla, jeśli wyższe temperatury lub suche warunki stymulują szybszy rozkład węgla przez mikroorganizmy. Alternatywnie, wyższe temperatury i stężenia CO2 w powietrzu mogą stymulować produkcję pierwotną do sekwestracji większej ilości CO2 w postaci węgla organicznego (OC). To, w jakim stopniu i jak szybko to OC rozkłada się na CO2 i CH4, zależy od złożonych interakcji między substratami donorów elektronów, dostępnością akceptorów elektronów i mikroorganizmami pośredniczącymi w transformacji. W wielu przypadkach mechanizmy te nie są dobrze scharakteryzowane, a zatem ich reakcja na perturbacje środowiskowe nie jest dobrze ograniczona i nie jest jasne, jaki będzie wynik netto zmian klimatycznych dla bilansu węglowego w ekosystemach torfowiskowych.

Złożona natura naturalnej materii organicznej (NOM) sprawiła, że nawet identyfikacja związków organicznych obecnych w mieszaninach NOM była historycznie trudna. Ostatnie postępy znacznie poprawiły naszą zdolność do charakteryzowania związków, które tradycyjnie i do pewnego stopnia nadal są uważane za oporne związki humusowe lub fulwowe3,4,5. Teraz rozumiemy, że wiele z tych związków jest w rzeczywistości dostępnych mikrobiologicznie i może ulec rozkładowi, jeśli dostępny jest odpowiedni końcowy akceptor elektronów (TEA)6,7. Obliczanie nominalnego stopnia utlenienia węgla (NOSC) dla związku dostarcza metryki do przewidywania potencjału rozkładu i wymaganej wydajności energetycznej TEA. Wymaga to jednak charakterystyki materii organicznej na poziomie molekularnym7. NOSC oblicza się ze wzoru cząsteczkowego za pomocą następującego równania7: NOSC = − ((−z + 4(#C) + (#H) − 3(#N) − 2(#O) + 5(#P) − 2(#S)) / (#C)) + 4, gdzie z jest ładunkiem netto. NOSC jest skorelowany z termodynamiczną siłą napędową8, przy czym związki o wyższym NOSC są łatwiejsze do degradacji, podczas gdy związki o niższym NOSC wymagają coraz bardziej energetycznych TEA, aby mogły zostać zredukowane. Związki o NOSC mniejszym niż −2 wymagają wysokiej energii TEA, takich jakO2, azotan lub MnIV, i nie mogą być degradowane przez powszechnie występujące herbaty o niższej wartości energetycznej, takie jak FeIII lub siarczan7. Jest to ważna kwestia w podmokłych warunkach beztlenowych występujących na terenach podmokłych, gdzie O2 i inne herbaty o wysokiej wydajności energetycznej są rzadkie9, a zatem degradacja niższych związków NOSC w tych warunkach jest termodynamicznie ograniczona. Perturbacje środowiskowe mogą wpływać na stan termodynamiczny ekosystemu poprzez zmiany hydrologiczne, które wpływają naO2 (najbardziej energetyczny akceptor elektronów), zmiany w substratach organicznych i akceptorach elektronów udostępnianych przez produkcję pierwotną oraz w mniejszym stopniu przez temperaturę. Ważnym przykładem wpływu temperatury w systemach mokradeł jest kompromis zachodzący między homoacetogenezą (tj. produkcją octanu z CO2 i H2 ) a metanogenezą hydrogenotroficzną (tj. produkcjąCH 4 z CO2 i H2). Wydaje się, że w niskich temperaturach homoacetogeneza jest nieco faworyzowana, podczas gdy cieplejsze temperatury faworyzują produkcję CH410. Ten wpływ temperatury może mieć ważne implikacje dla reakcji ekosystemów na zmieniający się klimat, ponieważ CH4 jest znacznie silniejszym gazem cieplarnianym niż CO211, a zatem zwiększenie produkcji CH4 kosztem CO2 w cieplejszych temperaturach może przyczynić się do dodatniego sprzężenia zwrotnego z ociepleniem klimatu.

Torfowiska produkują globalnie znaczące ilości CO2 i CH46 poprzez mikrobiologiczne oddychanie naturalnie występującej materii organicznej. NOSC substratów węgla organicznego określa względną proporcję wytwarzanego CO2:CH4, co jest parametrem krytycznym ze względu na wyższe wymuszanie radiacyjne CH4 w porównaniu do CO211, ale także dlatego, że wysiłki modelowania zidentyfikowały ten stosunek jako krytyczny parametr do szacowania strumienia C na torfowiskach12. W przypadku braku końcowych akceptorów elektronów innych niż CO2 można wykazać za pomocą bilansu elektronowego, że organiczne substraty C o NOSC > 0 będą wytwarzać CO2:CH4 > 1, organiczne C o NOSC = 0 wytwarza CO2 i CH4 w stosunku równomolowym, a organiczne C o NOSC < 1 będą wytwarzać CO2: CH4 < 113. Rozkład OC w naturalnych ekosystemach odbywa się za pośrednictwem mikroorganizmów, tak że nawet jeśli degradacja określonego związku jest termodynamicznie wykonalna, jest ona kinetycznie ograniczona przez aktywność enzymów mikrobiologicznych oraz, w warunkach beztlenowych, przez termodynamiczną siłę napędową (tj. NOSC)7. Do tej pory pełne scharakteryzowanie materii organicznej było wyzwaniem, ponieważ różnorodność obecnych związków wymaga różnych uzupełniających się technik ich charakteryzacji. Ostatnie postępy wypełniły tę lukę; Korzystając z zestawu technik analitycznych, możemy analizować szeroki zakres związków organicznych, zapewniając charakterystykę na poziomie molekularnym, a w niektórych przypadkach kwantyfikację, od małych metabolitów pierwotnych, takich jak glukoza, do 800 Da poliheterocykli. Wcześniej takie duże złożone cząsteczki byłyby charakteryzowane po prostu jako podobne do ligniny lub podobne do taniny i zakładano, że są krnąbrne. Charakterystyka na poziomie molekularnym pozwala jednak na obliczenie NOSC nawet dla tych dużych złożonych cząsteczek. Te wartości NOSC są liniowo skorelowane z termodynamiczną siłą napędową, co pozwala na ocenę jakości materii organicznej dostępnej do rozkładu, co w wielu przypadkach ujawnia, że te złożone cząsteczki mogą w rzeczywistości ulegać degradacji mikrobiologicznej nawet w warunkach beztlenowych panujących na terenach podmokłych.

Ponieważ wprowadzenie O2 pozwala na rozkład materii organicznej o prawie wszystkich naturalnie obserwowanych wartościach NOSC, skupiamy się tutaj na zmianach w materii organicznej i proteomice mikrobiologicznej, które prawdopodobnie będą głównymi czynnikami napędzającymi systemy wodno-błotne (tj. ograniczone O2). Jednak wszystkie techniki, które omówimy, można zastosować do materii organicznej z dowolnego ekosystemu. Zazwyczaj do oceny jakości materii organicznej stosuje się pomiary masowe oparte na analizach optycznych i fluorescencyjnych3,14. Jednak podczas korzystania z pomiarów masowych, takich jak te, drobne szczegóły są tracone, ponieważ duża liczba cząsteczek jest kategoryzowana razem pod ogólnymi terminami, takimi jak humiki lub fulwy. Definicje tych kategorii nie są dobrze ograniczone i w rzeczywistości mogą się różnić w zależności od badania, co uniemożliwia porównania. Co więcej, pomiary masowe nie dostarczają szczegółów molekularnych niezbędnych do obliczenia termodynamiki rządzącej systemem, a zatem nie są w stanie naprawdę ocenić jakości materii organicznej15.

Indywidualne techniki, takie jak spektrometria mas rezonansu cyklotronowego z transformacją jonową Fouriera (FTICR-MS), spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR), spektrometria mas chromatografii gazowej (GC-MS) i spektrometria mas chromatografii cieczowej (LC-MS) dostarczają takich szczegółów na poziomie molekularnym. Chociaż każda z tych technik ma swoje ograniczenia, mają one również swoje mocne strony, które można wykorzystać w zintegrowanym podejściu w celu uzyskania drobnych szczegółów molekularnych niezbędnych do ilościowego określenia jakości materii organicznej w rygorystycznym sensie termodynamicznym. GC-MS jest przydatny do identyfikacji krytycznych małych metabolitów, które mogą mieć proksymalny wpływ na produkcję CO2 i CH4 (np. glukozy, octanu itp.); jednak GC-MS wymaga weryfikacji w odniesieniu do wzorca i dlatego jest ograniczona do już znanych związków obecnych w bazie danych, co uniemożliwia identyfikację nowych związków. Co więcej, GC-MS jest techniką półjakościową pozwalającą na wnioskowanie o zmianach stężeń względnych, ale nie dostarczającą rzeczywistych informacji o stężeniach niezbędnych na przykład do obliczenia energii swobodnych Gibba. Wreszcie, GC-MS wymaga derywatyzacji cząsteczek przed analizą, co ogranicza rozdzielczość do związków mniejszych niż ~400 Da, a lotne alkohole są tracone na etapie suszenia.

Jednowymiarowy (1D) 1H płynny NMR pozwala na wysoce ilościową charakterystykę małych metabolitów (w tym pierwotnych metabolitów o małej masie cząsteczkowej i substancji lotnych, takich jak alkohole, octan, aceton, mrówczan, pirogronian, bursztynian, krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe, a także szereg węglowodanów notorycznie nieobecnych lub zagrożonych w metodach opartych na MS), a ich stężenia są szczególnie przydatne do obliczania parametrów termodynamicznych. Jednak, podobnie jak GC-MS, 1D NMR złożonych mieszanin wymaga standaryzacji w stosunku do bazy danych, a zatem sam w sobie nie pozwala na łatwą identyfikację nowych związków, które prawdopodobnie będą obfitować w złożonych naturalnych i zmieniających się ekosystemach. Ponadto NMR jest mniej czuły niż techniki oparte na MS, a zatem ilościowe profilowanie metabolitów uzyskuje się tylko powyżej 1 μM przy użyciu systemów NMR wyposażonych w zimne sondy chłodzone helem. Nie jest to powszechnie doceniane, niektóre zimne sondy NMR są odporne na sól i umożliwiają analizę mieszaniny środowiskowej w obecności milimolowych stężeń soli, gdy są używane w probówkach na próbki o mniejszej średnicy (< 3 mm średnicy zewnętrznej)16. Jednak kolejną komplikacją NMR jest to, że duże ilości metali i minerałów paramagnetycznych (np. Fe i Mn powyżej 1 - 3% wag.), które mogą występować w dużych ilościach w glebach wyżynnych, mogą poszerzać cechy spektralne i komplikować interpretację widm NMR. Zastosowanie ekstrakcji do fazy stałej (SPE) może pomóc w interpretacji metod metabolomicznych opartych zarówno na NMR, jak i MS poprzez redukcję soli mineralnych i poprawę jakości widma.

FTICR-MS poprzez bezpośrednie wstrzykiwanie jest bardzo czułą techniką, zdolną do wykrywania dziesiątek tysięcy metabolitów z pojedynczej próbki, ale nie wychwytuje krytycznych małych metabolitów, takich jak octan, pirogronian i bursztynian, i jest niezwykle trudna do użycia dla cukrów i innych węglowodanów17, ani nie dostarcza informacji ilościowych. Jednak w przeciwieństwie do innych technik, FTICR-MS doskonale radzi sobie z identyfikacją i przypisywaniem wzoru cząsteczkowego nowym związkom, a zatem identyfikuje największą liczbę związków dostarczających więcej informacji molekularnych niż którakolwiek z innych opisanych technik. Jest to przydatne, ponieważ informacje molekularne dostarczone przez FTICR-MS (i inne techniki) mogą być wykorzystane do obliczenia NOSC, która jest związana z termodynamiczną siłą napędową rządzącą prawdopodobieństwem określonych reakcji8 i ich szybkości w określonych warunkach7. Ponadto, poprzez sprzężenie FTICR-MS z technikami separacji, takimi jak LC wraz z tandemowym MS, można uzyskać ilościowe informacje strukturalne, kompensując niektóre wady tej techniki. LC-MS jest przydatny do identyfikacji związków lipidopodobnych i innych metabolitów, które nie są dobrze scharakteryzowane przez żadną z innych metod. Sprzężenie LC FTICR-MS lub LC-MS z kolektorem frakcji i zebranie frakcji specyficznych niewiadomych będących przedmiotem zainteresowania w celu wyjaśnienia strukturalnego za pomocą dwuwymiarowego (2D) NMR w stanie ciekłym to idealna sytuacja do identyfikacji i ilościowego określania nieznanych związków18,19. Jest to jednak bardzo czasochłonny krok, który można wykorzystać w razie potrzeby. Każda z tych technik, rozpatrywana indywidualnie, zapewnia inny obraz materii organicznej, a integrując je, możemy osiągnąć pełniejsze zrozumienie niż przy użyciu którejkolwiek z technik w izolacji.

Podczas gdy rozważania termodynamiczne ustalają ostateczne ograniczenia dotyczące możliwych przemian w systemie, rozkład materii organicznej jest spowodowany przez mikroorganizmy, których aktywność enzymatyczna kontroluje szybkość reakcji. W związku z tym pełne zrozumienie kontroli rozkładu materii organicznej i ostatecznie produkcji gazów cieplarnianych (CO2 i CH4) z terenów podmokłych wymaga zintegrowanego podejścia omicznego do scharakteryzowania aktywności enzymów mikrobiologicznych, a także metabolitów. W tym artykule opisujemy metodę uzyskiwania takiej kompleksowej analizy z pojedynczej próbki przy użyciu podejścia sekwencyjnego, które skutkuje w pełni sparowaną analizą. Podejście to rozszerza protokół ekstrakcji metabolitów, białek i lipidów (MPLex), w którym proteomika została sprzężona z GC-MS i LC-MS20 w celu identyfikacji małych metabolitów, białek i lipidów poprzez włączenie ilościowych informacji o metabolitach za pomocą NMR i identyfikację większych metabolitów wtórnych za pomocą FTICR-MS. Nieco inaczej niż w przypadku MPLex, protokół rozpoczynamy od ekstrakcji wodą, a następnie stosujemy ekstrakcję sekwencyjną z coraz bardziej niepolarnymi rozpuszczalnikami. Wszystkie ekstrakcje przeprowadza się na pojedynczej próbce, co pozwala zachować próbkę, gdy objętości są ograniczone lub trudne do uzyskania, i zmniejsza błąd doświadczalny wynikający z różnic między podwielokrotnościami z niejednorodnych matryc próbek (np. gleby i torfu) lub różnic w warunkach i czasie przechowywania.

Na koniec, łącząc analizy OM z analizami proteomicznymi społeczności mikrobiologicznej, możemy zbudować sieci metaboliczne, które opisują szlaki i przemiany rozkładu materii organicznej. Pozwala nam to przetestować konkretne hipotezy dotyczące tego, w jaki sposób zakłócenia systemu wpłyną na ostateczną produkcję CO2 i CH4 poprzez zmianę dostępnych substratów organicznych, akceptorów elektronów i społeczności mikroorganizmów pośredniczących w reakcjach poprzez aktywność katalizatorów enzymatycznych.

Ogólnym celem tej metody jest dostarczenie pojedynczego protokołu przepustowości do analizy metabolitów, lipidów i białek mikrobiologicznych z pojedynczej próbki, tworząc w ten sposób w pełni sparowany zestaw danych do budowy sieci metabolicznych przy jednoczesnym ograniczeniu błędów analitycznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Sekwencyjne pobieranie materii organicznej z gleby, osadów lub torfu

  1. Zebrać glebę, osady lub torf przez rdzeniowanie i podzielić rdzenie zgodnie z testowaną hipotezą (np. głębokość). Próbki należy przechowywać w pojemnikach pokrytych politetrafluoroetylenem i zamrażać w temperaturze -80 °C w celu przechowywania przed analizą.
    UWAGA: Do tego protokołu potrzebne jest około 25 mg C. W przypadku torfu (zwykle 45% C) wymagane jest 50 mg wysuszonego torfu. Większe ilości próbki mogą być potrzebne w przypadku próbek o niskiej zawartości organicznej, takich jak mineralne lub zalesione gleby wyżynne, w zależności od zawartości C (do 5 g). Ponieważ ekstrakcja rozpuszczalnikami organicznymi wciągnie glikol polietylenowy (PEG) do ekstraktów, co negatywnie wpłynie na jonizację na etapie 2.4, ważne jest, aby unikać kontaktu próbek z tworzywem sztucznym w dowolnym momencie podczas pobierania, przechowywania lub ekstrakcji.
  2. Gdy próbki będą gotowe do analizy, należy je zamrozić do stałej masy, a następnie zmielić w szybkoobrotowym młynie kulowym za pomocą kul mielących ze stali nierdzewnej w celu homogenizacji i rozdrobnienia wszelkich kruszyw.
    UWAGA: W tym momencie można wstrzymać działanie protokołu, a materiał przechowywać w temperaturze -80 °C.
  3. Używając naczynia ze stali nierdzewnej przemytego etanolem, podwielokrotność 50 mg każdej z wysuszonych próbek do pojedynczych szklanych fiolek o pojemności 2 ml. Próbki te będą sekwencyjnie ekstrahowane przy użyciu szeregu rozpuszczalników w celu sekwencyjnego ekstrahowania coraz bardziej niepolarnych metabolitów z każdej próbki. Dodać 1 ml destylowanej, odgazowanej wody (H2O) do każdej próbki, zakręcić fiolki i wstrząsać przez 2 godziny na stole do wytrząsania.
  4. Po wstrząśnięciu pozostaw roztwory w temperaturze pokojowej (RT) na 20 minut, następnie odwiruj przy 15 000 x g przez 30 minut, zdekantuj i zachowaj supernatant z każdego z nich.
    UWAGA: Roztwory te będą wstrzykiwane do FTICR-MS przez bezpośrednie wstrzyknięcie.
  5. Przeprowadź ekstrakcję Folch21 (znaną również jako MPLEx20) na pozostałościach ekstrahowanych wodą, powtarzając kroki 1.3 i 1.4, podstawiając 1 ml mieszaniny chloroformu:metanolu o temperaturze -20 °C 4:3 do wody w kroku 1.3.
    UWAGA: Chloroform i metanol są wysoce łatwopalne i toksyczne. Używaj odpowiednich środków ochrony osobistej (PPE), aby uniknąć kontaktu ze skórą i otwartego ognia.
  6. Ostrożnie oddzielić dwie powstałe warstwy rozpuszczalnika, które będą wizualnie rozróżnialne, w celu oddzielnej analizy za pomocą FTICR-MS za pomocą lejka separacyjnego lub po prostu usunąć górną warstwę przez staranne pipetowanie.
    UWAGA: Frakcja zawierająca chloroform będzie znajdować się na dole, podczas gdy frakcja zawierająca metanol jest mniej gęsta i będzie znajdować się na górze.
  7. Rozcieńczyć ekstrakt chloroformowy (etap 1.6) w stosunku 1:1 w metanolu, a ekstrakt wodny (etap 1.4) w stosunku 2:1 w metanolu, aby poprawić wydajność jonizacji elektrorozpylania (ESI) dla FTICR-MS przez bezpośrednie wstrzyknięcie.
    UWAGA: Frakcja zawierająca metanol z kroku 1.7 nie musi być dalej rozcieńczana w metanolu. Warstwa metanolu będzie prowadzona przez bezpośrednie wtryskiwanie na FTICR-MS.

2.Analiza FTICR-MS

  1. Spektrometr FTICR należy skalibrować poprzez bezpośrednie wstrzyknięcie 100 μl roztworu strojeniowego (patrz tabela materiałów) w zakresie mas około 100 - 1,300 Da do FTICR-MS.
  2. Przygotować wzorzec kwasu fulwowego rzeki Suwannee (patrz tabela materiałów), sporządzając roztwór 1 mg ml-1 w ultraczystej przefiltrowanej wodzie, a następnie rozcieńczając otrzymany roztwór do 20 μg mln-1 w metanolu.
  3. Bezpośrednio wstrzyknąć 23 μl tego końcowego roztworu do źródła ESI sprzężonego ze spektrometrem FTICR przez pompę strzykawkową ustawioną na natężenie przepływu 3,0 μl min-1. Ustaw napięcie igły na +4,4 kV, Q1 na 150 m/z, a szklaną kapilarnę na 180 °C. Sprawdź wynikowe widma za pomocą oprogramowania analitycznego (patrz tabela materiałów), aby potwierdzić jakość danych.
  4. Należy użyć metanolu klasy HPLC przed badaniem próbek i przez cały czas pobierania próbek w celu monitorowania przeniesienia. Wprowadzić 23 μl każdego ekstraktu przez bezpośrednie wstrzyknięcie do źródła ESI sprzężonego ze spektrometrem FTICR za pomocą pompy strzykawkowej ustawionej na natężenie przepływu 3,0 μl min-1. Ustawić napięcie igły na +4,4 kV, Q1 na 150 m/z i szklaną kapilarnę na 180 °C.
  5. Dostosuj czas akumulacji jonów (IAT) dla każdej próbki lub grupy próbek, aby uwzględnić zmiany w stężeniu C. Typowe wartości mieszczą się w zakresie od 0,1 do 0,3 s. Zbierz 144 skany dla każdej próbki, uśrednij skany, a następnie przeprowadź wewnętrzną kalibrację przy użyciu homologicznej serii CH2 (tj. separacji 14 Da).
    UWAGA: Po analizie FTICR-MS można podjąć decyzję o połączeniu frakcji ekstrahowanych wodą i metanolem w celu usprawnienia pozostałych etapów lub o oddzieleniu frakcji przez kolejne etapy. Zalety i wady każdego z tych podejść zostały szczegółowo opisane w dyskusji. W takim przypadku należy połączyć frakcje ekstrahowane wodą i metanolem.
  6. Wysuszyć ekstrakty za pomocą koncentratora, a pozostałą część ekstraktów zachować (~ 1 ml) do późniejszej analizy GC-MS (woda, metanol lub woda + metanol), LC-MS (chloroform) i NMR (woda + metanol).
    UWAGA: W tym momencie można wstrzymać protokół, a materiał przechowywać w temperaturze -20 °C.

3. Przetwarzanie danych FTICR-MS

  1. Wyrównaj wszystkie listy pików próbek dla całego zestawu danych, aby zmniejszyć przesunięcia masy i ustandaryzować przypisania pików za pomocą oprogramowania Formularity22 przed przypisaniem formuły.
  2. Użyj oprogramowania Formularity22, aby przypisać wzór cząsteczkowy przy użyciu stosunku sygnału do szumu większego niż 7, błędu pomiaru masy < 1 ppm i dopuszczając C, H, O, N, S i P przy jednoczesnym wykluczeniu wszystkich innych elementów.
  3. Jeżeli dla danej masy zwracanych jest wiele formuł kandydujących (często powyżej 500 Da), należy nałożyć ograniczenia zgodne z materiałem, z którego pobierane jest próbki. Na przykład w torfie typowe ograniczenia obejmują: najniższy błąd masy, najmniejszą liczbę heteroatomów (N, S, P), a jeśli występuje, P musi być w postaci utlenionej (tj. Na każdy atom P we wzorze muszą przypadać co najmniej 4 atomy O).

4. Derywatyzacja chemiczna dla GC-MS

  1. Przygotować ślepe próbki kontrolne heksanu klasy HPLC w fiolkach automatycznego podajnika próbek GC-MS23. Rozpuścić 100 mg mieszaniny estrów metylowych kwasów tłuszczowych (FAMEs: C8 - C28) o wzorcu czasu retencji w 200 μl heksanu.
  2. Aby chronić grupy karbonylowe, dodaj 20 μl 30 mg chlorowodorku metoksyaminy 30 mg mL-1 w pirydynie do każdego z ekstraktów metanolowych i ekstraktów wodnych (lub połączonych ekstraktów metanolowo-wodnych, jeśli używasz) z kroku 2.6, ślepych prób i próbek kalibracyjnych FAME23. Uszczelnić fiolki nakrętkami.
    UWAGA: Pirydyna jest zarówno wysoce toksyczna, jak i łatwopalna. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej, aby zapobiec kontaktowi ze skórą lub oczami i unikać otwartego ognia. Ponadto pirydyna ulatnia się w temperaturze pokojowej, powodując szkodliwe zanieczyszczenie powietrza. Pracuj tylko w dobrze wentylowanych pomieszczeniach pod wyciągiem.
  3. Ekstrakty Vortex przez 20 s. Ekstrakty Sonicate przez 60 s. Następnie inkubować ekstrakty w wirówce w temperaturze 37 °C przez 90 minut w temperaturze 100 x g.
    UWAGA: Nadmierna ilość węglowodanów lub soli może powodować krystalizację metabolitów po wysuszeniu. Sonikacja próbek pomoże odtworzyć skrystalizowane metabolity w odczynniku do derywatyzacji.
  4. Po inkubacji dodać 80 μl N-metylo-N-(trimetylosililo)trifluoroacetamidu z 1% trimetylochlorosilanem do każdej próbki, wirować ekstrakty przez 20 s. Sonikować ekstrakty przez 60 s i ponownie inkubować ekstrakty w wirówce w temperaturze 37 °C przez 30 minut w temperaturze 100 x g.
  5. Schłodzić ekstrakty do temperatury pokojowej (20 - 24 °C), a następnie przenieść do fiolek z automatycznym podajnikiem próbek GC-MS.

5. Analiza GC-MS

  1. Przed analizą należy dostroić i skalibrować MS zgodnie z zaleceniami dostawcy (patrz tabela materiałów), aby upewnić się, że maszyna prawidłowo odczytuje dane MS. Sprawdź, czy ciśnienie helu mieści się w określonej tolerancji.
  2. Oddzielić metabolity polarne w kolumnie GC (30 m × 0,25 mm × 0,25 μm). Ustaw protokół temperatury piekarnika w następujący sposób: (1) temperatura początkowa 60 °C przez 1 minutę, (2) wzrost do 325 °C z szybkością 10 °C min-1 i (3) utrzymanie 325 °C przez 5 minut.
  3. Analizować ekstrakty za pomocą GC sprzężonego z pojedynczym kwadrupolem MS. Ustawić temperaturę portu iniekcyjnego na stałą 250 °C. Wstrzyknąć 1 μl każdego derywatyzowanego ekstraktu w trybie bez rozszczepiania.

6. Przetwarzanie danych GC-MS

  1. Sprawdź wszystkie pliki danych, aby upewnić się, że zostały poprawnie przechwycone. Zwróć uwagę na potencjalne zmiany w odniesieniu do czasów i intensywności przechowywania wewnętrznych wzorców, aby potwierdzić, że dane zostały zebrane w sposób spójny przez cały czas trwania analizy.
  2. W razie potrzeby przekonwertuj format danych MS specyficzny dla dostawcy na ogólny format MS. Przetwarzaj surowe pliki danych za pomocą MetaboliteDetector24, kalibrując wskaźniki retencji w oparciu o wewnętrzne standardy FAME. Po wyrównaniu czasów przechowywania wszystkich plików danych, kontynuuj dekonwolucję i na końcu identyfikację metabolitów, dopasowując wskaźniki retencji i widma GC-MS do biblioteki metabolitów polarnych FiehnLib25.
  3. Porównaj pozostałe niezidentyfikowane metabolity z biblioteką NIST14 GC-MS przy użyciu dopasowania spektralnego. Walidacja identyfikacji jest indywidualna, aby wyeliminować fałszywe identyfikacje i zmniejszyć liczbę błędów dekonwolucji.

7. Analiza NMR stanu ciekłego

  1. Rozcieńczyć pozostałą część ekstraktów wodnych (~ 300 μl) przez 10% (obj./obj.) wzorcem wewnętrznym 5 mM 2,2-dimetylo-2-silapentano-5-sulfonian-d6. Alternatywnie, połącz wodę i ekstrakty metanolowe z kroku 1, a następnie zastąp je ponownie wodą. W ten sposób jednak niektóre lotne związki mogą zostać utracone na etapie liofilizacji. Typowe objętości próbek końcowych mieszczą się w zakresie 180 - 300 μL.
  2. Przenieś mieszaninę do wysokiej jakości probówki NMR ze szkła borokrzemianowego o średnicy zewnętrznej 3 mm.
  3. Zbieraj widma za pomocą spektrometru NMR (najlepiej co najmniej 600 MHz) wyposażonego w 5 mm potrójną rezonansową, tolerancyjną na sól zimną sondę i przedwzmacniacz z zimnym węglem.
  4. Zbierz widma 1D 1H za pomocą eksperymentu 1D z atomową spektroskopią efektu Overhausera (NOESY) w temperaturze 298 K z czasem akwizycji 4 s, opóźnieniem recyklingu 1,5 s, 65 536 punktami zespolonymi i 512 skanami.
  5. Zbierz widma 2D 1 H-13C heterojądrowej korelacji pojedynczego kwantu (HSQC) i 1 H-1H całkowitej korelacji (TOCSY), aby pomóc w przypisaniu metabolitów i walidacji.
  6. Przetwarzaj, przypisuj i analizuj wszystkie widma za pomocą oprogramowania do analizy NMR (patrz Tabela materiałów) w celu ilościowego określenia intensywności w stosunku do wzorca wewnętrznego. Identyfikuj metabolity, dopasowując informacje o przesunięciu chemicznym, sprzężeniu J i intensywności próbek z biblioteką.
    UWAGA: Biblioteka jest dodatkowo wzbogacona o niestandardowe wzorce ukierunkowanych metabolitów i regularne dodawanie metabolitów. W tym momencie można wstrzymać protokół, a materiał przechowywać w temperaturze -20 °C.

8. Analiza lipidomiczna LC-MS

  1. Wysuszony ekstrakt chloroformowy wytworzony w kroku 2.5 należy ponownie zwilżyć 200 μl metanolu.
  2. Wstrzyknąć 10 μl każdego ekstraktu do ultrasprawnego chromatografu cieczowego sprzężonego ze spektrometrem mas Orbitrap przy użyciu hybrydowej kolumny z odwróconą powierzchnią naładowaną fazowo (3,0 mm × 150 mm × wielkości cząstek 1,7 μm). Ustawić 34-minutowy gradient (faza ruchoma A: acetonitryl/H2O(40:60) zawierająca 10 mM octanu amonu; faza ruchoma B: acetonitryl/izopropanol (10:90) zawierający 10 mM octanu amonu) przy natężeniu przepływu 250 μl/min. Używaj zarówno ujemnych, jak i dodatnich trybów jonizacji z dysocjacją zderzeń o wyższej energii i dysocjacją wywołaną zderzeniem.
    UWAGA: Acetonitryl działa drażniąco na oczy, skórę i drogi oddechowe. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej. Ponadto acetonitryl jest palny. Nie dopuścić do kontaktu ze środkami utleniającymi, podczas spalania mogą powstawać toksyczne opary.
  3. Prześlij surowe pliki danych LC-MS/MS do LIQUID wraz z plikiem docelowym (tj. listą > 25 000 gatunków lipidów) dla odpowiedniego trybu jonizacji (dodatniego lub ujemnego). Przetwórz plik RAW. Ręcznie zwaliduj wynikowe identyfikacje, badając widma MS/MS pod kątem obecności jonów diagnostycznych, w stosownych przypadkach, pasujących jonów fragmentacyjnych (np. tłuszczowych łańcuchów acylowych), separacji izotopowej, błędu masy ppm prekursorów i czasu retencji. Eksportuj wynikową listę pewnie zidentyfikowanych lipidów jako plik .tsv.
    UWAGA: W tym momencie można wstrzymać działanie protokołu i przechowywać materiał w temperaturze -20 °C.

9. Analiza proteomiczna

  1. Ekstrahować białka zgodnie z protokołem MPLEx20 z pozostałej części fazy metanolowej wynikającej z kroku 2.4, przemłukując ekstrakt 20-krotnością objętości ekstraktu dodatkowego zimnego (-20 °C) metanolu.
  2. Użyć sorbentu na bazie krzemionki o stężeniu 1 ml/50 mg (patrz tabela materiałów) do kondycjonowania kolumn C18 SPE z 3 ml metanolu, 2 ml 0,1% kwasu trifluorooctowego (TFA) w wodzie, a następnie dodać ekstrakt z kroku 9.1 z szybkością nie większą niż 1 ml/min.
  3. Po dodaniu próbki przemyć kolumnę 4 ml 95:4.9:0,1 woda:acetonitryl:TFA, a następnie pozostawić do wyschnięcia. Umieścić probówkę zbiorczą o pojemności 1,5 ml pod kolumną SPE i wymyć próbkę 1 ml 80:19,9:0,1 metanol:woda:TFA.
  4. Skoncentrować ekstrakty do 100 μl w liofilizatorze wspomaganym próżnią, a następnie zmierzyć stężenie białka za pomocą testu kolorymetrycznego kwasu bicinchoninowego (BCA)26 przy długości fali 562 nm.
  5. Odwirować ekstrakty w temperaturze 10 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić otrzymany supernatant i wysuszyć pozostały osad w próżni przez 5 minut. Zawiesić osad białkowy w wodzie do końcowego stężenia 0,1 μg peptydu na μl.
  6. Dodać ditiotreitol do końcowego stężenia 5 mM i inkubować w temperaturze 60 °C przez 30 minut. Rozcieńczyć 10-krotnie roztworem mocznika NH4HCO3/8M i inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 godziny w obecności 1 mM CaCl2 i trypsyny świńskiej w stosunku enzymu do białka 1:50.
    UWAGA: W tym momencie protokół może zostać wstrzymany i przechowywać materiał w temperaturze -20 °C.
  7. Rozdzielić ekstrakty za pomocą chromatografii cieczowej przy użyciu wykładniczego gradientu 0,1% kwasu mrówkowego w wodnej fazie ruchomej (A) i 0,1% kwasu mrówkowego w ruchomej fazie acetonitrylowej (B) przy 10 kpsi i 500 nL min-1.
  8. Wprowadzić otrzymany eluent do spektrometru mas sprzężonego z ESI, zbierając widma od 400-2 000 m/z z rozdzielczością 100 000 przy m/z 400 w liniowym spektrometrze mas pułapki jonowej (LTQ) Orbitrap.
  9. Konwertuj pliki widm RAW do formatu mzML za pomocą msConvert lub ProteoWizard akceptując wszystkie parametry domyślne. Użyj uniwersalnego narzędzia do wyszukiwania w bazie danych MSGFPlus, aby przeszukać wynikowe proteomy w docelowej bazie danych sekwencji białek przewidywanych na podstawie odpowiednich genomów złożonych w metagenomie.
  10. Dołącz typowe zanieczyszczenia (np. trypsynę, keratynę, albuminę) i usuń wszystkie dokładnie zduplikowane sekwencje białek, aby poprawić statystyki dopasowania peptydu do widma masy. Oceń wynikowe wyniki prawdopodobieństwa spektralnego MSGF, aby określić, które dopasowanie peptydu do widma masy jest najlepsze. Użyj wartości Q z MSGFPlus, aby przefiltrować cały stos danych do 1% współczynnika fałszywych wykryć (FDR).

10. Analiza metabolomiczna i budowanie sieci metabolicznej

  1. Skompilować wszystkie wzory cząsteczkowe metabolitów określone w krokach 3, 6, 7 i 8 w jedną bazę danych metabolitów obecnych w próbkach. Połączyć te metabolity z numerami enzymów określonymi przez Komisję Enzymatyczną (EC) lub KEGG Orthology (KO) określonymi w kroku 9. Przeszukaj ten połączony zestaw danych w bazie danych KEGG27, sekcja szlaków metabolicznych.
  2. Ręczna ocena wyników w celu zidentyfikowania najbardziej prawdopodobnych szlaków i zintegrowania z modelem metabolicznym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przeprowadziliśmy opisany protokół analizy uzupełniającej i porównaliśmy torf z głębokością na torfowisku S1 na stanowisku Spruce and Peatlands Response Under Changing Environments (SPRUCE) w Minnesocie, USA. Wyniki te porównano z wynikami z torfowisk i torfowisk wiecznej zmarzliny z północnej Szwecji, aby pokazać, jak miejsca mogą różnić się pod względem aktywności metabolitów i enzymów. W analizie proteomicznej zidentyfikowaliśmy 3 312 enzymów. Dogłębna analiza aktywności enzymów ujawnia, że liczba enzymów gwałtownie s...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jednoprzepustowy, w pełni sprzężony strumień analityczny wykorzystywany do charakteryzowania metabolitów i proteomu zapewnia wgląd w szlaki, za pomocą których zachodzi cykl C w złożonym ekosystemie. Gleba i torf są matrycami niejednorodnymi, dlatego jeden z krytycznych etapów tej metody zachodzi na najwcześniejszych etapach w celu zapewnienia, że wyjściowy torf lub materiał glebowy jest wysoce jednorodny. Zaleca się dokładne zmielenie próbki, ponieważ kruszywa mogą zmniejszyć wydajność ekstrakcji. Jest to szczególny prob...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować J.P. Chantonowi, J.E. Kostkce i M.M. Kołtonowi za pomoc w zbieraniu próbek torfu. Część tych prac została przeprowadzona w Environmental Molecular Sciences Laboratory, Biurze Naukowym DOE sponsorowanym przez Biuro Badań Biologicznych i Środowiskowych. PNNL jest obsługiwany przez Battelle dla DOE na podstawie umowy DE-AC05-76RL01830. Prace te były wspierane przez Departament Energii Stanów Zjednoczonych, Biuro Nauki oraz Biuro Badań Biologicznych i Środowiskowych (granty: DE-AC05-00OR22725, DE-SC0004632, DESC0010580, DE-SC0012088 i DE-SC0014416).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
chlorowodorek metoksyaminySigma Aldrich226904środek do pochodnej
mm potrójny rezonans tolerancyjny na zimno sonda tolerująca sól OprzyrządowanieBruker
kapilarna kolumna GC HP-5MS kolumna (30 m & razy 0,25 mm & razy 0,25 μ m)Oprzyrządowanie AgilentAG19091S-433hybrydowa kolumna
z odwróconą powierzchnią naładowaną fazowo (3,0 mm i czasy; 150 mm & razy; 1,7 μ m wielkość cząstek)OprzyrządowanieThermoFisher
ml szklane fiolkiVWR International46610-722fiolki na próbki
z automatycznym sampleremVWR International97055-324; 9467671fiolki na próbki
ChloroformVWR InternationalJT9174-3
rozpuszczalnik EtanolVWR InternationalBDH67002.400rozpuszczalnik
metanolVWR InternationalBDH85681.400rozpuszczalnik
pirydynaVWR InternationalBDH67007.400rozpuszczalnik
2,2-dimetylo-2-silapentano-5-sulfonian-d6Sigma Aldrich178837standardowy
ester metylowy kwasów tłuszczowych C8-C24Sigma AldrichCRM18918standard
N-metylo-N- (trimetylosililo)trifluoroacetamidSigma Aldrich24589-78-4standard
kwasu fulwowego rzeki SuwaneeMiędzynarodowe towarzystwo substancji humusowych2S101Fstandard
trimetylochlorosilanSigmaAldrich 89595standardowe
rozwiązanie tuningoweOprogramowanie analityczne Agilent
FTICR-MSBrukerCompass DataAnalysis 4.1
Oprogramowanie FormularityPacific Northwest National LaboratoryFormularitydostępne do pobrania pod adresem: https://omics.pnl.gov/software/formularity
GC-MSAgilentAgilent GC 7890A z sorbentem na bazie krzemionki MSD 5975C
Phenomenex (Torrance, CA)Strata C18-E (PN 8E-S001-DAK)
RURKA NMR 3MM 8 150 CS5VWR InternationalKT897820-0008Rurka NMR
Spektrometr NMR Varian Direct Drive 600 MHz Varian InovaSpektrometr NMR600 MHz z napędem bezpośrednim
Chenomx NMR Suite 8.3Pakiet ChenomxNMR OprogramowanieNMR
Ultra-sprawny chromatograf cieczowy wodyAquity UPLC H chromatograf cieczowy 
Spektrometr masowy Velos-ETD Orbitrap Spektrometr masowy ThermoFisherThermo Scientific LTQ Orbitrap Velos 
5 2 , Varian

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bridgham, S. D., Megonigal, P. J., Keller, J. K., Bliss, N. B., Trettin, C. The carbon balance of North American wetlands. Wetlands. 26 (4), 889-916 (2006).
  2. Wilson, R. M., et al. Greenhouse gas balance over thaw-freeze cycles in discontinuous zone permafrost. Journal of Geophysical Research: Biogeosciences. 122 (2), 387-404 (2017).
  3. Broder, T., Knorr, K. H., Biester, H. Changes in dissolved organic matter quality in a peatland and forest headwater stream as a function of seasonality and hydrologic conditions. Hydrology and Earth System Sciences. 21 (4), 2035-2051 (2017).
  4. Ejarque, E., et al. Quality and reactivity of dissolved organic matter in a Mediterranean river across hydrological and spatial gradients. Science of The Total Environment. 599, 1802-1812 (2017).
  5. Valenzuela, E. I., et al. Anaerobic methane oxidation driven by microbial reduction of natural organic matter in a tropical wetland. Applied and Environmental Microbiology. 83 (11), e00645-e00617 (2017).
  6. Lehmann, J., Kleber, M. The contentious nature of soil organic matter. Nature. 528 (7580), 60-68 (2015).
  7. Keiluweit, M., Nico, P. S., Kleber, M., Fendorf, S. Are oxygen limitations under recognized regulators of organic carbon turnover in upland soils? Biogeochemistry. 127 (2-3), 157-171 (2016).
  8. LaRowe, D. E., Van Cappellen, P. Degradation of natural organic matter: A thermodynamic analysis. Geochimica et Cosmochimica Acta. 75 (8), 2030-2042 (2011).
  9. Wilson, R. M., et al. Hydrogenation of organic matter as a terminal electron sink sustains high CO2: CH4 production ratios during anaerobic decomposition. Organic Geochemistry. 112, 22-32 (2017).
  10. Ye, R., Jin, Q., Bohannan, B., Keller, J. K., Bridgham, S. D. Homoacetogenesis: A potentially underappreciated carbon pathway in peatlands. Soil Biology and Biochemistry. 68, 385-391 (2014).
  11. Neubauer, S. C., Megonigal, J. P. Moving beyond global warming potentials to quantify the climatic role of ecosystems. Ecosystems. 18 (6), 1000-1013 (2015).
  12. Ma, S., et al. Data-Constrained Projections of Methane Fluxes in a Northern Minnesota Peatland in Response to Elevated CO2 and Warming. Journal of Geophysical Research: Biogeosciences. 122 (11), 2841-2861 (2017).
  13. Conrad, R. Contribution of hydrogen to methane production and control of hydrogen concentrations in methanogenic soils and sediments. Federation of European Microbiological Societies Microbiology Ecology. 28 (3), 193-202 (1999).
  14. Cunada, C. L., Lesack, L. F. W., Tank, S. E. Seasonal dynamics of dissolved methane in lakes of the Mackenzie Delta and the role of carbon substrate quality. Journal of Geophysical Research: Biogeosciences. 123 (2), 591-609 (2018).
  15. Wilson, R. M., Tfaily, M. M. Advanced molecular techniques provide new rigorous tools for characterizing organic matter quality in complex systems. Journal of Geophysical Research: Biogeosciences. 123 (6), 1790-1795 (2018).
  16. Borton, M. A., et al. Coupled laboratory and field investigations resolve microbial interactions that underpin persistence in hydraulically fractured shales. Proceedingsof the National Academy of Sciences. 115 (28), E6585-E6659 (2018).
  17. Tang, K., Page, J. S., Smith, R. D. Charge competition and the linear dynamic range of detection in electrospray ionization mass spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 15 (10), 1416-1423 (2004).
  18. Boiteau, R. M., et al. Structure Elucidation of Unknown Metabolites in Metabolomics by Combined NMR and MS/MS Prediction. Metabolites. 8 (1), 8(2018).
  19. Walker, L. R., et al. Unambiguous Metabolite Identification in High-throughput Metabolomics by Hybrid 1DNMR/ESI MS Approach. Magnetic Resonance in Chemistry. 54 (12), 998-1003 (2016).
  20. Nicora, C. D., Burnum-Johnson, K. E., Nakayasu, E. S., Casey, C. P., White III, R. A., Roy Chowdhury, T., Kyle, J. E., Kim, Y. M., Smith, R. D., Metz, T. O., Jansson, J. K., Baker, E. S. The MPLEx Protocol for Multi-omic Analyses of Soil Samples. J. Vis. Exp. (135), e57343(2018).
  21. Folch, J., Lees, M., Sloane-Stanley, G. H. Extraction of fatty acid. Journal of Biological Chemistry. 226, 497-509 (1957).
  22. Tolic, N., et al. Formularity: software for automated formula assignment of natural and other organic matter from ultrahigh-resolution mass spectra. Analytical Chemistry. 89 (23), 12659-12665 (2017).
  23. Kim, Y. M., et al. Diel metabolomics analysis of a hot spring chlorophototrophic microbial mat leads to new hypotheses of community member metabolisms. Frontiers in microbiology. 6, 209(2015).
  24. Hiller, K., et al. MetaboliteDetector: comprehensive analysis tool for targeted and nontargeted GC/MS based metabolome analysis. Analytical Chemistry. 81 (9), 3429-3439 (2009).
  25. Kind, T., et al. FiehnLib: mass spectral and retention index libraries for metabolomics based on quadrupole and time-of-flight gas chromatography/mass spectrometry. Analytical Chemistry. 81 (24), 10038-10048 (2009).
  26. Kyle, J. E., et al. LIQUID: an-open source software for identifying lipids in LC-MS/MS-based lipidomics data. Bioinformatics. 33 (11), 1744-1746 (2017).
  27. Kanehisa, M. Enzyme annotation and metabolic reconstruction using KEGG. Protein Function Prediction: Methods and Protocols. 1611, 135-145 (2017).
  28. Van Krevelen, D. W. Graphical-statistical method for the study of structure and reaction processes of coal. Fuel. 29, 269-284 (1950).
  29. Hodgkins, S. B., et al. Changes in peat chemistry associated with permafrost thaw increase greenhouse gas production. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (16), 5819-5824 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Natural Organic MatterFTICR MS AnalysisGC MS AnalysisNMR SpectroscopyLC MS AnalysisProteomics AnalysisSequential ExtractionMPLEx ExtractionMetabolite CharacterizationPeatland Samples

Powiązane artykuły