Method Article

Jednoprzepustowe komplementarne techniki analityczne o wysokiej rozdzielczości do charakteryzowania złożonych mieszanin naturalnej materii organicznej

DOI:

10.3791/59035

⸱

January 7th, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Environmental Molecular Sciences Laboratory, Pacific Northwest National Laboratory, 2Department of Soil, Water and Environmental Science, University of Arizona, 3Department of Earth Ocean and Atmospheric Sciences, Florida State University, 4Bruker Daltonics Inc., 5Biological Sciences Division, Pacific Northwest National Laboratory

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje pojedynczą przepustowość dla uzupełniających technik analitycznych i omicznych, której kulminacją jest w pełni sparowana charakterystyka naturalnej materii organicznej i proteomiki mikrobiologicznej w różnych ekosystemach. Podejście to pozwala na solidne porównania w celu identyfikacji szlaków i przemian metabolicznych ważnych dla opisu produkcji gazów cieplarnianych i przewidywania reakcji na zmiany środowiskowe.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Naturalna materia organiczna (NOM) składa się z wysoce złożonej mieszaniny tysięcy związków organicznych, które historycznie okazały się trudne do scharakteryzowania. Jednakże, aby zrozumieć termodynamiczne i kinetyczne kontrole produkcji gazów cieplarnianych (dwutlenku węgla [CO2] i metanu [CH4]) wynikających z rozkładu NOM, konieczna jest charakterystyka na poziomie molekularnym w połączeniu z analizami proteomu mikrobiologicznego. Co więcej, oczekuje się, że zmiany klimatyczne i środowiskowe zakłócą naturalne ekosystemy, potencjalnie zakłócając złożone interakcje, które wpływają zarówno na dostarczanie substratów materii organicznej, jak i na mikroorganizmy dokonujące przemian. Szczegółowa charakterystyka molekularna materii organicznej, proteomiki drobnoustrojów oraz szlaków i przemian, w wyniku których materia organiczna ulega rozkładowi, będzie niezbędna do przewidzenia kierunku i wielkości skutków zmian środowiskowych. W artykule opisano metodologiczną przepustowość do kompleksowej charakterystyki metabolitów w pojedynczej próbce za pomocą spektrometrii mas rezonansu cyklotronowego z transformacją jonową Fouriera z bezpośrednim wtryskiem (FTICR-MS), chromatografii gazowej ze spektrometrią mas (GC-MS), spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR), spektrometrii mas chromatografii cieczowej (LC-MS) i analizy proteomicznej. Rezultatem tego podejścia jest w pełni sparowany zestaw danych, który zwiększa pewność statystyczną przy wnioskowaniu o szlakach rozkładu materii organicznej, wynikającym z tego tempie produkcji CO2 i CH4 oraz ich reakcjach na perturbacje środowiskowe. W niniejszej pracy przedstawiono wyniki zastosowania tej metody do próbek NOM pobranych z torfowisk; jednak protokół ma zastosowanie do każdej próbki NOM (np. torfu, gleb leśnych, osadów morskich itp.).

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szacuje się, że tereny podmokłe zawierają 529 Pg węgla (C), głównie w postaci organicznego węgla zakopanego w złożach torfu1. Obecnie takie torfowiska działają jak pochłaniacz C netto, sekwestrując 29 Tg C y-1 w samej Ameryce Północnej1. Jednak zakłócenia środowiskowe, takie jak drenaż, pożary, susze i wyższe temperatury, mogą zrównoważyć ten pochłaniacz C poprzez zwiększenie rozkładu materii organicznej, co skutkuje zwiększonymi stratami węgla w wyniku produkcji gazów cieplarnianych (dwutlenku węgla [CO2] i metanu [CH4]) 1,2

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Sekwencyjne pobieranie materii organicznej z gleby, osadów lub torfu

  1. Zebrać glebę, osady lub torf przez rdzeniowanie i podzielić rdzenie zgodnie z testowaną hipotezą (np. głębokość). Próbki należy przechowywać w pojemnikach pokrytych politetrafluoroetylenem i zamrażać w temperaturze -80 °C w celu przechowywania przed analizą.
    UWAGA: Do tego protokołu potrzebne jest około 25 mg C. W przypadku torfu (zwykle 45% C) wymagane jest 50 mg wysuszonego torfu. Większe ilości próbki mogą być potrzebne w przypadku próbek o niskiej zawartości organicznej, takich jak mineralne lub zalesione gleby wyżynne, w zależności od zawartości C (do 5 g)....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przeprowadziliśmy opisany protokół analizy uzupełniającej i porównaliśmy torf z głębokością na torfowisku S1 na stanowisku Spruce and Peatlands Response Under Changing Environments (SPRUCE) w Minnesocie, USA. Wyniki te porównano z wynikami z torfowisk i torfowisk wiecznej zmarzliny z północnej Szwecji, aby pokazać, jak miejsca mogą różnić się pod względem aktywności metabolitów i enzymów. W analizie proteomicznej zidentyfikowaliśmy 3 312 enzymów. Dogłębna analiza aktywności enzymów ujawnia, że liczba enzymów gwałtownie s.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jednoprzepustowy, w pełni sprzężony strumień analityczny wykorzystywany do charakteryzowania metabolitów i proteomu zapewnia wgląd w szlaki, za pomocą których zachodzi cykl C w złożonym ekosystemie. Gleba i torf są matrycami niejednorodnymi, dlatego jeden z krytycznych etapów tej metody zachodzi na najwcześniejszych etapach w celu zapewnienia, że wyjściowy torf lub materiał glebowy jest wysoce jednorodny. Zaleca się dokładne zmielenie próbki, ponieważ kruszywa mogą zmniejszyć wydajność ekstrakcji. Jest to szczególny prob.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować J.P. Chantonowi, J.E. Kostkce i M.M. Kołtonowi za pomoc w zbieraniu próbek torfu. Część tych prac została przeprowadzona w Environmental Molecular Sciences Laboratory, Biurze Naukowym DOE sponsorowanym przez Biuro Badań Biologicznych i Środowiskowych. PNNL jest obsługiwany przez Battelle dla DOE na podstawie umowy DE-AC05-76RL01830. Prace te były wspierane przez Departament Energii Stanów Zjednoczonych, Biuro Nauki oraz Biuro Badań Biologicznych i Środowiskowych (granty: DE-AC05-00OR22725, DE-SC0004632, DESC0010580, DE-SC0012088 i DE-SC0014416).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
chlorowodorek metoksyaminySigma Aldrich226904środek do pochodnej
mm potrójny rezonans tolerancyjny na zimno sonda tolerująca sól OprzyrządowanieBruker
kapilarna kolumna GC HP-5MS kolumna (30 m & razy 0,25 mm & razy 0,25 μ m)Oprzyrządowanie AgilentAG19091S-433hybrydowa kolumna
z odwróconą powierzchnią naładowaną fazowo (3,0 mm i czasy; 150 mm & razy; 1,7 μ m wielkość cząstek)OprzyrządowanieThermoFisher
ml szklane fiolkiVWR International46610-722fiolki na próbki
z automatycznym sampleremVWR International97055-324; 9467671fiolki na próbki
ChloroformVWR InternationalJT9174-3
rozpuszczalnik EtanolVWR InternationalBDH67002.400rozpuszczalnik
metanolVWR InternationalBDH85681.400rozpuszczalnik
pirydynaVWR InternationalBDH67007.400rozpuszczalnik
2,2-dimetylo-2-silapentano-5-sulfonian-d6Sigma Aldrich178837standardowy
ester metylowy kwasów tłuszczowych C8-C24Sigma AldrichCRM18918standard
N-metylo-N- (trimetylosililo)trifluoroacetamidSigma Aldrich24589-78-4standard
kwasu fulwowego rzeki SuwaneeMiędzynarodowe towarzystwo substancji humusowych2S101Fstandard
trimetylochlorosilanSigmaAldrich 89595standardowe
rozwiązanie tuningoweOprogramowanie analityczne Agilent
FTICR-MSBrukerCompass DataAnalysis 4.1
Oprogramowanie FormularityPacific Northwest National LaboratoryFormularitydostępne do pobrania pod adresem: https://omics.pnl.gov/software/formularity
GC-MSAgilentAgilent GC 7890A z sorbentem na bazie krzemionki MSD 5975C
Phenomenex (Torrance, CA)Strata C18-E (PN 8E-S001-DAK)
RURKA NMR 3MM 8 150 CS5VWR InternationalKT897820-0008Rurka NMR
Spektrometr NMR Varian Direct Drive 600 MHz Varian InovaSpektrometr NMR600 MHz z napędem bezpośrednim
Chenomx NMR Suite 8.3Pakiet ChenomxNMR OprogramowanieNMR
Ultra-sprawny chromatograf cieczowy wodyAquity UPLC H chromatograf cieczowy 
Spektrometr masowy Velos-ETD Orbitrap Spektrometr masowy ThermoFisherThermo Scientific LTQ Orbitrap Velos 
5 2 , Varian

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bridgham, S. D., Megonigal, P. J., Keller, J. K., Bliss, N. B., Trettin, C. The carbon balance of North American wetlands. Wetlands. 26 (4), 889-916 (2006).
  2. Wilson, R. M., et al. Greenhouse gas balance over thaw-freeze cycles in discontinuous zone per....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Natural Organic MatterFTICR MS AnalysisGC MS AnalysisNMR SpectroscopyLC MS AnalysisProteomics AnalysisSequential ExtractionMPLEx ExtractionMetabolite CharacterizationPeatland Samples

Related Articles