Artykuł metodologiczny

Monitorowanie przeżycia neuronów za pomocą podłużnej mikroskopii fluorescencyjnej

DOI:

10.3791/59036

⸱

19 stycznia 2019

 ,  ,  , 
1Department of Neurology, University of Michigan School of Medicine, 2Neuroscience Graduate Program, University of Michigan School of Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół monitorowania przeżywalności na podstawie pojedynczej komórki i identyfikowania zmiennych, które znacząco przewidują śmierć komórki.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Standardowe testy cytotoksyczności, które wymagają pobrania lizatów lub stałych komórek w wielu punktach czasowych, mają ograniczoną czułość i zdolność do oceny czynników wpływających na los neuronów. Testy te wymagają obserwacji oddzielnych populacji komórek w dyskretnych punktach czasowych. W rezultacie, poszczególne komórki nie mogą być śledzone prospektywnie w czasie, co poważnie ogranicza zdolność do rozróżnienia, czy zdarzenia subkomórkowe, takie jak tworzenie się puncta lub błędna lokalizacja białka, są patogennymi czynnikami choroby, odpowiedziami homeostatycznymi, czy tylko przypadkowymi zjawiskami. Mikroskopia podłużna pojedynczych komórek przezwycięża te ograniczenia, pozwalając badaczowi określić różnice w przeżywalności między populacjami i narysować związki przyczynowo-skutkowe ze zwiększoną czułością. Ten przewodnik wideo przedstawi reprezentatywny przebieg eksperymentów mierzących przeżywalność pojedynczych komórek pierwotnych neuronów korowych szczurów wykazujących ekspresję fluorescencyjnego markera białkowego. Widz dowie się, jak osiągać wysokiej wydajności transfekcji, zbierać i przetwarzać obrazy umożliwiające prospektywne śledzenie pojedynczych komórek oraz porównywać względne przeżycie populacji neuronów za pomocą analizy proporcjonalnych zagrożeń Coxa.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nieprawidłowa śmierć komórek jest czynnikiem napędzającym wiele chorób, w tym raka, neurodegenerację i udar mózgu1. Solidne i czułe testy śmierci komórki są niezbędne do scharakteryzowania tych zaburzeń, a także do opracowania strategii terapeutycznych w celu wydłużenia lub zmniejszenia przeżycia komórek. Obecnie istnieją dziesiątki technik pomiaru śmierci komórki, zarówno bezpośrednio, jak i za pomocą markerów zastępczych2. Na przykład śmierć komórki można ocenić wizualnie za pomocą ważnych barwników, które selektywnie barwią martwe lub żywe komórki3, lub monitorując pojawienie się określonych fosfolipidów na błonie komórkowej4,5,6. Pomiary składników wewnątrzkomórkowych lub metabolitów komórkowych uwalnianych do pożywki po rozpuszczeniu komórkowym mogą być również używane jako wskaźniki zastępcze dla śmierci komórki7,8. Alternatywnie, żywotność komórek można przybliżyć, oceniając aktywność metaboliczną9,10. Chociaż metody te zapewniają szybkie sposoby oceny przeżywalności komórek, nie są pozbawione zastrzeżeń. Każda technika polega na obserwacji kultury jako pojedynczej populacji, co uniemożliwia rozróżnienie poszczególnych komórek i ich unikalnych wskaźników przeżycia. Co więcej, takie testy populacyjne nie są w stanie zmierzyć czynników, które mogą być ważne dla śmierci komórki, w tym morfologii komórki, ekspresji białka lub lokalizacji. W wielu przypadkach testy te są ograniczone do dyskretnych punktów czasowych i nie pozwalają na ciągłą obserwację komórek w czasie.

W przeciwieństwie do tego, podłużna mikroskopia fluorescencyjna jest wysoce elastyczną metodologią, która bezpośrednio i stale monitoruje ryzyko zgonu na podstawie pojedynczej komórki11. Krótko mówiąc, podłużna mikroskopia fluorescencyjna umożliwia śledzenie tysięcy pojedynczych komórek w regularnych odstępach czasu przez dłuższy czas, umożliwiając precyzyjne określenie śmierci komórki i czynników, które zwiększają lub hamują śmierć komórki. U podstaw metody leży przejściowa transfekcja lub transdukcja komórek z wektorami kodującymi białka fluorescencyjne. Następnie ustalany jest unikalny powiernik, a pozycja każdej transfekowanej komórki w stosunku do tego punktu orientacyjnego pozwala użytkownikowi na obrazowanie i śledzenie poszczególnych komórek w ciągu godzin, dni lub tygodni. Gdy obrazy te są oglądane sekwencyjnie, śmierć komórki jest naznaczona charakterystycznymi zmianami we fluorescencji, morfologii i fragmentacji ciała komórki, co umożliwia przypisanie czasu śmierci każdej komórce. Obliczony współczynnik zgonów, określony przez funkcję hazardu, może być następnie ilościowo porównany między warunkami lub powiązany z wybranymi cechami komórkowymi za pomocą jednowymiarowej lub wielowymiarowej analizy proporcjonalnego hazardu Coxa12. Razem podejścia te umożliwiają dokładne i obiektywne rozróżnianie wskaźników śmierci komórek w populacjach komórkowych oraz identyfikację zmiennych, które w istotny sposób przewidują śmierć komórki i/lub przeżycie (Rysunek 1).

Chociaż ta metoda może być używana do monitorowania przeżywalności w dowolnym typie komórek post-mitotycznych w różnych formatach posiewu, ten protokół będzie opisywał warunki transfekcji i obrazowania neuronów korowych szczurów hodowanych na 96-dołkowej płytce.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie prace nad kręgowcami zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Użytkowania i Opieki nad Zwierzętami na Uniwersytecie Michigan (protokół # PRO00007096). Eksperymenty są starannie zaplanowane, aby zminimalizować liczbę uśmiercanych zwierząt. Ciężarne samice szczurów Long Evans (WT), nietransgenicznych (Rattus norvegicus) są trzymane pojedynczo w komorach wyposażonych we wzbogacanie środowiska i pod opieką Jednostki Medycyny Zwierząt Laboratoryjnych (ULAM) na Uniwersytecie Michigan, zgodnie z wspieranym przez NIH Przewodnikiem dotyczącym opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych. Wszystkie szczury były trzymane w rutynowych pomieszczeniach tak krótko, jak to możliwe przed eutanazją, zgodnie z zaleceniami Wytycznych dotyczących eutanazji Amerykańskiego Towarzystwa Lekarzy Weterynaryjnych i Wytycznych Uniwersytetu Michigan dotyczących metod eutanazji według gatunków.

1. Przygotowanie materiału

  1. Wypreparuj neurony korowe od embrionalnych dni 19–20 szczeniąt szczurów i hoduj neurony korowe szczurów w 0,5 x 106 komórek na mililitr na płytkach pokrytych poli-D-lizyną przez 4 dni in vitro, jak opisano wcześniej13,14,15,16,17,18,19.
  2. Przygotuj interesujące Cię plazmidowe DNA, postępując zgodnie z krokami opisanymi przez zestaw do izolacji plazmidowego DNA bez endotoksyn (patrz Tabela materiałów). Określić ilościowo otrzymany DNA za pomocą spektrofotometru.
  3. W 4. dniu in vitro (DIV4) podwielokrotnie, przesączyć, sterylizować i inkubować następujące pożywki w temperaturze 37 °C: 6 ml zredukowanej pożywki surowicy (RSM; np. OptiMEM), 25 ml neuronalnej pożywki podstawowej (NBM), 40 ml NBKY (NBM + 1 mM kwas kynureninowy + 10 mM MgCl2, dostosowany do pH 7,4), 10 ml NBC (NBM + 1x suplement do hodowli komórek neuronalnych + 1x suplement L-glutaminy + 1x Pen Strep).
    nuta: Podane objętości są wystarczające do transfekcji jednej płytki 96-dołkowej. Zapoznaj się z Tabelą materiałów, aby zapoznać się z konkretnymi odczynnikami.

2. Transfekcja neuronów kory mózgowej szczura

  1. Zmodyfikuj dostarczony przykładowy arkusz transfekcji (patrz plik uzupełniający 1), dostosowując typ płytki, mapę płyty, liczbę DNA, stężenie DNA i liczbę dołków (zielone pola).
    nuta: Całkowite DNA sumuje się do 0,2 μg na studzienkę, niezależnie od tego, czy do każdego dołka dodaje się jeden (np. DNA A) lub wiele (np. DNA B i C) konstruktów DNA.
  2. Pracując z arkusza kalkulacyjnego, połącz odpowiednią ilość RSM i DNA w jednej probówce. Połączyć odpowiednią ilość RSM i odczynnika do transfekcji (np. Lipofektaminy) w osobnej probówce.
  3. Inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 5 minut.
  4. Połączyć mieszaniny DNA i odczynnika do transfekcji RSM i inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
  5. Podczas tego etapu inkubacji należy użyć pipety wielokanałowej i sterylnych plastikowych koryt, aby przemyć komórki 2x po 100 μl na studzienkę NBM. Zachowaj kondycjonowaną pożywkę (CM) i przechowuj w temperaturze 37 °C. W tym i następnych krokach należy zadbać o to, aby zminimalizować czas, w którym neurony są wystawione na działanie powietrza.
  6. Usuń pożywkę NBM i zastąp ją 100 μl na studzienkę NBKY.
  7. Po upływie 20 minut dodać kroplami 50 μl mieszaniny odczynnika do transfekcji/DNA do każdej studzienki.
  8. Inkubować komórki z odczynnikiem do transfekcji/kompleksami DNA przez 20 minut w temperaturze 37 °C.
  9. Przepłukać 2x NBKY i zastąpić 100 μl CM i 100 μL NBC na studzienkę.
  10. Pomyślnie transfekowane komórki powinny być widoczne pod mikroskopią fluorescencyjną w ciągu 16–24 godzin od transfekcji. Aby ocenić skuteczność, użyj mikroskopu fluorescencyjnego, aby sprawdzić transfekcję po całonocnej inkubacji w temperaturze 37 °C.
    nuta: Ta technika daje ogólną skuteczność transfekcji od 5 do 10%.

3. Obrazowanie

  1. Umieść płytkę na mikroskopie fluorescencyjnym z zmotoryzowanym stolikiem i ustal powiernik (np. znak na spodzie płytki), który pozwoli użytkownikowi wyrównać płytkę za każdym razem, gdy jest ona obrazowana. Zapisz obraz tego powiernika w celach informacyjnych.
  2. Przejdź do interesującego Cię pola i zanotuj współrzędne x-y względem powiernika.
  3. Skoncentruj się na transfekowanych komórkach wykazujących ekspresję znacznika fluorescencyjnego.
  4. Wykonaj obrazy fluorescencyjne w odpowiednim kanale lub kanałach (np. białko czerwonej fluorescencji [RFP], białko zielonej fluorescencji [GFP], 4′,6-diamidino-2-fenyloindol [DAPI]), ręcznie lub w sposób zautomatyzowany. Wykonując kilka zdjęć w regularnych odstępach czasu, można zmontować montaż studzienki podczas przetwarzania obrazu (patrz krok 4).
    nuta: Odstępy zależą od kilku czynników, w tym powiększenia, optyki mikroskopu i wielkości detektora. Ogólnie rzecz biorąc, odstępy optyczne między sąsiednimi obrazami będą wynosić od 90 do 95% rozmiaru każdego pojedynczego obrazu, aby umożliwić niewielki stopień nakładania się obrazu i wyrównania cech.
  5. Powtarzaj ten proces tak często, jak to konieczne, za każdym razem dostosowując się do pierwotnego powiernika. W celu analizy przeżycia obrazowanie odbywa się co 6–24 godziny, w zależności od typu komórki i celu eksperymentu.

4. Przetwarzanie obrazu

UWAGA: Po akwizycji obrazu, przed analizą obrazu wymagana jest seria etapów przetwarzania. Należą do nich między innymi zszywanie, układanie w stosy i odejmowanie tła (Rysunek 1). Celem tych kroków jest utworzenie stosu obrazów lub szeregów czasowych, w których komórki są wyraźnie odróżnialne od tła i łatwe do śledzenia w wielu punktach czasowych. Dedykowane makro FIJI (Image_Processing.ijm, patrz Plik uzupełniający 2) wykonuje podstawowe zszywanie, układanie w stosy i odejmowanie tła. Wyjaśnienie każdego kroku i parametrów, które należy wziąć pod uwagę podczas przetwarzania obrazu, znajduje się w sekcji dyskusji.

  1. Dostosuj nieprzetworzone dane lub katalog wejściowy, aby pasowały do formatowania pokazanego w Rysunek 2.
  2. Jeśli punkty czasowe nie są ciągłe (np. T1, T2, T3), zmień nazwy tych folderów tak, aby były. Ten krok ma kluczowe znaczenie, aby upewnić się, że makro Image_Processing nie ulega awarii podczas układania w stos.
  3. Kliknij dwukrotnie ikonę Fidżi, aby otworzyć program, a następnie kliknij i przeciągnij makro Image_Processing na pasek Fidżi. Spowoduje to otwarcie makra na Fidżi.
  4. Dostosuj wiersze 2-7 makra Image_Processing, aby określić katalog wejściowy zawierający obrazy, żądany katalog wyjściowy dla obrazów zszytych i ułożonych w stos, liczbę punktów czasowych obrazowania, liczbę kanałów fluorescencyjnych i format płyty.
  5. Określ kolejność, w jakiej obrazy zostały pobrane. Aby to przetestować, ręcznie zszyj montaż obrazów na FIDŻI, manewrując do menu rozwijanego Wtyczki | Szwy | Szwy siatkowe/kolekcjonerskie. Dostosuj ustawienia w menu rozwijanych Typ i Kolejność, aż zostanie utworzony dokładnie zszyty obraz.
  6. Dostosuj zmienne GRID_TYPE i STITCH_ORDER w wierszach 8 i 9 makra Image_Processing, aby dopasować je do tych wyborów.
  7. Określ liczbę obrazów na studzienkę, dostosowując linię 10 w Image_Processing macro.
    nuta: W przypadku montażu obrazów 2 x 2 ten wiersz będzie brzmiał DIM = 2.
  8. Jeśli wymagane jest odejmowanie tła, dostosuj wiersz 14 w makrze Image_Processing do BGSUB = true.
  9. Ustaw promień toczącej się kulki, dostosowując linię 15 w makro Image_Processing.
    nuta: Aby uzyskać optymalne wyniki, ustaw promień na co najmniej średnicę największego obiektu pierwszego planu na obrazie.
  10. Kliknij przycisk Uruchom, aby uruchomić makro Image_Processing. Po uruchomieniu Image_Processing automatycznie przejdzie przez zszywanie, układanie w stosy i odejmowanie tła.

5. Punktacja śmierci komórki

UWAGA: Zobacz sekcję Dyskusja, aby uzyskać więcej informacji na temat oceny śmierci komórki i cenzurowania danych.

  1. Zlokalizuj stosy obrazów utworzone przez skrypt Image_Processing. Otwórz je na FIDŻI.
  2. Użyj narzędzia punktowego w FIDŻI, aby indywidualnie oznaczyć każdą komórkę liczbą. Naciśnięcie t po każdym punkcie spowoduje dodanie identyfikatora komórki do Menedżera ROI (regionu zainteresowania).
    nuta: Identyfikatory można wizualizować, klikając etykiety i wyświetlając wszystkie pola wyboru w Menedżerze ROI.
  3. Przejdź przez punkty czasowe w każdym stosie obrazów i zapisz punkt czasowy, w którym każda komórka albo umiera, albo musi zostać ocenzurowana w pliku Survival_spreadsheet.csv (patrz Plik uzupełniający 3).
    1. Każda komórka zajmuje pojedynczy wiersz w arkuszu kalkulacyjnym, w którym unikalny identyfikator (ID) dla każdej komórki składa się z odpowiadającego jej źródła i liczby zwrotu z inwestycji w tym źródle. tp_death jest ostatnim punktem czasowym, w którym zaobserwowano, że komórka jest żywa, podczas gdy time_death reprezentuje rzeczywisty czas śmierci w godzinach. Dla każdej komórki wprowadź te dane. Bardzo ważne jest utrzymanie tej struktury do późniejszej analizy z wykorzystaniem przeżycia. R (patrz plik uzupełniający 4).
      UWAGA: Kryteria określania śmierci komórki są kluczowe i mogą się różnić w zależności od typu komórki. Trzy główne kryteria są używane do identyfikacji martwych neuronów11,20 (Rysunek 3): utrata intensywności fluorescencji (np. Neuron 1 po 69 godzinach), zaokrąglenie ciała komórki (np. Neuron 2 po 188 godzinach) oraz utrata integralności neurytów lub pęcherzyki (np. Neuron 2 po 188 godzinach).
  4. Zapisz status cenzury komórki w ostatniej kolumnie.
    nuta: Tutaj, ze względu na specyficzny sposób, w jaki cenzura jest obsługiwana przez R, ocenzurowane komórki są oznaczone przez 0, podczas gdy nieocenzurowane komórki są oznaczone przez 1. Należy pamiętać, że wszystkie komórki, które żyją do ostatniego punktu czasu, są cenzurowane i dlatego są oznaczone jako 0.

6. Przeprowadzanie analizy proporcjonalnych zagrożeń Coxa i wizualizacja wyników

  1. W razie potrzeby pobierz program R studio pod adresem https://cran.r-project.org/mirrors.html.
  2. Otwórz R studio i kliknij dwukrotnie ikonę przetrwania. Skrypt języka R.
  3. Umieść kursor w wierszu 2 przetrwania. R i kliknij przycisk uruchamiania w głównym oknie R studio, aby załadować bibliotekę przetrwania.
  4. Zmień linię 5 przetrwania. Skrypt języka R pasujący do lokalizacji pliku Survival_spreadsheet.csv. Kliknij uruchom, aby załadować dane dotyczące przeżycia jako ramkę danych.
  5. Podświetl wiersze 8 i 9, a następnie kliknij przycisk uruchamiania w oknie konsoli programu R Studio, aby przeprowadzić analizę proporcjonalnych zagrożeń Coxa. Wyniki i statystyki wyjściowe są wyświetlane w oknie konsoli programu R Studio.
  6. Podkreśl linie 12-16 przetrwania. R i naciśnij przycisk uruchom, aby wygenerować skumulowane ryzyko śmierci, wykres, który pojawi się w zakładce wykresy w R studio. Plik ten można zapisać, klikając przycisk eksportu nad działką.
  7. Jeśli pożądane jest wykreślenie danych dotyczących przeżycia jako krzywej Kaplana-Meiera, zaznacz linie 19-24 przeżycia. R i naciśnij przycisk uruchamiania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z opisanej tutaj procedury transfekcji, neurony korowe szczurów DIV4 zostały przetransfekowane plazmidem kodującym białko fluorescencyjne mApple. Począwszy od 24 godzin po transfekcji, komórki obrazowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej co 24 godziny przez 10 kolejnych dni. Wynikowe obrazy zostały zorganizowane zgodnie z opisem w Rysunek 2, a następnie zszyte, ułożone w stos i ocenione pod kątem śmierci komórki (Rysunek 1).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W artykule przedstawiono metodologię bezpośredniego monitorowania przeżywalności neuronów w pojedynczej komórce. W przeciwieństwie do tradycyjnych testów śmierci komórki, które są ograniczone do dyskretnych punktów czasowych i całych populacji komórek, metoda ta pozwala na ciągłą ocenę różnych czynników, takich jak morfologia komórki, ekspresja białka lub lokalizacja, i może określić, w jaki sposób każdy czynnik wpływa na przeżycie komórki w sposób prospektywny.

Metodologia ta może być modyfik...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Steve'owi Finkbeinerowi i członkom laboratorium Finkbeinera za pionierską mikroskopię robotyczną. Dziękujemy również Danowi Peisachowi za stworzenie wstępnego oprogramowania niezbędnego do przetwarzania obrazów i automatycznej analizy przeżycia. Praca ta została sfinansowana przez National Institute for Neurological Disorders and Stroke (NINDS) R01-NS097542, University of Michigan Protein Folding Disease Initiative oraz Ann Arbor Active Against ALS.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Podłoże neuropodstawoweGIBCO21103-049
Opti-MEMGIBCO31985-070
CompactPrep Plasmid Maxi KitQiagen12863
Sześciowodny chlorek magnezuSigmaM9272
Hydrat kwasu kynureninowegoTCIH0303
PoliD-lizynaMiliporA-003-E
GlutamaxGIBCO35050-061
Lipofectamine 2000Invitrogen52887
B27 suplementThermo FisherA3582801
Penicylina/StreptomycynaGIBCO15140122
96-dołkowe płytkiTPP0876

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lockshin, R. A., Zakeri, Z. Cell death in health and disease. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 11, 1214-1224 (2007).
  2. Kepp, O., Galluzzi, L., Lipinski, M., Yuan, J., Kroemer, G. Cell death assays for drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 10, 221-237 (2011).
  3. Lemasters, J. J., et al. The mitochondrial permeability transition in cell death: a common mechanism in necrosis, apoptosis and autophagy. Biochimica et Biophysica Acta Bioenergetics. , 177-196 (1998).
  4. Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. Journal of Immunological Methods. 184, 39-51 (1995).
  5. Chien, K. R., Abrams, J., Serroni, A., Martin, J. T., Farber, J. L. Accelerated phospholipid degradation and associated membrane dysfunction in irreversible, ischemic liver cell injury. Journal of Biological Chemistry. 253, 4809-4817 (1978).
  6. Zwaal, R. F. A., Comfurius, P., Bevers, E. M. Surface exposure of phosphatidylserine in pathological cells. Cell and Molecular Life Sciences. 62, 971-988 (2005).
  7. Mitchell, D. B., Santone, K. S., Acosta, D. Evaluation of cytotoxicity in cultured cells by enzyme leakage. Journal of Tissue Culture Methods. 6, 113-116 (1980).
  8. Moran, J. H., Schnellmann, R. G. A rapid beta-NADH-linked fluorescence assay for lactate dehydrogenase in cellular death. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 36, 41-44 (1996).
  9. Mossman, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
  10. Guerzoni, L. P. B., et al. In Vitro Modulation of TrkB Receptor Signaling upon Sequential Delivery of Curcumin-DHA Loaded Carriers Towards Promoting Neuronal Survival. Pharmaceutical Research. 34 (2), 492-505 (2017).
  11. Arrasate, M., Finkbeiner, S. Automated microscope system for determining factors that predict neuronal fate. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 102, 3840-3845 (2005).
  12. Christensen, E. Multivariate survival analysis using Cox’s regression model. Hepatology. 7, 1346-1358 (1987).
  13. Barmada, S. J., et al. Autophagy induction enhances TDP43 turnover and survival in neuronal ALS models. Nature Chemical Biology. 10, 677-685 (2014).
  14. Barmada, S. J., et al. Amelioration of toxicity in neuronal models of amyotrophic lateral sclerosis by hUPF1. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 112, 7821-7826 (2015).
  15. Malik, A. M., et al. Matrin 3-dependent neurotoxicity is modified by nucleic acid binding and nucleocytoplasmic localization. Elife. 7, (2018).
  16. Archbold, H. C., et al. TDP43 nuclear export and neurodegeneration in models of amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia. Scientific Reports. 8, 4606(2018).
  17. Green, K. M., et al. RAN translation at C9orf72-associated repeat expansions is selectively enhanced by the integrated stress response. Nature Communications. 8, 2005(2017).
  18. Park, S. -K., et al. Overexpression of the essential Sis1 chaperone reduces TDP-43 effects on toxicity and proteolysis. PLOS Genetics. 13, e1006805(2017).
  19. Gupta, R., et al. The Proline/Arginine Dipeptide from Hexanucleotide Repeat Expanded C9ORF72 Inhibits the Proteasome. eNeuro. 4, (2017).
  20. Angelov, B., Angelova, A. Nanoscale clustering of the neurotrophin receptor TrkB revealed by super-resolution STED microscopy. Nanoscale. 9 (28), 9797-9804 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

ledzenie prze ywalno ci neuron wanaliza proporcjonalnych hazard w Coxafluorescencyjny marker bia kowyneurony korowe szczuraefektywno transfekcjiprzetwarzanie obraz w w programie Fijianaliza prze ywalno ci Kaplan Meierobrazowanie pojedynczych kom rekmonitorowanie mierci kom rek

Powiązane artykuły