Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie transferu energii rezonansu fluorescencyjnego in vitro do badania dynamiki kompleksów białkowych w milisekundowej skali czasowej

DOI:

10.3791/59038

⸱

14 marca 2019

 ,  , 
1Department of Biochemistry, Purdue University, 2Department of Botany and Plant Pathology, Purdue University, 3Center for Plant Biology, Purdue University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Interakcje białko-białko są kluczowe dla systemów biologicznych, a badania kinetyki wiązania dostarczają wglądu w dynamikę i funkcję kompleksów białkowych. Opisujemy metodę, która określa ilościowo parametry kinetyczne kompleksu białkowego za pomocą rezonansu fluorescencyjnego, transferu energii i techniki zatrzymanego przepływu.  

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Białka są głównymi operatorami systemów biologicznych i zazwyczaj oddziałują z innymi makro- lub małymi cząsteczkami, aby realizować swoje biologiczne funkcje. Takie interakcje mogą być bardzo dynamiczne, co oznacza, że oddziałujące podjednostki są stale powiązane i dysocjowane w określonym tempie. Podczas gdy pomiar powinowactwa wiązania za pomocą technik takich jak ilościowe ściąganie ujawnia siłę oddziaływania, badanie kinetyki wiązania dostarcza informacji na temat tego, jak szybko zachodzi interakcja i jak długo może istnieć każdy kompleks. Co więcej, pomiar kinetyki interakcji w obecności dodatkowego czynnika, takiego jak czynnik wymiany białka lub lek, pomaga ujawnić mechanizm, za pomocą którego interakcja jest regulowana przez drugi czynnik, dostarczając ważnej wiedzy dla postępu badań biologicznych i medycznych. W tym miejscu opisujemy protokół pomiaru kinetyki wiązania kompleksu białkowego, który ma wysoki współczynnik asocjacji wewnętrznej i może być szybko dysocjowany przez inne białko. Metoda wykorzystuje transfer energii rezonansu fluorescencyjnego do raportowania powstawania kompleksu białkowego in vitro i umożliwia monitorowanie szybkiej asocjacji i dysocjacji kompleksu w czasie rzeczywistym na fluorymetrze z zatrzymanym przepływem. Za pomocą tego testu określa się ilościowo stałe szybkości asocjacji i dysocjacji kompleksu białkowego.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aktywność biologiczna jest ostatecznie przeprowadzana przez białka, z których większość oddziałuje z innymi dla prawidłowych funkcji biologicznych. Korzystając z podejścia obliczeniowego, całkowita ilość interakcji białko-białko u człowieka jest szacowana na ~650 0001, a zakłócenie tych interakcji często prowadzi do chorób2. Ze względu na ich istotną rolę w kontrolowaniu procesów komórkowych i organizmowych, opracowano liczne metody badania interakcji białko-białko, takich jak drożdże-dwie hybrydy, dwucząsteczkowa komplementacja fluorescencji, komplementacja rozszczepionej lucyferazy i test koimmunoprecypitacji3. Chociaż metody te są dobre w odkrywaniu i potwierdzaniu interakcji białko-białko, są one zwykle nieilościowe, a zatem dostarczają ograniczonych informacji na temat powinowactwa między oddziałującymi partnerami białkowymi. Ilościowe pull-downy mogą być używane do pomiaru powinowactwa wiązania (np. stałej dysocjacji Kd), ale nie mierzą kinetyki wiązania, ani nie mogą być stosowane, gdy Kd jest bardzo niskie z powodu nieodpowiedniego stosunku sygnału do szumu4. Spektroskopia powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR) określa ilościowo kinetykę wiązania, ale wymaga określonej powierzchni i unieruchomienia jednego reagenta na powierzchni, co może potencjalnie zmienić właściwości wiązania reagenta5. Co więcej, SPR ma trudności z pomiarem szybkości asocjacji i dysocjacji5, a także nie jest właściwe używanie SPR do charakteryzowania zdarzenia wymiany podjednostek białkowych w kompleksie białkowym. W tym miejscu opisujemy metodę, która umożliwia pomiar szybkości składania i rozkładu kompleksu białkowego w milisekundowej skali czasowej. Metoda ta była niezbędna do określenia roli białka 1 isasocjowanego przez Cullin-a, N edd8-d (Cand1) jako czynnika wymiany białka F-box6,7.

Cand1 reguluje dynamikę ligaz E3 Skp1•Cul1•F-box protein (SCF), które należą do dużej rodziny ligaz ubikwityny Cullin-RING. SCF składają się z culliny Cul1, która wiąże białko domeny RING Rbx1, oraz wymiennego białka F-box, które rekrutuje substraty i wiąże Cul1 przez białko adaptorowe Skp18. Jako ligaza E3, SCF katalizuje koniugację ubikwityny z jej substratem i jest aktywowany, gdy substrat jest rekrutowany przez białko F-box i gdy Cul1 jest modyfikowany przez białko podobne do ubikwityny Nedd89. Cand1 wiąże niezmodyfikowany Cul1, a po związaniu zakłóca zarówno asocjację białka Skp1•F-box z Cul1, jak i koniugację Nedd8 z Cul110,11,12,13. W rezultacie, Cand1 wydawał się być inhibitorem aktywności SCF in vitro, ale niedobór Cand1 w organizmach powodował defekty, co sugeruje pozytywną rolę Cand1 w regulacji aktywności SCF in vivo14,15,16,17. Ten paradoks został ostatecznie wyjaśniony przez badanie ilościowe, które ujawniło dynamiczne interakcje między białkiem Cul1, Cand1 i Skp1•F-box. Korzystając z testów transferu energii rezonansu fluorescencyjnego (FRET), które wykrywają tworzenie się kompleksów SCF i Cul1•Cand1, stałe szybkości asocjacji i dysocjacji (odpowiednio kon i koff) mierzono indywidualnie. Pomiary wykazały, że zarówno białko Cand1, jak i Skp1•F-box tworzą niezwykle ścisły kompleks z Cul1, ale koff SCF jest dramatycznie zwiększone przez Cand1, a koff Cul1•Cand1 jest dramatycznie zwiększone przez Skp1•F-box protein6,7. Wyniki te stanowią wstępne i krytyczne wsparcie dla zdefiniowania roli Cand1 jako czynnika wymiany białek, który katalizuje tworzenie nowych kompleksów SCF poprzez recykling Cul1 ze starych kompleksów SCF.

Tutaj przedstawiamy procedurę opracowywania i używania testu FRET do badania dynamiki kompleksu Cul1•Cand1 class7, a ta sama zasada może być zastosowana do badania dynamiki różnych biomolekuł. FRET występuje, gdy donor jest wzbudzany odpowiednią długością fali, a akceptor o widmie wzbudzenia nakładającym się na widmo emisji donorowej jest obecny w odległości 10-100 A. Stan wzbudzony jest przenoszony do akceptora, zmniejszając w ten sposób intensywność donora i zwiększając intensywność akceptora18. Skuteczność FRET (E) zależy zarówno od promienia Förstera (R0), jak i odległości między fluoroforami donorowymi i akceptorowymi (r) i jest określona wzorem: E = R06/(R06 + r6). Promień Förstera (R0) zależy od kilku czynników, w tym od orientacji kątowej dipola, nakładania się widmowego pary donor-akceptor oraz zastosowanego roztworu19. Aby zastosować test FRET na fluorymetrze z zatrzymanym przepływem, który monitoruje zmianę emisji donora w czasie rzeczywistym i umożliwia pomiary szybkiego włączania i wyłączania k, konieczne jest ustalenie wydajnego FRET, który skutkuje znacznym zmniejszeniem emisji donora. Dlatego ważne jest zaprojektowanie wydajnego FRET poprzez wybór odpowiedniej pary barwników fluorescencyjnych i miejsc na białkach docelowych do przyłączenia barwników, co zostanie omówione w tym protokole.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Zaprojektuj test FRET.

  1. Pobierz plik struktury kompleksu Cul1•Cand1 z Banku Danych o Białkach (plik 1U6G).
  2. Wyświetl strukturę kompleksu Cul1•Cand1 w PyMOL.
  3. Użyj funkcji Pomiar w menu kreatora PyMOL, aby oszacować odległość między pierwszym aminokwasem Cand1 a ostatnim aminokwasem Cul1 (Rysunek 1).
  4. Załaduj przeglądarkę widm online (patrz Tabela materiałów) i wyświetl widma wzbudzenia i emisji 7-amino-4-metylokoumaryny (AMC) i FlAsH jednocześnie (Rysunek 2). Należy pamiętać, że AMC jest donorem FRET, a FlAsH jest akceptorem FRET.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Struktura krystaliczna Cul1•Cand1 i pomiar odległości między potencjalnymi miejscami znakowania. Plik struktury krystalicznej został pobrany z Banku Danych Białek (Plik 1U6G) i wyświetlony w PyMOL. Pomiary pomiędzy wybranymi atomami zostały wykonane za pomocą PyMOL. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-protocol-2
Rysunek 2: Widma wzbudzenia i emisji barwników fluorescencyjnych dla FRET. Pokazano widma AMC (7-amino-4-metylokumaryny) i FlAsH. Linie przerywane oznaczają widma wzbudzenia, a linie ciągłe oznaczają widma emisyjne. Obraz został pierwotnie wygenerowany przez Fluorescence SpectraViewer i został zmodyfikowany w celu uzyskania lepszej przejrzystości. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Przygotowanie Cul1AMC•Rbx1, białka dawcy FRET

  1. Skonstruować plazmidy do ekspresji ludzkiejsortazy Cul1•Rbx1 w komórkach E. coli. Zauważ, że dwa plazmidy współwyrażające ludzki Cul1•Rbx1 w komórkach E. coli są szczegółowo opisane w poprzednim raporcie20.
    1. Dodaj sekwencję DNA kodującą "LPETGGHHHHHH" (znacznik sortazy-His6) do końca 3' sekwencji kodującej Cul1 za pomocą standardowych metod PCR i klonowania21,22.
    2. Zsekwencjonuj nowy plazmid, aby potwierdzić, że wstawka genu jest dokładna.
  2. Koekspresjasortazy Cul1•Rbx1 w komórkach E. coli. Metoda pochodzi z poprzedniego raportu20.
    1. Wymieszaj 100 ng każdego z dwóch plazmidów z chemicznie kompetentnymi komórkami BL21 (DE3) do kotransformacji przy użyciu metody szoku cieplnego23. Hodować komórki na płytce agarowej LB zawierającej 100 μg/ml ampicyliny i 34 μg/ml chloramfenikolu w temperaturze 37 °C przez noc.
    2. Zaszczepić 50 ml kultury LB świeżo przekształconymi koloniami i rosnąć przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem 250 obr./min. Daje to kulturę starterową.
    3. Zaszczepić 6 kolb, każda 1 l pożywki LB, każdą po 5 ml kultury starterowej i rosnąć w temperaturze 37 °C z prędkością 250 obr./min, wytrząsając, aż OD600 osiągnie ~1,0. Schłodzić kulturę do temperatury 16 °C i dodać izopropylo-β-D-tiogalaktozyd (IPTG) do 0,4 mM. Przechowywać kulturę w temperaturze 16 °C przez noc, wstrząsając z prędkością 250 obr./min.
    4. Zebrać komórki E. coli przez odwirowanie przy 5 000 x g przez 15 minut i zebrać granulki komórek w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml.
      UWAGA: Granulki komórkowe można przetworzyć w celu oczyszczenia białka lub zamrozić w temperaturze -80 °C przed przejściem do etapów oczyszczania białka.
  3. Oczyszczanie kompleksusortazy Cul1•Rbx1. Ta metoda pochodzi z poprzedniego raportu20.
    1. Dodać 50 ml buforu do lizy (30 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 5 mM DTT, 10% glicerolu, 1 tabletkę koktajlu inhibitorów proteazy, pH 7,6) do osadu komórek E. coli wykazujących ekspresjęsortazy Cul1•Rbx1.
    2. Lizować komórki na lodzie za pomocą sonikacji przy amplitudzie 50%. Przełączaj się między 1 sekundą włączania i 1 sekundą wyłączania i biegaj przez 3 minuty.
    3. Powtórz krok 2.3.2 2-3 razy.
    4. Przenieś lizat komórkowy do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i usuń resztki komórek przez odwirowanie przy 25 000 x g przez 45 minut.
    5. Inkubować lizat komórek czystych z 5 ml kulek glutationu w temperaturze 4 °C przez 2 godziny.
    6. Odwirować mieszaninę kulek i lizatu o sile 1 500 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant.
    7. Przemyć kulki 5 ml buforu do lizy (bez inhibitorów proteazy) i usunąć supernatant po odwirowaniu w temperaturze 1 500 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C.
    8. Powtórz krok 2.3.7 2x.
    9. Dodać 3 ml buforu do lizy do umytych kulek i przenieść zawiesinę kulek do pustej kolumny.
    10. Dodać 5 ml buforu elucyjnego (50 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 10 mM zredukowanego glutationu, pH 8,0) do kolumny. Inkubować przez 10 minut i zebrać eluat.
    11. Powtórz krok 2.3.10 3-4 razy.
    12. Dodać 200 μl trombiny o stężeniu 5 mg/ml (patrz tabela materiałów) do eluatu z kulek glutationu i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.
    13. Rozcieńczyć próbkę białka buforem A (25 mM HEPES, 1 mM DTT, 5% glicerolu, pH 6,5) trzykrotnie.
    14. Zrównoważyć kolumnę chromatografii kationitowej (patrz tabela materiałów) w systemie FPLC z buforem A.
    15. Załadować próbkę białka do kolumny chromatografii kationitowej z natężeniem przepływu 0,5 ml/min.
    16. Eluować białko z gradientem NaCl w 40 ml, mieszając bufor A i bufor B od 0 do 50% (25 mM HEPES, 1 M NaCl, 1 mM DTT, 5% glicerolu, pH 6,5) przy natężeniu przepływu 1 ml/min.
    17. Sprawdź eluowane białko w różnych frakcjach za pomocą SDS-PAGE24.
      UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.
    18. Zebrać frakcje eluatu zawierającesortazę Cul1•Rbx1.
    19. Zagęścić zbiorczą próbkęsortazy Cul1•Rbx1 do 2,5 ml, przepuszczając bufor przez membranę ultrafiltracyjną (odcięcie 30 kDa).
  4. Dodaj AMC do C-końca Cul1 za pomocą transpeptydacji za pośrednictwem sortazy21,22.
    1. Zmienić bufor w próbcesortazy Cul1•Rbx1 na bufor sortazy (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7,5) za pomocą kolumny odsalającej (patrz tabela materiałów).
      1. Zrównoważyć kolumnę odsalającą z 25 ml buforu sortazy.
      2. Załadować 2,5 ml próbkisortazy Cul1•Rbx1 do kolumny. Odrzuć przepływ.
      3. Eluować próbkę za pomocą 3,5 ml buforu sortazy. Zbierz przepływ.
    2. Do 900 μl roztworusortazy Cul1•Rbx1 w buforze sortazy dodać 100 μl 600 μM oczyszczonego roztworu sortazy A i 10 μl 25 mM peptyduGGGG AMC. Mieszaninę reakcyjną inkubować w temperaturze 30 °C w ciemności przez noc. Należy pamiętać, że ten krok spowoduje wygenerowanie Cul1AMC•Rbx1.
      UWAGA: Barwniki fluorescencyjne są wrażliwe na światło, dlatego w miarę możliwości unikaj wystawiania ich na działanie światła otoczenia podczas przygotowywania białek i próbek.
      UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.
    3. Do mieszaniny reakcyjnej dodać 50 μl kulek agarozy Ni-NTA i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 min.
    4. Granulki agarozy Ni-NTA osadzać przez odwirowanie przy 5 000 x g przez 2 minuty i zebrać supernatant.
    5. Zrównoważyć kolumnę chromatografii wykluczającej wielkość (patrz tabela materiałów) z buforem (30 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 10% glicerol) w systemie FPLC.
    6. Załadować całą próbkęCul1 AMC•Rbx1 do kolumny chromatografii wykluczającej rozmiar. Elute z 1,5-krotną objętością buforu w kolumnie.
    7. Sprawdź frakcje eluacyjne za pomocą SDS-PAGE24.
    8. Zebrać frakcje eluatu zawierające Cul1AMC•Rbx1.
    9. Zmierzyć stężenie białka, wykorzystując jego absorbancję przy 280 nm za pomocą spektrofotometru.
    10. Roztwor białkowy podzielić na porcje i przechowywać w temperaturze -80 °C.
      UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.

3. Przygotowanie FlAsHCand1, białka akceptora FRET

UWAGA: Większość kroków w tej części jest taka sama jak w Kroku 2. Warunki, które się różnią, zostały szczegółowo opisane poniżej.

  1. Skonstruuj plazmid do ekspresji ludzkiego TetraCysCand1 w komórkach E. coli.
    1. Dodaj sekwencję DNA kodującą "CCPGCCGSG" (znacznik tetracysteiny/TetraCys) przed 15tym aminokwasem Cand1 za pomocą zwykłego PCR25 (sekwencje starterów: TGCTGTCCGGGCTGCTGCGGCAGCGGCATCATCCAGAGCCACAAGGACTTTAG; CTAACTAGTGTCCATTGATTCCAAG).
    2. Wprowadzić produkt PCR do wektora pGEX-4T-2. Zsekwencjonuj plazmid, aby potwierdzić, że wstawka genu jest dokładna i w ramce.
  2. Ekspresja TetraCysCand1in E. coli w taki sam sposób, jak w kroku 2.2, z wyjątkiem tego, że plazmid jest przekształcany w kompetentne komórki Rosetta.
  3. Oczyszczanie TetraCysCand1 z komórek E. coli.
    1. Zlizuj osady komórek E. coli i wyekstrahuj TetraCysCand1 za pomocą kulek glutationu. Te kroki są takie same jak kroki 2.3.1–2.3.12.
    2. Rozcieńczyć eluat białka z kulek glutationu buforem C (50 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, 5% glicerolu, pH 7,5) trzykrotnie. Zrównoważyć kolumnę chromatografii anionowymiennej (patrz tabela materiałów) w systemie FPLC z buforem C i załadować rozcieńczoną próbkę białka z szybkością przepływu 0,5 ml/min.
    3. Eluować białko z gradientem NaCl w 40 ml, mieszając bufor C i bufor D od 0 do 50% (50 mM Tris-HCl, 1 M NaCl, 1 mM DTT, 5% glicerolu, pH 7,5) przy natężeniu przepływu 1 ml / min. Sprawdź eluowane białko w różnych frakcjach za pomocą SDS-PAGE24 i połącz frakcje zawierające TetraCysCand1. Należy pamiętać, że TetraCysCand1 ma większą objętość przechowywania niż bezpłatny GST.
    4. Zagęścić zbiorczą próbkę TetraCysCand1, przepuszczając bufor przez membranę ultrafiltracyjną (odcięcie 30 kDa).
    5. Zrównoważyć kolumnę chromatografii wykluczającej wielkość z buforem znakującym (20 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 2 mM TCEP, 1 mM EDTA, 5% glicerolu) w systemie FPLC. Załaduj próbkę TetraCysCand1 (za każdym razem 500 μL) i sprawdź frakcje eluatu za pomocą SDS-PAGE24.
    6. Zebrać wszystkie frakcje zawierające TetraCysCand1 i zagęścić białko do ~40 μM, przepuszczając bufor przez membranę ultrafiltracyjną (odcięcie 30 kDa). Oszacować stężenie białka, stosując jego absorbancję przy 280 nm. Przechowywać białko w postaci 50 μl porcji w temperaturze -80 °C.
      UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.
  4. Przygotowanie FlAsHCand1.
    1. Dodać 1 μl roztworu FlAsH (patrz tabela materiałów) do 50 μl roztworu TetraCysCand1.
    2. Dobrze wymieszaj i inkubuj mieszaninę w temperaturze pokojowej w ciemności przez 1-2 godziny, aby uzyskać FlAsHCand1,
      UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.

4. Przygotowanie Cand1, białka goniącego FRET

UWAGA: Protokół przygotowania białka jest podobny do Kroku 3, z następującymi modyfikacjami.

  1. Wstaw sekwencję kodowania pełnej długości Cand1 do wektora pGEX-4T-2.
  2. Zmień bufor użyty w kroku 3.3.5 na bufor zawierający 30 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 10% glicerolu.
  3. Wyeliminuj kroki 3.3.7 i 3.3.8.

5. Przetestuj i potwierdź test FRET

  1. Przygotuj bufor FRET zawierający 30 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 0,5 mM DTT, 1 mg/ml albuminy jaja kurzego, pH 7,6 i użyj w temperaturze pokojowej.
  2. Przetestuj FRET między Cul1AMC•Rbx1 i FlAsHCand1 na fluorymetrze.
    1. W 300 μl buforu FRET dodać Cul1AMC•Rbx1 (donor FRET) do końcowego stężenia 70 nM. Przenieś roztwór do kuwety.
    2. Umieścić kuwetę w uchwycie na próbkę fluorymetru. Wzbudzić próbkę światłem wzbudzającym o długości fali 350 nm i skanować sygnały emisyjne od 400 nm do 600 nm w krokach co 1 nm.
    3. Powtórz krok 5.2.1, ale zmień Cul1AMC•Rbx1 na FlAsHCand1 (akceptor FRET). Zeskanuj próbkę FlAsHCand1 przy użyciu tej samej metody, co w kroku 5.2.2.
    4. (Opcjonalnie) Wzbudz FlAsHCand1 światłem wzbudzenia 510 nm i zeskanuj sygnał emisyjny od 500 nm do 650 nm.
    5. W 300 μl buforu FRET dodać zarówno Cul1AMC•Rbx1, jak i FlAsHCand1 do końcowego stężenia 70 nM. Analizować próbkę w taki sam sposób, jak w kroku 5.2.2.
  3. Potwierdź FRET między Cul1AMC•Rbx1 i FlAsHCand1, dodając białko chase (nieznakowane Cand1) (Rysunek 3C).
    1. W 300 μl buforu FRET dodać 70 nMCul1 AMC•Rbx1 i 700 nM Cand1. Zeskanować emisję próbki jak w kroku 5.2.2.
    2. W 300 μl buforu FRET dodać 70 nM FlAsHCand1 i 700 nM Cand1. Zeskanować emisję próbki jak w kroku 5.2.2.
    3. W 300 μl buforu FRET dodać 70 nMCul1 AMC•Rbx1 i 70 nM FlAsHCand1 i inkubować próbkę w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Następnie dodać 700 nM Cand1 i natychmiast po dodaniu zeskanować emisję próbki jak w kroku 5.2.2). Należy pamiętać, że ten krok jest podobny do kroku 5.2.5.
    4. W buforze FRET o pojemności 300 μl dodaj kolejno 70 nMCul1 AMC•Rbx1, 700 nM Cand1 i 70 nM FlAsHCand1. Inkubować próbkę w temperaturze pokojowej przez 5 minut i skanować emisję próbki jak w kroku 5.2.2. Zauważ, że jest to próbka pościgu (zielona linia w Rysunek 3C).

6. Zmierz stałą szybkości asocjacji (kon) Cul1•Cand1

UWAGA: Szczegóły obsługi fluorymetru z zatrzymanym przepływem zostały opisane w poprzednim raporcie26.

  1. Przygotuj fluorymetr z zatrzymanym przepływem do pomiaru.
    1. Włącz fluorymetr z zatrzymanym przepływem zgodnie z instrukcją producenta.
    2. Ustaw światło wzbudzenia na 350 nm i użyj filtra pasmowo-przepustowego, który przepuszcza światło emisyjne 450 nm i blokuje światło emisyjne 500-650 nm.
    3. Utrzymuj zawory próbki w pozycji FILL i podłącz strzykawkę o pojemności 3 ml wypełnioną wodą. Umyć dwie strzykawki z próbkami (A i B) wodą, przesuwając kilkakrotnie napęd strzykawki z próbką w górę i w dół. Wylej całą wodę użytą na tym etapie.
    4. Utrzymuj zawory próbki w pozycji FILL i podłącz strzykawkę o pojemności 3 ml wypełnioną buforem FRET. Umyć dwie strzykawki z próbkami buforem FRET, kilkakrotnie przesuwając napęd strzykawki z próbką w górę i w dół. Odrzuć cały bufor FRET użyty w tym kroku.
  2. Wykonaj pomiar kontrolny (Rysunek 4C).
    1. Podłączyć strzykawkę o pojemności 3 ml i załadować strzykawkę A 100 nM Cul1AMC•Rbx1 do bufora FRET. Przekręć sample zawór do pozycji DRIVE.
    2. Podłączyć strzykawkę o pojemności 3 ml i załadować strzykawkę B buforem FRET. Przekręć sample zawór do pozycji DRIVE.
    3. Użyj Panelu sterowania w obszarze Acquire w oprogramowaniu, aby wykonać pięć zdjęć (zmieszać równą objętość próbek ze strzykawki A i strzykawki B) na fluorymetrze z zatrzymanym przepływem bez zapisywania wyników.
    4. Otwórz Panel sterowania w obszarze Acquire w oprogramowaniu i zaprogramuj do rejestrowania emisji Cul1AMC przez 60 s. Następnie zrób pojedynczy strzał.
    5. Powtórz krok 6.2.4 2x.
    6. Przekręć sample zawór do pozycji FILL. Opróżnij strzykawkę B i umyj ją buforem FRET.
  3. Zmierz obserwowane stałe szybkości asocjacji (kobs) Cul1•Cand1 (Rysunek 4B).
    1. Utrzymać próbkę w strzykawce A w taki sam sposób, jak w kroku 6.2.1.
    2. Podłączyć strzykawkę o pojemności 3 ml i załadować strzykawkę B ze 100 nM FlAsHCand1 do bufora FRET. Przekręć sample zawór do pozycji DRIVE.
    3. Użyj Panelu sterowania w obszarze Acquire w oprogramowaniu, aby zrobić pięć zdjęć bez rejestrowania wyników.
    4. Otwórz Panel sterowania w obszarze Acquire w oprogramowaniu i zaprogramuj do rejestrowania emisji Cul1AMC przez 60 s. Następnie zrób pojedynczy strzał.
    5. Powtórz krok 6.3.4 2x.
    6. Opróżnij strzykawkę B i umyj ją buforem FRET.
    7. Powtórz kroki 6.3.1–6.3.6 kilka razy ze wzrostem stężenia FlAsHCand1 w buforze FRET.
    8. Dopasuj zmianę (spadek) sygnałów fluorescencyjnych mierzonych w czasie od każdego strzału do pojedynczej krzywej wykładniczej. Spowoduje to uzyskanie kobs w każdym pomiarze, a jednostką jest s-1. Zauważ, że podstawa tego obliczenia została dobrze omówiona w poprzednim raporcie27.
  4. Obliczyć średnią i odchylenie standardowe kobs dla każdego zastosowanego stężenia FlAsHCand1. Wykreśl średnią kobs w stosunku do stężenia Cand1 (Rysunek 4D), a nachylenie linii reprezentuje kon z Cul1•Cand1, z jednostką M-1 s-1.

7. Zmierz stałą szybkości dysocjacji (koff) Cul1•Cand1 w obecności białka Skp1•F-box.

UWAGA: Ten krok jest podobny do kroku 6, z następującymi modyfikacjami.

  1. W strzykawce A, w pozycji FILL, załadować roztwór 100 nM Cul1AMC•Rbx1 i 100 nM FlAsHCand1 do bufora FRET. Przekręć sample zawór do pozycji "DRIVE".
  2. Do strzykawki B, w pozycji FILL, załaduj roztwór Skp1•Skp2 (przygotowany zgodnie z poprzednim raportem20). Przekręć sample zawór do pozycji "DRIVE".
  3. Otwórz Panel sterowania w obszarze Acquire w oprogramowaniu i zaprogramuj do rejestrowania emisji Cul1AMC przez 30 s. Następnie zrób pojedynczy strzał. Sygnały fluorescencyjne nasilają się z czasem po zmieszaniu roztworów ze strzykawki A i strzykawki B (Rysunek 5).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby przetestować FRET między Cul1AMC i FlAsHCand1, najpierw określiliśmy intensywność emisji odpowiednio 70 nM Cul1AMC (dawca) i 70 nM FlAsHCand1 (akceptor), (Rysunek 3A-C, niebieskie linie). W każdej analizie występował tylko jeden pik emisji, a emisja FlAsHCand1 (akceptora) była niska. Gdy po 70 nM Cul1AMC i FlAsHCand1 zmieszano w celu wygenerowania FRET, w widmach emisyjnyc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FRET jest zjawiskiem fizycznym, które jest bardzo interesujące dla badania i zrozumienia systemów biologicznych19. W tym miejscu przedstawiamy protokół testowania i wykorzystania FRET do badania kinetyki wiązania dwóch oddziałujących ze sobą białek. Projektując FRET, wzięliśmy pod uwagę trzy główne czynniki: nakładanie się widma między emisją donorową a wzbudzeniem akceptorowym, odległość między dwoma fluoroforami oraz orientację dipolową fluoroforów28. Aby wybrać fluorofor...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Shu-Ou Shan (California Institute of Technology) za wnikliwą dyskusję na temat rozwoju testu FRET. M.G., Y.Z. i X.L. zostały sfinansowane z funduszy startowych z Purdue University dla Y.Z. i X.L. Praca ta była częściowo wspierana przez grant zalążkowy z Purdue University Center for Plant Biology.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kolumna chromatografii anionowymiennejGE Healthcare17505301Kolumna chromatografii anionowej HiTrap Q FF
Wirówka stołowa z chłodzeniemEppendorf2231000511
BL21 (DE3) Kompetentne komórkiThermoFisher ScientificC600003
Chlorek wapniaFisher ScientificC78-500
Wymiana kationowa Kolumna chromatograficznaGE Healthcare17505401HiTrap SP Sepharose FF
Kolumna odsalającaGE Healthcare17085101
Wirówka podłogowa (wysoka prędkość)Beckman CoulterJ2-MC
Wirówka podłogowa (wolna prędkość)Beckman CoulterJ6-MI
Fluorescence SpectraViewerThermoFisher Scientifichttps://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html
FluoroMax FluoroMaxHORIBAFluoroMax-3
FPLCGE Healthcare29018224
peptyd GGGGAMCAnglia Peptydniestandardowa synteza
Koraliki glutationuGE Healthcare
GlicerolFisher ScientificG33-500
HEPESFisher ScientificBP310-100
Izopropylo-β-D-tiogalaktozyd (IPTG)Fisher Scientific15-529-019
Bulion LBFisher ScientificBP1426-500
Agaroza Ni-NTAQiagen30210
MiliporeSigmaA2512
wektor pGEX-4T-2GE Healthcare28954550
Koktajl inhibitorów proteazyMilliporeSigma4693132001
Zredukowany glutationFisher ScientificBP25211
Wytrząsarka chłodniczaEppendorfM1282-0004
Rosetta Kompetentne komórkiMilliporeSigma70953-3
Kolumna chromatograficzna wykluczająca rozmiarGE Healthcare28990944Kolumna Superdex 200 10/300 GL
Chlorek sodu (NaCl)Fisher ScientificS271-500
Fluorymetr z zatrzymanym przepływemHi-Tech ScientificSF-61 DX2
TCEP· HClFisher ScientificPI20490
TrombinMilliporeSigmaT4648
Tris BaseFisher ScientificBP152-500
Membrana ultrafiltracyjnaMilliporeSigmaUFC903008Filtry odśrodkowe Amicon Ultra-15, Ultra-15, 30 000 NMWL
Nowa 17075605

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Stumpf, M. P. H., et al. Estimating the size of the human interactome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (19), 6959-6964 (2008).
  2. Kuzmanov, U., Emili, A. Protein-protein interaction networks: probing disease mechanisms using model systems. Genome Medicine. 5 (4), 37(2013).
  3. Titeca, K., Lemmens, I., Tavernier, J., Eyckerman, S. Discovering cellular protein-protein interactions: Technological strategies and opportunities. Mass Spectrometry Reviews. , 1-33 (2018).
  4. Lapetina, S., Gil-Henn, H. A guide to simple, direct, and quantitative in vitro binding assays. Journal of Biological Methods. 4 (1), 62(2017).
  5. Zheng, X., Bi, C., Li, Z., Podariu, M., Hage, D. S. Analytical methods for kinetic studies of biological interactions: A review. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 113, 163-180 (2015).
  6. Pierce, N. W., et al. Cand1 promotes assembly of new SCF complexes through dynamic exchange of F box proteins. Cell. 153 (1), 206-215 (2013).
  7. Liu, X., Reitsma, J. M., Mamrosh, J. L., Zhang, Y., Straube, R., Deshaies, R. J. Cand1-Mediated Adaptive Exchange Mechanism Enables Variation in F-Box Protein Expression. Molecular Cell. 69 (5), 773-786 (2018).
  8. Zheng, N., et al. Structure of the Cul1-Rbx1-Skp1-F boxSkp2 SCF ubiquitin ligase complex. Nature. 416 (6882), 703-709 (2002).
  9. Kleiger, G., Deshaies, R. Tag Team Ubiquitin Ligases. Cell. 166 (5), 1080-1081 (2016).
  10. Zheng, J., et al. CAND1 binds to unneddylated CUL1 and regulates the formation of SCF ubiquitin E3 ligase complex. Molecular Cell. 10 (6), 1519-1526 (2002).
  11. Hwang, J. W., Min, K. W., Tamura, T. A., Yoon, J. B. TIP120A associates with unneddylated cullin 1 and regulates its neddylation. FEBS Letters. 541 (1-3), 102-108 (2003).
  12. Min, K. W., Hwang, J. W., Lee, J. S., Park, Y., Tamura, T., Yoon, J. B. TIP120A associates with cullins and modulates ubiquitin ligase activity. Journal of Biological Chemistry. 278 (18), 15905-15910 (2003).
  13. Goldenberg, S. J., et al. Structure of the Cand1-Cul1-Roc1 complex reveals regulatory mechanisms for the assembly of the multisubunit cullin-dependent ubiquitin ligases. Cell. 119 (4), 517-528 (2004).
  14. Chuang, H. W., Zhang, W., Gray, W. M. Arabidopsis ETA2, an apparent ortholog of the human cullin-interacting protein CAND1, is required for auxin responses mediated by the SCF(TIR1) ubiquitin ligase. Plant Cell. 16 (7), 1883-1897 (2004).
  15. Feng, S., et al. Arabidopsis CAND1, an Unmodified CUL1-Interacting Protein, Is Involved in Multiple Developmental Pathways Controlled by Ubiquitin/Proteasome-Mediated Protein Degradation. the Plant Cell Online. 16 (7), 1870-1882 (2004).
  16. Cheng, Y., Dai, X., Zhao, Y. AtCAND1, a HEAT-repeat protein that participates in auxin signaling in Arabidopsis. Plant Physiology. 135 (June), 1020-1026 (2004).
  17. Lo, S. -C., Hannink, M. CAND1-Mediated Substrate Adaptor Recycling Is Required for Efficient Repression of Nrf2 by Keap1. Molecular and Cellular Biology. 26 (4), 1235-1244 (2006).
  18. Okamoto, K., Sako, Y. Recent advances in FRET for the study of protein interactions and dynamics. Current Opinion in Structural Biology. 46, 16-23 (2017).
  19. Hussain, S. A. An introduction to fluorescence resonance energy transfer (FRET). arXiv preprint. , (2009).
  20. Li, T., Pavletich, N. P., Schulman, B. A., Zheng, N. High-level expression and purification of recombinant SCF ubiquitin ligases. Methods in Enzymology. 398 (1996), 125-142 (2005).
  21. Popp, M. W., Antos, J. M., Grotenbreg, G. M., Spooner, E., Ploegh, H. L. Sortagging: A versatile method for protein labeling. Nature Chemical Biology. 3 (11), 707-708 (2007).
  22. Antos, J. M., Ingram, J., Fang, T., Pishesha, N., Truttmann, M. C., Ploegh, H. L. Site-Specific Protein Labeling via Sortase-Mediated Transpeptidation. Current Protocols in Protein Science. 89, (2017).
  23. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method. Journal of Visualized Experiments. , (2007).
  24. Simpson, R. J. SDS-PAGE of Proteins. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
  25. Kleiger, G., Saha, A., Lewis, S., Kuhlman, B., Deshaies, R. J. Rapid E2-E3 Assembly and Disassembly Enable Processive Ubiquitylation of Cullin-RING Ubiquitin Ligase Substrates. Cell. 139 (5), 957-968 (2009).
  26. Biro, F. N., Zhai, J., Doucette, C. W., Hingorani, M. M. Application of Stopped-flow Kinetics Methods to Investigate the Mechanism of Action of a DNA Repair Protein. Journal of Visualized Experiments. (37), 2-8 (2010).
  27. Patel, J. T., Belsham, H. R., Rathbone, A. J., Friel, C. T. Use of Stopped-Flow Fluorescence and Labeled Nucleotides to Analyze the ATP Turnover Cycle of Kinesins. Journal of Visualized Experiments. (92), 1-6 (2014).
  28. Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. A guide to fluorescent protein FRET pairs. Sensors (Switzerland). 16 (9), 1-24 (2016).
  29. Chen, A. K., Cheng, Z., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Assessing the sensitivity of commercially available fluorophores to the intracellular environment. Analytical Chemistry. 80 (19), 7437-7444 (2008).
  30. Lin, C. T., Rorabacher, D. B. Mathematical approach for stopped-flow kinetics of fast second-order reactions involving inhomogeneity in the reaction cell. Journal of Physical Chemistry. 78 (3), 305-308 (1974).
  31. Toseland, C. P., Geeves, M. A. Rapid Reaction Kinetic Techniques. Fluorescent Methods for Molecular Motors. , 49-65 (2014).
  32. Adams, S. R., et al. New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: Synthesis and biological applications. Journal of the American Chemical Society. 124 (21), 6063-6076 (2002).
  33. Lin, C. W., Ting, A. Y. Transglutaminase-catalyzed site-specific conjugation of small-molecule probes to proteins in vitro and on the surface of living cells. Journal of the American Chemical Society. 128 (14), 4542-4543 (2006).
  34. Yin, J., et al. Genetically encoded short peptide tag for versatile protein labeling by Sfp phosphopantetheinyl transferase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (44), 15815-15820 (2005).
  35. Diaspro, A., Chirico, G., Usai, C., Ramoino, P., Dobrucki, J. Photobleaching. Handbook Of Biological Confocal Microscopy. , 690-702 (2006).
  36. Aoki, K., Kamioka, Y., Matsuda, M. Fluorescence resonance energy transfer imaging of cell signaling from in vitro to in vivo: Basis of biosensor construction, live imaging, and image processing. Development, Growth & Differentiation. 55 (4), 515-522 (2013).
  37. Kilic, S., et al. Single-molecule FRET reveals multiscale chromatin dynamics modulated by HP1α. Nature Communications. 9 (1), (2018).
  38. Shen, K., Arslan, S., Akopian, D., Ha, T., Shan, S. O. Activated GTPase movement on an RNA scaffold drives co-translational protein targeting. Nature. 492 (7428), 271-275 (2012).
  39. Bajar, B. T., et al. Improving brightness and photostability of green and red fluorescent proteins for live cell imaging and FRET reporting. Scientific Reports. 6 (February), 1-12 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Kinetyka kompleks w bia kowychfluorymetr z przep ywem zatrzymanymdonor i akceptor FRETszybko ci asocjacji i dysocjacjioczyszczanie bia ekkulki z glutationemchromatografia wykluczania cz steczkowegokationowymienna chromatografia jonowaci cie trombin

Powiązane artykuły