Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie transferu energii rezonansu fluorescencyjnego in vitro do badania dynamiki kompleksów białkowych w milisekundowej skali czasowej

7.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59038

⸱

14 marca 2019

 ,  , 
1Department of Biochemistry, Purdue University, 2Department of Botany and Plant Pathology, Purdue University, 3Center for Plant Biology, Purdue University

W tym artykule

Podsumowanie

Interakcje białko-białko są kluczowe dla systemów biologicznych, a badania kinetyki wiązania dostarczają wglądu w dynamikę i funkcję kompleksów białkowych. Opisujemy metodę, która określa ilościowo parametry kinetyczne kompleksu białkowego za pomocą rezonansu fluorescencyjnego, transferu energii i techniki zatrzymanego przepływu.  

Streszczenie

Białka są głównymi operatorami systemów biologicznych i zazwyczaj oddziałują z innymi makro- lub małymi cząsteczkami, aby realizować swoje biologiczne funkcje. Takie interakcje mogą być bardzo dynamiczne, co oznacza, że oddziałujące podjednostki są stale powiązane i dysocjowane w określonym tempie. Podczas gdy pomiar powinowactwa wiązania za pomocą technik takich jak ilościowe ściąganie ujawnia siłę oddziaływania, badanie kinetyki wiązania dostarcza informacji na temat tego, jak szybko zachodzi interakcja i jak długo może istnieć każdy kompleks. Co więcej, pomiar kinetyki interakcji w obecności dodatkowego czynnika, takiego jak czynnik wymiany białka lub lek, pomaga ujawnić mechanizm, za pomocą którego interakcja jest regulowana przez drugi czynnik, dostarczając ważnej wiedzy dla postępu badań biologicznych i medycznych. W tym miejscu opisujemy protokół pomiaru kinetyki wiązania kompleksu białkowego, który ma wysoki współczynnik asocjacji wewnętrznej i może być szybko dysocjowany przez inne białko. Metoda wykorzystuje transfer energii rezonansu fluorescencyjnego do raportowania powstawania kompleksu białkowego in vitro i umożliwia monitorowanie szybkiej asocjacji i dysocjacji kompleksu w czasie rzeczywistym na fluorymetrze z zatrzymanym przepływem. Za pomocą tego testu określa się ilościowo stałe szybkości asocjacji i dysocjacji kompleksu białkowego.

Wprowadzenie

Aktywność biologiczna jest ostatecznie przeprowadzana przez białka, z których większość oddziałuje z innymi dla prawidłowych funkcji biologicznych. Korzystając z podejścia obliczeniowego, całkowita ilość interakcji białko-białko u człowieka jest szacowana na ~650 0001, a zakłócenie tych interakcji często prowadzi do chorób2. Ze względu na ich istotną rolę w kontrolowaniu procesów komórkowych i organizmowych, opracowano liczne metody badania interakcji białko-białko, takich jak drożdże-dwie hybrydy, dwucząsteczkowa komplementacja fluorescencji, komplementacja rozszczepionej lucyferazy i test koimmunoprecypitacji3. Chociaż metody te są dobre w odkrywaniu i potwierdzaniu interakcji białko-białko, są one zwykle nieilościowe, a zatem dostarczają ograniczonych informacji na temat powinowactwa między oddziałującymi partnerami białkowymi. Ilościowe pull-downy mogą być używane do pomiaru powinowactwa wiązania (np. stałej dysocjacji Kd), ale nie mierzą kinetyki wiązania, ani nie mogą być stosowane, gdy Kd jest bardzo niskie z powodu nieodpowiedniego stosunku sygnału do szumu4. Spektroskopia powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR) określa ilościowo kinetykę wiązania, ale wymaga określonej powierzchni i unieruchomienia jednego reagenta na powierzchni, co może potencjalnie zmienić właściwości wiązania reagenta5. Co więcej, SPR ma trudności z pomiarem szybkości asocjacji i dysocjacji5, a także nie jest właściwe używanie SPR do charakteryzowania zdarzenia wymiany podjednostek białkowych w kompleksie białkowym. W tym miejscu opisujemy metodę, która umożliwia pomiar szybkości składania i rozkładu kompleksu białkowego w milisekundowej skali czasowej. Metoda ta była niezbędna do określenia roli białka 1 isasocjowanego przez Cullin-a, N edd8-d (Cand1) jako czynnika wymiany białka F-box6,7.

Cand1 reguluje dynamikę ligaz E3 Skp1•Cul1•F-box protein (SCF), które należą do dużej rodziny ligaz ubikwityny Cullin-RING. SCF składają się z culliny Cul1, która wiąże białko domeny RING Rbx1, oraz wymiennego białka F-box, które rekrutuje substraty i wiąże Cul1 przez białko adaptorowe Skp18. Jako ligaza E3, SCF katalizuje koniugację ubikwityny z jej substratem i jest aktywowany, gdy substrat jest rekrutowany przez białko F-box i gdy Cul1 jest modyfikowany przez białko podobne do ubikwityny Nedd89. Cand1 wiąże niezmodyfikowany Cul1, a po związaniu zakłóca zarówno asocjację białka Skp1•F-box z Cul1, jak i koniugację Nedd8 z Cul110,11,12,13. W rezultacie, Cand1 wydawał się być inhibitorem aktywności SCF in vitro, ale niedobór Cand1 w organizmach powodował defekty, co sugeruje pozytywną rolę Cand1 w regulacji aktywności SCF in vivo14,15,16,17. Ten paradoks został ostatecznie wyjaśniony przez badanie ilościowe, które ujawniło dynamiczne interakcje między białkiem Cul1, Cand1 i Skp1•F-box. Korzystając z testów transferu energii rezonansu fluorescencyjnego (FRET), które wykrywają tworzenie się kompleksów SCF i Cul1•Cand1, stałe szybkości asocjacji i dysocjacji (odpowiednio kon i koff) mierzono indywidualnie. Pomiary wykazały, że zarówno białko Cand1, jak i Skp1•F-box tworzą niezwykle ścisły kompleks z Cul1, ale koff SCF jest dramatycznie zwiększone przez Cand1, a koff Cul1•Cand1 jest dramatycznie zwiększone przez Skp1•F-box protein6,7. Wyniki te stanowią wstępne i krytyczne wsparcie dla zdefiniowania roli Cand1 jako czynnika wymiany białek, który katalizuje tworzenie nowych kompleksów SCF poprzez recykling Cul1 ze starych kompleksów SCF.

Tutaj przedstawiamy procedurę opracowywania i używania testu FRET do badania dynamiki kompleksu Cul1•Cand1 class7, a ta sama zasada może być zastosowana do badania dynamiki różnych biomolekuł. FRET występuje, gdy donor jest wzbudzany odpowiednią długością fali, a akceptor o widmie wzbudzenia nakładającym się na widmo emisji donorowej jest obecny w odległości 10-100 A. Stan wzbudzony jest przenoszony do akceptora, zmniejszając w ten sposób intensywność donora i zwiększając intensywność akceptora18. Skuteczność FRET (E) zależy zarówno od promienia Förstera (R0), jak i odległości między fluoroforami donorowymi i akceptorowymi (r) i jest określona wzorem: E = R06/(R06 + r6). Promień Förstera (R0) zależy od kilku czynników, w tym od orientacji kątowej dipola, nakładania się widmowego pary donor-akceptor oraz zastosowanego roztworu19. Aby zastosować test FRET na fluorymetrze z zatrzymanym przepływem, który monitoruje zmianę emisji donora w czasie rzeczywistym i umożliwia pomiary szybkiego włączania i wyłączania k, konieczne jest ustalenie wydajnego FRET, który skutkuje znacznym zmniejszeniem emisji donora. Dlatego ważne jest zaprojektowanie wydajnego FRET poprzez wybór odpowiedniej pary barwników fluorescencyjnych i miejsc na białkach docelowych do przyłączenia barwników, co zostanie omówione w tym protokole.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Zaprojektowanie testu FRET.

  1. Pobierz plik struktury kompleksu Cul1•Cand1 z Protein Data Bank (plik 1U6G).
  2. Wyświetl strukturę kompleksu Cul1•Cand1 w programie PyMOL.
  3. Użyj funkcji Measurement w menu Wizard programu PyMOL, aby oszacować odległość między pierwszym aminokwasem Cand1 a ostatnim aminokwasem Cul1 (Rysunek 1).
  4. Uruchom internetową przeglądarkę widm (patrz Tabela materiałów) i wyświetl jednocześnie widma wzbudzenia i emisji 7-amino-4-metylokumaryny (AMC) oraz FlAsH (Rysunek 2). Należy pamiętać, że AMC jest donorem FRET, a FlAsH jest akceptorem FRET.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Struktura krystaliczna kompleksu Cul1•Cand1 i pomiar odległości między potencjalnymi miejscami znakowania. Plik struktury krystalicznej pobrano z Protein Data Bank (Plik 1U6G) i wyświetlono w programie PyMOL. Pomiary między wybranymi atomami wykonano w programie PyMOL. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-protocol-2
Rycina 2: Widma wzbudzenia i emisji barwników fluorescencyjnych stosowanych w FRET. Przedstawiono widma AMC (7-amino-4-metylokumaryny) oraz FlAsH. Linie przerywane oznaczają widma wzbudzenia, a linie ciągłe – widma emisji. Obraz został pierwotnie wygenerowany za pomocą Fluorescence SpectraViewer i zmodyfikowany w celu zwiększenia przejrzystości. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

2. Przygotowanie Cul1AMC•Rbx1, białka donora FRET

  1. Skonstruuj plazmidy do ekspresji ludzkiego białka Cul1sortase•Rbx1 w komórkach E. coli. Należy zauważyć, że dwa plazmidy koekspresyjne dla ludzkiego Cul1•Rbx1 w komórkach E. coli zostały szczegółowo opisane w poprzedniej publikacji20.
    1. Do końca 3’ sekwencji kodującej Cul1 dodaj sekwencję DNA kodującą „LPETGGHHHHHH” (znacznik sortase-His6) przy użyciu standardowych metod PCR i klonowania21,22.
    2. Wykonaj sekwencjonowanie nowego plazmidu, aby potwierdzić poprawność insertu genu.
  2. Przeprowadź koekspresję Cul1sortase•Rbx1 w komórkach E. coli . Metoda ta została opracowana na podstawie poprzedniej publikacji20.
    1. Wymieszaj po 100 ng każdego z dwóch plazmidów z chemicznie kompetentnymi komórkami BL21 (DE3) w celu ko-transformacji metodą szoku termicznego23. Hoduj komórki na płytkach z agarem LB zawierającym 100 µg/mL ampicyliny i 34 µg/mL chloramfenikolu w temperaturze 37 °C przez noc.
    2. Zaszczep 50 mL kultury LB świeżo transformowanymi koloniami i inkubuj przez noc w 37 °C przy wytrząsaniu z prędkością 250 rpm. Otrzymany roztwór stanowi kulturę startową.
    3. Zaszczep 6 kolb, każda zawierająca 1 L podłoża LB, po 5 mL kultury startowej i hoduj w 37 °C przy wytrząsaniu 250 rpm, aż do osiągnięcia OD600 na poziomie ~1,0. Schłodź kulturę do 16 °C i dodaj izopropyl-β-D-1-tiogalaktozyd (IPTG) do stężenia 0,4 mM. Inkubuj kulturę w 16 °C przez noc przy wytrząsaniu 250 rpm.
    4. Zebierz komórki E. coli poprzez wirowanie przy 5 000 x g przez 15 min i zbierz osady komórkowe do probówek stożkowych o pojemności 50 mL.
      UWAGA: Osady komórkowe można poddać oczyszczaniu białka lub zamrozić w temperaturze -80 °C przed przejściem do etapów oczyszczania białka.
  3. Oczyszczanie kompleksu Cul1sortase•Rbx1. Metoda ta została opracowana na podstawie poprzedniej publikacji20.
    1. Do osadu komórek E. coli ekspresujących Cul1sortase•Rbx1 dodaj 50 mL buforu do lizy (30 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 5 mM DTT, 10% glicerolu, 1 tabletka koktajlu inhibitorów proteaz, pH 7,6).
    2. Zlizuj komórki na lodzie za pomocą sonikacji przy amplitudzie 50%. Stosuj cykle: 1 sekunda włączony i 1 sekunda wyłączony przez 3 min.
    3. Powtórz krok 2.3.2 od 2 do 3 razy.
    4. Przenieś lizat komórkowy do probówki do wirowania o pojemności 50 mL i usuń szczątki komórkowe poprzez wirowanie przy 25 000 x g przez 45 min.
    5. Inkubuj klarowny lizat komórkowy z 5 mL kulek z glutationem w temperaturze 4 °C przez 2 h.
    6. Wirowuj mieszaninę kulek z lizatem przy 1 500 x g przez 2 min w 4 °C. Usuń nadsącz.
    7. Przemyj kulki 5 mL buforu do lizy (bez inhibitorów proteaz) i usuń nadsącz po wirowaniu przy 1 500 x g przez 2 min w 4 °C.
    8. Powtórz krok 2.3.7 dwa razy.
    9. Do przemytych kulek dodaj 3 mL buforu do lizy i przenieś zawiesinę kulek do pustej kolumny.
    10. Do kolumny dodaj 5 mL buforu do elucji (50 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 10 mM zredukowanego glutationu, pH 8,0). Inkubuj przez 10 min i zbierz eluat.
    11. Powtórz krok 2.3.10 od 3 do 4 razy.
    12. Do eluatu z kulek z glutationem dodaj 200 µL trombiny o stężeniu 5 mg/mL (patrz Tabela materiałów) i inkubuj przez noc w 4 °C.
      UWAGA: Protokół można w tym miejscu przerwać.
    13. Rozcieńcz próbkę białka trzykrotnie za pomocą buforu A (25 mM HEPES, 1 mM DTT, 5% glicerolu, pH 6,5).
    14. Zrównoważ kolumnę do chromatografii wymiany kationowej (patrz Tabela materiałów) na systemie FPLC przy użyciu buforu A.
    15. Nałóż próbkę białka na zrównoważoną kolumnę do chromatografii wymiany kationowej z prędkością przepływu 0,5 mL/min.
    16. Eluuj białko gradientem NaCl w 40 mL, mieszając bufor A z 0 do 50% buforu B (25 mM HEPES, 1 M NaCl, 1 mM DTT, 5% glicerolu, pH 6,5) przy prędkości przepływu 1 mL/min.
    17. Sprawdź eluowane białko w różnych frakcjach za pomocą SDS-PAGE24.
      UWAGA: Protokół można w tym miejscu przerwać.
    18. Połącz frakcje eluatu zawierające Cul1sortase•Rbx1.
    19. Skoncentruj połączoną próbkę Cul1sortase•Rbx1 do objętości 2,5 mL, przepuszczając bufor przez membranę ultrafiltracyjną (odcięcie 30 kDa).
  4. Dodaj AMC do końca C-końcowego Cul1 poprzez transpeptydację pośredniczoną przez sortazę21,22.
    1. Zmień bufor w próbce Cul1sortase•Rbx1 na bufor do sortazy (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7,5) przy użyciu kolumny do odsalania (patrz Tabela materiałów).
      1. Zrównoważ kolumnę do odsalania 25 mL buforu do sortazy.
      2. Nałóż 2,5 mL próbki Cul1sortase•Rbx1 na kolumnę. Odrzuć przepływ.
      3. Eluuj próbkę 3,5 mL buforu do sortazy. Zbierz przepływ.
    2. Do 900 µL roztworu Cul1sortase•Rbx1 w buforze do sortazy dodaj 100 µL oczyszczonego roztworu sortazy A o stężeniu 600 µM oraz 10 µL peptydu GGGGAMC o stężeniu 25 mM. Inkubuj mieszaninę reakcyjną w 30 °C w ciemności przez noc. Należy pamiętać, że ten etap spowoduje powstanie Cul1AMC•Rbx1.
      OSTRZEŻENIE: Barwniki fluorescencyjne są wrażliwe na światło, dlatego należy w miarę możliwości unikać ich wystawiania na światło otoczenia podczas przygotowania białek i próbek.
      UWAGA: Protokół można w tym miejscu przerwać.
    3. Do mieszaniny reakcyjnej dodaj 50 µL kulek agarozowych Ni-NTA i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 min.
    4. Zestalej kulki agarozowe Ni-NTA poprzez wirowanie przy 5 000 x g przez 2 min i zbierz nadsącz.
    5. Zrównoważ kolumnę do chromatografii wykluczania żelowego (patrz Tabela materiałów) buforem (30 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 10% glicerolu) na systemie FPLC.
    6. Nałóż całą próbkę Cul1AMC•Rbx1 na kolumnę do chromatografii wykluczania żelowego. Eluuj 1,5-krotnością objętości kolumny buforem.
    7. Sprawdź frakcje eluatu za pomocą SDS-PAGE24.
    8. Połącz frakcje eluatu zawierające Cul1AMC•Rbx1.
    9. Zmierz stężenie białka, wykorzystując jego absorbancję przy 280 nm za pomocą spektrofotometru.
    10. Rozdziel roztwór białka na aalikwoty i przechowuj w temperaturze -80 °C.
      UWAGA: Protokół można w tym miejscu przerwać.

3. Przygotowanie FlAsHCand1, białka akceptora FRET

UWAGA: Większość etapów w tej części jest taka sama jak w kroku 2. Warunki, które uległy zmianie, zostały opisane szczegółowo poniżej.

  1. Skonstruowanie plazmidu do ekspresji ludzkiego TetraCysCand1 w komórkach E. coli.
    1. Dodanie sekwencji DNA kodującej „CCPGCCGSG” (znacznik tetracysteiny/TetraCys) przed 15tym aminokwasem Cand1 za pomocą standardowej reakcji PCR25 (sekwencje starterów: TGCTGTCCGGGCTGCTGCGGCAGCGGCATGACATCCAGCGACAAGGACTTTAG; CTAACTAGTGTCCATTGATTCCAAG).
    2. Wprowadzenie produktu PCR do wektora pGEX-4T-2. Sekwencjonowanie plazmidu w celu potwierdzenia poprawności i ramki odczytu wstawionego genu.
  2. Ekspresja TetraCysCand1 w komórkach E. coli w ten sam sposób, co w kroku 2.2, z wyjątkiem tego, że plazmid jest transformowany do kompetentnych komórek Rosetta.
  3. Oczyszczanie TetraCysCand1 z komórek E. coli.
    1. Lizę pelletów komórek E. coli i ekstrakcja TetraCysCand1 przy użyciu kulek z glutationem. Kroki te są identyczne z etapami 2.3.1–2.3.12.
    2. Rozcieńczenie trzykrotne eluatu białkowego z kulek z glutationem w Buforze C (50 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, 5% glicerolu, pH 7.5). Równoważenie kolumny do chromatografii wymiany anionowej (patrz Tabela materiałów) w systemie FPLC Buforem C i nałożenie rozcieńczonej próbki białka przy szybkości przepływu 0.5 mL/min.
    3. Elucja białka gradientem NaCl w 40 mL poprzez mieszanie Buforu C i od 0 do 50% Buforu D (50 mM Tris-HCl, 1 M NaCl, 1 mM DTT, 5% glicerolu, pH 7.5) przy szybkości przepływu 1 mL/min. Analiza eluowanego białka w różnych frakcjach za pomocą SDS-PAGE24 i połączenie frakcji zawierających TetraCysCand1. Należy pamiętać, że TetraCysCand1 ma większą objętość retencji niż wolny GST.
    4. Koncentracja połączonej próbki TetraCysCand1 poprzez przepuszczenie buforu przez membranę ultrafiltracyjną (odcięcie 30 kDa).
    5. Równoważenie kolumny do chromatografii wykluczania cząsteczkowego buforem do znakowania (20 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 2 mM TCEP, 1 mM EDTA, 5% glicerolu) w systemie FPLC. Nałożenie próbki TetraCysCand1 (za każdym razem 500 µL) i analiza frakcji eluatu za pomocą SDS-PAGE24.
    6. Połączenie wszystkich frakcji zawierających TetraCysCand1 i koncentracja białka do stężenia ~40 µM poprzez przepuszczenie buforu przez membranę ultrafiltracyjną (odcięcie 30 kDa). Oszacowanie stężenia białka na podstawie jego absorbancji przy 280 nm. Przechowywanie białka w alikwotach po 50 µL w temperaturze -80 °C.
      UWAGA: Protokół można w tym miejscu przerwać.
  4. Przygotowanie FlAsHCand1.
    1. Dodanie 1 µL roztworu FlAsH (patrz Tabela materiałów) do 50 µL roztworu TetraCysCand1.
    2. Dokładne wymieszanie i inkubacja mieszaniny w temperaturze pokojowej w ciemności przez 1-2 h w celu otrzymania FlAsHCand1.
      UWAGA: Protokół można w tym miejscu przerwać.

4. Przygotowanie Cand1, białka śledzącego w technice FRET

UWAGA: Protokół przygotowania białka jest podobny do Kroku 3, z następującymi modyfikacjami.

  1. Wprowadź sekwencję kodującą pełnowymiarowe białko Cand1 do wektora pGEX-4T-2.
  2. Zmień bufor użyty w kroku 3.3.5 na bufor zawierający 30 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 10% glicerolu.
  3. Pomiń kroki 3.3.7 i 3.3.8.

5. Testowanie i potwierdzenie analizy FRET

  1. Przygotować bufor FRET zawierający 30 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 0.5 mM DTT, 1 mg/mL owalbuminy, pH 7.6, i stosować go w temperaturze pokojowej.
  2. Przeprowadzić test FRET pomiędzy Cul1AMC•Rbx1 a FlAsHCand1 za pomocą fluorymetru.
    1. Do 300 µL buforu FRET dodać Cul1AMC•Rbx1 (donor FRET) do stężenia końcowego 70 nM. Przenieść roztwór do kuwety.
    2. Umieścić kuwetę w uchwycie na próbki fluorymetru. Próbkę wzbudzić światłem o długości fali 350 nm i przeskanować sygnały emisji w zakresie od 400 nm do 600 nm w odstępach 1 nm.
    3. Powtórzyć krok 5.2.1, zamieniając Cul1AMC•Rbx1 na FlAsHCand1 (akceptor FRET). Próbkę FlAsHCand1 przeskanować tą samą metodą, co w kroku 5.2.2.
    4. (Opcjonalnie) Wzbudzić FlAsHCand1 światłem o długości fali 510 nm i przeskanować sygnał emisji w zakresie od 500 nm do 650 nm.
    5. Do 300 µL buforu FRET dodać zarówno Cul1AMC•Rbx1, jak i FlAsHCand1 do stężenia końcowego 70 nM. Próbkę analizować w ten sam sposób, co w kroku 5.2.2.
  3. Potwierdzić występowanie FRET pomiędzy Cul1AMC•Rbx1 a FlAsHCand1 poprzez dodanie białka wypierającego (nieznakowanego Cand1) (Rysunek 3C).
    1. Do 300 µL buforu FRET dodać 70 nM Cul1AMC•Rbx1 oraz 700 nM Cand1. Przeskanować emisję próbki zgodnie z krokiem 5.2.2.
    2. Do 300 µL buforu FRET dodać 70 nM FlAsHCand1 oraz 700 nM Cand1. Przeskanować emisję próbki zgodnie z krokiem 5.2.2.
    3. Do 300 µL buforu FRET dodać 70 nM Cul1AMC•Rbx1 oraz 70 nM FlAsHCand1 i inkubować próbkę w temperaturze pokojowej przez 5 min. Następnie dodać 700 nM Cand1 i niezwłocznie po dodaniu przeskanować emisję próbki zgodnie z krokiem 5.2.2. Należy zauważyć, że krok ten jest analogiczny do kroku 5.2.5.
    4. Do 300 µL buforu FRET dodać sekwencyjnie 70 nM Cul1AMC•Rbx1, 700 nM Cand1 oraz 70 nM FlAsHCand1. Inkubować próbkę w temperaturze pokojowej przez 5 min, a następnie przeskanować emisję próbki zgodnie z krokiem 5.2.2. Jest to próbka z wypieraniem (zielona linia na Rysunku 3C).

6. Pomiar stałej szybkości asocjacji (kon) kompleksu Cul1•Cand1

UWAGA: Szczegóły obsługi fluorymetru z przepływem zatrzymanym (stopped-flow) zostały opisane w poprzednim raporcie26.

  1. Przygotuj fluorymetr z systemem zatrzymanego przepływu (stopped-flow) do pomiaru.
    1. Włącz fluorymetr stopped-flow zgodnie z instrukcją producenta.
    2. Ustaw światło wzbudzenia na 350 nm i zastosuj filtr pasmowy, który przepuszcza światło emisji o długości 450 nm i blokuje emisję w zakresie 500-650 nm.
    3. Ustaw zawory próbek w pozycji FILL i podłącz strzykawkę 3 mL wypełnioną wodą. Przepłucz obie strzykawki z próbkami (A i B) wodą, przesuwając napęd strzykawek z próbkami kilka razy w górę i w dół. Odrzuć całą wodę zużytą w tym kroku.
    4. Ustaw zawory próbek w pozycji FILL i podłącz strzykawkę 3 mL wypełnioną buforem FRET. Przepłucz obie strzykawki z próbkami buforem FRET, przesuwając napęd strzykawek z próbkami kilka razy w górę i w dół. Odrzuć cały bufor FRET zużyty w tym kroku.
  2. Wykonaj pomiar kontrolny (Rysunek 4C).
    1. Podłącz strzykawkę 3 mL i napełnij strzykawkę A roztworem 100 nM Cul1AMC•Rbx1 w buforze FRET. Przełącz zawór próbki w pozycję DRIVE.
    2. Podłącz strzykawkę 3 mL i napełnij strzykawkę B buforem FRET. Przełącz zawór próbki w pozycję DRIVE.
    3. Używając Control Panel w sekcji Acquire w oprogramowaniu, wykonaj pięć pomiarów (wymieszaj równe objętości próbek ze strzykawki A i strzykawki B) na fluorymetrze stopped-flow bez zapisywania wyników.
    4. Otwórz Control Panel w sekcji Acquire w oprogramowaniu i zaprogramuj zapis emisji Cul1AMC przez 60 s. Następnie wykonaj pojedynczy pomiar.
    5. Powtórz krok 6.2.4 dwukrotnie.
    6. Przełącz zawór próbki w pozycję FILL. Opróżnij strzykawkę B i przepłucz ją buforem FRET.
  3. Zmierz obserwowane stałe szybkości asocjacji (kobs) dla Cul1•Cand1 (Rysunek 4B).
    1. Pozostaw w strzykawce A tę samą próbkę, co w kroku 6.2.1.
    2. Podłącz strzykawkę 3 mL i napełnij strzykawkę B roztworem 100 nM FlAsHCand1 w buforze FRET. Przełącz zawór próbki w pozycję DRIVE.
    3. Używając Control Panel w sekcji Acquire w oprogramowaniu, wykonaj pięć pomiarów bez zapisywania wyników.
    4. Otwórz Control Panel w sekcji Acquire w oprogramowaniu i zaprogramuj zapis emisji Cul1AMC przez 60 s. Następnie wykonaj pojedynczy pomiar.
    5. Powtórz krok 6.3.4 dwukrotnie.
    6. Opróżnij strzykawkę B i przepłucz ją buforem FRET.
    7. Powtórz kroki 6.3.1–6.3.6 kilka razy, stosując zwiększające się stężenia FlAsHCand1 w buforze FRET.
    8. Dopasuj zmianę (spadek) sygnałów fluorescencji mierzonych w czasie dla każdego pomiaru do pojedynczej krzywej wykładniczej. Pozwoli to wyznaczyć kobs dla każdego pomiaru w jednostkach s-1. Należy zauważyć, że podstawy tych obliczeń zostały szczegółowo omówione w poprzedniej publikacji27.
  4. Oblicz średnią i odchylenie standardowe kobs dla każdego użytego stężenia FlAsHCand1. Przedstaw zależność średniej wartości kobs od stężenia Cand1 (Rysunek 4D); nachylenie linii reprezentuje stałą kon dla Cul1•Cand1, wyrażoną w jednostkach M-1 s-1.

7. Pomiar stałej szybkości dysocjacji (koff) kompleksu Cul1•Cand1 w obecności białka Skp1•F-box.

UWAGA: Ten krok jest podobny do kroku 6, z następującymi modyfikacjami.

  1. W strzykawce A, w pozycji FILL, należy wprowadzić roztwór 100 nM Cul1AMC•Rbx1 i 100 nM FlAsHCand1 w buforze FRET. Przekręcić zawór próbkowy do pozycji „DRIVE”.
  2. W strzykawce B, w pozycji FILL, należy wprowadzić roztwór Skp1•Skp2 (przygotowany zgodnie z wcześniejszym raportem20). Przekręcić zawór próbkowy do pozycji „DRIVE”.
  3. Otworzyć Panel sterowania w sekcji Acquire w oprogramowaniu i zaprogramować rejestrację emisji Cul1AMC przez 30 s. Następnie wykonać pojedynczy pomiar. Sygnały fluorescencyjne wzrastają w czasie po zmieszaniu roztworów ze strzykawki A i strzykawki B (Rycina 5).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby przetestować FRET między Cul1AMC a FlAsHCand1, najpierw określono intensywność emisji odpowiednio 70 nM Cul1AMC (donora) oraz 70 nM FlAsHCand1 (akceptora) (Rysunek 3A-C, niebieskie linie). W każdej analizie obecny był tylko jeden pik emisji, a emisja FlAsHCand1 (akceptora) była niska. Po zmieszaniu 70 nM Cul1AMC i 70 nM FlAsHCand1 w celu wywołania FRET, w widmach...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

FRET jest zjawiskiem fizycznym, które jest bardzo interesujące dla badania i zrozumienia systemów biologicznych19. W tym miejscu przedstawiamy protokół testowania i wykorzystania FRET do badania kinetyki wiązania dwóch oddziałujących ze sobą białek. Projektując FRET, wzięliśmy pod uwagę trzy główne czynniki: nakładanie się widma między emisją donorową a wzbudzeniem akceptorowym, odległość między dwoma fluoroforami oraz orientację dipolową fluoroforów28. Aby wybrać fluorofor...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Shu-Ou Shan (California Institute of Technology) za wnikliwą dyskusję na temat rozwoju testu FRET. M.G., Y.Z. i X.L. zostały sfinansowane z funduszy startowych z Purdue University dla Y.Z. i X.L. Praca ta była częściowo wspierana przez grant zalążkowy z Purdue University Center for Plant Biology.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kolumna chromatografii anionowymiennejGE Healthcare17505301Kolumna chromatografii anionowej HiTrap Q FF
Wirówka stołowa z chłodzeniemEppendorf2231000511
BL21 (DE3) Kompetentne komórkiThermoFisher ScientificC600003
Chlorek wapniaFisher ScientificC78-500
Wymiana kationowa Kolumna chromatograficznaGE Healthcare17505401HiTrap SP Sepharose FF
Kolumna odsalającaGE Healthcare17085101
Wirówka podłogowa (wysoka prędkość)Beckman CoulterJ2-MC
Wirówka podłogowa (wolna prędkość)Beckman CoulterJ6-MI
Fluorescence SpectraViewerThermoFisher Scientifichttps://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html
FluoroMax FluoroMaxHORIBAFluoroMax-3
FPLCGE Healthcare29018224
peptyd GGGGAMCAnglia Peptydniestandardowa synteza
Koraliki glutationuGE Healthcare
GlicerolFisher ScientificG33-500
HEPESFisher ScientificBP310-100
Izopropylo-β-D-tiogalaktozyd (IPTG)Fisher Scientific15-529-019
Bulion LBFisher ScientificBP1426-500
Agaroza Ni-NTAQiagen30210
MiliporeSigmaA2512
wektor pGEX-4T-2GE Healthcare28954550
Koktajl inhibitorów proteazyMilliporeSigma4693132001
Zredukowany glutationFisher ScientificBP25211
Wytrząsarka chłodniczaEppendorfM1282-0004
Rosetta Kompetentne komórkiMilliporeSigma70953-3
Kolumna chromatograficzna wykluczająca rozmiarGE Healthcare28990944Kolumna Superdex 200 10/300 GL
Chlorek sodu (NaCl)Fisher ScientificS271-500
Fluorymetr z zatrzymanym przepływemHi-Tech ScientificSF-61 DX2
TCEP· HClFisher ScientificPI20490
TrombinMilliporeSigmaT4648
Tris BaseFisher ScientificBP152-500
Membrana ultrafiltracyjnaMilliporeSigmaUFC903008Filtry odśrodkowe Amicon Ultra-15, Ultra-15, 30 000 NMWL
Nowa 17075605

Bibliografia

  1. Stumpf, M. P. H., et al. Estimating the size of the human interactome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (19), 6959-6964 (2008).
  2. Kuzmanov, U., Emili, A. Protein-protein interaction networks: probing disease mechanisms using model systems. Genome Medicine. 5 (4), 37(2013).
  3. Titeca, K., Lemmens, I., Tavernier, J., Eyckerman, S. Discovering cellular protein-protein interactions: Technological strategies and opportunities. Mass Spectrometry Reviews. , 1-33 (2018).
  4. Lapetina, S., Gil-Henn, H. A guide to simple, direct, and quantitative in vitro binding assays. Journal of Biological Methods. 4 (1), 62(2017).
  5. Zheng, X., Bi, C., Li, Z., Podariu, M., Hage, D. S. Analytical methods for kinetic studies of biological interactions: A review. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 113, 163-180 (2015).
  6. Pierce, N. W., et al. Cand1 promotes assembly of new SCF complexes through dynamic exchange of F box proteins. Cell. 153 (1), 206-215 (2013).
  7. Liu, X., Reitsma, J. M., Mamrosh, J. L., Zhang, Y., Straube, R., Deshaies, R. J. Cand1-Mediated Adaptive Exchange Mechanism Enables Variation in F-Box Protein Expression. Molecular Cell. 69 (5), 773-786 (2018).
  8. Zheng, N., et al. Structure of the Cul1-Rbx1-Skp1-F boxSkp2 SCF ubiquitin ligase complex. Nature. 416 (6882), 703-709 (2002).
  9. Kleiger, G., Deshaies, R. Tag Team Ubiquitin Ligases. Cell. 166 (5), 1080-1081 (2016).
  10. Zheng, J., et al. CAND1 binds to unneddylated CUL1 and regulates the formation of SCF ubiquitin E3 ligase complex. Molecular Cell. 10 (6), 1519-1526 (2002).
  11. Hwang, J. W., Min, K. W., Tamura, T. A., Yoon, J. B. TIP120A associates with unneddylated cullin 1 and regulates its neddylation. FEBS Letters. 541 (1-3), 102-108 (2003).
  12. Min, K. W., Hwang, J. W., Lee, J. S., Park, Y., Tamura, T., Yoon, J. B. TIP120A associates with cullins and modulates ubiquitin ligase activity. Journal of Biological Chemistry. 278 (18), 15905-15910 (2003).
  13. Goldenberg, S. J., et al. Structure of the Cand1-Cul1-Roc1 complex reveals regulatory mechanisms for the assembly of the multisubunit cullin-dependent ubiquitin ligases. Cell. 119 (4), 517-528 (2004).
  14. Chuang, H. W., Zhang, W., Gray, W. M. Arabidopsis ETA2, an apparent ortholog of the human cullin-interacting protein CAND1, is required for auxin responses mediated by the SCF(TIR1) ubiquitin ligase. Plant Cell. 16 (7), 1883-1897 (2004).
  15. Feng, S., et al. Arabidopsis CAND1, an Unmodified CUL1-Interacting Protein, Is Involved in Multiple Developmental Pathways Controlled by Ubiquitin/Proteasome-Mediated Protein Degradation. the Plant Cell Online. 16 (7), 1870-1882 (2004).
  16. Cheng, Y., Dai, X., Zhao, Y. AtCAND1, a HEAT-repeat protein that participates in auxin signaling in Arabidopsis. Plant Physiology. 135 (June), 1020-1026 (2004).
  17. Lo, S. -C., Hannink, M. CAND1-Mediated Substrate Adaptor Recycling Is Required for Efficient Repression of Nrf2 by Keap1. Molecular and Cellular Biology. 26 (4), 1235-1244 (2006).
  18. Okamoto, K., Sako, Y. Recent advances in FRET for the study of protein interactions and dynamics. Current Opinion in Structural Biology. 46, 16-23 (2017).
  19. Hussain, S. A. An introduction to fluorescence resonance energy transfer (FRET). arXiv preprint. , (2009).
  20. Li, T., Pavletich, N. P., Schulman, B. A., Zheng, N. High-level expression and purification of recombinant SCF ubiquitin ligases. Methods in Enzymology. 398 (1996), 125-142 (2005).
  21. Popp, M. W., Antos, J. M., Grotenbreg, G. M., Spooner, E., Ploegh, H. L. Sortagging: A versatile method for protein labeling. Nature Chemical Biology. 3 (11), 707-708 (2007).
  22. Antos, J. M., Ingram, J., Fang, T., Pishesha, N., Truttmann, M. C., Ploegh, H. L. Site-Specific Protein Labeling via Sortase-Mediated Transpeptidation. Current Protocols in Protein Science. 89, (2017).
  23. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method. Journal of Visualized Experiments. , (2007).
  24. Simpson, R. J. SDS-PAGE of Proteins. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
  25. Kleiger, G., Saha, A., Lewis, S., Kuhlman, B., Deshaies, R. J. Rapid E2-E3 Assembly and Disassembly Enable Processive Ubiquitylation of Cullin-RING Ubiquitin Ligase Substrates. Cell. 139 (5), 957-968 (2009).
  26. Biro, F. N., Zhai, J., Doucette, C. W., Hingorani, M. M. Application of Stopped-flow Kinetics Methods to Investigate the Mechanism of Action of a DNA Repair Protein. Journal of Visualized Experiments. (37), 2-8 (2010).
  27. Patel, J. T., Belsham, H. R., Rathbone, A. J., Friel, C. T. Use of Stopped-Flow Fluorescence and Labeled Nucleotides to Analyze the ATP Turnover Cycle of Kinesins. Journal of Visualized Experiments. (92), 1-6 (2014).
  28. Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. A guide to fluorescent protein FRET pairs. Sensors (Switzerland). 16 (9), 1-24 (2016).
  29. Chen, A. K., Cheng, Z., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Assessing the sensitivity of commercially available fluorophores to the intracellular environment. Analytical Chemistry. 80 (19), 7437-7444 (2008).
  30. Lin, C. T., Rorabacher, D. B. Mathematical approach for stopped-flow kinetics of fast second-order reactions involving inhomogeneity in the reaction cell. Journal of Physical Chemistry. 78 (3), 305-308 (1974).
  31. Toseland, C. P., Geeves, M. A. Rapid Reaction Kinetic Techniques. Fluorescent Methods for Molecular Motors. , 49-65 (2014).
  32. Adams, S. R., et al. New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: Synthesis and biological applications. Journal of the American Chemical Society. 124 (21), 6063-6076 (2002).
  33. Lin, C. W., Ting, A. Y. Transglutaminase-catalyzed site-specific conjugation of small-molecule probes to proteins in vitro and on the surface of living cells. Journal of the American Chemical Society. 128 (14), 4542-4543 (2006).
  34. Yin, J., et al. Genetically encoded short peptide tag for versatile protein labeling by Sfp phosphopantetheinyl transferase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (44), 15815-15820 (2005).
  35. Diaspro, A., Chirico, G., Usai, C., Ramoino, P., Dobrucki, J. Photobleaching. Handbook Of Biological Confocal Microscopy. , 690-702 (2006).
  36. Aoki, K., Kamioka, Y., Matsuda, M. Fluorescence resonance energy transfer imaging of cell signaling from in vitro to in vivo: Basis of biosensor construction, live imaging, and image processing. Development, Growth & Differentiation. 55 (4), 515-522 (2013).
  37. Kilic, S., et al. Single-molecule FRET reveals multiscale chromatin dynamics modulated by HP1α. Nature Communications. 9 (1), (2018).
  38. Shen, K., Arslan, S., Akopian, D., Ha, T., Shan, S. O. Activated GTPase movement on an RNA scaffold drives co-translational protein targeting. Nature. 492 (7428), 271-275 (2012).
  39. Bajar, B. T., et al. Improving brightness and photostability of green and red fluorescent proteins for live cell imaging and FRET reporting. Scientific Reports. 6 (February), 1-12 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Kinetyka kompleks w bia kowychfluorymetr z przep ywem zatrzymanymdonor i akceptor FRETszybko ci asocjacji i dysocjacjioczyszczanie bia ekkulki z glutationemchromatografia wykluczania cz steczkowegokationowymienna chromatografia jonowaci cie trombin
Wykorzystanie transferu energii rezonansu fluorescencyjnego in vitro do badania dynamiki kompleksów białkowych w milisekundowej skali czasowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.