Obecny protokół opisuje zintegrowaną metodę badania migracji i inwazji komórek rakowych na jednej platformie w czasie rzeczywistym, zapewniając łatwą do odtworzenia i efektywną czasowo opcję badania mobilności i morfologii komórek.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Prosty przepływ pracy migracji/inwazji przy użyciu zautomatyzowanego imagera Live Cell
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Mobilność komórek rakowych jest kluczowa dla inicjacji przerzutów. Dlatego badanie ruchu komórek i zdolności inwazyjnych ma ogromne znaczenie. Testy migracji zapewniają podstawowy wgląd w ruch komórek na poziomie 2D, podczas gdy testy inwazji są bardziej istotne fizjologicznie, naśladując przemieszczanie się komórek rakowych in vivo z pierwotnego miejsca i inwazję przez macierz zewnątrzkomórkową. Obecny protokół zapewnia pojedynczy przepływ pracy dla testów migracji i inwazji. Wraz ze zintegrowaną, zautomatyzowaną kamerą mikroskopową do przetwarzania obrazów HD w czasie rzeczywistym i wbudowanym modułem analitycznym, daje to naukowcom efektywną czasowo, prostą i powtarzalną opcję eksperymentalną. Protokół ten obejmuje również zamienniki materiałów eksploatacyjnych i alternatywne metody analizy do wyboru przez użytkowników.
Wprowadzenie
Migracja i inwazja komórek to ważne procesy biologiczne, które umożliwiają normalne funkcjonowanie w ludzkim ciele, takie jak zamykanie ran, inwazja łożyska do macicy i morfogeneza gruczołu sutkowego1,2,3. Ciało ludzkie ma precyzyjną i ścisłą kontrolę nad tymi zdarzeniami biologicznymi; Istnieją jednak pewne wyjątki. Na przykład nowotwory złośliwe są w stanie uciec przed tym zabezpieczeniem, wykazywać nieprawidłową proliferację i atakować sąsiednie tkanki, co nazywa się przerzutami. Przerzuty są główną przyczyną śmiertelności związanej z rakiem4.
<....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
UWAGA: Dwie linie komórkowe powinny być obsługiwane oddzielnie. Poniższe procedury należy zastosować do jednej pojedynczej linii komórkowej, jeśli nie zostały określone.
1. Zoptymalizuj gęstość komórek przed zranieniem
- Hodowla komórek adherentnych w kolbach do hodowli tkankowych T75 cm2 do około 80% konfluencji w wolnym od czerwieni fenolowej zmodyfikowanym podłożu Dulbecco Eagle Medium (DMEM) uzupełnionym 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 200 mM L-glutaminą i 2 μg/ml insuliny w temperaturze 37 °C z 5% CO2 (standardowe warunki inkubacji dla większości linii komórek rakowych, preparaty ho....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Niniejszy test migracji/inwazji opiera się na teście gojenia ran, który ocenia szybkość przemieszczania się komórek do obszaru wolnego od komórek, utworzonego za pomocą 96-pinowego narzędzia do drapania. Różnica między testami migracji i inwazji polega na tym, że testy migracji mierzą przemieszczanie się komórek po powierzchni plastiku traktowanej do hodowli tkanek, natomiast testy inwazji mierzą przemieszczanie się komórek przez żel ECM.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Migracja i inwazja są ważnymi parametrami oceny mobilności komórek nowotworowych. Dzięki zastosowaniu 96-pinowego narzędzia do drapania możliwe jest jednoczesne przeprowadzanie testów gojenia się ran w 2D i 3D. Oprócz ułatwienia automatycznego skanowania, zapewniając stabilne środowisko hodowli komórkowej przy minimalnych zakłóceniach, test zarysowania przeprowadzony przy użyciu 96-pinowego narzędzia do zarysowania zapewnia spójne rany po zadrapaniach, umożliwiając eksperymenty, które są bardziej niezawodne i powtarzalne.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować za nasze wsparcie finansowe ze strony Fundacji Bloomfield Group za pośrednictwem Hunter Medical Research Institute (HMRI 13-02). X.Z jest wspierany przez stypendium APA za pośrednictwem Uniwersytetu w Newcastle oraz stypendium doktoranckie HCRA Biomarkers Flag
.....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0,5% roztwór trypsyny-EDTA (10x) | ThermoFisher Scientific | 30028-02 | Rozcieńczyć do 2x w DPBS |
| Countess II FL Automatyczny licznik komórek | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | Automatyczny licznik komórek |
| Detergent 1 (Alconox) | Sigma-Aldrich | 242985 | 0,5% stężenie robocze |
| Detergent 2 (Virkon S) | VetProduct DIRECT | 1% pracy koncentracja | |
| Dulbecco" s Zmodyfikowana pożywka Eagle, bez czerwieni fenolowej | ThermoFisher Scientific | 21063-045 | Dostarczana z 10% FBS, 200 mM L-glutaminą, 2 μ g / ml insuliny |
| Żel ECM (matrigel) | Sigma-Aldrich | E6909 | Obniżony czynnik wzrostu, bez czerwieni fenolowej |
| Essen ImageLock 96-dołkowa płytka, płaskie dno | Essen | 4379 | |
| EVE Szkiełka liczące | BioTools | EVS-50 | |
| Płodowa surowica bydlęca (FBS) | Bovogen Biologicals | SFBS-F-500ml | |
| IncuCyte 96-dołkowa inwazja komórek rany drapanej akcesoria | Essen | 4444 | W tym CoolBox, 2x CoolSink |
| IncuCyte Zestaw do migracji komórek | Essen | 4493 | W zestawie 96-dołkowy blok pinów, 2x myjki i oprogramowanie |
| IncuCyte ZOOM | Essen | System analizy żywych komórek | |
| Roztwór insuliny ludzkiej | Sigma-Aldrich | 19278-5ML | |
| roztwór L-glutaminy (100x) | ThermoFisher Scientific | 25030-091 | |
| Kolba do hodowli tkankowych, powierzchnia wzrostu 75 cm2 | Greiner Bio-One | 658175 |
Bibliografia
- Graham, C. H., Lala, P. K. Mechanisms of placental invasion of the uterus and their control. Biochemistry and Cell Biology. 70, 867-874 (1992).
- Affolter, M., Zeller, R., Caussinus, E. Tissue remodelling through branching morphogenesis. Nature Reviews Mo....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
