Prosty przepływ pracy migracji/inwazji przy użyciu zautomatyzowanego imagera Live Cell

Summary

Obecny protokół opisuje zintegrowaną metodę badania migracji i inwazji komórek rakowych na jednej platformie w czasie rzeczywistym, zapewniając łatwą do odtworzenia i efektywną czasowo opcję badania mobilności i morfologii komórek.

Abstract

Mobilność komórek rakowych jest kluczowa dla inicjacji przerzutów. Dlatego badanie ruchu komórek i zdolności inwazyjnych ma ogromne znaczenie. Testy migracji zapewniają podstawowy wgląd w ruch komórek na poziomie 2D, podczas gdy testy inwazji są bardziej istotne fizjologicznie, naśladując przemieszczanie się komórek rakowych in vivo z pierwotnego miejsca i inwazję przez macierz zewnątrzkomórkową. Obecny protokół zapewnia pojedynczy przepływ pracy dla testów migracji i inwazji. Wraz ze zintegrowaną, zautomatyzowaną kamerą mikroskopową do przetwarzania obrazów HD w czasie rzeczywistym i wbudowanym modułem analitycznym, daje to naukowcom efektywną czasowo, prostą i powtarzalną opcję eksperymentalną. Protokół ten obejmuje również zamienniki materiałów eksploatacyjnych i alternatywne metody analizy do wyboru przez użytkowników.

Introduction

Migracja i inwazja komórek to ważne procesy biologiczne, które umożliwiają normalne funkcjonowanie w ludzkim ciele, takie jak zamykanie ran, inwazja łożyska do macicy i morfogeneza gruczołu sutkowego^1,2,3. Ciało ludzkie ma precyzyjną i ścisłą kontrolę nad tymi zdarzeniami biologicznymi; Istnieją jednak pewne wyjątki. Na przykład nowotwory złośliwe są w stanie uciec przed tym zabezpieczeniem, wykazywać nieprawidłową proliferację i atakować sąsiednie tkanki, co nazywa się przerzutami. Przerzuty są główną przyczyną śmiertelności związanej z rakiem⁴.

Rak piersi jest najczęściej diagnozowanym nowotworem u kobiet i jest drugą najczęstszą przyczyną zgonów związanych z rakiem wśród kobiet w krajach rozwiniętych na całym świecie⁵. Rak piersi wywodzi się z przewodów lub zrazików, które składają się z jednej lub więcej warstw komórek nabłonkowych. W prawidłowej piersi komórki nabłonkowe przylegają do siebie i do błony podstawnej poprzez białka błonowe, takie jak E-kadheryna i integryny⁶. Jednak inwazyjne komórki raka piersi utraciły swoją polaryzację i adhezję komórka-komórka i klasycznie przechodzą mezenchymalne przejście nabłonkowe (EMT) i zyskują zdolność poruszania się. Po wynaczynieniu komórki te przemieszczają się przez macierz zewnątrzkomórkową (ECM) i dostają się do naczynia krwionośnego lub układu limfatycznego, po czym następuje wynaczynienie i wzrost przerzutowy⁷. Zrozumienie mechanizmów, za pomocą których to zachodzi, ma ogromne znaczenie, ponieważ przerzuty są najczęstszą przyczyną zgonów związanych z rakiem i są ściśle związane z migracją/inwazją komórek rakowych. Aby zobrazować ruch komórek nowotworowych, testy migracji i inwazji są idealnymi modelami do badania odpowiednio ruchu komórek 2D i 3D. Migracja bezpośrednio ocenia ruch komórek, podczas gdy inwazja wiąże się z interakcją z mikrośrodowiskiem i zdolnością do degradacji barier biologicznych. Te dwa procesy nie są w pełni od siebie niezależne, ponieważ migracja jest warunkiem inwazji.

Opracowano kilka metod do badania migracji i inwazji. Jak dokonali przeglądy Kramer i wsp., testy migracji, takie jak gojenie się ran, testy ogrodzenia i mikronośników, generują obszar wolny od komórek, aby umożliwić komórkom przemieszczanie się, oceniając zmianę obszaru; Natomiast testy transwell i kapilarne opierają się na liczbie komórek, które poruszają się w kierunku atraktantu8. W przypadku testów inwazji należy skonfigurować środowisko ECM, na przykład z żelem lub kolagenem ECM, a ruch 3D można ocenić, monitorując obszar inwazji, odległość i liczbę komórek (np. test transwell, test dziobaka)⁸. Innym rodzajem testu inwazji jest połączenie komórek inwazyjnych z komórkami nieinwazyjnymi i ocena zachowania komórek inwazyjnych (np. testy sferoidalne). Powyższe metody mają swoje wady i zalety, a sposób, który jest łatwy do podejścia, łatwy do powtórzenia i łączenia testu migracji i testu inwazji w podobnym przepływie pracy, jest preferowany w projektowaniu eksperymentalnym.

Ten protokół opisuje pomiar migracji i inwazji komórek za pomocą imagera żywych komórek. Jest to system monitorowania komórek w czasie rzeczywistym zainstalowany w standardowym inkubatorze do hodowli komórkowych. Wykonuje obrazy w wysokiej rozdzielczości zgodnie z ustalonymi interwałami skanowania i pomiarami, nakładając odpowiednie maski na komórki lub cele fluorescencyjne. Moduł testu migracji/inwazji obejmuje użycie 96-pinowego narzędzia do rysowania, które nadaje się do wykonywania jednorodnych ran zadrapań na monowarstwie komórki na 96-dołkowej płytce. Mechanizm opiera się na testach gojenia się ran in vitro, monitorujących ruch komórek 2D na powierzchni z tworzywa sztucznego lub powlekanej. Można również ocenić inwazję lub ruch 3D przez dodatkowy ECM w obrębie rany po zadrapaniu. Krótki przepływ pracy jest zilustrowany w Rysunek 1.

Protocol

UWAGA: Dwie linie komórkowe powinny być obsługiwane oddzielnie. Poniższe procedury należy zastosować do jednej pojedynczej linii komórkowej, jeśli nie zostały określone.

1. Zoptymalizuj gęstość komórek przed zranieniem

1. Hodowla komórek adherentnych w kolbach do hodowli tkankowych T75 cm² do około 80% konfluencji w wolnym od czerwieni fenolowej zmodyfikowanym podłożu Dulbecco Eagle Medium (DMEM) uzupełnionym 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 200 mM L-glutaminą i 2 μg/ml insuliny w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ (standardowe warunki inkubacji dla większości linii komórek rakowych, preparaty hodowlane są zależne od linii komórkowej).
2. Usunąć pożywkę hodowlaną, pipetując ją do pojemnika na odpady. Odpipetować 2 ml wstępnie podgrzanej 0,1% trypsyny-EDTA, aby krótko spłukać monowarstwę komórek i odpipetować. Dodać kolejne 2 ml 0,1% trypsyny-EDTA i umieścić kolbę w standardowych warunkach inkubacji w temperaturze 37 °C na 5 minut.
3. Delikatnie postukać w kolbę, aby zapewnić oderwanie komórek, a następnie dodać 10 ml wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej, aby zatrzymać reakcję proteolityczną.
4. Przenieść zawiesinę komórek do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i wirować w temperaturze 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT). Ostrożnie usunąć supernatant bez mieszania osadu komórkowego i ponownie zawiesić z kolejnymi 10 ml wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej.

2. Zliczanie numerów komórek za pomocą automatycznego licznika komórek (lub dowolnych metod liczenia)

1. Rozcieńczyć 200 μl zawieszonej zawiesiny komórek 800 μl 1x sól fizjologiczna buforowana fosforanem (DPBS) firmy Dulbecco w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml.
2. Przymocuj czujnik liczby komórek 60 μm do licznika komórek, przytrzymaj przełącznik i połącz końcówkę z zawiesiną komórki. Powoli zwalniaj przełącznik, aż zawiesina ogniw zostanie pomyślnie wciągnięta do czujnika. Stężenie komórek jest wyświetlane w komórkach/ml.
3. Obliczyć liczbę komórek w zawiesinie komórek o objętości 10 ml.

3. Poszycie komórek

1. Płytki komórek o różnej gęstości komórek (40 000-90 000 komórek/dołek) w trzech egzemplarzach na 96-dołkowej płytce.
2. Umieść płytkę w imagerze live-cell i zaplanuj skanowanie co 2 godziny przez 24 godziny.
   1. W oprogramowaniu kliknij opcję Zaplanuj skanowanie na liście zadań. W okienku ustawień szuflady określ położenie blachy, kliknij przycisk Dodaj naczynie i wybierz typ blachy. W panelu Scan Setup (Ustawienia skanowania) wybierz lub edytuj wzór skanowania zgodnie z ustawieniami płytki eksperymentalnej, a następnie ustaw Typ skanowania jako Standardowy.
   2. Kliknij prawym przyciskiem myszy oś czasu i wybierz Ustaw interwały. Ustaw opcję Dodaj skany co do 2 godzin zgodnie z harmonogramem 24-godzinnym. Kliknij przycisk Zastosuj.

4. Określ optymalną gęstość wysiewu komórek dla testu migracji

1. Po24 godzinach zastosuj narzędzie do analizy przetwarzania konfluencji do automatycznie zebranych obrazów kontrastu fazowego HD i wygeneruj krzywą proliferacji komórek w czasie.
   1. Określ od 3 do 6 reprezentatywnych obrazów i umieść je w nowej kolekcji obrazów.
   2. Określ właściwą maskę jako definicję przetwarzania.
   3. Uruchom zadanie analizy.
   4. Określ zoptymalizowaną gęstość komórek zgodnie z konfluencją w czasie (około 100% konfluencji w ciągu 6 -18 godzin, w zależności od tego, kiedy rozpoczyna się test migracji).
      nuta: Czas potrzebny do wyhodowania komórek do zbiegu różni się w zależności od rozcieńczenia wysiewu.

5. Dzień 1 i 2: Przygotowanie do testów migracji i inwazji

1. W dniu 1 pokryj płytkę do testu inwazji.
   UWAGA: Żel ECM należy zawsze dotykać na lodzie i z końcówkami, które zostały umieszczone w lodówce na noc.
   1. Rozcieńczyć żel ECM lodowatą pożywką hodowlaną do 100 μg/ml i dodać 50 μl rozcieńczonego żelu/pożywki ECM do wyznaczonych studzienek.
   2. Umieścić płytkę w standardowych warunkach inkubacji na noc.
2. W dniu 2 delikatnie odessaj nadmiar pożywki. Komórki płytkowe o zoptymalizowanej gęstości komórek na 2 96-dołkowych płytkach przeznaczonych do testu migracji (niepowlekane) i testu inwazji (powlekane) w trzech egzemplarzach zgodnie z sekcjami 1-3 późnym popołudniem (w obecnym protokole zoptymalizowane gęstości wysiewu dla ZR75-1 i MDA-MB-231 wynosiły odpowiednio 90 000/dołek i 50 000/dołek).
3. Umieść płytki w standardowych warunkach inkubacji na noc.

6. Dzień 3: Zadrapanie rany

1. Spryskaj i wytrzyj narzędzie do drapania i 2 łódeczki myjące 70% etanolem przed umieszczeniem ich w szafie bezpieczeństwa biologicznego. Napełnij łódź myjącą 1 i 2 dokładnie 45 ml sterylnej (autoklawowanej) wody destylowanej i 70% etanolu.
2. W celu sterylizacji umieść blok kołków do drapania (u góry) na łodzi myjącej 1 i 2 na 5 minut każdy.
3. Zacznij od płytki do oznaczania migracji.
   1. Przesunąć płytkę zawierającą komórki z inkubatora i upewnić się, że żadna studzienka nie jest sucha, aby uniknąć uszkodzenia narzędzia do drapania. Zdejmij pokrywę płyty i włóż ją do uchwytu płyty podstawy narzędzia do drapania i ostrożnie umieść górną część na części podstawy, prowadząc kołki. Naciśnij i przytrzymaj czarną dźwignię, a w międzyczasie ostrożnie podnieś blok sworznia. Szczeliny w każdej studzience są zwykle widoczne gołym okiem i pod mikroskopem.
   2. Szybko namocz szpilki w wodzie; to wystarczy, aby wyczyścić narzędzie do zarysowania przed zarysowaniem płytki do badania inwazji, jeśli konfiguracja płytki jest identyczna. W przeciwnym razie powtórz etapy sterylizacji sterylną wodą destylowaną, a następnie 70% etanolem przez 5 minut każdy.
4. Umyj płytkę 1 lub 2 razy wstępnie podgrzaną pożywką hodowlaną, aby uniknąć ponownego przyczepienia się oderwanych komórek lub arkuszy komórek do studzienki.
5. Dodać 100 μl świeżej, ciepłej pożywki do wyznaczonych studzienek z zabiegami lub bez.
6. Dodatkowe kroki do testu inwazji.
   1. Umieścić płytkę do oznaczania inwazji w temperaturze 4 °C na 5 minut w celu zrównoważenia i ostrożnie zassać zimną pożywkę.
   2. Rozcieńczyć żel ECM lodowatą pożywką hodowlaną do 5 mg/ml, dodać 50 μl rozcieńczonego żelu ECM do wyznaczonych studzienek i umieścić w standardowej inkubacji na 30 minut.
   3. Dodać 100 μl podgrzanej pożywki ze związkami testowymi lub bez.
7. Umieść płytkę w imagerze live-cell i pozwól jej się zrównoważyć przez 5 minut. Wybierz Vessel Type (Typ naczynia) jako płytkę imagelock. Ustaw Typ skanowania jako Rana zadrapań, wybierz lub edytuj Wzór skanowania zgodnie z konfiguracją płytki eksperymentalnej (1 obraz/studzienka i tryb szerokokątny) i zaplanuj 24-godzinne powtarzanie skanowania co 1-2 godziny przez 72 godziny, aż rany się zagoją.
8. Aby wyczyścić drapak, umieść górną blokadę kołków w każdym z następujących roztworów (45 ml w łódkach do mycia) na 5 minut: 0,5% detergentu 1 (patrz Tabela materiałów), 1% detergentu 2 (patrz Tabela materiałów), sterylnej wody destylowanej i 70% etanolu. Umieść narzędzie do drapania z powrotem na płycie podstawy i przechowuj w środowisku wolnym od kurzu.

7. Analiza danych

1. Przestań skanować wyznaczoną płytkę po zagojeniu się wszystkich ran, wybierając eksperymentalną płytkę w ustawieniach szuflady i klikając Usuń naczynie.
2. Zbierz 3-6 reprezentatywnych obrazów obejmujących różne wartości procentowe dźwięku, w tym obrazy bezpośrednio po wykonaniu rany, zamknięciu rany o 10% i 50%.
3. Aby określić prawidłową definicję przetwarzania, użyj narzędzi Korekta segmentacji, Oczyszczanie i Filtry, aby zastosować odpowiednią maskę zadrapań i maskę konfluencji. Użyj opcji Podgląd bieżącej/wszystkich, aby wyświetlić dokładność masek.
4. Uruchom zadanie analizy.
5. Dane mogą być analizowane w oprogramowaniu lub eksportowane w celu dalszej analizy. Do oceny obrazów w fazie HD można wykorzystać trzy wskaźniki dostarczane przez oprogramowanie: szerokość rany (μm), zbieżność rany (%) i względną gęstość rany (%). Porównania zostaną omówione w następnej sekcji.

Results

Ten test migracji/inwazji opiera się na teście gojenia się ran, który ocenia szybkość przemieszczania się komórek do obszaru wolnego od komórek, utworzonego przez 96-pinowe narzędzie do drapania. Różnica między testami migracji i inwazji polega na tym, że testy migracji mierzą komórki poruszające się po powierzchni tworzywa sztucznego poddanego działaniu hodowli tkankowej, a inwazja mierzy komórki poruszające się po żelu ECM.

Na...

Discussion

Migracja i inwazja są ważnymi parametrami oceny mobilności komórek nowotworowych. Dzięki zastosowaniu 96-pinowego narzędzia do drapania możliwe jest jednoczesne przeprowadzanie testów gojenia się ran w 2D i 3D. Oprócz ułatwienia automatycznego skanowania, zapewniając stabilne środowisko hodowli komórkowej przy minimalnych zakłóceniach, test zarysowania przeprowadzony przy użyciu 96-pinowego narzędzia do zarysowania zapewnia spójne rany po zadrapaniach, umożliwiając eksperymenty, które są bardziej niezawodne i powtarzalne...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,5% roztwór trypsyny-EDTA (10x)	ThermoFisher Scientific	30028-02	Rozcieńczyć do 2x w DPBS
Countess II FL Automatyczny licznik komórek	ThermoFisher Scientific	AMQAX1000	Automatyczny licznik komórek
Detergent 1 (Alconox)	Sigma-Aldrich	242985	0,5% stężenie robocze
Detergent 2 (Virkon S)	VetProduct DIRECT		1% pracy koncentracja
Dulbecco" s Zmodyfikowana pożywka Eagle, bez czerwieni fenolowej	ThermoFisher Scientific	21063-045	Dostarczana z 10% FBS, 200 mM L-glutaminą, 2 μ g / ml insuliny
Żel ECM (matrigel)	Sigma-Aldrich	E6909	Obniżony czynnik wzrostu, bez czerwieni fenolowej
Essen ImageLock 96-dołkowa płytka, płaskie dno	Essen	4379
EVE Szkiełka liczące	BioTools	EVS-50
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	Bovogen Biologicals	SFBS-F-500ml
IncuCyte 96-dołkowa inwazja komórek rany drapanej akcesoria	Essen	4444	W tym CoolBox, 2x CoolSink
IncuCyte Zestaw do migracji komórek	Essen	4493	W zestawie 96-dołkowy blok pinów, 2x myjki i oprogramowanie
IncuCyte ZOOM	Essen		System analizy żywych komórek
Roztwór insuliny ludzkiej	Sigma-Aldrich	19278-5ML
roztwór L-glutaminy (100x)	ThermoFisher Scientific	25030-091
Kolba do hodowli tkankowych, powierzchnia wzrostu 75 cm2	Greiner Bio-One	658175