Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Zaawansowane obrazowanie ludzkich limfocytów naprowadzających płuca w eksperymentalnym modelu zapalenia alergicznego in vivo opartym na mikroskopii arkuszowej światła

7.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59043

⸱

16 kwietnia 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine 1, University Hospital of Erlangen, 2Department of Medicine 3, University Hospital of Erlangen

W tym artykule

Podsumowanie

Wprowadzony tutaj protokół pozwala na scharakteryzowanie zdolności naprowadzania płuc pierwotnych ludzkich limfocytów w warunkach zapalnych in vivo. Naciek płucny adoptywnie przeniesionych ludzkich komórek odpornościowych w mysim modelu alergicznego zapalenia można zobrazować i określić ilościowo za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej arkusza świetlnego chemicznie oczyszczonej tkanki płucnej.

Streszczenie

Przytłaczająca akumulacja wysoce aktywowanych komórek odpornościowych stanowi cechę charakterystyczną różnych przewlekłych chorób zapalnych i stała się atrakcyjnym celem terapeutycznym w klinicznym leczeniu dotkniętych pacjentów. W celu dalszej optymalizacji strategii mających na celu regulację terapeutyczną patologicznie niezrównoważonego naciekania tkanek prozapalnych komórek odpornościowych, szczególnie ważne będzie uzyskanie lepszego wglądu w specyficzne dla choroby i narządu właściwości naprowadzania limfocytów obwodowych. Opisany w niniejszym dokumencie protokół eksperymentalny pozwala na monitorowanie akumulacji w płucach znakowanych fluorescencyjnie i adoptywnie przenoszonych ludzkich limfocytów w kontekście zapalenia płuc wywołanego papainą. W przeciwieństwie do standardowych testów in vitro często stosowanych do analizy migracji komórek odpornościowych i chemotaksji, obecnie wprowadzone warunki in vivo uwzględniają specyficzne dla płuc aspekty organizacji tkanek i wpływ złożonego scenariusza zapalnego zachodzącego w żywym organizmie myszy. Co więcej, trójwymiarowe obrazowanie mikroskopowe fluorescencji w przekroju poprzecznym nie tylko dostarcza danych ilościowych na temat naciekających komórek odpornościowych, ale także przedstawia wzorzec lokalizacji komórek odpornościowych w płucach objętych stanem zapalnym. Ogólnie rzecz biorąc, jesteśmy w stanie wprowadzić innowacyjną technikę o wysokiej wartości dla badań immunologicznych w dziedzinie przewlekłych zapalnych chorób płuc, którą można łatwo zastosować, postępując zgodnie z dostarczonym protokołem krok po kroku.

Wprowadzenie

Klasyczne choroby zapalne płuc, takie jak astma alergiczna i przewlekła obturacyjna choroba płuc (POChP), są dobrze znane z tego, że są napędzane przez zwiększoną rekrutację aktywowanych limfocytów do tkanki płucnej1,2. Cytokiny uwalniane przez limfocyty (np. IL-4, IL-5, IL-9, IL-13, IFN-γ i TNF-α) dodatkowo promują chemotaksję wrodzonych i nabytych komórek odpornościowych, indukują przebudowę zwłóknień dróg oddechowych lub bezpośrednio uszkadzają miąższ płuca2. Jak dotąd mechanizmy leżące u podstaw patologicznej akumulacji limfocytów w tkance płucnej nie są jeszcze w pełni poznane. Analogicznie do selektywnego tkankowo imprintingu limfocytów T opisanego dla naprowadzania jelit i skóry, płucne komórki dendrytyczne (DC) są oczywiście w stanie przygotować obwodowe limfocyty T do preferencyjnej infiltracji płuc, przynajmniej częściowo poprzez indukcję ekspresji CCR4 na powierzchni limfocytów3. Oprócz CCR4, limfocyty T naciekające drogi oddechowe charakteryzują się również szczególnie zwiększoną ekspresją receptorów chemokiny CCR5 i CXCR3 w porównaniu z limfocytami T w krwi obwodowej 1, 4,< sup class = "xref">5. Ogólnie rzecz biorąc, istniejące dane są zgodne z koncepcją, że naprowadzanie limfocytów T w płucach w warunkach fizjologicznych lub zapalnych obejmuje szereg różnych receptorów chemokiny i ich odpowiednich ligandów, a zatem zasadniczo zależy od ściśle kontrolowanej współpracy między wrodzonymi i adaptacyjnymi komórkami odpornościowymi1. Szczególnie w początkowej fazie ekspozycji na patogen lub alergen komórki wrodzonego układu odpornościowego reagują na stymulację TLR lub sieciowanie za pośrednictwem IgE poprzez natychmiastowe uwalnianie różnych chemoatraktantów, takich jak LTB4, CCL1, CCL17, CCL22, CCL20, CXCL10 i PGD21,6,7. Najlepszym przykładem jest to, że interakcja między PGD2 a receptorem chemoatraktantu CRTh2 ma szczególne znaczenie dla chemotaksji komórek Th2 i dlatego wydaje się być obiecującym celem terapeutycznym w klinicznym leczeniu astmy. Rzeczywiście, pacjenci z umiarkowaną astmą wykazali poprawę objawów i znaczny wzrost natężonej objętości wydechowej w ciągu jednej sekundy (FEV1) po leczeniu selektywnym antagonistą CRTh2 w porównaniu z grupą placebo8,9. W bardziej zaawansowanym stanie odpowiedzi zapalnej już zrekrutowane limfocyty T są w stanie dalej wzmacniać akumulację limfocytów płucnych poprzez uwalnianie IL-4 i IL-13 jako silnych bodźców dla płucnych DC. Następnie, te wrodzone komórki pochodzenia szpikowego regulują ekspresję CCL17 i CCL22 w sposób zależny od STAT61,10,11. Chociaż złożoność opisanego scenariusza nadal utrudnia pełne zrozumienie naprowadzania płuc przez limfocyty T, oferuje on mnóstwo celów molekularnych dla potencjalnie zoptymalizowanej kontroli terapeutycznej zapalnych lub alergicznych chorób płuc. W związku z tym istnieje pilne zapotrzebowanie na innowacyjne techniki eksperymentalne, które są w stanie jeszcze bardziej pogłębić i uzupełnić naszą wiedzę w dziedzinie chemotaksji limfocytów T i naprowadzania płuc.

Ze względu na fakt, że na naprowadzanie limfocytów w ludzkim ciele wpływa wiele parametrów komórkowych, humoralnych i fizycznych1, większość istniejących metod eksperymentalnych nie jest w stanie modelować całej złożoności tego procesu immunologicznego. Zamiast tego wiele standardowych protokołów analizy naprowadzania płuc selektywnie koncentruje się na konkretnym aspekcie związanym z kaskadą przyciągania, adhezji, migracji i zatrzymywania limfocytów. Oprócz czysto opisowego określenia wzorca ekspresji mRNA lub białka integryn i receptorów chemokiny na limfocytach obwodowych lub naciekających płuca oraz uzupełniającego pomiaru odpowiednich poziomów chemokiny we krwi, płukaniu oskrzelowo-pęcherzykowym (BAL) lub tkance płucnej12,13,14,15, dobrze ugruntowane testy hodowli komórkowych in vitro pozwalają na funkcjonalną charakterystykę adhezji limfocytów lub chemotaksji w określonych warunkach eksperymentalnych16,17,18. Zasadniczo, statyczne testy adhezji in vitro monitorują zdolność wiązania hodowanych limfocytów do monowarstwy śródbłonka lub do szkiełek pokrytych rekombinowanymi cząsteczkami adhezyjnymi śródbłonka (np. MAdCAM-1, VCAM-1), podczas gdy standardowe testy chemotaksji in vitro są zwykle stosowane w celu ilościowego określenia zdolności limfocytów do migracji wzdłuż gradientu chemokin w systemie transwell19. Oba warunki in vitro umożliwiają kontrolowane dostosowanie i modulację warunków eksperymentalnych, ale z drugiej strony brakuje w nich ważnych zmiennych, o których wiadomo, że mają krytyczny wpływ na chemotaksję in vivo i adhezję limfocytów. W przeważającej mierze statyczne testy hodowli komórkowych ignorują wpływ sił ścinających spowodowanych stałym przepływem krwi19 i potencjalnie zaniedbują zaangażowanie otaczającego środowiska immunologicznego i oddziałujących na siebie komórek odpornościowych nielimfocytów, obecnych w żywym organizmie. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, interpretacja wyników uzyskanych w statycznych testach chemotaksji in vitro lub adherencji wymaga dalszej walidacji w dynamicznych eksperymentach adhezyjnych w warunkach przepływu20,21 oraz w modelach in vivo patologii narządów zapalnych19. Rzeczywiście, ważne wnioski na temat regulacji naprowadzania płuc przez limfocyty T w warunkach zapalnych lub alergicznych można wyciągnąć z badań na zwierzętach analizujących genetycznie zmodyfikowane myszy w zdefiniowanych modelach różnych chorób płuc3,22,23. Ilościowe porównanie limfocytów naciekających płuca między myszami typu dzikiego a myszami z niedoborem określonego genu będącego przedmiotem zainteresowania stanowi dobrze ugruntowane i szeroko stosowane narzędzie do określania wpływu określonych szlaków komórkowych lub receptorów na wzorce dystrybucji limfocytów T sterowane chorobą. Jednak w przeciwieństwie do wcześniej omówionych testów hodowli komórkowych in vitro, projekt badania oparty na klasycznych modelach zwierzęcych nie ma możliwości analizowania i monitorowania pierwotnych ludzkich limfocytów T pochodzących bezpośrednio z krwi lub BAL pacjentów cierpiących na zapalną chorobę płuc. W związku z tym nadal wyzwaniem pozostaje funkcjonalna walidacja, czy zdiagnozowana choroba płuc jest w stanie wdrukować ludzkie limfocyty w celu preferencyjnego tropizmu płuc i jak bardzo parametry kliniczne mogą wpływać na ten scenariusz. Niedawno wprowadzono bardzo eleganckie podejście in vivo w kontekście chorób zapalnych jelit (IBD), które było w stanie przezwyciężyć większość tych ograniczeń i otworzyło nowe możliwości dla zaawansowanych badań translacyjnych nad naprowadzaniem limfocytów jelitowych 24. Korzystając z protokołów oczyszczania tkanek na bazie rozpuszczalnika, a następnie przekrojowej mikroskopii fluorescencyjnej z arkuszami świetlnymi jako potężnego narzędzia do obrazowania, możliwe było zobrazowanie infiltracji i dystrybucji adoptyjnie przeniesionych ludzkich limfocytów T w jelicie myszy z niedoborem odporności na colit24. W szczególności w tym środowisku eksperymentalnym wdrożono dwie główne innowacje: (1) pierwotne ludzkie komórki odpornościowe mogą być analizowane w eksperymentalnie zdefiniowanych warunkach in vivo; (2) dość duży obszar chorego narządu (około 1,5 cm x 1,5 cm) można zobrazować w jakości wysokiej rozdzielczości, a następnie przeprowadzić rekonstrukcję 3D. Co więcej, kilka ostatnich badań z powodzeniem ustaliło zastosowanie oczyszczania tkanek na bazie rozpuszczalnika i mikroskopii fluorescencyjnej z użyciem arkuszy świetlnych jako ważnych narzędzi do zaawansowanego obrazowania płuc 25,26. Aby skorzystać z tego postępu technologicznego w dziedzinie immunologii płuc, przyjęliśmy teraz system do analizy naprowadzania płuc.

Prezentowany tutaj protokół krok po kroku wprowadza do tego, jak oczyszczać i fluorescencyjnie znakować pierwotne ludzkie limfocyty T do transferu do myszy z indukowanym zapaleniem płuc, a ponadto szczegółowo opisuje późniejszy proces obrazowania mikroskopowego fluorescencji za pomocą arkusza świetlnego, w tym przygotowanie narządów i przetwarzanie obrazu. Ogólnie rzecz biorąc, mamy nadzieję wesprzeć przyszłe badania translacyjne w dziedzinie zapalnych lub alergicznych chorób płuc poprzez wprowadzenie zaawansowanego, ale mimo to wykonalnego, eksperymentalnego modelu monitorowania naprowadzania ludzkich limfocytów w płucach w warunkach in vivo.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez odpowiednie władze lokalne w Erlangen (Regierung von Unterfranken, Würzburg, Niemcy). Myszy trzymano w określonych warunkach wolnych od patogenów. Pobranie krwi ludzkiej zostało zatwierdzone przez lokalną komisję etyczną i instytucjonalną komisję rewizyjną Uniwersytetu w Erlangen-Norymberdze. Każdy pacjent wyraził pisemną świadomą zgodę.

1. Wywołanie alergicznego zapalenia płuc u myszy

UWAGA: Jak opisano we wcześniejszych badaniach27, następująca procedura eksperymentalna pozwala na wywołanie alergicznego zapalenia dróg oddechowych u myszy i odpowiednio do tego powoduje akumulację wrodzonych i adaptacyjnych komórek odpornościowych w BAL. Opisany protokół został ustalony u myszy C57BL/6J, ale przyjęcie do innych standardowych szczepów wsobnych powinno być możliwe.

Zobacz Rysunek 1A dla podsumowania procedury eksperymentalnej in vivo.

  1. Znieczulić myszy przez dootrzewnowe wstrzyknięcie ketaminy/ksylazyny.
    UWAGA:     Używaj wyłącznie myszy C57BL/6J starszych niż 6 tygodni i o masie ciała co najmniej 16 g.
    1. Przygotować roztwór ketaminy/ksylazyny w PBS (12 mg/ml ketaminy; 1,6 mg/ml ksylazyny) i określić dokładną masę ciała myszy.
    2. Wstrzyknij pierwszej myszy 8 μl/g masy ciała roztworu ketaminy/ksylazyny dootrzewnowo i potwierdź głębokie znieczulenie poprzez brak odruchu szczypania łapy przed przejściem do kroku 1.3.
  2. Świeżo przygotować 5 mg/ml papainy w PBS. Powoli odpipetować 10 μl (50 μg) roztworu papainy do nozdrza. Uważnie monitoruj mysz aż do przebudzenia.
  3. Powtórz kroki 1.1 i 1.2 dla wszystkich myszy biorących udział w eksperymencie. Wykonuj kroki 1.1–1.3 przez trzy kolejne dni.

2. Oczyszczanie i fluorescencyjne znakowanie ludzkich limfocytów T CD4+ krwi obwodowej

UWAGA: Przetwarzaj komórki w sterylnych warunkach.

  1. Zbierz 18 ml pełnej krwi ludzkiej z żyły obwodowej. Przeprowadzić wirowanie w gradiach Ficoll-Hypaque w celu wybrania frakcji komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC).
    nuta: Gromadzenie i analiza pierwotnego materiału ludzkiego muszą być zatwierdzone przez lokalne organy etyczne. Tylko osoba posiadająca odpowiednie kwalifikacje medyczne może pobierać krew z żyły obwodowej.
    1. Zebrać krew w monowetach zawierających kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) (1,6 mg EDTA/ml krwi) w celu uniknięcia krzepnięcia.
      fakultatywny: Zamiast pełnej krwi żylnej należy stosować krew z kożuchowca, produkt uboczny oddawania krwi wzbogaconej w leukocyty.
    2. Przenieść krew do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i rozcieńczyć w stosunku 1:2 w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Ostrożnie dodać 10 ml pożywki Ficoll (gęstość 1,077 g/ml) jako dolną warstwę pod rozcieńczoną krew. Odwirować próbkę (800 x g przez 15 minut w temperaturze pokojowej bez hamulca).
    3. Ostrożnie wyjmij probówkę z wirówki i przenieś interfazę zawierającą PBMC do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Wyrzuć górną i dolną warstwę. Napełnić probówkę zawierającą PBMC PBS i odwirować (300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C). Usunąć supernatant.
      nuta: Opcjonalnie, jeśli to konieczne, wykonaj lizę pozostałych erytrocytów. Ostrożnie dodać 3 ml buforu do lizy chlorku amonu i potasu (ACP) (155 mM chlorku amonu; 19 mM wodorowęglanu potasu i 0,68 mM EDTA; pH 7,27) do zawieszonego osadu komórkowego i wymieszać próbkę. Potrząsaj probówkami przez 3 minuty. W celu usunięcia buforu do lizy ACP dodać 40 ml PBS i odwirować (300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C). Odrzucić supernatant.
  2. Oczyść limfocyty T CD4 + za pomocą mikrokulek CD4.
    nuta: Ogólnie rzecz biorąc, istnieje kilka dystrybutorów mikrokulek magnetycznych do oczyszczania ludzkich komórek CD4+, co powinno skutkować porównywalnymi poziomami czystości komórek. Wybór produktu powinien opierać się na indywidualnych preferencjach. Kolejne etapy protokołu (2.2.2–2.2.7) są dostosowane do zdefiniowanego produktu mikrokulek CD4 i odpowiednich kolumn separacyjnych, jak wskazano dalej w tabeli materiałów. Pewne modyfikacje protokołu mogą być wymagane w przypadku wyboru alternatywnego produktu z mikrogranulkami CD4.
    1. Zawiesić osad PBMC w co najmniej 80 μl PBS zawierającym 0,5% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 2 mM EDTA (PBS/FBS/EDTA-bufor) na 10,7 PBMC. Użyj populacji wyjściowej około 30 x 106 PBMC, aby uzyskać około 3 x 106 do 6 x 106 oczyszczonych ludzkich limfocytów T CD4 +.
    2. Dodać 20 μl mikrogranulek CD4 na 107 PBMC, delikatnie wymieszać i inkubować przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Napełnić probówkę buforem PBS/FBS/EDTA (schłodzonym do 4 °C) i odwirować (300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C). Usunąć supernatant.
    3. Umieść kolumnę separacyjną w polu magnetycznym. Przepłukać kolumnę 3 ml buforu PBS/FBS/EDTA. Zawiesić osad komórkowy w 500 μl buforu PBS/FBS/EDTA (schłodzonego do 4 °C) i przenieść zawiesinę komórek na przepłukaną kolumnę separacyjną umieszczoną w polu magnetycznym.
    4. Przepłukać kolumnę separacyjną trzykrotnie 3 ml buforu PBS/FBS/EDTA (schłodzonego do 4 °C) i wylać ścieki.
    5. Wyjmij kolumnę separacyjną z pola magnetycznego i umieść ją w probówce o pojemności 15 ml. Eluować frakcję komórkową CD4+ w 5 ml buforu PBS/FBS/EDTA-za pomocą tłoka.
    6. Napełnić probówkę PBS i odwirować (300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C). Usunąć supernatant. Powtórz ten krok prania dwa razy.
    7. Określić liczbę uzyskanych komórek za pomocą standardowej metody z wyboru (np. komory Neubauera).
  3. Oznacz limfocyty T CD4 + barwnikiem proliferacji komórek fluorescencyjnych.
    1. Ponownie zawiesić limfocyty T CD4 + w PBS (do 107 komórek / ml; nie należy używać mniej niż 500 μl PBS).
    2. Przygotować 6 μM roztwór pobudliwego barwnika proliferacji komórek o czerwonym działaniu światła (patrz tabela materiałów) w PBS (wstępnie podgrzany do temperatury pokojowej). Wymieszać ten roztwór w stosunku 1:2 z wcześniej przygotowaną zawiesiną komórkową i dokładnie odwirować (stężenie końcowe 3 μM).
    3. Inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C (chronić przed światłem). Następnie dodać pięć objętości pożywki RPMI zawierającej 10% FBS i inkubować przez 5 minut na lodzie (chronionym przed światłem).
    4. Umyć oznakowane komórki trzykrotnie w pożywce RPMI zawierającej 10% FBS (wirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C). Ponownie zawiesić oznakowane komórki w PBS, przechowywać na lodzie i chronić przed światłem do czasu użycia.
      nuta: Długotrwałe przechowywanie komórek (>60 min) może negatywnie wpłynąć na przeżywalność komórek.
      >fakultatywny: Określić czystość frakcji komórek CD4+ i skuteczność procedury znakowania za pomocą cytometrii przepływowej. Ponownie zawiesić 0,5 x 106 do 1 x 106 komórek CD4 + w 100 μl buforu (1% FBS, 2 mM EDTA w PBS) i dodać przeciwciało anty-ludzkie CD4 sprzężone z wybranym barwnikiem fluorescencyjnym. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Dodać 1 ml buforu i odwirować (300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C). Odrzucić supernatant. Kontynuuj pomiar cytometryczny próbki metodą cytometrii przepływowej (reprezentatywny wynik jest przedstawiony w Rysunek 1B,C).

3. Adoptywny transfer ludzkich limfocytów T CD4+ do komórki biorcy narażonej na działanie papainy

UWAGA: Zobacz Rysunek 1A dla podsumowania procedury eksperymentalnej przeprowadzonej in vivo. Wykonaj transfer komórek dzień po ostatnim donosowym podaniu papainy.

  1. Dostosuj zawiesinę znakowanych fluorescencyjnie ludzkich limfocytów T CD4 + (krok 2.3.4) do stężenia 1 x 107 komórek/ml w PBS. Wlać 100 μl zawiesiny komórek do strzykawki o pojemności 1 ml/30 G.
  2. Ostrożnie umieść pierwszą mysz C57BL/6J wystawioną na działanie papainy (kroki 1.1–1.3) w urządzeniu ograniczającym do wstrzykiwania żyły ogonowej. Za pomocą przygotowanej strzykawki (krok 3.1) nakłuć żyłę ogonową i powoli wstrzyknąć 100 μl zawiesiny komórkowej zawierającej 1 x 106 znakowanych ludzkich komórek CD4+. Nie należy natychmiast wyciągać igły po wstrzyknięciu, ale odczekać dodatkowe 5 sekund, aby zapobiec wyciekowi zawiesiny komórek.
  3. Zwolnij mysz z urządzenia przytrzymującego i kontynuuj z następnym zwierzęciem. Trzymaj co najmniej jedno zwierzę wystawione na działanie papainy, które nie jest poddawane transferowi z komórkami znakowanymi fluorescencyjnie, aby służyło jako kontrola negatywna dla mikroskopii fluorescencyjnej z użyciem arkusza świetlnego.

4. Przygotowanie tkanki płucnej do mikroskopii fluorescencyjnej za pomocą arkusza świetlnego

UWAGA: Następujące kroki są wykonywane 3 godziny po transferze fluorescencyjnie znakowanych komórek ludzkich (krok 3.2). Opisane procedury eksperymentalne, w tym pobieranie tkanki płucnej, utrwalanie i oczyszczanie tkanek na bazie rozpuszczalnika, zostały zaadaptowane z obecnie opisanych protokołów24,28.

  1. Poświęć mysz przez wdychanie dwutlenku węgla (C02).
  2. Perfuzja płuc in situ za pomocą PBS zawierającego 5 mM EDTA.
    1. Otwórz klatkę piersiową, przecinając wzdłuż mostka, aby odsłonić serce. Punktowo należy ustawić prawą komorę za pomocą kaniuli 21 G podłączonej do cewnika.
    2. Otwórz lewą komorę, przecinając ją, a tym samym pozwól na wydostanie się krwi i płynu perfuzyjnego. Powoli perfaktoruj płuca 20 ml lodowatego PBS zawierającego 5 mM EDTA przez cewnik.
  3. W celu wykonania zespolenia płuc in situ nie należy usuwać cewnika z prawej komory. Powoli przeprowadź perfuzję płuc za pomocą 2 ml lodowatego 4% paraformaldehydu (PFA) rozpuszczonego w PBS. Usuń cewnik i kaniulę.
    nuta: Utrwalanie in situ tkanki płucnej na podstawie PFA stanowi sprawdzoną technikę przygotowania mysiej tkanki płucnej do późniejszej analizy mikroskopowej29,30.
    ostrożność: PFA jest toksyczny i należy obchodzić się z nim pod maską z ostrożnością.
  4. Napełnij płuca 0,75% agarozy in situ.
    1. Przygotować 0,75% agarozy w PBS i przechowywać ją w stanie stałym w temperaturze 50 °C w wytrząsarce termicznej do momentu użycia. Usuń gruczoły ślinowe myszy, przetnij mięsień mostkowo-gnykowy i odsłoń tchawicę, wsuwając pod spód kleszcze.
    2. Odsłoniętą tchawicę należy przeciąć igłą o natężeniu 30 G i zastąpić ją cewnikiem 30 G, aby zapobiec dalszemu uszkodzeniu tchawicy powodującemu niepożądany wyciek agarozy. Uszczelnij połączenie między wprowadzonym cewnikiem a tchawicą za pomocą uchwytu na igłę.
      fakultatywny: Połącz opisaną tutaj procedurę z kolekcją BAL, aby przeanalizować infiltrowane komórki ludzkie w BAL, jak ostatnio opisano szczegółowo31 (zobacz Rysunek 2E dla reprezentatywnych wyników).
    3. Ostrożnie napełnić drogi oddechowe 0,75% agarozą (schłodzoną do temperatury ciała) przez cewnik, aż do całkowitego rozwinięcia się płuca; poczekaj do całkowitego zestalenia się agarozy. Wyjmij cewnik i ostrożnie pobierz płuco do zaciemnionej probówki o pojemności 2 ml wypełnionej 4% PFA.
  5. W celu dodatkowego utrwalenia inkubować próbkę w 4% PFA rozpuszczonym w PBS przez 2 godziny w temperaturze 4 °C przy ciągłej rotacji (31 obr./min).
  6. Odwodnić tkankę, następnie inkubując próbkę w ciągłym obracaniu się (31 obr./min) w temperaturze 4 °C w 50% etanolu (pH 9), 70% etanolu (pH 9) i 100% etanolu; każdy etap przez co najmniej 4 godziny. Na koniec wykonaj drugą inkubację w świeżym 100% etanolu przez 4 godziny.
  7. Przeprowadzić oczyszczanie tkanki za pomocą rozpuszczalnika za pomocą cynamonianu etylu (ECi). W związku z tym należy przenieść próbkę do ECi. Inkubować przez noc w temperaturze pokojowej (przy stałej rotacji), aż tkanka stanie się półprzezroczysta (patrz Rysunek 1D dla reprezentatywnych obrazów).
    nuta: Próbki przechowywane w ECi w temperaturze pokojowej (chronione przed światłem) są stabilne przez kilka tygodni do miesięcy.

5. Wykonaj mikroskopię fluorescencyjną za pomocą lekkiego arkusza płatów płuc myszy

UWAGA: Proszę zapoznać się z Tabelą Materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat mikroskopu fluorescencyjnego z arkuszami świetlnymi i odpowiadającego mu oprogramowania, na którym oparte są następujące kroki. Porównywalne systemy innych producentów mogą być jednak również używane z modyfikacjami poniższego protokołu specyficznymi dla programistów. Przed rozpoczęciem należy zapoznać się z instrukcją obsługi mikroskopu i postępować zgodnie z instrukcjami technicznymi osoby odpowiedzialnej na miejscu.

  1. Ustaw mikroskop z arkuszem świetlnym.
    1. Włącz mikroskop z arkuszem świetlnym i otwórz odpowiednie oprogramowanie do obrazowania na komputerze. Napełnij komorę próbki przefiltrowanym ECi (filtr 100 μm) i umieść ją w swoim miejscu między wiązkami lasera.
    2. Użyj małej kropli kleju organicznego stabilnego w rozpuszczalniku, aby przykleić płuco do uchwytu próbki. Aby wymagana głębokość penetracji arkuszy świetlnych była jak najmniejsza, należy ustawić płat płuca w pozycji pionowej. Następnie umieść uchwyt na próbkę w jego komorze.
    3. Ustaw współczynnik załamania światła obiektywu na 3,5 w przypadku używania ECi jako odczynnika czyszczącego.
  2. Dostosuj ustawienia pod mikroskopem świetlnym, aby wykrywać komórki ludzkie w kontekście całego narządu.
    1. Wybierz wymagane lasery (filtruj do pomiaru > aktywuj pola wyboru wymaganych laserów) i wybierz odpowiednie intensywności w oprogramowaniu sterującym (sterowanie transmisją laserową > użyj suwaka, aby ustawić intensywność lasera > zastosować). Użyj długości fali wzbudzenia 488 nm (filtr 525/50) do wykrycia autofluorescencyjnej tkanki płucnej i 640 nm (filtr 680/30) do wzbudzenia komórek ludzkich znakowanych fluoroforem emitującym w widmie czerwonym.
    2. Ustaw ostrość na próbce wzbudzonej przy długości fali 488 nm i dostosuj ostrość za pomocą narzędzia do "korekcji chromatycznej" na długości fali wzbudzenia 640 nm (użyj suwaka, aby ustawić korekcję chromatyczną > zastosowanie).
    3. Wybierz odpowiedni współczynnik powiększenia; użyj przeglądu w małym powiększeniu (np. 6,3x), aby określić ogólny rozkład znakowanych komórek w tkance płucnej i powiększonych obrazów (np. 32x), aby uzyskać szczegółową lokalizację.
    4. Wybierz szerokość arkusza równomiernie wyjaśniającego cały organ lub określoną sekcję zainteresowania (optyka > użyć suwaka, aby ustawić szerokość arkusza; zwykle w zakresie 20–40%). Zdefiniuj aperturę numeryczną arkusza (NA) z wyższym NA, tworząc ostrzejsze obrazy (optyka > użyć suwaka do ustawienia arkusza NA; w przypadku mysiego płata płuc rozszerzonego do jego fizjologicznego rozmiaru często można użyć NA 0,025%).
    5. Wybierz liczbę arkuszy świetlnych, które mają być używane w sekcji "zaawansowane ustawienia pomiarów". W przypadku oświetlenia dwukierunkowego połącz lewe i prawe arkusze świetlne, aby utworzyć jednorodnie oświetlony obraz (zaawansowane > scalania arkuszy świetlnych > wybierz tryb mieszania > użyj suwaków, aby określić nakładanie się obu arkuszy świetlnych).
      >nuta: Zaleca się skorzystanie z dwukierunkowego oświetlenia próbki za pomocą trzech arkuszy świetlnych każdy.
      fakultatywny: Aby jeszcze bardziej poprawić jakość obrazu, użyj operacji dynamicznego ustawiania ostrości. Pozwala to na przesuwanie ostrości w kierunku x podczas akwizycji obrazu.
    6. Zdefiniuj pozycję początkową i końcową stosu z, który ma być mierzony, i ustaw rozmiar kroku na 5 μm (tabela xyz Z > zakres skanowania).
      >nuta: Pozycja początkowa i końcowa stosu z zależy od wielkości i położenia płata płuc w komorze próbki. Jednak zwykle pobiera się około 300 do 800 stosów z dla pojedynczego płata płuca (rozmiar kroku 5 μm).
    7. Zapisz pliki za pomocą "ustawień automatycznego zapisywania" i rozpocznij pomiar, aby uchwycić obrazy. Po zakończeniu zbierania danych wyczyść uchwyt i komorę próbki zanieczyszczoną ECi pod bieżącą wodą.
      nuta: Użyj tych samych ustawień, aby zobrazować kilka płatów płuc, które mają być następnie porównane.

6. Przetwarzanie po obrazie i kwantyfikacja komórek ludzkich zgromadzonych w płucach

UWAGA: Proszę zapoznać się z Tabelą Materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat oprogramowania do analizy 3D, na którym opierają się następujące kroki. Można jednak również użyć alternatywnych programów do post-obrazowania.

  1. Załaduj pierwszy obraz stosu z (aktywuj przycisk przekrocz, zarchiwizuj > otwórz > wybierz obraz), aby zainicjować otwieranie wszystkich innych obrazów wybranego stosu z i ich automatyczną rekonstrukcję 3D.
  2. Aby zapewnić prawidłowe wyświetlanie wymiarów x, y i z, sprawdź rozmiary wokseli i dostosuj je w razie potrzeby (edytuj > właściwości obrazu > wprowadź rozmiar woksela ręcznie). Dla rozmiaru woksela z wprowadź wybrany rozmiar kroku między dwoma obrazami (tutaj 5 μm).
  3. Wyświetlaj każdy kanał w innym kolorze (edytuj > pokaż regulację wyświetlania). Kliknij na każdy kanał jeden po drugim, aby zdefiniować wybrany kolor (w Rysunek 2A,B,C,D sygnał autofluorescencji jest wyświetlany na szaro i oznaczony ludzkimi komórkami CD4 + na czerwono).
  4. Dostosuj intensywność, poziom czerni i kontrast dla każdego kanału (edytuj > pokaż regulację wyświetlania) za pomocą trójkątów na paskach kanałów lub wprowadzając dokładne liczby w ustawieniach kanałów. Do regulacji intensywności użyj trójkąta prostokątnego. Do regulacji poziomu czerni użyj lewego trójkąta, a do regulacji kontrastu użyj środkowego trójkąta.
    nuta: Użyj płuca pochodzącego od myszy kontrolnej bez transferu komórek (krok 3.3), aby odróżnić specyficzne sygnały pochodzące od komórek ludzkich od niespecyficznego tła.
  5. Aby określić ilościowo znakowane komórki w tkance płucnej, użyj opcji "dodaj nowe miejsca" na pasku narzędzi i wybierz opcję "pomiń automatyczne tworzenie, edytuj ręcznie" w celu ręcznego zliczania komórek.
    UWAGA: Alternatywnie     użyj narzędzia do automatycznego liczenia komórek w sekcji "spots". Jednak ręczne zliczanie pozwala na bardziej precyzyjne rozróżnianie sygnałów specyficznych i niespecyficznych.
    1. Aby porównać akumulację komórek ludzkich w różnych próbkach, zdefiniuj sześcian płuc o określonej objętości za pomocą narzędzia tnącego 3D (edytuj > kadrowanie 3D) (tutaj 813 μm x 813 μm x 1,000 μm).
    2. Aby policzyć skumulowane komórki, wybierz kanał 640 nm i zdefiniuj "skalę promienia" 10 μm. Następnie kliknij "edytuj", zaznacz "wybierz" w menu wskaźnika i zaznacz każdą komórkę kropką, klikając z wciśniętym Shift lewym przyciskiem myszy. Znajdź łączną liczbę zliczonych komórek wyświetlanych w statystykach.
      UWAGA: Zdecydowanie zaleca się policzenie kilku kostek na płat płuca (tutaj pięć), aby zapewnić wiarygodność wyników i skompensować zależny od naukowca wybór zliczonej objętości płuc (strategia kwantyfikacji i reprezentatywne wyniki są przedstawione w Rysunek 2D).
  6. Zrób zdjęcie za pomocą narzędzia "migawka" i/lub nagraj film za pomocą narzędzia "animacja". Zapisz dostosowane pliki jako pliki .ims (plik > eksport).
    >nuta: W celach reprezentacyjnych pokaż lub ukryj ramkę, zaznaczając lub usuwając zaznaczenie ramki na pasku narzędzi. Ponadto wyświetlaj obrazy jako projekcję o maksymalnej intensywności (MIP) (pasek narzędzi > trybie > głośności > sprawdź MIP) lub użyj "trybu powierzchniowego" (pasek narzędzi > dodawania nowych powierzchni). "Tryb powierzchniowy" musi być aktywowany oddzielnie dla każdego kanału, aby podkreślić architekturę tkanek i/lub ciała komórkowe (reprezentatywne obrazy są pokazane w Rysunek 2C).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przedstawiony protokół opisuje eksperymentalny model mysi, który umożliwia monitorowanie i kwantyfikację akumulacji adoptywnie przeniesionych ludzkich limfocytów T w płucach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z arkuszem światła. Rysunek 1A przedstawia schematyczny przegląd etapów in vivo harmonogramu eksperymentalnego. W celu zagwarantowania wiarygodnych wyników kluczowe jest zapewnienie wysokiej jakości izolowanych i znakowanych fluorescencyjnie ludzkich komórek T CD4

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisane tutaj warunki doświadczalne dają możliwość monitorowania zdolności naprowadzania płuc pierwotnych ludzkich komórek odpornościowych w warunkach zapalnych in vivo, a tym samym odpowiednio uzupełniają klasycznie przeprowadzane testy adhezji i chemotaksji in vitro. Aby wziąć pod uwagę specyficzne cechy anatomiczne narządów płuc, ważne aspekty naprowadzania komórek odpornościowych (w tym chemotaksję i dystrybucję komórek w narządzie docelowym), a także znaczenie kliniczne i możliwość przen...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

M.F. Neurath pracował jako doradca dla firm Pentax, Giuliani, MSD, Abbvie, Janssen, Takeda i Boehringer. Pozostali autorzy nie ujawniają żadnego konfliktu.

Podziękowania

Autorzy dziękują za dofinansowanie przez DFG Collaborative Research Centers, SFB 1181 i TRR 241. Centrum Obrazowania Optycznego w Erlangen (OICE), a w szczególności Ralf Palmisano, Philipp Tripal i Tina Fraaß (projekt Z2 DFG CRC 1181) są uznawani za fachowe wsparcie techniczne w zakresie obrazowania mikroskopowego za pomocą fluorescencji na arkuszach świetlnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Agarose NEEO UltraCarl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Niemcy2267.4
AlexaFlour594 przeciwciało anty-ludzkie CD45BioLegend, San Diego, USA304060
Chlorek amonuCarl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, NiemcyK2981
Kaniula 21 GBecton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA301300
Barwnik proliferacyjny komórek eflour670eBioscience Inc., San Diego, USA65-0840-85
CD4 MicroBeads, humanMiltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Niemcy130-045-101
EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy)Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Niemcy8043.1
Probówka do pobierania krwi potas-EDTA, 9 mlSarstedt AG & Co., Nü mbrecht, Niemcy21066001
Ethly cinnamate (ECi)Sigma-Aldrich, Steinheim, Niemcy112372-100G
Etanol ≥ 99,5% (EtOH)Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Niemcy5054.3
FBS (płodowa surowica bydlęca) Good FortePAN-Biotech GmbH, Aidenbach, NiemcyP40-47500
Filtr 100 &mikro; m VWR International Germany GmbH, Darmstadt, Niemcy732-2758
Imaris Image Analysis Software 9.0.2Bitplane AG, Zurych, Szwajcarian.a.ImspectorPro
softwareAbberior Instruments GmbH, Gö ttingen, Niemcyn.d.Ketamin
 Inresa Arzneimittel GmbH, Fryburg Bryzgowijski, Niemcy3617KET-V
LaVision UltraMicroscope IILaVision BioTec GmbH, Bielefeld, Niemcyn.a.MACS
MultiStandMiltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Niemcy130-042-303
Kaniula Multifly 20 GSarstedt AG & Co., Nü mbrecht, Niemcy851638035
Igła 30 GB. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hesja, Niemcy9161502
Komora licząca NeubauerneoLab Migge GmbH, Heidelberg, NiemcyC-1003
Pattex GlueHenkel AG & Co, Dü sseldorf, NiemcyKolumna PSK1C
LSMiltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Niemcy130-042-401
Pożywka do separacji limfocytów (gęstość 1,077 g/ml)anprotecAC-AF-0018
PapainaMerck1,071,440,025
PBS Dulbecco (sól fizjologiczna buforowana fosforanami)Biochrom GmbH, Berlin, NiemcyL182-10
PerCP/Cy5.5 anty-ludzki CD4BioLegend, San Diego, Stany Zjednoczone317428
PerCP/Cy5.5 mysz IgG2b, κ izotyp CtrlBioLegend, San Diego, USA400337
PFA (paraformaldehyd)Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Niemcy0335.1
Wodorowęglan potasuCarl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, NiemcyP7481
Pipeta serologiczna 10 mlSarstedt AG & Co., Nü mbrecht, Niemcy86.1254.001 
Strzykawka 1 mlB. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hesja, Niemcy9166017V
Strzykawka 5 mlBecton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA260067
Strzykawka 20 mlBecton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA260069
Probówka 1,5 mlSarstedt AG & Co., Nü mbrecht, Niemcy72,706,400
Probówka 2 mlSarstedt AG & Co., Nü mbrecht, Niemcy72.695.400 
Probówka 2 mL, brązowaSarstedt AG & Co., Nü mbrecht, Niemcy72,695,001
Probówka 15 mlSarstedt AG & Co., Nü mbrecht, Niemcy62.554.502 
Probówka 50 mlSarstedt AG & Co., Nü mbrecht, Niemcy62.547.254 
Separator QuadroMACSMiltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Niemcy130-090-976
Xylazin (Rompun 2%)Bayer Vital GmbH, Leverkusen, NiemcyKPOBD32

Bibliografia

  1. Medoff, B. D., Thomas, S. Y., Luster, A. D. T cell trafficking in allergic asthma: the ins and outs. Annual Review of Immunology. 26, 205-232 (2008).
  2. Baraldo, S., Lokar Oliani, K., Turato, G., Zuin, R., Saetta, M. The Role of Lymphocytes in the Pathogenesis of Asthma and COPD. Current Medicinal Chemistry. 14 (21), 2250-2256 (2007).
  3. Mikhak, Z., Strassner, J. P., Luster, A. D. Lung dendritic cells imprint T cell lung homing and promote lung immunity through the chemokine receptor CCR4. Journal of Experimental Medicine. 210 (9), 1855-1869 (2013).
  4. Thomas, S. Y., Banerji, A., Medoff, B. D., Lilly, C. M., Luster, A. D. Multiple chemokine receptors, including CCR6 and CXCR3, regulate antigen-induced T cell homing to the human asthmatic airway. Journal of Immunology. 179 (3), 1901-1912 (2007).
  5. Katchar, K., Eklund, A., Grunewald, J. Expression of Th1 markers by lung accumulated T cells in pulmonary sarcoidosis. Journal of Internal Medicine. 254 (6), 564-571 (2003).
  6. Wu, Z., et al. Mast cell FcepsilonRI-induced early growth response 2 regulates CC chemokine ligand 1-dependent CD4+ T cell migration. Journal of Immunology. 190 (9), 4500-4507 (2013).
  7. Hart, P. H. Regulation of the inflammatory response in asthma by mast cell products. Immunology, Cell Biology. 79 (2), 149-153 (2001).
  8. Bice, J. B., Leechawengwongs, E., Montanaro, A. Biologic targeted therapy in allergic asthma. Annals of Allergy & Asthma & Immunology. 112 (2), 108-115 (2014).
  9. Barnes, N., et al. A randomized, double-blind, placebo-controlled study of the CRTH2 antagonist OC000459 in moderate persistent asthma. Clinical & Experimental Allergy. 42 (1), 38-48 (2012).
  10. Medoff, B. D., et al. CD11b+ myeloid cells are the key mediators of Th2 cell homing into the airway in allergic inflammation. Journal of Immunology. 182 (1), 623-635 (2009).
  11. Oeser, K., Maxeiner, J., Symowski, C., Stassen, M., Voehringer, D. T. T cells are the critical source of IL-4/IL-13 in a mouse model of allergic asthma. Allergy. 70 (11), 1440-1449 (2015).
  12. Freeman, C. M., Curtis, J. L., Chensue, S. W. CC chemokine receptor 5 and CXC chemokine receptor 6 expression by lung CD8+ cells correlates with chronic obstructive pulmonary disease severity. The American Journal of Pathology. 171 (3), 767-776 (2007).
  13. Kallinich, T., et al. Chemokine-receptor expression on T cells in lung compartments of challenged asthmatic patients. Clinical & Experimental Allergy. 35 (1), 26-33 (2005).
  14. Vasakova, M., et al. Bronchoalveolar lavage fluid cellular characteristics, functional parameters and cytokine and chemokine levels in interstitial lung diseases. Scandinavian Journal of Immunology. 69 (3), 268-274 (2009).
  15. Campbell, J. J., et al. Expression of chemokine receptors by lung T cells from normal and asthmatic subjects. Journal of Immunology. 166 (4), 2842-2848 (2001).
  16. Halwani, R., et al. IL-17 Enhances Chemotaxis of Primary Human B Cells during Asthma. PLoS One. 9 (12), 114604(2014).
  17. Agostini, C., et al. Cxcr3 and its ligand CXCL10 are expressed by inflammatory cells infiltrating lung allografts and mediate chemotaxis of T cells at sites of rejection. The American Journal of Pathology. 158 (5), 1703-1711 (2001).
  18. Ainslie, M. P., McNulty, C. A., Huynh, T., Symon, F. A., Wardlaw, A. J. Characterisation of adhesion receptors mediating lymphocyte adhesion to bronchial endothelium provides evidence for a distinct lung homing pathway. Thorax. 57 (12), 1054-1059 (2002).
  19. Radeke, H. H., Ludwig, R. J., Boehncke, W. H. Experimental approaches to lymphocyte migration in dermatology in vitro and in vivo. Experimental Dermatology. 14 (9), 641-666 (2005).
  20. Miles, A., Liaskou, E., Eksteen, B., Lalor, P. F., Adams, D. H. CCL25 and CCL28 promote alpha4 beta7-integrin-dependent adhesion of lymphocytes to MAdCAM-1 under shear flow. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 294 (5), 1257-1267 (2008).
  21. Zundler, S., et al. The alpha4beta1 Homing Pathway Is Essential for Ileal Homing of Crohn's Disease Effector T Cells In vivo. Inflammatory Bowel Diseases. 23 (3), 379-391 (2017).
  22. Verbist, K. C., Cole, C. J., Field, M. B., Klonowski, K. D. A role for IL-15 in the migration of effector CD8 T cells to the lung airways following influenza infection. Journal of Immunology. 186 (1), 174-182 (2011).
  23. Kopf, M., Abel, B., Gallimore, A., Carroll, M., Bachmann, M. F. Complement component C3 promotes T-cell priming and lung migration to control acute influenza virus infection. Nature Medicine. 8 (4), 373-378 (2002).
  24. Zundler, S., et al. Three-Dimensional Cross-Sectional Light-Sheet Microscopy Imaging of the Inflamed Mouse Gut. Gastroenterology. 153 (4), 898-900 (2017).
  25. Mzinza, D. T., et al. Application of light sheet microscopy for qualitative and quantitative analysis of bronchus-associated lymphoid tissue in mice. Cellular & Molecular Immunology. , (2018).
  26. Erturk, A., Lafkas, D., Chalouni, C. Imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3DISCO. Journal of Visualized Experiments. (89), 51382(2014).
  27. Morita, H., et al. An Interleukin-33-Mast Cell-Interleukin-2 Axis Suppresses Papain-Induced Allergic Inflammation by Promoting Regulatory T Cell Numbers. Immunity. 43 (1), 175-186 (2015).
  28. Mann, L., Klingberg, A., Gunzer, M., Hasenberg, M. Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (123), 55450(2017).
  29. Mercer, R. R., et al. Extrapulmonary transport of MWCNT following inhalation exposure. Particle and Fibre Toxicology. 10, 38(2013).
  30. Minton, C., et al. Demonstration of microvessel networks and endothelial cell phenotypes in the normal murine lung. Journal of Nippon Medical School. 72 (6), 314-315 (2005).
  31. Van Hoecke, L., Job, E. R., Saelens, X., Roose, K. Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration. Journal of Visualized Experiments. (123), 55398(2017).
  32. Fischer, A., et al. Differential effects of alpha4beta7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo. Gut. 65 (10), 1642-1664 (2016).
  33. Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nature Reviews Immunology. 7 (2), 118-130 (2007).
  34. Brehm, M. A., Jouvet, N., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Humanized mice for the study of infectious diseases. Current Opinion in Immunology. 25 (4), 428-435 (2013).
  35. Wege, A. K. Humanized Mouse Models for the Preclinical Assessment of Cancer Immunotherapy. BioDrugs. , (2018).
  36. Jespersen, H., et al. Clinical responses to adoptive T-cell transfer can be modeled in an autologous immune-humanized mouse model. Nature Communications. 8 (1), 707(2017).
  37. Schloder, J., Berges, C., Luessi, F., Jonuleit, H. Dimethyl Fumarate Therapy Significantly Improves the Responsiveness of T Cells in Multiple Sclerosis Patients for Immunoregulation by Regulatory T Cells. International Journal of Molecular Sciences. 18 (2), (2017).
  38. Murdoch, C., Finn, A. Chemokine receptors and their role in inflammation and infectious diseases. Blood. 95 (10), 3032-3043 (2000).
  39. Rivera-Nieves, J., Gorfu, G., Ley, K. Leukocyte adhesion molecules in animal models of inflammatory bowel disease. Inflammatory Bowel Diseases. 14 (12), 1715-1735 (2008).
  40. Zundler, S., Neurath, M. F. Novel Insights into the Mechanisms of Gut Homing and Antiadhesion Therapies in Inflammatory Bowel Diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 23 (4), 617-627 (2017).
  41. Halim, T. Y., Krauss, R. H., Sun, A. C., Takei, F. Lung natural helper cells are a critical source of Th2 cell-type cytokines in protease allergen-induced airway inflammation. Immunity. 36 (3), 451-463 (2012).
  42. Kamijo, S., et al. IL-33-mediated innate response and adaptive immune cells contribute to maximum responses of protease allergen-induced allergic airway inflammation. Journal of Immunology. 190 (9), 4489-4499 (2013).
  43. Milne, J., Brand, S. Occupational asthma after inhalation of dust of the proteolytic enzyme, papain. British Journal of Industrial Medicine. 32 (4), 302-307 (1975).
  44. Klingberg, A., et al. Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).
  45. Ariel, P. A beginner's guide to tissue clearing. The International Journal of Biochemistry, Cell Biology. 84, 35-39 (2017).
  46. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  47. Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nature Methods. 8 (1), 91-96 (2011).
  48. Looney, M. R., Bhattacharya, J. Live imaging of the lung. Annual Review of Physiology. 76, 431-445 (2014).
  49. Lefrancais, E., et al. The lung is a site of platelet biogenesis and a reservoir for haematopoietic progenitors. Nature. 544 (7648), 105-109 (2017).
  50. Headley, M. B., et al. Visualization of immediate immune responses to pioneer metastatic cells in the lung. Nature. 531 (7595), 513-517 (2016).
  51. Hammad, H., et al. House dust mite allergen induces asthma via Toll-like receptor 4 triggering of airway structural cells. Nature Medicine. 15 (4), 410-416 (2009).
  52. Bose, O., et al. Mast cells present protrusions into blood vessels upon tracheal allergen challenge in mice. PLoS One. 10 (3), 0118513(2015).
  53. Galkina, E., et al. Preferential migration of effector CD8+ T cells into the interstitium of the normal lung. Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3473-3483 (2005).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Homing limfocyt w T do p ucmodel zapalenia alergicznegoledzenie ludzkich limfocyt wzapalenie indukowane papainanaliza cytometrycznalimfocyty T CD4protok przejrzysto ci tkanekobrazowanie z rekonstrukcj 3Dadoptywny transfer kom rek
Zaawansowane obrazowanie ludzkich limfocytów naprowadzających płuca w eksperymentalnym modelu zapalenia alergicznego in vivo opartym na mikroskopii arkuszowej światła
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.