Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Mysi model zamknięcia dwóch naczyń niedokrwienia mózgu-reperfuzji

11.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59078

⸱

1 marca 2019

 ,  , 
1Research Center of Translational Imaging, College of Medicine, Taipei Medical University, 2Radiogenomic Research Center, Taipei Medical University Hospital, Taipei Medical University, 3Department of Radiology, School of Medicine, College of Medicine, Taipei Medical University, 4Department of Medical Imaging, Taipei Medical University Hospital, Taipei Medical University, 5Department of Medical Research, Taipei Medical University Hospital, Taipei Medical University, 6Department of Surgery, School of Medicine, College of Medicine, Taipei Medical University, 7Division of General Surgery, Department of Surgery, Taipei Medical University Hospital

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Mysi model niedokrwienia i reperfuzji mózgu został stworzony w celu zbadania patofizjologii udaru. Podwiązujemy dystalnie prawą środkową tętnicę mózgową i prawą tętnicę szyjną wspólną i przywracamy przepływ krwi po 10 lub 40 minutach niedokrwienia.

Streszczenie

W tym badaniu, mysi model okluzji środkowej tętnicy mózgowej (MCA) jest używany do badania niedokrwienia mózgu. Powtarzalny i wiarygodny model mysi jest przydatny do badania patofizjologii niedokrwienia i reperfuzji mózgu oraz określania potencjalnych strategii terapeutycznych dla pacjentów z udarem. Różnice w anatomii koła Willisa myszy C57BL / 6 wpływają na ich objętość zawału po urazie wywołanym niedokrwieniem mózgu. Badania wykazały, że dystalna okluzja MCA (MCAO) może przezwyciężyć ten problem i skutkować stabilnym rozmiarem zawału. W tym badaniu ustalamy mysi model niedrożności dwóch naczyń mózgowych z niedokrwieniem i reperfuzją poprzez przerwanie przepływu krwi do prawego MCA. Podwiązujemy dystalnie prawą MCA i prawą tętnicę szyjną wspólną (CCA) i przywracamy przepływ krwi po pewnym okresie niedokrwienia. Ten uraz niedokrwienno-reperfuzyjny wywołuje zawał o stabilnej wielkości i deficyt behawioralny. Obwodowe komórki odpornościowe infiltrują niedokrwiony mózg w ciągu 24-godzinnego okresu infiltracji. Dodatkowo utrata neuronów w obszarze kory mózgowej jest mniejsza przez dłuższy czas trwania reperfuzji. Dlatego ten model okluzji dwóch naczyń jest odpowiedni do badania odpowiedzi immunologicznej i regeneracji neuronów w okresie reperfuzji po niedokrwieniu mózgu.

Wprowadzenie

Model myszy z niedokrwieniem i reperfuzją mózgu jest jednym z najczęściej stosowanych podejść eksperymentalnych do badania patofizjologii uszkodzenia mózgu wywołanego niedokrwieniem1. Ponieważ niedokrwienie mózgu aktywuje obwodowy układ odpornościowy, obwodowe komórki odpornościowe infiltrują niedokrwiony mózg i powodują uszkodzenie neuronów2. W związku z tym do zrozumienia patofizjologii udaru potrzebny jest wiarygodny i powtarzalny model myszy, który naśladuje niedokrwienie i reperfuzję mózgu.

C57BL/6J (B6) myszy są najczęściej używanym szczepem w eksperymentach z udarem, ponieważ można je łatwo manipulować genetycznie. Dostępne są dwa popularne modele MCAO/reperfuzji, które naśladują stan niedokrwienia mózgu-reperfuzji. Pierwszym z nich jest model włókna śródświetlnego proksymalnego MCAO, w którym włókno pokryte silikonem jest wykorzystywane do wewnątrznaczyniowego blokowania przepływu krwi w MCA; Włókno zasłaniające jest następnie usuwane w celu przywrócenia przepływu krwi3. Krótki czas trwania okluzji powoduje uszkodzenie obszaru podkorowego, podczas gdy dłuższy czas trwania okluzji powoduje zawały w obszarach korowych i podkorowych. Drugim modelem jest model podwiązania dystalnego MCAO, który polega na zewnątrznaczyniowym podwiązaniu MCA i CCA w celu zmniejszenia przepływu krwi przez MCA, po czym przepływ krwi jest przywracany poprzez usunięcie szwu i tętniaka clip4. W tym modelu zawał jest spowodowany w obszarach korowych, a śmiertelność jest niska. Ponieważ podwiązanie modelu MCAO/reperfuzji wymaga kraniektomii, aby odsłonić miejsce dystalnego MCA, miejsce to można łatwo potwierdzić, a zbadanie, czy przepływ krwi w dystalnym MCA jest zakłócony podczas zabiegu, jest proste.

B6 myszy wykazują znaczne różnice w anatomii swojego kręgu Willisa; może to wpływać na objętość zawału po niedokrwieniu mózgu-reperfuzji5,6,7. Obecnie problem ten można przezwyciężyć poprzez podwiązanie dystalnej klasy MCA8. W tym badaniu ustalamy metodę zamykania przepływu krwi MCA i umożliwiania reperfuzji po z góry określonym okresie niedokrwienia. Niedrożność dwóch naczyń w modelu niedokrwienno-reperfuzyjnym mózgu indukuje przejściowe niedokrwienie terytorium MCA poprzez podwiązanie prawego dystalnego MCA i prawego CCA, z przywróconym przepływem krwi po pewnym okresie niedokrwienia. Ten model MCAO/reperfuzji indukuje zawał o stabilnej wielkości, większość komórek odpornościowych naciekających mózg w niedokrwionym mózgu i deficyt behawioralny po niedokrwieniu mózgu–reperfuzja4.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Instytucjonalne komitety ds. opieki nad zwierzętami i ich użytkowania Academia Sinica i Uniwersytetu Medycznego w Tajpej zatwierdziły ten protokół do wykorzystania zwierząt doświadczalnych.

1. MCAO/model reperfuzyjny

  1. Zapewnij myszom swobodny dostęp do wody i karmy do czasu operacji.
  2. Autoklaw narzędzi chirurgicznych i zdezynfekuj stół operacyjny i sprzęt za pomocą 70% etanolu. Nosić maskę chirurgiczną i sterylne rękawiczki. Użyj suchego sterylizatora kulek do ponownej sterylizacji narzędzi chirurgicznych, jeśli w jednym eksperymencie zostanie przeprowadzonych wiele operacji na myszach.
  3. Znieczulić mysz w wieku od 8 do 12 tygodni (masa: 25–30 g) za pomocą 0,8% hydratu chloralu we wstrzyknięciu dootrzewnowym. Upewnij się, że znieczulona mysz nie ma odruchu pedałowania (testowanego za pomocą mocnego uszczypnięcia palca) po znieczuleniu.
  4. Użyj maści weterynaryjnej, aby zapobiec wysuszeniu oczu myszy, gdy jest pod narkozą.
  5. Użyj nieinwazyjnego systemu pomiaru ciśnienia krwi, aby monitorować ciśnienie krwi myszy.
  6. Użyj systemu monitorowania fizjologicznego, aby monitorować temperaturę w odbycie i gazometrię krwi tętniczej. Utrzymuj temperaturę ciała na poziomie 36,5 ± 0,5 °C.
  7. Podskórnie wstrzyknąć myszu profilaktyczny antybiotyk (25 mg/kg cefazoliny)8.
  8. Umieść mysz w pozycji leżącej na poduszce grzewczej.
  9. Użyj elektrycznych maszynek do strzyżenia, aby odsłonić skórę, goląc sierść myszy w brzusznej okolicy szyi, a także w okolicy między prawym okiem a prawym uchem.
  10. Użyj kremu do depilacji, aby usunąć sierść z ciała myszy i zdezynfekuj miejsce operowane naprzemiennie z powidyną i 70% etanolem.
  11. Użyj nożyczek do tęczówki, aby wyciąć nacięcie linii środkowej na szyi o długości 1 cm.
  12. Użyj kleszczyków tęczówkowych, aby ostrożnie wypreparować CCA z nerwów błędnych, nie powodując obrażeń fizycznych.
  13. Użyj jedwabnych szwów 5-0, aby odizolować CCA.
  14. Wykonaj 0,3 cm nacięcie na skórze głowy w połowie drogi między prawym okiem a prawym uchem.
  15. Użyj mikronożyczek, aby przeciąć mięsień skroniowy, aby odsłonić kość jarzmową i łuskową.
  16. Pod stereoskopowym mikroskopem preparacyjnym użyj mikrowiertła, aby utworzyć otwór o średnicy 2 mm bezpośrednio nad dystalnym MCA po prawej stronie.
  17. Podwiązać pień dystalnego MCA po prawej stronie za pomocą szwu 10-0.
  18. Zatkaj CCA po prawej stronie za pomocą nieurazowego klipsa na tętniaka.
  19. Po 10 lub 40 minutach niedokrwienia usuń klipsy tętniaka i szew, aby przywrócić przepływ krwi do MCA i CCA.
  20. Użyj klipsa do szwów, aby uszczelnić nacięcie skóry na głowie.
  21. Uszczelnij nacięcia skóry szyjki macicy za pomocą pojedynczego szwu, a następnie zamknij skórę szyi szwem lub zszywką9.
  22. Podskórnie wstrzyknąć buprenorfinę (0,1 mg/kg) w celu złagodzenia bólu9.
  23. Utrzymuj temperaturę ciała myszy na poziomie 36.5 ± 0.5 °C na poduszce grzewczej, aż w pełni wyzdrowieje po znieczuleniu. Nie należy zwracać zwierzęcia, które przeszło operację, do towarzystwa innych zwierząt, dopóki w pełni nie wyzdrowieje. Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności.
  24. Umieść mysz w autoklawowanej klatce, aby miała swobodny dostęp do wody i jedzenia po całkowitym wyzdrowieniu.

2. Barwienie chlorkiem 2,3,5-trifenylotetrazolu

  1. Znieczulić mysz 0,8% hydratem chloralu za pomocą wstrzyknięcia dootrzewnowego.
  2. Użyj nożyczek operacyjnych, aby odciąć głowę zwierzęciu.
  3. Odsłoń czaszkę za pomocą nożyczek do tęczówki, aby wykonać nacięcie w skórze głowy.
  4. Użyj nożyczek operacyjnych, aby przeciąć przednią część kości czołowej.
  5. Użyj nożyczek do tęczówki, aby przeciąć czaszkę wzdłuż szwu strzałkowego.
  6. Użyj rongeura kostnego, aby odepchnąć na bok kość czołową i ciemieniową oraz odsłonić mózg.
  7. Użyj kleszczy tęczówkowych, aby wypreparować mózg.
  8. Użyj macierzy mózgowej myszy i żyletek, aby uzyskać 2 mm plasterki koronalne.
  9. Barwieć plastry mózgu przez 10 minut w temperaturze 37 °C 2% chlorkiem 2,3,5-trifenylotetrazolu (TTC) w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem.
  10. Opłucz mózg 2x 10% formaliną.
  11. Utrwal mózg w 10% formalinie w temperaturze pokojowej przez 24 godziny.

3. Pomiar wielkości zawału

  1. Ułóż sekcje na czystym plastikowym szkiełku i ustaw sekcje od rostralnego do ogonowego.
  2. Zeskanuj slajd za pomocą skanera. Umieść linijkę metryczną i upewnij się, że jest widoczna na zeskanowanym obrazie. Odwróć suwak i zeskanuj jego odwrotną stronę.
  3. Oblicz obszar zawału każdej sekcji za pomocą oprogramowania ImageJ.
    1. Otwórz plik obrazu i skonfiguruj skalę obrazu.
    2. Użyj zaznaczenia odręcznego, aby zaznaczyć obszar zawału.
    3. Użyj menedżera obszarów zainteresowania (ROI), aby zmierzyć obszar zainteresowania.
  4. Zsumuj obszary zawału dla każdej sekcji i pomnóż wynik przez grubość przekroju, aby oszacować całkowitą objętość zawału.

4. Analiza statystyczna

  1. Użyj GraphPad Prism 6, aby określić istotność statystyczną za pomocą testu t-testowego Studenta.
    UWAGA: Słupki błędów na wykresach słupkowych reprezentują błędy standardowe średniej (SEM).
  2. Użyj G*Power 3.1, aby obliczyć odpowiednią wielkość próby i przeprowadzić analizę mocy10.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Ta procedura MCAO/reperfuzji spowodowała powstanie zawału kory w obrębie prawej tętnicy środkowej mózgu (MCA) oraz doprowadziła do deficytu behawioralnego. Poprzez wydłużenie czasu ligacji w korze mózgowej obszaru prawej MCA uzyskano różne stopnie objętości zawału indukowanego niedokrwieniem (Rysunek 1A,B) oraz utraty neuronów (Rysunek 1C,D). Ten uraz MCAO/reperfuzji zmniejszył aktywność lokomoto...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Mysi model MCAO / reperfuzyjny jest modelem zwierzęcym powszechnie stosowanym do naśladowania przejściowego niedokrwienia u ludzi. Ten model zwierzęcy można zastosować do transgenicznych i nokautujących szczepów myszy w celu zbadania patofizjologii udaru. Kilka kroków w protokole jest szczególnie krytycznych. (1) Mikrowiertło musi być ostrożnie używane podczas tworzenia w czaszce, przy czym niewłaściwe działanie łatwo powoduje krwawienie z MCA. (2) MCA nie powinno być uszkodzone i należy unikać krwawienia przed i po zabi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Ministerstwo Nauki i Technologii Tajwanu (MOST 106-2320-B-038-024, MOST 105-2221-E-038-007-MY3 i MOST 104-2320-B-424-001) oraz Szpital Uniwersytetu Medycznego w Tajpej (107TMUH-SP-01). Ten rękopis został zredagowany przez Wallace Academic Editing.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Bone rongeurDienerFriedman
BuprenorphineSigmaB-044
CefazolinSigma1097603
Hydrat chloraluSigmaC8383
Mikroskop preparacyjnyNikonSMZ-745
Maszynki elektryczne do strzyżeniaPetpro
10% formalinySigmaF5304
Sterylizator suchych kulek GerminatorBraintree Scientific
Kleszcze do przysłonyKarl Klappenecker10 cm
Nożyczki do tęczówkiDiener9 cm
Nożyczki do irysa STRKarl Klappenecker11 cm
MicrodrillStoeltingFOREEDOM K.1070
Mikronożyczki-VannasHEISSH-4240ostrze 7mm, 8 cm
Matryca mózgu myszyŚwiat Instrumenty precyzyjne
Nieinwazyjny system ciśnienia krwiMuromachiMK-2000ST
Nożyczki operacyjne STRKarl Klappenecker14 cm
System monitorowania fizjologicznegoAparat
Brzytwa ostrzaEver-Ready
Stoelting Ocieplacze na gryzonieStoelting53810Poduszka grzewcza
Klips do szwówPęseta Stoelting
IDEALTEKNo.3
Vetbond3M15672Klej chirurgiczny
10-0 szewUNIKNT0410
2,3,5-Trifenylotetrazolium chlorekSigmaT8877
Harvarda

Bibliografia

  1. Woodruff, T. M., et al. Pathophysiology, treatment, and animal and cellular models of human ischemic stroke. Molecular Neurodegeneration. 6 (1), 11(2011).
  2. Chamorro, A., et al. The immunology of acute stroke. Nature Reviews. Neurology. 8 (7), 401-410 (2012).
  3. Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice - Middle cerebral artery occlusion with the filament model. Journal of Visualized Experiments. (47), e2423(2011).
  4. Lee, G. A., et al. Interleukin 15 blockade protects the brain from cerebral ischemia-reperfusion injury. Brain, Behavior, and Immunity. 73, 562-570 (2018).
  5. Barone, F. C., Knudsen, D. J., Nelson, A. H., Feuerstein, G. Z., Willette, R. N. Mouse strain differences in susceptibility to cerebral ischemia are related to cerebral vascular anatomy. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 13 (4), 683-692 (1993).
  6. Kitagawa, K., et al. Cerebral ischemia after bilateral carotid artery occlusion and intraluminal suture occlusion in mice: evaluation of the patency of the posterior communicating artery. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 18 (5), 570-579 (1998).
  7. Wellons, J. C. 3rd, et al. A comparison of strain-related susceptibility in two murine recovery models of global cerebral ischemia. Brain Research. 868 (1), 14-21 (2000).
  8. Doyle, K. P., Fathali, N., Siddiqui, M. R., Buckwalter, M. S. Distal hypoxic stroke: a new mouse model of stroke with high throughput, low variability and a quantifiable functional deficit. Journal of Neuroscience Methods. 207 (1), 31-40 (2012).
  9. Doyle, K. P., Buckwalter, M. S. A mouse model of permanent focal ischemia: Distal middle cerebral artery occlusion. Methods in Molecular Biology. , 103-110 (2014).
  10. Wayman, C., et al. Performing Permanent Distal Middle Cerebral with Common Carotid Artery Occlusion in Aged Rats to Study Cortical Ischemia with Sustained Disability. Journal Of Visualized Experiments. (108), e53106(2016).
  11. Noor, R., Wang, C. X., Shuaib, A. Effects of hyperthermia on infarct volume in focal embolic model of cerebral ischemia in rats. Neuroscience Letters. 349 (2), 130-132 (2003).
  12. Florian, B., et al. Long-term hypothermia reduces infarct volume in aged rats after focal ischemia. Neuroscience Letters. 438 (2), 180-185 (2008).
  13. Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx: The Journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 2 (3), 396-409 (2005).
  14. Lin, T. N., Te, J., Huang, H. C., Chi, S. I., Hsu, C. Y. Prolongation and enhancement of postischemic c-fos expression after fasting. Stroke. 28 (2), 412-418 (1997).
  15. Glazier, S. S., O'Rourke, D. M., Graham, D. I., Welsh, F. A. Induction of ischemic tolerance following brief focal ischemia in rat brain. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 14 (4), 545-553 (1994).
  16. Tachibana, M., et al. Early Reperfusion After Brain Ischemia Has Beneficial Effects Beyond Rescuing Neurons. Stroke. 48 (8), 2222-2230 (2017).
  17. Gan, Y., et al. Ischemic neurons recruit natural killer cells that accelerate brain infarction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (7), 2704-2709 (2014).
  18. Li, M., et al. Astrocyte-derived interleukin-15 exacerbates ischemic brain injury via propagation of cellular immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (3), E396-E405 (2017).
  19. Wang, S., Zhang, H., Dai, X., Sealock, R., Faber, J. E. Genetic architecture underlying variation in extent and remodeling of the collateral circulation. Circulation Research. 107 (4), (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

tętnica środkowa mózguprocedura chirurgicznaobjętość zawałuinfiltracja komórek odpornościowychutrata neuronówlaserowy pomiar dopplerowskibarwienie TTC
Mysi model zamknięcia dwóch naczyń niedokrwienia mózgu-reperfuzji
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.