Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Poprawa ekstruzji mikrokryształów o wysokiej lepkości w celu czasowo-rozdzielczej seryjnej krystalografii femtosekundowej w laserach rentgenowskich

8.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59087

⸱

28 lutego 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Biology and Chemistry - Laboratory for Biomolecular Research, Paul Scherrer Institut, 2Photon Science Division - SwissFEL, Paul Scherrer Institut, 3RIKEN SPring-8 Center, 4Department of Cell Biology, Graduate School of Medicine, Kyoto University, 5Department of Biology, ETH Zürich

W tym artykule

Podsumowanie

Powodzenie eksperymentu z seryjną krystalografią femtosekundową z rozdzielczością czasową zależy od efektywnego dostarczania próbki. W tym miejscu opisujemy protokoły optymalizujące wytłaczanie mikrokryształów bakteriorodopsyny z wtryskiwacza do mikroekstruzji o wysokiej lepkości. Metodologia opiera się na homogenizacji próbki za pomocą nowatorskiego łącznika trójdrożnego i wizualizacji za pomocą szybkiej kamery.

Streszczenie

Wtryskiwacze mikroekstruzji o wysokiej lepkości znacznie zmniejszyły zużycie próbek w seryjnych femtosekundowych eksperymentach krystalograficznych (SFX) przy laserach rentgenowskich na swobodnych elektronach (XFEL). Seria eksperymentów z wykorzystaniem bakteriorodopsyny napędzanej światłem pompy protonowej dodatkowo ustaliła, że wstrzykiwacze te są preferowaną opcją dostarczania kryształów do czasowo-rozdzielczej seryjnej krystalografii femtosekundowej (TR-SFX) w celu rozwiązania zmian strukturalnych białek po fotoaktywacji. Aby uzyskać wiele migawek strukturalnych o wysokiej jakości, konieczne jest zebranie dużych ilości danych i zapewnienie odstępu kryształów między każdym impulsem lasera pompy. Tutaj szczegółowo opisujemy, w jaki sposób zoptymalizowaliśmy wytłaczanie mikrokryształów bakteriorodopsyny dla naszych ostatnich eksperymentów TR-SFX w koherentnym źródle światła Linac (LCLS). Celem metody jest optymalizacja ekstruzji w celu uzyskania stabilnego i ciągłego przepływu przy jednoczesnym zachowaniu wysokiej gęstości kryształów, aby zwiększyć szybkość, z jaką można zbierać dane w eksperymencie TR-SFX. Cel ten osiągamy poprzez przygotowanie lipidowej fazy sześciennej z jednorodnym rozkładem kryształów za pomocą nowatorskiego trójdrożnego urządzenia sprzęgającego strzykawkę, a następnie dostosowanie składu próbki na podstawie pomiarów stabilności ekstruzji wykonanych za pomocą szybkiej kamery. Metodologia może być dostosowana w celu optymalizacji przepływu innych mikrokryształów. Konfiguracja będzie dostępna dla użytkowników nowego szwajcarskiego lasera na swobodnych elektronach.

Wprowadzenie

Seryjna krystalografia femtosekundowa (SFX) to technika biologii strukturalnej, która wykorzystuje unikalne właściwości rentgenowskich laserów na swobodnych elektronach (XFEL) do określania struktur temperatury pokojowej z tysięcy kryształów o rozmiarach mikrometrów, jednocześnie wyprzedzając większość uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem przez zasadę "dyfrakcji przed zniszczeniem"1,2,3.

W czasowym rozszerzeniu SFX (TR-SFX), impulsy femtosekundowe z XFEL są używane do badania zmian strukturalnych w białkach4,5. Białko będące przedmiotem zainteresowania jest aktywowane za pomocą lasera optycznego (lub innego wyzwalacza aktywności) tuż przed wystrzeleniem przez XFEL w konfiguracji pompa-sonda. Dzięki precyzyjnemu kontrolowaniu opóźnienia między impulsami pompy i sondy, białko docelowe może być wychwytywane w różnych stanach. Molekularne filmy przedstawiające zmiany strukturalne na przestrzeni jedenastu rzędów wielkości w czasie pokazują moc nowych źródeł XFEL do badania dynamiki kilku celów białkowych6,7,8,9,10,11,12,13. Zasadniczo, metoda ta łączy dynamiczne techniki spektroskopowe i statyczne techniki strukturalne w jedną, zapewniając wgląd w dynamikę białek w rozdzielczości bliskiej atomowej.

Proste systemy dla TR-SFX mogą zawierać endogenny wyzwalacz aktywacji za pomocą światłoczułego komponentu, takiego jak siatkówka, w bakteriorodopsyny (bR)9,10, chromofory w fotosystemie II12,13, fotoaktywne żółte białko (PYP)6,7 odwracalnie fotoprzełączalne białko fluorescencyjne11, lub fotolizowalny tlenek węgla w mioglobinie8. Ekscytujące warianty techniki, które wciąż są w fazie rozwoju, opierają się na schematach mieszania i wstrzykiwania14,15 do badania reakcji enzymatycznych lub pola elektrycznego używanego do wywoływania zmian strukturalnych16. Biorąc pod uwagę, że źródła XFEL są dostępne dopiero od kilku lat i ekstrapolują dotychczasowe sukcesy na przyszłość, metoda ta wykazuje potencjał jako prawdziwy przełom w odniesieniu do naszego zrozumienia funkcjonowania białek.

Ponieważ próbki biologiczne są niszczone przez jednorazowe wystawienie na działanie impulsu XFEL o dużej mocy, konieczne było nowe podejście do krystalografii białek. Wśród tych procedur należało opracować zdolność do hodowania dużych ilości jednorodnych mikrokryształów17,18,19. Aby umożliwić zbieranie danych w XFEL, kryształy te muszą zostać dostarczone, wyrzucone, a następnie odnowione dla każdego impulsu XFEL. Biorąc pod uwagę, że XFEL wystrzeliwują użyteczne impulsy z częstotliwością 10-120 Hz, dostarczanie próbki musi być szybkie, stabilne i niezawodne, przy jednoczesnym zachowaniu kryształów w stanie nienaruszonym i ograniczeniu zużycia. Jednym z najbardziej udanych rozwiązań jest wtryskiwacz do mikroekstruzji o wysokiej lepkości, który dostarcza ciągłą kolumnę krystalicznej fazy lipidowej sześciennej (LCP) w temperaturze pokojowej przez pulsacyjną wiązkę promieniowania rentgenowskiego20. Losowo zorientowane kryształy, osadzone w strumieniu LCP, które są przechwytywane przez impulsy XFEL, rozpraszają promieniowanie rentgenowskie na detektor, w którym rejestrowany jest wzór dyfrakcyjny. LCP był naturalnym wyborem dla pożywki do dostarczania próbek, ponieważ jest często używany jako pożywka wzrostowa dla kryształów białek błonowych17,21,22,23, jeszcze inne nośniki o wysokiej lepkości24,25,26,27,28,29,30 i rozpuszczalne białka31 zostały również użyte w wtryskiwaczu. SFX z wtryskiwaczem o wysokiej lepkości odniósł sukces podczas określania struktury białek błonowych13,32 z uwzględnieniem receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCRs)33,34,35,36,37, z jakością danych wystarczającą do natywnego fazowania38,39 przy jednoczesnej efektywności zarówno czasowej, jak i próbki. Obecnie wtryskiwacze te są używane bardziej rutynowo do pomiarów temperatury pokojowej w źródłach synchrotronowych28,30,40,41, a także podczas bardziej wymagających technicznie eksperymentów TR-SFX w XFELs9,10,13,42.

Porównywalne eksperymenty TR-SFX zostały przeprowadzone przy użyciu innych typów wtryskiwaczy, takich jak dostarczanie fazy ciekłej w dyszy skoncentrowanej na przepływie6,7,12, jednak ta metoda wymaga ilości białka, które nie są dostępne dla wielu biologicznie interesujących celów. W celu określenia struktur statycznych za pomocą wytłaczania lepkiego zgłoszono średnie zużycie 0,072 mg białka na 10 000 indeksowanych wzorów dyfrakcyjnych w porównaniu do 9,35 mg dla dysz strumieniowych z cieczą (tj. około 130 razy większa wydajność próbki)20. Wykazano, że wtryskiwacz o wysokiej lepkości jest realnym urządzeniem do dostarczania próbek dla TR-SFX, poświęcając tylko część tej wydajności próbki43. Na przykład w Nogly et al. (2018)10 zużycie próbki wynosiło około 1,5 mg na 10 000 indeksowanych wzorców, co wypada korzystnie w porównaniu z podobnymi eksperymentami TR-SFX z użyciem PYP, w których średnie zużycie próbki było znacznie wyższe i zawierało 74 mg białka na 10 000 indeksowanych wzorców6. Wtryskiwacze o wysokiej lepkości mają zatem wyraźne zalety, gdy ilość dostępnego białka jest ograniczona lub gdy kryształy są hodowane bezpośrednio w LCP.

Dla TR-SFX korzystającego z wtryskiwaczy o wysokiej lepkości w celu uzyskania najbardziej wiarygodnych danych należy rozwiązać kilka problemów technicznych: prędkość przepływu musi pozostać powyżej minimalnej wartości krytycznej; współczynnik trafień powinien być utrzymany na poziomie, który nie powoduje spowolnienia zbierania danych (np. więcej niż 5%); a próbka musi być dostarczona bez nadmiernych zakłóceń. Idealnie byłoby, gdyby warunki te zostały spełnione na długo przed zaplanowanym eksperymentem TR-SFX, aby jak najefektywniej wykorzystać dostępny czas XFEL. Zasadniczo spowolnienie strumienia LCP może pozwolić na sondowanie kryształów, które zostały aktywowane więcej niż jednym optycznym impulsem laserowym i skutkują mieszanymi stanami aktywnymi, lub sondowanie pompowanego materiału, gdy spodziewany jest materiał pompowany w wiązce. Dodatkową korzyścią płynącą ze wstępnego testowania wtrysku jest to, że przestoje podczas zbierania danych w XFEL są zminimalizowane, ponieważ czas przeznaczony na wymianę zatkanych dysz, wymianę próbek niewytłaczanych i inne zadania konserwacyjne są zredukowane.

Tutaj prezentujemy metodę optymalizacji dostarczania próbek do zbierania danych TR-SFX za pomocą wtryskiwacza do mikroekstruzji o wysokiej lepkości. Dla uproszczenia, opisane metody nie opierają się na dostępie do źródła promieniowania rentgenowskiego, chociaż prace na synchrotronowej linii badawczej29 dostarczyłyby dalszych informacji na temat oczekiwanych wskaźników trafień i dyfrakcji kryształów. Nasze protokoły zostały opracowane w celu optymalizacji eksperymentów mających na celu uchwycenie izomeryzacji siatkówki w bakteriorodopsyny pompy protonowej10 i są przeprowadzane w dwóch fazach, zaczynając od przygotowania próbek kryształów do wytłaczania, a następnie monitorowania ekstruzji za pomocą szybkiej konfiguracji kamery. W pierwszej fazie krystaliczny LCP miesza się z dodatkowym LCP, lipidami o niskiej temperaturze przejścia lub innymi dodatkami, aby zapewnić, że końcowa mieszanina nadaje się do dostarczenia do środowiska próbki bez zatykania lub spowalniania. Nowy trójdrożny łącznik strzykawki został opracowany w celu poprawy wydajności mieszania i jednorodności próbki. Druga faza składa się z testu wytłaczania zarejestrowanego przez szybką kamerę w celu bezpośredniego pomiaru stabilności prędkości wytłaczania. Po analizie danych wideo można wprowadzić poprawki do protokołu przygotowania próbki w celu poprawy wyników eksperymentu. Procedury te mogą być dostosowane do przygotowania innych białek do zbierania danych TR-SFX, przy minimalnych modyfikacjach, i przyczynią się do efektywnego wykorzystania ograniczonego czasu wiązki XFEL. Dzięki nowym obiektom XFEL, które dopiero rozpoczynają swoją działalność44,45 i przeniesieniu metod zbierania danych szeregowych opartych na wtryskiwaczach do synchrotronów28,30,40,41, najbliższe lata z pewnością przyniosą nowe, ekscytujące spojrzenie na dynamikę strukturalną coraz szerszego zakresu celów białkowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie próbki kryształu białka

  1. Około 30 min przed wtryskiem próbki, należy pobrać 50 µL LCP na bazie monooleiny zawierającej kryształy do strzykawki o pojemności 100 µL.
  2. W przypadku wtrysku pod ciśnieniem atmosferycznym: do tylnej części drugiej strzykawki należy pobrać 10 µL parafiny w płynie. Trzymając strzykawkę pionowo, należy usunąć z niej pęcherzyki powietrza.
    1. W przypadku wtrysku do środowiska próżniowego: do tylnej części drugiej strzykawki należy pobrać 5 µL MAG 7.9 oraz 5 µL parafiny w płynie. Trzymając strzykawkę pionowo, należy usunąć z niej pęcherzyki powietrza.
  3. Strzykawkę z parafiną/MAG 7.9 należy podłączyć do standardowego łącznika strzykawek i usunąć powietrze z łącznika, delikatnie naciskając tłok, aż na końcówce igły łącznika pojawi się niewielka objętość (<1 µL) parafiny/lipidów.
  4. Strzykawkę z próbką należy podłączyć do łącznika strzykawek, uważając, aby nie wprowadzić powietrza do próbki. Należy wymieszać ją z lipidami/parafiną, wielokrotnie przepuszczając materiał próbki przez łącznik.
  5. Do kolejnej strzykawki o pojemności 100 µL należy pobrać 20 µL wymieszanego wstępnie LCP (27% PEG, 100 mM Sorensen pH 5.6 + MO). W razie potrzeby należy usunąć pęcherzyki powietrza.
  6. Należy odłączyć pustą strzykawkę od łącznika i za pomocą standardowego łącznika strzykawek połączyć strzykawkę z wymieszanym wstępnie LCP ze strzykawką zawierającą kryształy. Próbkę należy przepuścić przez łącznik 100 razy.
    UWAGA: Mieszanie próbki może spowodować jej niewielkie podgrzanie46. Mieszanie powinno odbywać się powoli, tak aby temperatura próbki pozostała na względnie stałym poziomie.
  7. Należy sprawdzić przejrzystość próbki pod źródłem światła. Jeśli utworzył się klarowny, homogeniczny LCP, należy przejść do kroku 1.9.
  8. Aby doprowadzić próbkę do fazy kubicznej, należy dodać 3 µL monooleiny i wymieszać 50 razy (zgodnie z opisem powyżej). Procedurę tę należy powtarzać tylko do momentu utworzenia się fazy przezroczystej, aby uniknąć nadmiaru monooleiny.
    UWAGA: Formowanie się LCP jest zależne od temperatury47, a najlepsze wyniki uzyskuje się nieco powyżej 20 °C. Ilość dodatkowej monooleiny zależy od objętości pozostałego roztworu precypitantu przeniesionego z procesu krystalizacji.
  9. W ramach wstępnego testu sztywności próbki (oczekiwanej dla fazy LCP) oraz możliwości jej wyciśnięcia, należy odłączyć pustą strzykawkę od łącznika i trzymając strzykawkę pionowo, wycisnąć niewielką ilość próbki (<2 µL) przez łącznik. Jeśli wyciśnięta próbka tworzy pionowy cylinder, jest ona gotowa do testów ekstruzji.
  10. Całkowitą objętość próbki należy dostosować do 100 µL poprzez dodanie większej ilości wymieszanego wstępnie LCP (jak w kroku 1.5).
  11. Strzykawkę z próbką oraz dwie puste strzykawki należy podłączyć do trójdrożnego łącznika strzykawek (usuwając powietrze z łącznika w sposób opisany wcześniej). Należy wymieszać próbkę co najmniej 50 razy (lub do uzyskania homogeniczności), przepuszczając połowę próbki do drugiej strzykawki, a następnie jednocześnie wciskając obie połowy próbki do trzeciej strzykawki.
  12. Strzykawkę z wymieszaną próbką należy umieścić pod mikroskopem stereoskopowym, aby zweryfikować homogeniczne rozłożenie kryształów.

2. Testowanie ekstruzji próbki przy użyciu zestawu z kamerą wysokiej prędkości

  1. Wyznaczanie parametrów eksperymentalnych.
    1. Wybierz rozmiar dyszy do testu.
      UWAGA: Rozmiary dysz wynoszą zazwyczaj 50 lub 75 µm średnica wewnętrzna (ID), lecz każdy rozmiar od około 30-100 µm Można rozważyć zastosowanie ID. Wybór opiera się na kompromisie między średnim czasem zapychania, rozpraszaniem tła, zużyciem próbki a odsetkiem trafień.
    2. Oblicz optymalną prędkość przepływu na podstawie eksperymentalnej wielkości plamki laserowej (1/e^2)2 średnica) oraz schemat gromadzenia danych (np. przeplatanie fazy jasnej i ciemnej), który zostanie zastosowany w XFEL.
    3. Obliczyć pożądany przepływ (Koncepcja równowagi, ΣFx=0, schemat z siłami; analiza równowagi statycznej w mechanice.) próbki przy optymalnej prędkości przepływu (Schemat równowagi statycznej z równaniami ΣFx=0, przedstawiający wektory sił i kąty do analizy.) oraz wybranej średnicy dyszy (Diagram równowagi statycznej, ΣFx=0, wizualizacja bilansu sił, edukacyjna metoda fizyki):
      Równanie przepływu płynu \(Q_s = v_e \pi \frac{d^2}{4}\), opisujące analizę natężenia przepływu w rurze.
      Wyznacz prędkość przepływu (Symbol fazy ilościowej (Qₚ), reprezentujący równowagę statyczną w równaniach fizycznych.) należy wprowadzić do pompy HPLC na podstawie współczynnika wzmocnienia (Schemat równowagi statycznej, ΣFx=0, ilustrujący siły i równowagę w układzie do analizy wektorowej.) wtryskiwacza.
      Równanie zjawisk transportowych, Qp=QsA, równanie matematyczne istotne w badaniach nad dynamiką płynów.
      Oblicz maksymalne ciśnienie (Równowaga statyczna, wzór ΣFx=0, schemat wektorów sił, ilustrujący zasady równowagi.) z ciśnienia znamionowego złączy dysz (Równowaga statyczna, symbol RMAX, stosowany w równaniach fizycznych dla warunków promienia maksymalnego.) oraz współczynnik wzmocnienia wtryskiwacza (Schemat równowagi statycznej z wzorem ΣFx=0; schemat ciała swobodnego; siły i wektory.):
      Wzór na obliczanie mocy \( P_{\text{MAX}} = \frac{R_{\text{MAX}}}{A} \), równanie fizyczne.
  2. Konfiguracja wtryskiwacza do ekstruzji materiałów o wysokiej lepkości do zastosowań offline, zgodnie z przedstawionym schematem w Rycina 1.
    UWAGA: Inżektor działa na zasadzie ekstruzji hydraulicznej zasilanej pompą HPLC i wykorzystuje współpłynącą osłonę z gazu helu sterowaną przez regulator gazu. Konfiguracja pompy i regulatora nie jest omawiana w niniejszym protokole. Patrz rozdział czwarty w James (2015).48 do szczegółowego podręcznika.
    1. Przepłucz pompę oraz wszystkie linie wodne, aby zapewnić dokładność przepływów. Przepłucz stopień hydrauliczny injektora.
    2. Zamocuj injektor (lub kamerę) na stole trójosiowym, aby ułatwić kadrowanie i ustawienie ostrości w nagraniach wideo o wysokiej prędkości. Pozostaw wokół miejsca iniekcji miejsce na obiektyw, oświetlenie, ekran refleksyjny oraz mały zlew do zbierania zużytej próbki.
    3. Należy skonstruować „dyszę atrapy” (pusty zbiornik z przymocowaną dyszą) i zainstalować ją na wtryskiwaczu, aby ułatwić pozycjonowanie, ustawienie ostrości i oświetlenie.
    4. Zamontuj kamerę wysokich prędkości tak, aby końcówka dyszy znajdowała się w pobliżu punktu ogniskowania obiektywu.
    5. Umieść ekran refleksyjny za injektorem i dostosuj oświetlenie tak, aby dysza była podświetlona z przodu.
    6. Włącz kamerę i połącz się z nią za pomocą dostarczonego oprogramowania. Przy uruchomionym podglądzie wideo w czasie rzeczywistym ustaw końcówkę dyszy w centrum kadru i ustaw ostrość za pomocą stolika trójosiowego.
    7. Reguluj oświetlenie do momentu, aż dysza będzie wyraźnie widoczna, a tło zostanie równomiernie oświetlone.
  3. Konfiguracja kamery do rejestrowania przyspieszonych filmów poklatkowych o wysokiej prędkości.
    1. Ustaw częstotliwość klatek na 1000 fps. Ustaw rozdzielczość na 512 x 512 pikseli.
    2. Po ustawieniu czasu ekspozycji za pomocą częstotliwości klatek, należy dostosować poziom oświetlenia do momentu, aż dysza stanie się widoczna (tj. nie będzie niedoświetlona ani prześwietlona). Należy ponownie ustawić końcówkę dyszy tak, aby znajdowała się w centrum w poziomie oraz w górnej jednej trzeciej kadru.
    3. Przeprowadź korekcję tła lub operacje balansu bieli.
    4. Skonfiguruj aparat w trybie poklatkowym (time-lapse). Ustaw interwał na 30 s i powtórzenia do 40 razyustaw tryb wyzwalania na losowy (lub losowy reset) i wprowadź liczbę klatek do zarejestrowania 1000.
  4. Napełnij zbiornik za pomocą 20 µL próbki testowej, a następnie przymocuj dyszę kapilarną.
  5. Podłącz napełniony zbiornik do injektora. Podłącz linię gazową do portu w dyszy i uruchom przepływ gazu.
  6. Ręcznie przesuń tłok, otwierając zawór liniowy i naciskając strzykawkę. Zamknij zawór, gdy tłok uzyska stały kontakt z próbką w zbiorniku.
  7. Zaprogramuj pompę z obliczonym przepływem i ustaw maksymalne ciśnienie na obliczoną wartość (patrz krok 2.1.3).
  8. Jednocześnie uruchomić pompę i nagrywanie kamerą.
  9. Wraz z rozpoczęciem ekstruzji należy dostosować ciśnienie gazu w celu zwiększenia stabilności. Należy zwiększyć ciśnienie gazu, jeśli w końcówce dyszy zamiast kolumny cieczy tworzy się kropla. Należy zmniejszyć ciśnienie, jeśli ekstruzja ulega przerwaniu z powodu nadmiernego ścinania przez przepływ gazu lub gdy występują szybkie oscylacje (efekt biczowania).
  10. Monitoruj proces ekstruzji (zazwyczaj 10 min wystarcza do stwierdzenia uzyskania warunków homogenicznego przepływu), a gdy ciśnienie pompy gwałtownie wzrośnie w pobliżu przewidywanego czasu zakończenia, przerwij rejestrację, wyłącz pompę i upuść ciśnienie z układu, otwierając zawór bezpieczeństwa.
  11. Analiza plików wideo
    UWAGA: W przypadku oczywistej niewystarczalności ekstruzji próbki szczegółowa analiza nie jest wymagana. Niemniej jednak nadal użyteczne jest zidentyfikowanie trybu awarii, aby umożliwić optymalizację próbki.
    1. Otwórz plik wideo w oprogramowaniu do analizy (np. Fiji)49) i skalibrować narzędzia pomiarowe.
    2. Skalibruj pomiary, wybierając za pomocą narzędzia wyboru linii odcinek o znanej długości na obrazie wideo. Otwórz Ustawienie skali okno poprzez Analiza | Ustawienie skali i wprowadź znaną odległość oraz jednostki miary.
      UWAGA: Znana średnica dyszy zapewnia odpowiednią długość kalibracyjną dla tych pomiarów.
    3. Znajdź w filmie klatkę, w której w ekstrudacie widoczna jest cecha możliwa do śledzenia (np. kryształ). Zapisz numer klatki.
    4. Przewiń wideo do klatki, w której ta sama cecha jest widoczna, lecz przesunęła się ze swojej pozycji z poprzedniego kroku. Zapisz numer klatki.
    5. Używając narzędzia do pomiaru linii prostych, zmierz odległość od punktu początkowego do końcowego cechy poprzez Analizuj | Mierz.
      UWAGA: Im dłuższy dystans śledzenia, tym mniejszy wpływ błędów pomiarowych na obliczenia
    6. Oblicz prędkość strumienia na podstawie zmierzonej odległości i upływu czasu (liczba klatek podzielona przez częstotliwość klatek na sekundę).
    7. Powtórz kroki 2.11.3–2.11.6 kilka razy dla każdego segmentu filmu.
    8. Wykreśl serie danych zgodnie z Rysunek 2.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Idealnym materiałem wyjściowym dla opisanych tutaj procedur (Rysunek 3) są wysokie gęstości mikrokryształów zawieszonych w lepkim medium nośnym dla injektora. Procedura wymaga około 50 µL nośnika z kryształami dla każdego przygotowania. Mogą one być hodowane bezpośrednio w LCP, tak jak w przypadku bR9,10 użytego tutaj jako przykład (Rysunek 4), lub przygotowane przy użyci...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Metoda TR-SFX z wstrzykiwaczem do wytłaczania lepkiego okazała się skuteczną techniką do badań dynamiki strukturalnej bakteriorodopsyny 9,10 i fotosystemu II13, a obecnie wydaje się gotowa do badania białek napędzających inne procesy fotobiologiczne, takie jak transport jonów sterowany światłem lub percepcja sensoryczna 5,50. Opisane powyżej protokoły zostały zaprojektowane w celu ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Gebhardowi Schertlerowi, Rafaelowi Abeli i Chrisowi Milne'owi za poparcie stosowania wtryskiwaczy o wysokiej lepkości w PSI. Richard Neutze i jego zespół są znani z dyskusji na temat krystalografii czasowo-rozdzielczej i dostarczania próbek przy użyciu wtryskiwaczy o wysokiej lepkości. Za wsparcie finansowe dziękujemy Szwajcarskiej Narodowej Fundacji Nauki za granty 31003A_141235, 31003A_159558 (dla J.S.) i PZ00P3_174169 (dla P.N.). Projekt ten otrzymał dofinansowanie z programu Unii Europejskiej w zakresie badań naukowych i innowacji Horyzont 2020 w ramach umowy o udzielenie grantu nr 701646 Marie-Skłodowska-Curie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sprzęgło strzykawki Mosquito LCPSklep laboratoryjny TTP3072-01050
Strzykawka Hamilton 1710 RNR, 100 i mikro; lHamiltonHA-81065
Strzykawka Hamilton 1750 RNR, 500 i mikro; lHamiltonHA-81265
MonooleinaNu-Chek Prep, Inc.M-239
7.9 MAGAvanti Polar Lipids Inc.850534O
50% w/v PEG 2000Wymiary molekularneMD2-250-7
Parafina (ciecz)Sigma-Aldrich1.07162
Szybka kameraPhotronPhotron Mini AX
Obiektyw o dużym powiększeniuNavitar12X Zoom Lens System
trzyosiowyThorLabsPT3/M
Światłowódlekki ThorlabsOSL2
Stopione włókno krzemionkoweMolex/PolymicroTSP-505375
Lite tulejka dotykowaIDEXLT-100
ASU wtryskiwacz o wysokiej lepkościStanowy ArizonyDo kupienia w pompie Uwe Weierstall (weier@asu.edu)
HPLCShimadzuLC-20AD
Elektroniczny regulator gazuProporcja PowietrzeGP1
Uniwersytet

Bibliografia

  1. Neutze, R., Wouts, R., van der Spoel, D., Weckert, E., Hajdu, J. Potential for biomolecular imaging with femtosecond X-ray pulses. Nature. 406 (6797), 752-757 (2000).
  2. Chapman, H. N., et al. Femtosecond X-ray protein nanocrystallography. Nature. 470 (7332), 73-77 (2011).
  3. Barty, A., et al. Self-terminating diffraction gates femtosecond X-ray nanocrystallography measurements. Nature photonics. 6 (December), 35-40 (2012).
  4. Aquila, A., et al. Time-resolved protein nanocrystallography using an X-ray free-electron laser. Optics express. 20 (3), 2706-2716 (2012).
  5. Panneels, V., et al. Time-resolved structural studies with serial crystallography: A new light on retinal proteins. Structural Dynamics. 2 (4), 041718(2015).
  6. Tenboer, J., et al. Time-resolved serial crystallography captures high-resolution intermediates of photoactive yellow protein. Science. 346 (6214), 1242-1246 (2014).
  7. Pande, K., et al. Femtosecond structural dynamics drives the trans/cis isomerization in photoactive yellow protein. Science (New York, N.Y.). 352 (6286), 725-729 (2016).
  8. Barends, T. R. M., et al. Direct observation of ultrafast collective motions in CO myoglobin upon ligand dissociation. Science (New York, N.Y.). 350 (6259), 445-450 (2015).
  9. Nango, E., et al. A three-dimensional movie of structural changes in bacteriorhodopsin. Science. 354 (6319), 1552-1557 (2016).
  10. Nogly, P., et al. Retinal isomerization in bacteriorhodopsin captured by a femtosecond x-ray laser. Science. 0094 (June), eaat0094 (2018).
  11. Coquelle, N., et al. Chromophore twisting in the excited state of a photoswitchable fluorescent protein captured by time-resolved serial femtosecond crystallography. Nature Chemistry. 10 (1), 31-37 (2017).
  12. Kupitz, C., et al. Serial time-resolved crystallography of photosystem II using a femtosecond X-ray laser. Nature. , (2014).
  13. Suga, M., et al. Light-induced structural changes and the site of O=O bond formation in PSII caught by XFEL. Nature. 543 (7643), 131-135 (2017).
  14. Stagno, J. R., et al. Structures of riboswitch RNA reaction states by mix-and-inject XFEL serial crystallography. Nature. 541 (7636), 242-246 (2017).
  15. Wang, D., Weierstall, U., Pollack, L., Spence, J. C. H. Liquid Mixing Jet for XFEL Study of Chemical Kinetics. Journal of synchrotron radiation. , In submiss 1364-1366 (2014).
  16. Hekstra, D. R., White, K. I., Socolich, M. A., Henning, R. W., Šrajer, V., Ranganathan, R. Electric-field-stimulated protein mechanics. Nature. 540 (7633), 400-405 (2016).
  17. Liu, W., Ishchenko, A., Cherezov, V. Preparation of microcrystals in lipidic cubic phase for serial femtosecond crystallography. Nature. 9 (9), 2123-2134 (2014).
  18. Kupitz, C., Grotjohann, I., Conrad, C. E., Roy-Chowdhury, S., Fromme, R., Fromme, P. Microcrystallization techniques for serial femtosecond crystallography using photosystem II from Thermosynechococcus elongatus as a model system. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological sciences. 369 (1647), (2014).
  19. Falkner, J. C., et al. Generation of Size-Controlled, Submicrometer Protein Crystals. Chemistry of Materials. 17 (10), 2679-2686 (2005).
  20. Weierstall, U., et al. Lipidic cubic phase injector facilitates membrane protein serial femtosecond crystallography. Nature communications. 5, 3309(2014).
  21. Landau, E. M., Rosenbusch, J. P. Lipidic cubic phases: a novel concept for the crystallization of membrane proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (December), 14532-14535 (1996).
  22. Caffrey, M. A comprehensive review of the lipid cubic phase or in meso method for crystallizing membrane and soluble proteins and complexes. Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 71 (1), 3-18 (2015).
  23. Cherezov, V. Lipidic cubic phase technologies for membrane protein structural studies. Current Opinion in Structural Biology. 21 (4), 559-566 (2011).
  24. Conrad, C. E., et al. A novel inert crystal delivery medium for serial femtosecond crystallography. IUCrJ. 2 (4), 421-430 (2015).
  25. Sugahara, M., et al. Hydroxyethyl cellulose matrix applied to serial crystallography. Scientific Reports. 7 (1), 703(2017).
  26. Sugahara, M., et al. Grease matrix as a versatile carrier of proteins for serial crystallography. Nature Methods. 12 (1), 61-63 (2014).
  27. Sugahara, M., et al. Oil-free hyaluronic acid matrix for serial femtosecond crystallography. Scientific Reports. 6 (1), 24484(2016).
  28. Botha, S., et al. Room-temperature serial crystallography at synchrotron X-ray sources using slowly flowing free-standing high-viscosity microstreams. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (2), 387-397 (2015).
  29. Kovácsová, G., et al. Viscous hydrophilic injection matrices for serial crystallography. IUCrJ. 4 (4), 400-410 (2017).
  30. Martin-Garcia, J. M., et al. Serial millisecond crystallography of membrane and soluble protein microcrystals using synchrotron radiation. IUCrJ. 4 (4), 439-454 (2017).
  31. Fromme, R., et al. Serial femtosecond crystallography of soluble proteins in lipidic cubic phase. IUCrJ. 2, 545-551 (2015).
  32. Caffrey, M., Li, D., Howe, N., Shah, S. T. A. "Hit and run" serial femtosecond crystallography of a membrane kinase in the lipid cubic phase. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1647), 20130621(2014).
  33. Liu, W., et al. Serial femtosecond crystallography of G protein-coupled receptors. Science (New York, N.Y.). 342 (6165), 1521-1524 (2013).
  34. Zhang, H., et al. Structure of the Angiotensin Receptor Revealed by Serial Femtosecond Crystallography. Cell. 161 (4), 833-844 (2015).
  35. Fenalti, G., et al. Structural basis for bifunctional peptide recognition at human δ-opioid receptor. Nature Structural & Molecular Biology. (February), (2015).
  36. Kang, Y., et al. Crystal structure of rhodopsin bound to arrestin by femtosecond X-ray laser. Nature. 523 (7562), 561-567 (2015).
  37. Ishchenko, A., Cherezov, V., Liu, W. Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography. Journal of Visualized Experiments. 9 (115), 2123-2134 (2016).
  38. Batyuk, A., et al. Native phasing of x-ray free-electron laser data for a G protein-coupled receptor. Science Advances. 2 (9), e1600292(2016).
  39. Nakane, T., et al. Native sulfur/chlorine SAD phasing for serial femtosecond crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (12), 2519-2525 (2015).
  40. Nogly, P., et al. Lipidic cubic phase serial millisecond crystallography using synchrotron radiation. IUCrJ. 2 (2), 168-176 (2015).
  41. Weinert, T., et al. Serial millisecond crystallography for routine room-temperature structure determination at synchrotrons. Nature Communications. 8 (1), 542(2017).
  42. Tosha, T., et al. Capturing an initial intermediate during the P450nor enzymatic reaction using time-resolved XFEL crystallography and caged-substrate. Nature Communications. 8 (1), 1585(2017).
  43. Nogly, P., et al. Lipidic cubic phase injector is a viable crystal delivery system for time-resolved serial crystallography. Nature Communications. 7, 12314(2016).
  44. Abela, R., et al. Perspective: Opportunities for ultrafast science at SwissFEL. Structural Dynamics. 4 (6), 061602(2017).
  45. Marx, V. Structural biology: doors open at the European XFEL. Nature Methods. 14 (9), 843-846 (2017).
  46. Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples. Chemistry and Physics of Lipids. 95 (1), 11-21 (1998).
  47. Qiu, H., Caffrey, M. The phase diagram of the monoolein/water system: Metastability and equilibrium aspects. Biomaterials. 21 (3), 223-234 (2000).
  48. James, D. Injection Methods and Instrumentation for Serial X-ray Free Electron Laser Experiments. , (2015).
  49. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  50. Moffat, K. Femtosecond structural photobiology. Science (New York, N.Y.). 361 (6398), 127-128 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Dostarczanie mikrokryształówtrójdrożny łącznik strzykawkowylipidowa faza kubicznaanaliza za pomocą kamery wysokiej prędkościtestowanie stabilności ekstruzjimikrokryształy bakteriorodopsynywtryskiwanie próbek do XFELprzygotowanie próbek LCP
Poprawa ekstruzji mikrokryształów o wysokiej lepkości w celu czasowo-rozdzielczej seryjnej krystalografii femtosekundowej w laserach rentgenowskich
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.