Artykuł metodologiczny

Poprawa ekstruzji mikrokryształów o wysokiej lepkości w celu czasowo-rozdzielczej seryjnej krystalografii femtosekundowej w laserach rentgenowskich

DOI:

10.3791/59087

⸱

28 lutego 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Biology and Chemistry - Laboratory for Biomolecular Research, Paul Scherrer Institut, 2Photon Science Division - SwissFEL, Paul Scherrer Institut, 3RIKEN SPring-8 Center, 4Department of Cell Biology, Graduate School of Medicine, Kyoto University, 5Department of Biology, ETH Zürich

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Powodzenie eksperymentu z seryjną krystalografią femtosekundową z rozdzielczością czasową zależy od efektywnego dostarczania próbki. W tym miejscu opisujemy protokoły optymalizujące wytłaczanie mikrokryształów bakteriorodopsyny z wtryskiwacza do mikroekstruzji o wysokiej lepkości. Metodologia opiera się na homogenizacji próbki za pomocą nowatorskiego łącznika trójdrożnego i wizualizacji za pomocą szybkiej kamery.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wtryskiwacze mikroekstruzji o wysokiej lepkości znacznie zmniejszyły zużycie próbek w seryjnych femtosekundowych eksperymentach krystalograficznych (SFX) przy laserach rentgenowskich na swobodnych elektronach (XFEL). Seria eksperymentów z wykorzystaniem bakteriorodopsyny napędzanej światłem pompy protonowej dodatkowo ustaliła, że wstrzykiwacze te są preferowaną opcją dostarczania kryształów do czasowo-rozdzielczej seryjnej krystalografii femtosekundowej (TR-SFX) w celu rozwiązania zmian strukturalnych białek po fotoaktywacji. Aby uzyskać wiele migawek strukturalnych o wysokiej jakości, konieczne jest zebranie dużych ilości danych i zapewnienie odstępu kryształów między każdym impulsem lasera pompy. Tutaj szczegółowo opisujemy, w jaki sposób zoptymalizowaliśmy wytłaczanie mikrokryształów bakteriorodopsyny dla naszych ostatnich eksperymentów TR-SFX w koherentnym źródle światła Linac (LCLS). Celem metody jest optymalizacja ekstruzji w celu uzyskania stabilnego i ciągłego przepływu przy jednoczesnym zachowaniu wysokiej gęstości kryształów, aby zwiększyć szybkość, z jaką można zbierać dane w eksperymencie TR-SFX. Cel ten osiągamy poprzez przygotowanie lipidowej fazy sześciennej z jednorodnym rozkładem kryształów za pomocą nowatorskiego trójdrożnego urządzenia sprzęgającego strzykawkę, a następnie dostosowanie składu próbki na podstawie pomiarów stabilności ekstruzji wykonanych za pomocą szybkiej kamery. Metodologia może być dostosowana w celu optymalizacji przepływu innych mikrokryształów. Konfiguracja będzie dostępna dla użytkowników nowego szwajcarskiego lasera na swobodnych elektronach.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Seryjna krystalografia femtosekundowa (SFX) to technika biologii strukturalnej, która wykorzystuje unikalne właściwości rentgenowskich laserów na swobodnych elektronach (XFEL) do określania struktur temperatury pokojowej z tysięcy kryształów o rozmiarach mikrometrów, jednocześnie wyprzedzając większość uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem przez zasadę "dyfrakcji przed zniszczeniem"1,2,3.

W czasowym rozszerzeniu SFX (TR-SFX), impulsy femtosekundowe z XFEL są używane do badania zmian strukturalnych w białkach4,5. Białko będące przedmiotem zainteresowania jest aktywowane za pomocą lasera optycznego (lub innego wyzwalacza aktywności) tuż przed wystrzeleniem przez XFEL w konfiguracji pompa-sonda. Dzięki precyzyjnemu kontrolowaniu opóźnienia między impulsami pompy i sondy, białko docelowe może być wychwytywane w różnych stanach. Molekularne filmy przedstawiające zmiany strukturalne na przestrzeni jedenastu rzędów wielkości w czasie pokazują moc nowych źródeł XFEL do badania dynamiki kilku celów białkowych6,7,8,9,10,11,12,13. Zasadniczo, metoda ta łączy dynamiczne techniki spektroskopowe i statyczne techniki strukturalne w jedną, zapewniając wgląd w dynamikę białek w rozdzielczości bliskiej atomowej.

Proste systemy dla TR-SFX mogą zawierać endogenny wyzwalacz aktywacji za pomocą światłoczułego komponentu, takiego jak siatkówka, w bakteriorodopsyny (bR)9,10, chromofory w fotosystemie II12,13, fotoaktywne żółte białko (PYP)6,7 odwracalnie fotoprzełączalne białko fluorescencyjne11, lub fotolizowalny tlenek węgla w mioglobinie8. Ekscytujące warianty techniki, które wciąż są w fazie rozwoju, opierają się na schematach mieszania i wstrzykiwania14,15 do badania reakcji enzymatycznych lub pola elektrycznego używanego do wywoływania zmian strukturalnych16. Biorąc pod uwagę, że źródła XFEL są dostępne dopiero od kilku lat i ekstrapolują dotychczasowe sukcesy na przyszłość, metoda ta wykazuje potencjał jako prawdziwy przełom w odniesieniu do naszego zrozumienia funkcjonowania białek.

Ponieważ próbki biologiczne są niszczone przez jednorazowe wystawienie na działanie impulsu XFEL o dużej mocy, konieczne było nowe podejście do krystalografii białek. Wśród tych procedur należało opracować zdolność do hodowania dużych ilości jednorodnych mikrokryształów17,18,19. Aby umożliwić zbieranie danych w XFEL, kryształy te muszą zostać dostarczone, wyrzucone, a następnie odnowione dla każdego impulsu XFEL. Biorąc pod uwagę, że XFEL wystrzeliwują użyteczne impulsy z częstotliwością 10-120 Hz, dostarczanie próbki musi być szybkie, stabilne i niezawodne, przy jednoczesnym zachowaniu kryształów w stanie nienaruszonym i ograniczeniu zużycia. Jednym z najbardziej udanych rozwiązań jest wtryskiwacz do mikroekstruzji o wysokiej lepkości, który dostarcza ciągłą kolumnę krystalicznej fazy lipidowej sześciennej (LCP) w temperaturze pokojowej przez pulsacyjną wiązkę promieniowania rentgenowskiego20. Losowo zorientowane kryształy, osadzone w strumieniu LCP, które są przechwytywane przez impulsy XFEL, rozpraszają promieniowanie rentgenowskie na detektor, w którym rejestrowany jest wzór dyfrakcyjny. LCP był naturalnym wyborem dla pożywki do dostarczania próbek, ponieważ jest często używany jako pożywka wzrostowa dla kryształów białek błonowych17,21,22,23, jeszcze inne nośniki o wysokiej lepkości24,25,26,27,28,29,30 i rozpuszczalne białka31 zostały również użyte w wtryskiwaczu. SFX z wtryskiwaczem o wysokiej lepkości odniósł sukces podczas określania struktury białek błonowych13,32 z uwzględnieniem receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCRs)33,34,35,36,37, z jakością danych wystarczającą do natywnego fazowania38,39 przy jednoczesnej efektywności zarówno czasowej, jak i próbki. Obecnie wtryskiwacze te są używane bardziej rutynowo do pomiarów temperatury pokojowej w źródłach synchrotronowych28,30,40,41, a także podczas bardziej wymagających technicznie eksperymentów TR-SFX w XFELs9,10,13,42.

Porównywalne eksperymenty TR-SFX zostały przeprowadzone przy użyciu innych typów wtryskiwaczy, takich jak dostarczanie fazy ciekłej w dyszy skoncentrowanej na przepływie6,7,12, jednak ta metoda wymaga ilości białka, które nie są dostępne dla wielu biologicznie interesujących celów. W celu określenia struktur statycznych za pomocą wytłaczania lepkiego zgłoszono średnie zużycie 0,072 mg białka na 10 000 indeksowanych wzorów dyfrakcyjnych w porównaniu do 9,35 mg dla dysz strumieniowych z cieczą (tj. około 130 razy większa wydajność próbki)20. Wykazano, że wtryskiwacz o wysokiej lepkości jest realnym urządzeniem do dostarczania próbek dla TR-SFX, poświęcając tylko część tej wydajności próbki43. Na przykład w Nogly et al. (2018)10 zużycie próbki wynosiło około 1,5 mg na 10 000 indeksowanych wzorców, co wypada korzystnie w porównaniu z podobnymi eksperymentami TR-SFX z użyciem PYP, w których średnie zużycie próbki było znacznie wyższe i zawierało 74 mg białka na 10 000 indeksowanych wzorców6. Wtryskiwacze o wysokiej lepkości mają zatem wyraźne zalety, gdy ilość dostępnego białka jest ograniczona lub gdy kryształy są hodowane bezpośrednio w LCP.

Dla TR-SFX korzystającego z wtryskiwaczy o wysokiej lepkości w celu uzyskania najbardziej wiarygodnych danych należy rozwiązać kilka problemów technicznych: prędkość przepływu musi pozostać powyżej minimalnej wartości krytycznej; współczynnik trafień powinien być utrzymany na poziomie, który nie powoduje spowolnienia zbierania danych (np. więcej niż 5%); a próbka musi być dostarczona bez nadmiernych zakłóceń. Idealnie byłoby, gdyby warunki te zostały spełnione na długo przed zaplanowanym eksperymentem TR-SFX, aby jak najefektywniej wykorzystać dostępny czas XFEL. Zasadniczo spowolnienie strumienia LCP może pozwolić na sondowanie kryształów, które zostały aktywowane więcej niż jednym optycznym impulsem laserowym i skutkują mieszanymi stanami aktywnymi, lub sondowanie pompowanego materiału, gdy spodziewany jest materiał pompowany w wiązce. Dodatkową korzyścią płynącą ze wstępnego testowania wtrysku jest to, że przestoje podczas zbierania danych w XFEL są zminimalizowane, ponieważ czas przeznaczony na wymianę zatkanych dysz, wymianę próbek niewytłaczanych i inne zadania konserwacyjne są zredukowane.

Tutaj prezentujemy metodę optymalizacji dostarczania próbek do zbierania danych TR-SFX za pomocą wtryskiwacza do mikroekstruzji o wysokiej lepkości. Dla uproszczenia, opisane metody nie opierają się na dostępie do źródła promieniowania rentgenowskiego, chociaż prace na synchrotronowej linii badawczej29 dostarczyłyby dalszych informacji na temat oczekiwanych wskaźników trafień i dyfrakcji kryształów. Nasze protokoły zostały opracowane w celu optymalizacji eksperymentów mających na celu uchwycenie izomeryzacji siatkówki w bakteriorodopsyny pompy protonowej10 i są przeprowadzane w dwóch fazach, zaczynając od przygotowania próbek kryształów do wytłaczania, a następnie monitorowania ekstruzji za pomocą szybkiej konfiguracji kamery. W pierwszej fazie krystaliczny LCP miesza się z dodatkowym LCP, lipidami o niskiej temperaturze przejścia lub innymi dodatkami, aby zapewnić, że końcowa mieszanina nadaje się do dostarczenia do środowiska próbki bez zatykania lub spowalniania. Nowy trójdrożny łącznik strzykawki został opracowany w celu poprawy wydajności mieszania i jednorodności próbki. Druga faza składa się z testu wytłaczania zarejestrowanego przez szybką kamerę w celu bezpośredniego pomiaru stabilności prędkości wytłaczania. Po analizie danych wideo można wprowadzić poprawki do protokołu przygotowania próbki w celu poprawy wyników eksperymentu. Procedury te mogą być dostosowane do przygotowania innych białek do zbierania danych TR-SFX, przy minimalnych modyfikacjach, i przyczynią się do efektywnego wykorzystania ograniczonego czasu wiązki XFEL. Dzięki nowym obiektom XFEL, które dopiero rozpoczynają swoją działalność44,45 i przeniesieniu metod zbierania danych szeregowych opartych na wtryskiwaczach do synchrotronów28,30,40,41, najbliższe lata z pewnością przyniosą nowe, ekscytujące spojrzenie na dynamikę strukturalną coraz szerszego zakresu celów białkowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie próbki kryształu białka

  1. Na około 30 minut przed wstrzyknięciem próbki należy załadować 50 μl LCP na bazie krystalicznej monooleiny do strzykawki o pojemności 100 μl.
  2. Do wstrzykiwań pod ciśnieniem atmosferycznym: Umieścić 10 μl ciekłej parafiny na tylnej części drugiej strzykawki. Trzymając strzykawkę pionowo, usunąć pęcherzyki powietrza ze strzykawki.
    1. Do wstrzykiwania do środowiska próżniowego: Załadować 5 μl MAG 7,9 i 5 μl ciekłej parafiny do tylnej części drugiej strzykawki. Trzymając strzykawkę pionowo, usunąć pęcherzyki powietrza ze strzykawki.
  3. Podłączyć strzykawkę z parafiną/MAG 7,9 do standardowej złączki strzykawkowej, usunąć powietrze ze złączki, delikatnie naciskając tłok, aż na końcu igły łącznika będzie widoczna niewielka objętość (<1 μl) parafiny/lipidu.
  4. Podłączyć strzykawkę z próbką do łącznika strzykawki, uważając, aby nie wprowadzić powietrza do próbki. Wymieszać z lipidem/parafiną, wielokrotnie przepuszczając materiał próbki przez łącznik.
  5. Załaduj 20 μl wstępnie zmieszanego LCP (27% PEG, 100 mM Sorensen pH 5,6 + MO) do kolejnej strzykawki o pojemności 100 μl. W razie potrzeby usuń pęcherzyki powietrza.
  6. Wyjąć pustą strzykawkę ze złączki i przymocować wstępnie zmieszany LCP do strzykawki zawierającej kryształ za pomocą standardowej złączki strzykawki. Przepuścić próbkę przez łącznik 100 razy.
    UWAGA: Mieszanie próbki może nieznacznie podgrzać próbkę46. Mieszanie powinno odbywać się z powolną szybkością, tak aby temperatura próbki mogła być utrzymywana na względnie stałym poziomie.
  7. Sprawdzić próbkę pod kątem przezroczystości w stosunku do źródła światła. Jeśli utworzył się wyraźny jednorodny LCP, przejdź do kroku 1.9.
  8. Aby wprowadzić próbkę w fazę sześcienną, dodać 3 μl monooleiny i wymieszać 50 razy (jak opisano powyżej). Powtarzaj tę procedurę tylko do momentu, gdy utworzy się przezroczysta faza, aby uniknąć nadmiaru monooleiny.
    UWAGA: Tworzenie LCP jest zależne od temperatury47, a najlepsze wyniki osiąga się nieco powyżej 20 °C. Ilość potrzebnej dodatkowej monooleiny będzie zależeć od objętości pozostałego roztworu strącającego przeniesionego z krystalizacji.
  9. Jako wstępny test sztywności próbki (zgodnie z oczekiwaniami w fazie LCP) i zdolności do wytłaczania, należy odłączyć pustą strzykawkę od łącznika strzykawki i trzymając strzykawkę pionowo, wycisnąć niewielką ilość próbki (<2 μl) przez łącznik. Jeśli wytłaczana próbka tworzy pionowy cylinder, oznacza to, że próbka jest gotowa do badania wytłaczania.
  10. Dostosuj całkowitą objętość próbki do 100 μl, dodając więcej wstępnie zmieszanego LCP (jak w kroku 1.5).
  11. Podłączyć strzykawkę z próbką i dwie puste strzykawki do trójdrożnego łącznika strzykawki (usuwając powietrze ze złączki jak poprzednio). Wymieszać co najmniej 50 razy (lub do uzyskania jednorodności), przepuszczając połowę próbki do drugiej strzykawki, a następnie jednocześnie wciskając obie połówki próbki do trzeciej strzykawki.
  12. Umieścić strzykawkę zawierającą zmieszaną próbkę pod mikroskopem stereoskopowym, aby sprawdzić jednorodny rozkład kryształów.

2. Testowanie wytłaczania próbki za pomocą szybkiej kamery

  1. Określanie parametrów eksperymentalnych.
    1. Wybierz rozmiar dyszy do testu.
      UWAGA: Rozmiary dysz to zazwyczaj średnica wewnętrzna (ID) 50 lub 75 μm, ale można rozważyć dowolny rozmiar od około 30 do 100 μm ID. Selekcja opiera się na równowadze między średnim czasem zatykania, rozpraszaniem tła, zużyciem próbki i współczynnikiem trafień.
    2. Oblicz optymalną prędkość przepływu na podstawie eksperymentalnego rozmiaru plamki lasera (średnica 1/e 2) oraz schematu zbierania danych (np. przeplatane światło i ciemność), który będzie używany w XFEL.
    3. Oblicz żądane natężenie przepływu (figure-protocol-1) próbki od optymalnej prędkości przepływu (figure-protocol-2) i wybranej średnicy dyszy (figure-protocol-3):
      figure-protocol-4
      Określ natężenie przepływu (figure-protocol-5), które należy wprowadzić do pompy HPLC w oparciu o współczynnik wzmocnienia (figure-protocol-6) wtryskiwacza.
      figure-protocol-7
      Oblicz maksymalne ciśnienie (figure-protocol-8) na podstawie ciśnienia znamionowego złączek dysz (figure-protocol-9) i współczynnika wzmocnienia wtryskiwacza (figure-protocol-10):
      figure-protocol-11
  2. Konfiguracja wtryskiwacza do wytłaczania o wysokiej lepkości do użytku w trybie offline, jak pokazano na rysunku 1.
    UWAGA: Wtryskiwacz działa za pomocą wytłaczania hydraulicznego zasilanego pompą HPLC i wykorzystuje współpłynącą osłonę helu gazowego sterowaną przez regulator gazu. Konfiguracja pompy i regulatora nie jest omówiona w tym protokole. Zobacz rozdział czwarty w James (2015)48, aby uzyskać szczegółową instrukcję.
    1. Oczyść pompę i wszystkie przewody wodne, aby upewnić się, że natężenie przepływu jest dokładne. Oczyść stopień hydrauliczny wtryskiwacza.
    2. Zamontuj wtryskiwacz (lub kamerę) na trzyosiowym stoliku, aby ułatwić kadrowanie i ustawianie ostrości w przypadku szybkich filmów. Wokół punktu wstrzyknięcia należy pozostawić miejsce na soczewkę obiektywu, oświetlenie, ekran odblaskowy i małą zlewkę, aby złapać zużytą próbkę.
    3. Skonstruuj "atrapę dyszy" (pusty zbiornik z dołączoną dyszą) i zainstaluj ją na wtryskiwaczu, aby ułatwić ustawianie, ustawianie ostrości i oświetlenie.
    4. Zamontuj szybką kamerę tak, aby końcówka dyszy znajdowała się w pobliżu punktu ogniskowego obiektywu.
    5. Umieść odblaskowy ekran za wtryskiwaczem i wyreguluj podświetlenie, aby oświetlić dyszę z przodu.
    6. Włącz aparat i połącz się z nim za pomocą dostarczonego oprogramowania. Po uruchomieniu wideo na żywo w celu uzyskania wizualnej informacji zwrotnej umieść końcówkę dyszy na środku kadru i ustaw ją w ostrości za pomocą stolika trzyosiowego.
    7. Dostosuj oświetlenie, aż dysza będzie wyraźnie widoczna, a tło będzie równomiernie oświetlone.
  3. Konfigurowanie kamery do nagrywania filmów poklatkowych z dużą szybkością.
    1. Ustaw liczbę klatek na sekundę na 1000 kl./s. Ustaw rozdzielczość na 512 x 512 pikseli.
    2. Gdy czas naświetlania jest teraz ustawiony przez liczbę klatek na sekundę, dostosuj poziom oświetlenia, aż dysza będzie widoczna (tj. nie będzie niedoświetlona lub prześwietlona). Zmień położenie końcówki dyszy tak, aby była wyśrodkowana od lewej do prawej i znajdowała się w górnej jednej trzeciej ramy.
    3. Uruchom dowolne operacje korekcji tła lub balansu bieli.
    4. Ustaw kamerę w trybie poklatkowym. Ustaw interwał na 30 s i powtórzenia na 40 razy, ustaw tryb wyzwalania na losowy (lub losowy reset) i wprowadź liczbę klatek do nagrania na 1000.
  4. Załadować do zbiornika 20 μl badanej próbki i założyć dyszę kapilarną.
  5. Podłącz napełniony zbiornik do wtryskiwacza. Podłącz przewód gazowy do portu na dyszy i rozpocznij przepływ gazu.
  6. Ręcznie przesunąć tłok, otwierając zawór w linii i naciskając strzykawkę. Zamknij zawór, gdy tłok zetknie się na stałe z próbką w zbiorniku.
  7. Zaprogramuj pompę z obliczonym natężeniem przepływu i ustaw maksymalne ciśnienie na obliczoną wartość (patrz krok 2.1.3).
  8. Jednocześnie uruchom pompę i nagrywanie z kamery.
  9. Gdy rozpocznie się wytłaczanie, dostosuj ciśnienie gazu, aby zwiększyć stabilność. Zwiększ ciśnienie gazu, jeśli płyn tworzy kroplę na końcu dyszy zamiast na kolumnie. Zmniejsz ciśnienie, jeśli wytłaczanie jest przerwane z powodu nadmiernego ścinania od przepływu gazu lub szybko oscyluje (biczowanie).
  10. Monitoruj wytłaczanie (zwykle wystarczy 10 minut, aby rozpoznać jednorodny stan przepływu), a gdy ciśnienie pompy gwałtownie wzrośnie w pobliżu oczekiwanego czasu zakończenia, przerwij nagrywanie, wyłącz pompę i odpowietrz ciśnienie w układzie, otwierając zawór nadmiarowy.
  11. Analiza plików wideo
    UWAGA: Wytłaczanie próbki, które jest wyraźnie nieodpowiednie, nie wymaga szczegółowej analizy. Jednak nadal przydatne jest zidentyfikowanie trybu awarii, aby próbka mogła zostać zoptymalizowana.
    1. Otwórz plik wideo z oprogramowaniem do analizy (np. Fiji49) i skalibruj narzędzia pomiarowe.
    2. Skalibruj pomiary, wybierając linię o znanej długości na obrazie wideo za pomocą narzędzia do wyboru linii. Otwórz okno Ustaw skalę za pomocą punktu menu Analizuj | Ustaw Skala i wprowadź znaną odległość oraz jednostki miary.
      UWAGA: Znana średnica dyszy zapewnia odpowiednią długość kalibracji dla tych pomiarów.
    3. Znajdź klatkę w filmie, w której widoczna jest możliwa do śledzenia cecha (np. kryształ) w wyciągnięciu. Zapisz numer klatki.
    4. Przesuń wideo do klatki, w której ten sam obiekt jest widoczny, ale przesunął się z poprzedniego kroku. Zapisz numer klatki.
    5. Korzystając z narzędzia do pomiaru w linii prostej, zmierz odległość od początku i punktu końcowego elementu za pomocą opcji Analizuj | Środek.
      UWAGA: Im dłuższa odległość, którą można śledzić, tym mniej błędów w pomiarze wpłynie na obliczenia
    6. Oblicz prędkość strumienia na podstawie zmierzonej odległości i czasu, który upłynął (liczba klatek, które upłynęły, podzielona przez liczbę klatek na sekundę).
    7. Powtórz kroki 2.11.3–2.11.6 kilka razy dla każdego segmentu filmu.
    8. Wykreśl serię danych, jak pokazano na rysunku 2.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Idealnym materiałem wyjściowym dla opisanych tutaj procedur (Rysunek 3) są duże gęstości mikrokryształów zawartych w lepkim nośniku dla wtryskiwacza. Procedura wymaga około 50 μl krystalicznego nośnika na każdy preparat. Można je hodować bezpośrednio w LCP, tak jak w przypadku bR9,10 użytego tutaj, jako przykład (Rysunek 4), lub przygotowane przy użyciu kryształów wyhodowanych w ko...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metoda TR-SFX z wstrzykiwaczem do wytłaczania lepkiego okazała się skuteczną techniką do badań dynamiki strukturalnej bakteriorodopsyny 9,10 i fotosystemu II13, a obecnie wydaje się gotowa do badania białek napędzających inne procesy fotobiologiczne, takie jak transport jonów sterowany światłem lub percepcja sensoryczna 5,50. Opisane powyżej protokoły zostały zaprojektowane w celu ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Gebhardowi Schertlerowi, Rafaelowi Abeli i Chrisowi Milne'owi za poparcie stosowania wtryskiwaczy o wysokiej lepkości w PSI. Richard Neutze i jego zespół są znani z dyskusji na temat krystalografii czasowo-rozdzielczej i dostarczania próbek przy użyciu wtryskiwaczy o wysokiej lepkości. Za wsparcie finansowe dziękujemy Szwajcarskiej Narodowej Fundacji Nauki za granty 31003A_141235, 31003A_159558 (dla J.S.) i PZ00P3_174169 (dla P.N.). Projekt ten otrzymał dofinansowanie z programu Unii Europejskiej w zakresie badań naukowych i innowacji Horyzont 2020 w ramach umowy o udzielenie grantu nr 701646 Marie-Skłodowska-Curie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sprzęgło strzykawki Mosquito LCPSklep laboratoryjny TTP3072-01050
Strzykawka Hamilton 1710 RNR, 100 i mikro; lHamiltonHA-81065
Strzykawka Hamilton 1750 RNR, 500 i mikro; lHamiltonHA-81265
MonooleinaNu-Chek Prep, Inc.M-239
7.9 MAGAvanti Polar Lipids Inc.850534O
50% w/v PEG 2000Wymiary molekularneMD2-250-7
Parafina (ciecz)Sigma-Aldrich1.07162
Szybka kameraPhotronPhotron Mini AX
Obiektyw o dużym powiększeniuNavitar12X Zoom Lens System
trzyosiowyThorLabsPT3/M
Światłowódlekki ThorlabsOSL2
Stopione włókno krzemionkoweMolex/PolymicroTSP-505375
Lite tulejka dotykowaIDEXLT-100
ASU wtryskiwacz o wysokiej lepkościStanowy ArizonyDo kupienia w pompie Uwe Weierstall (weier@asu.edu)
HPLCShimadzuLC-20AD
Elektroniczny regulator gazuProporcja PowietrzeGP1
Uniwersytet

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Neutze, R., Wouts, R., van der Spoel, D., Weckert, E., Hajdu, J. Potential for biomolecular imaging with femtosecond X-ray pulses. Nature. 406 (6797), 752-757 (2000).
  2. Chapman, H. N., et al. Femtosecond X-ray protein nanocrystallography. Nature. 470 (7332), 73-77 (2011).
  3. Barty, A., et al. Self-terminating diffraction gates femtosecond X-ray nanocrystallography measurements. Nature photonics. 6 (December), 35-40 (2012).
  4. Aquila, A., et al. Time-resolved protein nanocrystallography using an X-ray free-electron laser. Optics express. 20 (3), 2706-2716 (2012).
  5. Panneels, V., et al. Time-resolved structural studies with serial crystallography: A new light on retinal proteins. Structural Dynamics. 2 (4), 041718(2015).
  6. Tenboer, J., et al. Time-resolved serial crystallography captures high-resolution intermediates of photoactive yellow protein. Science. 346 (6214), 1242-1246 (2014).
  7. Pande, K., et al. Femtosecond structural dynamics drives the trans/cis isomerization in photoactive yellow protein. Science (New York, N.Y.). 352 (6286), 725-729 (2016).
  8. Barends, T. R. M., et al. Direct observation of ultrafast collective motions in CO myoglobin upon ligand dissociation. Science (New York, N.Y.). 350 (6259), 445-450 (2015).
  9. Nango, E., et al. A three-dimensional movie of structural changes in bacteriorhodopsin. Science. 354 (6319), 1552-1557 (2016).
  10. Nogly, P., et al. Retinal isomerization in bacteriorhodopsin captured by a femtosecond x-ray laser. Science. 0094 (June), eaat0094 (2018).
  11. Coquelle, N., et al. Chromophore twisting in the excited state of a photoswitchable fluorescent protein captured by time-resolved serial femtosecond crystallography. Nature Chemistry. 10 (1), 31-37 (2017).
  12. Kupitz, C., et al. Serial time-resolved crystallography of photosystem II using a femtosecond X-ray laser. Nature. , (2014).
  13. Suga, M., et al. Light-induced structural changes and the site of O=O bond formation in PSII caught by XFEL. Nature. 543 (7643), 131-135 (2017).
  14. Stagno, J. R., et al. Structures of riboswitch RNA reaction states by mix-and-inject XFEL serial crystallography. Nature. 541 (7636), 242-246 (2017).
  15. Wang, D., Weierstall, U., Pollack, L., Spence, J. C. H. Liquid Mixing Jet for XFEL Study of Chemical Kinetics. Journal of synchrotron radiation. , In submiss 1364-1366 (2014).
  16. Hekstra, D. R., White, K. I., Socolich, M. A., Henning, R. W., Šrajer, V., Ranganathan, R. Electric-field-stimulated protein mechanics. Nature. 540 (7633), 400-405 (2016).
  17. Liu, W., Ishchenko, A., Cherezov, V. Preparation of microcrystals in lipidic cubic phase for serial femtosecond crystallography. Nature. 9 (9), 2123-2134 (2014).
  18. Kupitz, C., Grotjohann, I., Conrad, C. E., Roy-Chowdhury, S., Fromme, R., Fromme, P. Microcrystallization techniques for serial femtosecond crystallography using photosystem II from Thermosynechococcus elongatus as a model system. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological sciences. 369 (1647), (2014).
  19. Falkner, J. C., et al. Generation of Size-Controlled, Submicrometer Protein Crystals. Chemistry of Materials. 17 (10), 2679-2686 (2005).
  20. Weierstall, U., et al. Lipidic cubic phase injector facilitates membrane protein serial femtosecond crystallography. Nature communications. 5, 3309(2014).
  21. Landau, E. M., Rosenbusch, J. P. Lipidic cubic phases: a novel concept for the crystallization of membrane proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (December), 14532-14535 (1996).
  22. Caffrey, M. A comprehensive review of the lipid cubic phase or in meso method for crystallizing membrane and soluble proteins and complexes. Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 71 (1), 3-18 (2015).
  23. Cherezov, V. Lipidic cubic phase technologies for membrane protein structural studies. Current Opinion in Structural Biology. 21 (4), 559-566 (2011).
  24. Conrad, C. E., et al. A novel inert crystal delivery medium for serial femtosecond crystallography. IUCrJ. 2 (4), 421-430 (2015).
  25. Sugahara, M., et al. Hydroxyethyl cellulose matrix applied to serial crystallography. Scientific Reports. 7 (1), 703(2017).
  26. Sugahara, M., et al. Grease matrix as a versatile carrier of proteins for serial crystallography. Nature Methods. 12 (1), 61-63 (2014).
  27. Sugahara, M., et al. Oil-free hyaluronic acid matrix for serial femtosecond crystallography. Scientific Reports. 6 (1), 24484(2016).
  28. Botha, S., et al. Room-temperature serial crystallography at synchrotron X-ray sources using slowly flowing free-standing high-viscosity microstreams. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (2), 387-397 (2015).
  29. Kovácsová, G., et al. Viscous hydrophilic injection matrices for serial crystallography. IUCrJ. 4 (4), 400-410 (2017).
  30. Martin-Garcia, J. M., et al. Serial millisecond crystallography of membrane and soluble protein microcrystals using synchrotron radiation. IUCrJ. 4 (4), 439-454 (2017).
  31. Fromme, R., et al. Serial femtosecond crystallography of soluble proteins in lipidic cubic phase. IUCrJ. 2, 545-551 (2015).
  32. Caffrey, M., Li, D., Howe, N., Shah, S. T. A. "Hit and run" serial femtosecond crystallography of a membrane kinase in the lipid cubic phase. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1647), 20130621(2014).
  33. Liu, W., et al. Serial femtosecond crystallography of G protein-coupled receptors. Science (New York, N.Y.). 342 (6165), 1521-1524 (2013).
  34. Zhang, H., et al. Structure of the Angiotensin Receptor Revealed by Serial Femtosecond Crystallography. Cell. 161 (4), 833-844 (2015).
  35. Fenalti, G., et al. Structural basis for bifunctional peptide recognition at human δ-opioid receptor. Nature Structural & Molecular Biology. (February), (2015).
  36. Kang, Y., et al. Crystal structure of rhodopsin bound to arrestin by femtosecond X-ray laser. Nature. 523 (7562), 561-567 (2015).
  37. Ishchenko, A., Cherezov, V., Liu, W. Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography. Journal of Visualized Experiments. 9 (115), 2123-2134 (2016).
  38. Batyuk, A., et al. Native phasing of x-ray free-electron laser data for a G protein-coupled receptor. Science Advances. 2 (9), e1600292(2016).
  39. Nakane, T., et al. Native sulfur/chlorine SAD phasing for serial femtosecond crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (12), 2519-2525 (2015).
  40. Nogly, P., et al. Lipidic cubic phase serial millisecond crystallography using synchrotron radiation. IUCrJ. 2 (2), 168-176 (2015).
  41. Weinert, T., et al. Serial millisecond crystallography for routine room-temperature structure determination at synchrotrons. Nature Communications. 8 (1), 542(2017).
  42. Tosha, T., et al. Capturing an initial intermediate during the P450nor enzymatic reaction using time-resolved XFEL crystallography and caged-substrate. Nature Communications. 8 (1), 1585(2017).
  43. Nogly, P., et al. Lipidic cubic phase injector is a viable crystal delivery system for time-resolved serial crystallography. Nature Communications. 7, 12314(2016).
  44. Abela, R., et al. Perspective: Opportunities for ultrafast science at SwissFEL. Structural Dynamics. 4 (6), 061602(2017).
  45. Marx, V. Structural biology: doors open at the European XFEL. Nature Methods. 14 (9), 843-846 (2017).
  46. Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples. Chemistry and Physics of Lipids. 95 (1), 11-21 (1998).
  47. Qiu, H., Caffrey, M. The phase diagram of the monoolein/water system: Metastability and equilibrium aspects. Biomaterials. 21 (3), 223-234 (2000).
  48. James, D. Injection Methods and Instrumentation for Serial X-ray Free Electron Laser Experiments. , (2015).
  49. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  50. Moffat, K. Femtosecond structural photobiology. Science (New York, N.Y.). 361 (6398), 127-128 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Time resolved Serial Femtosecond CrystallographyHigh Viscosity ExtrusionMicrocrystal DeliveryThree way Syringe CouplerLipidic Cubic PhaseHigh speed Camera AnalysisExtrusion Stability TestingBacteriorhodopsin MicrocrystalsXFEL Sample InjectionLCP Sample Preparation

Powiązane artykuły