Wpływ przeciwciała anty-c-fms na tworzenie i proliferację prekursora osteoklastów in vitro

Podsumowanie

Ten protokół obejmuje preparację mysich kości długich i izolację szpiku kostnego, w celu wytworzenia makrofagów szpiku kostnego i wytworzenia osteoklastów za pomocą czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF) i aktywatora receptora liganda czynnika jądrowego Kappa-B (RANKL) lub czynnika martwicy nowotworu alfa (TNF-α) i ich zatrzymanie przez przeciwciało anty-c-fms, receptor M-CSF.

Streszczenie

Przebudowa kości jest złożonym procesem i obejmuje okresy depozycji i resorpcji. Resorpcja kości to proces, w którym kość jest rozkładana przez osteoklasty w odpowiedzi na różne bodźce. Prekursory osteoklastów różnicują się w wielojądrzaste osteoklasty w odpowiedzi na czynnik stymulujący tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF) i aktywator receptora liganda czynnika jądrowego Kappa-B (RANKL). W warunkach patologicznych profil cytokin jest inny i obejmuje mieszaninę cytokin zapalnych. Czynnik martwicy nowotworów alfa (TNF-α) jest jedną z najważniejszych cytokin, ponieważ występuje w dużych ilościach w obszarach związanych z zapalną osteolizą. Celem tego protokołu jest zapewnienie metody, za pomocą której mysi szpik kostny jest izolowany w celu wytworzenia osteoklastów poprzez indukcję za pomocą M-CSF i RANKL lub TNF-α które zostaną następnie zahamowane przez zwiększenie dawek przeciwciała anty-c-fms, receptora dla M-CSF. Eksperyment ten podkreśla wartość terapeutyczną przeciwciała anty-c-fms w chorobach zapalnej resorpcji kości.

Wprowadzenie

Osteoklasty są wysoce wyspecjalizowanymi komórkami i odróżniają się od hematopoetycznych komórek macierzystych poprzez fuzję wielu prekursorów osteoklastów. Są one niezbędne do zdrowej przebudowy kości i przyczyniają się do patologicznej resorpcji kości związanej z zapalnymi chorobami osteolitycznymi, takimi jak reumatoidalne zapalenie stawów i choroby przyzębia¹.

Osteoklastogeneza i funkcja osteoklastów są zależne od dwóch kluczowych czynników; czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF) i aktywatora receptora ligandu czynnika jądrowego kappa-B (RANKL). Zarówno M-CSF, jak i RANKL są ważne dla różnicowania osteoklastów². Innym czynnikiem, który, jak wykazano, indukuje tworzenie osteoklastów z makrofagów szpiku kostnego in vitro, jest czynnik martwicy nowotworów alfa (TNF-α)^3,4,5. Wykazano, że tworzenie osteoklastów za pośrednictwem TNF-α ma kluczowe znaczenie dla osteolizy w destrukcyjnych chorobach kości, takich jak reumatoidalne zapalenie stawów⁶, choroby przyzębia⁷ i osteoporoza pomenopauzalna⁸.

C-fms jest receptorem błonowym M-CSF i pośredniczy w jego działaniu. Rola c-fms jest dobrze udokumentowana w literaturze, ponieważ wykazano, że podanie przeciwciała przeciwko c-fms (anti-c-fms anti-fms) całkowicie zatrzymało osteoklastogenezę w modelu zapalenia stawów, a także w nadżerkach kości wywołanych przez TNF-α, podczas gdy osteoklastogeneza oddalona od stawu objętego stanem zapalnym była nadal solidna⁹. Podanie przeciwciała anty-c-fms hamowało tworzenie osteoklastów i resorpcję kości indukowaną przez lipopolisacharyd (LPS) u myszy calvariae¹⁰, a także w indukowanym przez LPS zapaleniu przyzębia model¹¹. Co więcej, przeciwciało anty-c-fms hamowało resorpcję korzeni wywołaną naprężeniami mechanicznymi podczas ortodontycznego ruchu zębów¹², a także ortodontyczny ruch zębów i resorpcję kości związane z ortodontycznym ruchem zęba¹³.

M-CSF ma inne funkcje, które są niezbędne dla odpowiedzi immunologicznej gospodarza. Brak M-CSF u myszy op/op z bakteryjnym zapaleniem płuc prowadzi do wzrostu obciążenia bakteryjnego i rozprzestrzeniania się bakterii do wątroby z martwicą wątroby¹⁴. Dlatego M-CSF jest ważny dla odpowiedzi immunologicznej w ochronie przed infekcją.

To badanie pokazuje wpływ przeciwciała anty-c-fms na M-CSF i RANKL lub TNF-α indukowane tworzenie osteoklastów in vitro oraz indukowaną przez M-CSF proliferację prekursorów osteoklastów. Protokół ten demonstruje izolację mysich komórek szpiku kostnego z kości długich oraz etapy generowania makrofagów szpiku kostnego (BMM), które są uważane za prekursory osteoklastów, oraz indukowania różnicowania BMM w wielojądrzaste osteoklasty za pomocą dwóch metod; RANKL lub TNF-α. W protokole porównano również zatrzymanie osteoklastogenezy w obu metodach przy użyciu przeciwciała anty-c-fms.

Proces, w którym szpik kostny jest pobierany, a następnie wykorzystywany do generowania prekursorów osteoklastów, jest niezawodny w produkcji dużych ilości czystych kultur osteoklastów, które mogą być używane w wielu dalszych zastosowaniach, takich jak testowanie leków. Zastosowanie RANKL lub TNF-α do indukcji osteoklastogenezy w tym protokole odróżnia osteoklastogenezę jako proces fizjologiczny (RANKL) od osteoklastogenezy jako procesu patologicznego (TNF-α), co z kolei zapewnia dwie alternatywne procedury do podjęcia decyzji, która z nich jest lepsza pod względem odczynników, które mają być stosowane w dalszych zastosowaniach. Protokół ten zapewnia również metodę, za pomocą której możemy określić odpowiednie stężenie przeciwciała anty-c-fms, które można bezpiecznie wykorzystać do późniejszych badań związanych z resorpcją kości i chorobami osteolitycznymi.

Protokół

Wszystkie procedury i opieka nad zwierzętami były wykonywane zgodnie z zasadami i przepisami Uniwersytetu Tohoku.

1. Rozwarstwienie i postępowanie z kończynami tylnymi myszy

1. Przed sekcją napełnij płytkę około 50 ml α-MEM w zależności od wielkości pojemnika i umieść go na lodzie. Będzie on służył jako pojemnik zbiorczy do czasu zakończenia sekcji wszystkich kości. Do tego i kolejnych eksperymentów należy użyć α-MEM zawierającego 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 100 j.m./ml penicyliny G i 100 μg/ml streptomycyny.
2. Poddać eutanazji mysz C57Bl/6J przez wdychanie przedawkowania 5% izofluranu.
3. Zamocuj mysz w pozycji leżącej na plecach za pomocą kołków przebitych przez dłonie i stopy i dokładnie spryskaj 70% etanolem.
4. Wykonaj nacięcie skóry za pomocą sterylnych nożyczek chirurgicznych i pęsety na poziomie biodra i rozciągnij je w dół do stóp, odsłaniając mięśnie.
5. Przetnij ścięgno przyczepiające mięsień czworogłowy uda i ścięgno przyczepiające mięsień ścięgna podkolanowego do kości. Oderwij mięśnie odsłaniające zarówno stawy biodrowe, jak i kolanowe. Zlokalizowanie tych ścięgien ułatwi uwolnienie obu mięśni z przyczepów bez pozostawiania znaczników tkanek miękkich. Nie przecinaj kości.
6. Umieść nożyczki między głową kości udowej a przestrzenią stawową i wtnij się w nią, uwalniając kość udową, ale pozostawiając nienaruszoną kość. Umożliwi to oderwanie kości bez ryzyka odsłonięcia szpiku kostnego.
7. Podobnie odetnij mięśnie przyczepiające się do kości piszczelowej. Odetnij kość piszczelową od jej przyczepu w stawie skokowym, utrzymując kość w stanie nienaruszonym, aby uniknąć zanieczyszczenia.
8. Zeskrob pozostałą tkankę miękką z kości udowej i piszczelowej za pomocą ostrzy nożyczek i kimwipe i umieść ją na talerzu z α-MEM umieszczonym na lodzie.

2. Izolacja szpiku kostnego kończyn tylnych myszy

1. Napełnić strzykawkę z igłą 30 g α-MEM.
2. Odłącz kość piszczelową i kość udową od stawu kolanowego.
3. Odetnij końce długiej kości z obu stron za pomocą nożyczek.
4. Przytrzymaj kość z trzonu za pomocą pęsety, włóż igłę do przestrzeni szpiku kostnego i powoli przepłucz zawartość szpiku do naczynia hodowlanego o średnicy 6 cm. Kość będzie biała, co oznacza ekstrakcję całej zawartości szpiku kostnego. Powtórz dla wszystkich kości.
5. Odcedzić ekstrakt ze szpiku kostnego za pomocą sitka do komórek nylonowych o pojemności 40 μm do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i wirować przy 300 x g przez 5 minut.
6. Wyrzucić supernatant, przemyć 5 ml α-MEM i odwirować przy 300 x g przez 5 minut. Powtórzyć mycie w sumie 2 razy.
7. Zawiesić osad w 10 ml α-MEM i przeprowadzić zliczanie komórek za pomocą hemocytometru w następujący sposób:
   1. Zawiesinę komórek należy rozcieńczyć w stosunku 1:1, dodając 10 μl zawiesiny komórek do 10 μl 0,4% błękitu trypanowego w probówce o pojemności 1,5 ml i jednokrotnie pipetować.
   2. Przykryj komorę hemocytometru szkiełkową osłoną i przenieś zawiesinę barwnika do hemocytometru. Ważne jest, aby nie przepełniać ani nie przepełniać komory i pozwolić, aby zawiesina wypełniła komorę poprzez działanie kapilarne.
   3. Umieść hemocytometr na stoliku mikroskopu. Używając obiektywu 10x, skup się na środkowym kwadracie. Policz wszystkie komórki ograniczone 3 liniami. Aby upewnić się, że komórki nie są liczone dwukrotnie, policz górny i prawy róg każdego kwadratu. Martwe komórki będą ciemnoniebieskie, są one wyłączone z liczenia.
8. W zależności od dalszej aplikacji, należy zasiać komórki w odpowiednim naczyniu hodowlanym. W przypadku tego konkretnego eksperymentu postępuj zgodnie z sekcją 3.

3. Generacja BMM

1. Wysiew 1 x 10 7 komórek/10 ml w 10 cm naczyniu hodowlanym i dodaj M-CSF 100 ng/ml. Końcowe stężenie M-CSF wynosi 100 ng/ml pożywki hodowlanej. Inkubować kulturę w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez 3 dni.
2. Po 3 dniach usunąć pożywkę hodowlaną, energicznie przemyć komórki dwukrotnie 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w celu usunięcia nieprzylegających komórek, dodać 5 ml 0,02% trypsyny-EDTA o temperaturze pokojowej w PBS i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez 5 min.
3. Odłączyć ogniwa przez dokładne pipetowanie. Upewnij się, że komórki zostały odłączone, obserwując hodowlę pod mikroskopem (komórki powinny wydawać się zaokrąglone i unoszące się w pożywce). Jeśli komórki pozostają połączone, należy dokładnie powtórzyć pipetowanie, aby je odłączyć. Po odłączeniu komórek dodaj 5 ml α-MEM, aby dezaktywować reakcję.
4. Zebrać komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i odwirować przy 300 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant i przemyć 5 ml α-MEM.
5. Wirować przy 300 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić osad w 10 ml α-MEM.
6. Wykonaj zliczanie komórek zgodnie z wcześniejszym opisem w kroku 2.7.1.
7. Wysiew 1 x 10⁶ komórek/10 ml w naczyniu hodowlanym o średnicy 10 cm i dodaj M-CSF 100 ng/ml. Końcowe stężenie M-CSF wynosi 100 ng/ml pożywki hodowlanej. Inkubować kulturę w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez 3 dni.

4. Generowanie osteoklastów z BMM jako prekursorów osteoklastów

1. Po 3 dniach zbierz przyłączone komórki, które reprezentują BMM jako prekursory osteoklastów, wykonując kroki 3.2-3.7.
2. Wysiewaj BMM w 5 x 10⁴ komórek/200 μl α-MEM na płytce 96-dołkowej. Dodaj RANKL dla końcowego stężenia 50 ng/ml lub TNF-α dla końcowego stężenia 100 ng/ml. Dodaj M-CSF do każdego dołka o końcowym stężeniu 100 ng / ml.
3. Dodaj przeciwciało anty-c-fms (końcowe stężenia 0, 1, 10, 100, 100 ng / ml) do każdej studzienki.
4. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez 4 dni. Zmieniaj nośniki co drugi dzień przez 4 dni.

5. Barwnik kwaśnej fosfatazy odpornej na winian (TRAP)

1. Po 4 dniach inkubacji delikatnie zassać pożywkę hodowlaną z każdej studzienki. Umyj każdą studzienkę raz 200 μl o temperaturze pokojowej 1x PBS.
2. Dodaj 200 μl 10% formaliny do każdego dołka w celu utrwalenia i inkubuj przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Odessać formalinę i umyć każdą studzienkę 3 razy wodą dejonizowaną.
3. Dodać 200 μl 0,2% Triton X-100 w PBS do każdej studzienki w celu przepuszczalności i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Zassać Triton X-100 i umyć każdą studzienkę 3 razy wodą dejonizowaną.
4. Do każdej studzienki dodać 200 μl roztworu plamy TRAP. Wizualizuj plamę pod mikroskopem. Potrzeba od 10-30 minut, aby plama rozwinęła się prawidłowo.
5. Zassać plamę i umyć każdą studzienkę wodą dejonizowaną 3 razy i wysuszyć na powietrzu. Przechowywać w temperaturze pokojowej do wykorzystania w dalszej obserwacji.

6. Test proliferacji

1. Nasiona BMM jako prekursory osteoklastów w 5 x 10 3 komórkach/200 μl α-MEM w 96-dołkowej płytce. Dodaj M-CSF do każdego dołka o końcowym stężeniu 100 ng / ml.
2. Dodać przeciwciało anty-c-fms (końcowe stężenia 0, 1, 10, 100, 1 000 ng/ml) i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez 3 dni bez zmiany pożywki.
3. Po 3 dniach umyj komórki 1x PBS. Dodać 100 μl α-MEM do każdej studzienki.
4. Dodać 10 μl roztworu zestawu do liczenia komórek i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez 2 godziny i oznaczyć absorbancję każdego dołka przy 450 nm za pomocą czytnika mikropłytek.

Wyniki

Celem niniejszego protokołu jest ocena wpływu przeciwciała przeciwko c-fms na tworzenie się osteoklastów w obecności RANKL lub TNF-α oraz określenie wpływu M-CSF na proliferację prekursorów osteoklastów. W niniejszym protokole przedstawiliśmy niezawodny proces generowania dużych ilości czystych kultur osteoklastów. Przedstawiliśmy również sposób badania odpowiedniego stężenia przeciwciała przeciwko c-fms w celu hamowania tworzenia się osteoklastów w różnych warunkach hodowli.

Dyskusja

W tym badaniu zbadaliśmy wpływ przeciwciała anty-c-fms na tworzenie osteoklastów indukowane przez RANKL, tworzenie osteoklastów indukowane przez TNF-α i proliferację prekursorów osteoklastów indukowaną przez M-CSF. Stwierdziliśmy, że skuteczna ilość przeciwciała anty-c-fms do hamowania osteoklastogenezy wśród tworzenia osteoklastów indukowanego przez RANKL, tworzenia osteoklastów indukowanego przez TNF-α i indukowanej przez M-CSF proliferacji prekursorów osteoklastów jest inna.

RANKL pośrednic...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
		anty-c-Fms	AFS98, szczurze przeciwciało monoklonalne, antymysie, przeciwciało c-Fms (IgG2a)
TNF-α			Rekombinowana mysia TNF-α przygotowana w naszym laboratorium. TNF-&alfa; Fragment cDNA sklonowany metodą RT-PCR i sklonowany do pGEX-6P-I (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) w celu wygenerowania białka fuzyjnego GST. GST-TNF-&alfa; ulegała ekspresji w komórkach Escherichia coli BL21 (Stratagene, La Jolla, CA). Komórki poddano lizie w warunkach niedenaturujących i GST-TNF-α został oczyszczony nad kolumną glutation-sefaloza. GST został odcięty przez PreScission Protease (Amersham Biosciences) przez producenta s kierunków i został usunięty przez kolumnę glutation-sefaroza.
RANKL	PEPROTECH	315-11	Rekombinowany mysi ligand sRANK, Źródło: E. coli
M-CSF			Rekombinowany ludzki M-CSF. 1/10 vol CMG14– 12 Supernatant do hodowli linii komórkowych w 5x106  w naczyniu do hodowli zawiesiny o średnicy 10 cm.
α-MEM	Wako		z L-glutaminą i czerwienią fenolową
Płodowa surowica bydlęca	Biowest	s1820-500	Płodowa surowica bydlęca pochodzenia francuskiego
Naczynie hodowlane Naczynie	Corning		100 mm x 20 mm
Płytka 96-dołkowa	Thermofischer Scientific		Nun clon Powierzchnia Delta
Zestaw do liczenia komórek-8	Dojindo, Kumamoto, Japonia
Czytnik mikropłytek	Sunrise REMOTE; Tekan Japan, Kawasaki, Japonia
Sitko komórkowe	Corning		40 μ m Nylonowa
rurka wirówkowa	Corning		50 ml Nasadka CentriStar
Triton X-100	Wako		Eter polioksyetylenowy (10) oktyfenylowy

Przeciwciało w stylu