Artykuł metodologiczny

Obrazowanie konfokalne dwuniciowego RNA i receptorów rozpoznawania wzorców w zakażeniu wirusem RNA o ujemnym znaczeniu

DOI:

10.3791/59095

⸱

26 stycznia 2019

 ,  , 
1Department of Pathology and Institute for Human Infections and Immunity, University of Texas Medical Branch

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dwuniciowe RNA wytwarzane podczas replikacji wirusa RNA mogą być rozpoznawane przez receptory rozpoznające wzorce, aby wywołać wrodzoną odpowiedź immunologiczną. W przypadku wirusów RNA o ujemnym znaczeniu interakcja między niskim poziomem dsRNA a PRR pozostaje niejasna. Opracowaliśmy metodę mikroskopii konfokalnej do wizualizacji dsRNA i PRR arenawirusa w poszczególnych komórkach.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dwuniciowy (ds) RNA jest wytwarzany jako replikacyjny produkt pośredni podczas infekcji wirusem RNA. Rozpoznawanie dsRNA przez receptory rozpoznawania wzorców gospodarza (PRR), takie jak receptory podobne do kwasu retinowego (RIG-I) (RLR), RIG-I i białko związane z różnicowaniem czerniaka 5 (MDA-5), prowadzi do indukcji wrodzonej odpowiedzi immunologicznej. Powstawanie i wewnątrzkomórkowa dystrybucja dsRNA w zakażeniu wirusem RNA o dodatnim sensie została dobrze scharakteryzowana za pomocą mikroskopii. Wiele wirusów RNA o ujemnym sensie, w tym niektóre arenawirusy, wyzwala wrodzoną odpowiedź immunologiczną podczas infekcji. Uważa się jednak, że wirusy RNA o ujemnym znaczeniu wytwarzają niskie poziomy dsRNA, co utrudnia badanie obrazowe rozpoznawania PRR wirusowego dsRNA. Dodatkowo, eksperymenty z infekcjami wysoce zjadliwymi arenawirusami muszą być przeprowadzane w obiektach o wysokim poziomie bezpieczeństwa biologicznego (BSL-4). Interakcja między wirusowym RNA a PRR dla wysoce zjadliwego wirusa RNA jest w dużej mierze nieznana ze względu na dodatkowe wyzwania techniczne, z którymi naukowcy muszą się zmierzyć w obiektach BSL-4. Ostatnio odkryto, że przeciwciało monoklonalne (Mab) (klon 9D5) pierwotnie używane do wykrywania pan-enterowirusa specyficznie wykrywa dsRNA z wyższą czułością niż tradycyjne przeciwciała anty-dsRNA J2 lub K1. Tutaj, wykorzystując przeciwciało 9D5, opisujemy protokół mikroskopii konfokalnej, który został z powodzeniem wykorzystany do jednoczesnej wizualizacji dsRNA, białka wirusowego i PRR w pojedynczych komórkach zakażonych arenawirusem. Protokół nadaje się również do badań obrazowych dystrybucji dsRNA i PRR w patogennych komórkach zakażonych wirusem arenawirusowym w obiektach BSL4.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Początkowym etapem indukcji wrodzonej odpowiedzi immunologicznej jest rozpoznanie przez gospodarza dwuniciowego (ds) RNA przez receptory rozpoznawania wzorców (PRR), takie jak receptory podobne do kwasu retinowego (RIG-I) (RLR), RIG-I i białko związane z różnicowaniem czerniaka 5 (MDA-5)1. W przypadku wirusów RNA o dodatnim sensie, dsRNA można zwykle łatwo wykryć za pomocą przeciwciał monoklonalnych anty-dsRNA J2 lub K1 (Mab)2. Interakcja między dsRNA i PRR w wirusach o dodatniej nici RNA, takich jak pikornawirus, została scharakteryzowana za pomocą mikroskopii konfokalnej3. Jednak w przypadku wirusa RNA o ujemnym sensie, wizualizacja i charakterystyka interakcji PRR i dsRNA była utrudniona przez brak wrażliwych przeciwciał przeciwko dsRNA. Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ RNA (FISH) została zastosowana do wizualizacji wirusowego RNA i PRRs4. Niemniej jednak metodologia FISH wymaga znajomości docelowej sekwencji RNA i może nie być kompatybilna z współbarwieniem PRR. Niedawno okazało się, że 9D5 Mab, który został pierwotnie opracowany do diagnozowania infekcji pan-enterowirusem, jest bardziej czuły niż J2 Mab i może łatwo wykryć dsRNA w infekcji wirusem RNA o ujemnym sensie5,6. Tak więc Mab 9D5 jest nowatorskim i użytecznym narzędziem do badania replikacji wirusa i interakcji między PRR a wirusowym RNA dla wirusa RNA o ujemnym sensie.

Arenawirusy to rodzina jednoniciowych wirusów RNA o ujemnym znaczeniu, które zawierają kilka ludzkich patogenów, takich jak wirus Lassa (LASV), wirus Junín (JUNV) i wirus Machupo (MACV), które powodują ciężkie choroby gorączki krwotocznej u ludzi7. Dane kliniczne dotyczące ciężkich i śmiertelnych przypadków argentyńskiej gorączki krwotocznej wywołanej przez arenawirusa Nowego Świata JUNV wykazują niezwykle wysokie poziomy IFN-α8,9. Wykazaliśmy, że patogenne arenawirusy NW (JUNV i MACV), ale nie patogenny arenawirus Starego Świata, LASV, indukują odpowiedź interferonu typu I (IFN) w ludzkich komórkach dendrytycznych pochodzących z monocytów10. Co więcej, RIG-I jest jednym z czujników pośredniczących w odpowiedzi IFN typu I w komórkach zakażonych JUNV11. Odkryliśmy również, że receptor kinazy białkowej R (PKR), który jest tradycyjnie znany z rozpoznawania dsRNA, jest aktywowany w patogennej infekcji arenawirusem NW12. Aby lepiej zrozumieć mechanizm specyficznej dla wirusa odpowiedzi IFN podczas infekcji arenawirusem, naszym celem było opracowanie protokołu wizualizacji interakcji między wirusowym dsRNA a cytoplazmatycznymi PRR.

Eksperymenty z infekcjami patogennymi JUNV, MACV i LASV muszą być przeprowadzane w obiektach o 4 poziomie bezpieczeństwa biologicznego (BSL-4). W związku z tym, oprócz przypuszczalnie niskiego poziomu dsRNA powstającego w wyniku infekcji arenawirusowej, spełnienie wymagań bezpieczeństwa biologicznego jest kolejnym wyzwaniem technicznym podczas wykonywania badań obrazowych dla tych wysoce zjadliwych wirusów. Wykorzystując przeciwciało 9D5 i szczep szczepionki Candid1# JUNV, w niniejszym raporcie opisano protokół oparty na mikroskopii konfokalnej, który został z powodzeniem wykorzystany do jednoczesnej wizualizacji dsRNA, białka wirusowego i PRR w komórkach zakażonych arenawirusem w laboratoriach BSL2. Protokół nadaje się również do wizualizacji wewnątrzkomórkowej dystrybucji dsRNA i PRR podczas patogennej infekcji arenawirusem w obiektach BSL4.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie komórek A549 i infekcja JUNV

  1. Wysiewaj 2 x 105 komórek ludzkiego nabłonka płuc A549 na szkiełka nakrywkowe pokryte poli-D-lizyną (PDL) w 12-dołkowych płytkach na 24 godziny przed zakażeniem.
  2. Przygotować podwielokrotności 150 μl JUNV13 przy mnożeniu infekcji (MOI) 1,0 jednostki tworzącej płytkę miażdżycową na komórkę rozcieńczoną w pożywce Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) uzupełnionej 2% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) oraz 1% penicyliny i streptomycyny (P/S).
  3. Usuń pożywkę z hodowli komórkowej. Dodać inokulum wirusa do każdej studzienki zawierającej szkiełko nakrywkowe i inkubować przez 1,5 godziny w temperaturze 37 °C. Wstrząsać płytkami co 15 minut.
  4. Usunąć inokulum wirusa, dodać 1 ml DMEM uzupełnionego 5% FBS i 1% P/S. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C do żądanego punktu czasowego.

2. Utrwalenie i barwienie immunologiczne

  1. Zassać media. Przepłucz komórki, dodając do każdej studzienki 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) uzupełnionej wapniem i magnezem.
  2. Usuń PBS. Dodać 1 ml metanolu (MeOH) wstępnie schłodzonego w temperaturze -20 °C i inkubować w temperaturze -20 °C lub na suchym lodzie przez 15 minut.
  3. Usuń MeOH.
  4. Dodać 1 ml PBS do każdego dołka i myć próbki w temperaturze 4 °C, delikatnie kołysząc przez 5 minut. Powtórzyć mycie w sumie 4 razy.
  5. Przemyć utrwalone komórki na szkiełkach nakrywkowych w 1 ml 0,2% t-oktylofenoksypolietylenu przez 5 minut w temperaturze 4 °C, delikatnie kołysząc.
  6. Dodaj 1 ml PBS do każdej studzienki. Próbki należy myć w temperaturze 4 °C przez 5 minut, delikatnie kołysząc. Powtórz krok prania w sumie 4 razy.
  7. Aby wykryć dsRNA i MDA5, należy inkubować próbki w 200 μl przeciwciał pierwszorzędowych rozcieńczonych w 3% albuminie surowicy bydlęcej (BSA). Rozcieńczyć przeciwciało anty-dsRNA 9D5 w rozcieńczeniu 1:2 i rozcieńczyć przeciwciało anty-MDA-5 w stosunku 1:250. Inkubować z delikatnym kołysaniem w temperaturze 4 °C przez noc.
  8. Usuń przeciwciała pierwszorzędowe i przemyj każdą studzienkę 1 ml PBS przez 5 minut, delikatnie kołysząc w temperaturze pokojowej. Powtórz to płukanie jeszcze cztery razy.
  9. Dodać 200 μl przeciwciał drugorzędowych (rozcieńczenie 1:2 000) rozcieńczonych w 3% BSA i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
  10. Usuń przeciwciała wtórne i przemyj każdą studzienkę 1 ml PBS przez 5 minut, delikatnie kołysząc w temperaturze pokojowej. Powtórz to płukanie jeszcze cztery razy.
  11. Aby wykryć nukleoproteinę JUNV (NP) i RIG-I, dodaj 200 μl sprzężonych przeciwciał rozcieńczonych w 3% BSA. Rozcieńczyć sprzężony anty-JUNV NP (AG-12) w stosunku 1:1 000 i inkubować próbki przez 2 godziny w temperaturze pokojowej z delikatnym kołysaniem. Rozcieńczyć sprzężone przeciwciało anty-RIG-I w stosunku 1:500 i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc, delikatnie kołysząc.
  12. Usuń sprzężone przeciwciała i przemyj każdą studzienkę 1 ml PBS przez 5 minut, delikatnie kołysząc w temperaturze pokojowej. Powtórz to płukanie jeszcze cztery razy.
  13. Przeciwbarwić szkiełka nakrywkowe za pomocą DAPI (1:1 000) przez 3 minuty, delikatnie kołysząc w temperaturze RT.
  14. Szkiełka nakrywkowe należy myć 3 razy, za każdym razem przez 5 minut w 1 ml 0,5% t-oktylofenoksypolietylenu z delikatnym kołysaniem w temperaturze pokojowej.
  15. Umyć dwukrotnie w 1 ml PBS przez 5 minut za każdym razem z delikatnym kołysaniem w temperaturze RT.
  16. Umyć raz w 1 ml ddH2O przez 1 minutę w temperaturze pokojowej, delikatnie kołysząc.
  17. Zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełkach podstawowych za pomocą nośników montażowych. Pozostaw do utwardzenia na noc.
  18. Uszczelnij szkiełka lakierem do paznokci i schnij na powietrzu przez 1 godzinę.
  19. Obraz w mikroskopie konfokalnym z soczewką olejową o aperturze numerycznej 60x/1,42 przy użyciu tych samych emisji laserowych dla każdej próbki.
  20. Podczas analizowania danych, jeśli to konieczne, dokonaj korekty jasności i kontrastu, używając tej samej korekty liniowej dla wszystkich próbek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół został zastosowany do zbadania dystrybucji i kolokalizacji pomiędzy RLR (RIG-I i MDA-5) a dsRNA w komórkach zakażonych JUNV. Jak pokazano na Rysunek 1 i Rysunek 2, akumulacja dsRNA wzrasta z czasem wraz z postępem infekcji wirusowej. Skoncentrowane sygnały MDA-5 (Rysunek 1) i RIG-I (Rysunek 2) okazały się kolokalizowane ze strukturami punktowymi NP i dsRNA.

...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W przypadku wirusów RNA o dodatnim sensie i wirusów dsDNA, dsRNA jest łatwo wykrywane za pomocą szeroko stosowanego przeciwciała anty-dsRNA J2. Uważa się jednak, że wirusy RNA o ujemnym znaczeniu wytwarzają dsRNA na niskim lub niższym poziomie wykrywania przy użyciu tego samego przeciwciała2. W związku z tym wiele aspektów interakcji wirusowego RNA i PRR jest w dużej mierze niejasnych dla wirusów RNA o ujemnym sensie. Próbowaliśmy wybarwić dsRNA w infekcji arenawirusem przy użyciu przeciwciała J2,...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować głównym obiektom obrazowania UTMB oraz Maksymowi Ivannikovowi za pomoc mikroskopową.

Ta praca była wspierana przez dotację Publicznej Służby Zdrowia RO1AI093445 i RO1AI129198 przyznaną SP, UTMB Commitment Fund P84373 do CH, oraz T32 AI007526 do EM.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zestaw do znakowania przeciwciał APEX Alexa Fluor 647InvitrogenA10475
BSASigmaAldrich A4503
DAPICell Signaling40831:1,000 rozcieńczenie
osioł-anty królik Alexa Fluor 594InvitrogenA-110581:2,000 rozcieńczenie; Część #: 1454437
Zmodyfikowane podłoże Eagle's DulbeccoCorning10-013-CV
Surowica bydlęcaAtlanta BioS11150
Szklane szkiełka mikroskopoweFisher12-550-15
Kozioł anty myszy Alexa Fluor 488InvitrogenA-110291:2000 rozcieńczenie; Część #: 1874804
Ludzkie komórki nabłonkowe płuc A549ATCCCCL-185
MetanolFisherA412Przechowywany w temperaturze -20 ° C
Mysz MAb anty-JUNV NPBEINA05-AG12sprzężona z Alexa-647 w rozcieńczeniu 1:1,000
Mysz MAb pan-enterovirus 9D5 OdczynnikMillipore Sigma3361gotowy do użycia; rozcieńczony w stosunku 1:2; Część #: 3067445
PBS uzupełniony Ca i MgCorning21-030-CV
PDL Szkiełka nakrywkowepowlekane NeuvitroH-12-1.5-pdl
ProLong Gold antifadeInvitrogenP10144
Rabbit MAb MDA-5Abcamab1266301:250 rozcieńczenie; Partia #: GR97758-7
rekombinowany szczep Candid#1 JUNVLab wygenerowanyw laboratorium Jakopisano wcześniej w odnośniku 13.
Mysz RIG-I MAb sprzężona z Alexa-594Santa Cruzsc-376845rozcieńczenie 1:1000; Część #: AO218
Triton X-100Sigma AldrichT8787 
płodu

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jensen, S., Thomsen, A. R. Sensing of RNA viruses: a review of innate immune receptors involved in recognizing RNA virus invasion. Journal of Virology. 86, 2900-2910 (2012).
  2. Weber, F., Wagner, V., Rasmussen, S. B., Hartmann, R., Paludan, S. R. Double-stranded RNA is produced by positive-strand RNA viruses and DNA viruses but not in detectable amounts by negative-strand RNA viruses. Journal of Virology. 80, 6(2006).
  3. Triantafilou, K., Vakakis, E., Kar, S., Richer, E., Evans, G. L., Triantafilou, M. Visualisation of direct interaction of MDA5 and the dsRNA replicative intermediate form of positive strand RNA viruses. Journal of Cell Science. 125, 4761-4769 (2012).
  4. Onomoto, K., et al. Critical role of an antiviral stress granule containing RIG-I and PKR in viral detection and innate immunity. PLoS One. 7, e43031(2012).
  5. Son, K. N., Liang, Z., Lipton, H. L. Double-stranded RNA is detected by immunofluorescence analysis in RNA and DNA virus infections, including those by negative-sense RNA viruses. Journal of Virology. 89, 9383-9392 (2015).
  6. Mateer, E. J., Paessler, S., Huang, C. Visualization of double-stranded RNA colocalizing with pattern recognition receptors in arenavirus infected cells. Frontiers Cellular and Infection Microbiology. 8, 251(2018).
  7. Buchmeier, M. J., de la Torre, J. C., Peters, C. J. Arenavirdae: The viruses and their replication. Fields Virology. Knipe, D. M., Howley, P. M. 2, Lippincott Williams & Wilkins. (2006).
  8. Levis, S. C., et al. Endogenous interferon in Argentine hemorrhagic fever. The Journal of Infectious Diseases. 149, 428-433 (1984).
  9. Levis, S. C., et al. Correlation between endogenous interferon and the clinical evolution of patients with Argentine hemorrhagic fever. Journal of Interferon Research. 5, 383-389 (1985).
  10. Huang, C., et al. Highly pathogenic new world and old world human arenaviruses induce distinct interferon response in human cells. Journal of Virology. 89, 7079-7088 (2015).
  11. Huang, C., et al. Junin virus infection activates the type I interferon pathway in a RIG-I-dependent manner. PLoS Neglected Tropical Diseases. 6, e1659(2012).
  12. Huang, C., Kolokoltsova, O. A., Mateer, E. J., Koma, T., Paessler, S. Highly pathogenic new world arenavirus infection activates the pattern recognition receptor protein kinase R without attenuating virus replication in human cells. Journal of Virology. 91, 20(2017).
  13. Emonet, S. F., et al. Rescue from cloned cDNAs and in vivo characterization of recombinant pathogenic Romero and live-attenuated Candid#1 strains of Junin virus, the causative agent of Argentine hemorrhagic fever disease. Journal of Virology. 85 (4), 1473-1483 (2011).
  14. Child, S. J., et al. Antagonism of the protein kinase R pathway in human cells by Rhesus Cytomegalovirus. Journal of Virology. 92, 6(2018).
  15. Hobro, A. J., Smith, N. I. An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging. Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Double Stranded RNA DetectionConfocal Microscopy ProtocolPattern Recognition ReceptorsNegative Sense RNA VirusMonoclonal Antibody 9D5Viral Nuclear ProteinHost PRR InteractionMultiplex ImmunofluorescenceA549 Cell InfectionBSL4 Facility Imaging

Powiązane artykuły