Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Śledzenie behawioralne i obrazowanie neuromastu meksykańskich ryb jaskiniowych

7.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59099

⸱

6 kwietnia 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, University of Hawai'i at Mānoa, 2Department of Anatomy, Biochemistry and Physiology, University of Hawai'i at Mānoa, 3Pacific Biosciences Research Center, University of Hawai'i at Mānoa

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy metody wysokoprzepustowego badania szeregu zachowań meksykańskich ryb jaskiniowych i istotnego barwienia systemu mechanosensorycznego. Metody te wykorzystują wolne oprogramowanie i niestandardowe skrypty, zapewniając praktyczną i opłacalną metodę badania zachowań.

Streszczenie

Zwierzęta żyjące w jaskiniach wykształciły szereg cech morfologicznych i behawioralnych, aby dostosować się do swojego wiecznie ciemnego i ubogiego w żywność środowiska. Wśród tych cech, zachowania związane z żerowaniem są jednym z użytecznych okien na funkcjonalne zalety ewolucji cech behawioralnych. W niniejszym artykule przedstawiono zaktualizowane metody analizy zachowania przyciągania drgań (VAB: adaptacyjne zachowanie żerowania) oraz obrazowania powiązanych czujników mechanicznych tetra przystosowanej do jaskiń, Astyanax mexicanus. Ponadto przedstawiono metody wysokoprzepustowego śledzenia szeregu dodatkowych zachowań ryb jaskiniowych, w tym nadpobudliwości i utraty snu. Ryby jaskiniowe wykazują również aspołeczność, powtarzające się zachowania i większy niepokój. Dlatego ryby jaskiniowe służą jako zwierzęcy model dla wyewoluowanych zachowań. Metody te wykorzystują wolne oprogramowanie i niestandardowe skrypty, które można zastosować do innych typów zachowań. Metody te stanowią praktyczną i opłacalną alternatywę dla dostępnego na rynku oprogramowania śledzącego.

Wprowadzenie

Meksykańska tetra, Astyanax mexicanus (Teleostei: Characidae), jest wyjątkowa wśród ryb, ponieważ posiada dwie radykalnie różne alternatywne morfy - widzącą, żyjącą na powierzchni i ślepą, zamieszkującą jaskinię morfę, składającą się z kilku odrębnych populacji1. Chociaż różnią się morfologią i fizjologią, nadal są interpłodne2,3. Wydaje się, że te interpłodne morfy ewoluowały szybko (~20 000 lat)4, co czyni je idealnym systemem modelowym do badania szybkiej adaptacji. Wiadomo, że ryby jaskiniowe mają zestaw rozbieżnych cech morfologicznych i behawioralnych, w tym zwiększoną gęstość kubków smakowych, zwiększoną liczbę mechanosensorów, zachowania żerowe dostrojone do określonej częstotliwości bodźca wibracyjnego, nadpobudliwość i bezsenność. Wiele z tych zachowań prawdopodobnie ewoluowało równocześnie, a niektóre z nich zostały zasugerowane jako korzystne w ciemnościach jaskiń do żerowania5 i oszczędzania energii w ciemnych i ubogich w żywność środowiskach6,7.

W wielu systemach modeli ewolucyjnych trudno jest zdobyć zintegrowaną wiedzę na temat tego, jak zmienia się morfologia i zachowanie zwierząt w odpowiedzi na środowisko, ponieważ większość gatunków jest rozmieszczona w ciągłym gradieniu w złożonych środowiskach. Jednak wyraźny kontrast między jaskinią a powierzchniowym morfem Astyanax, który ewoluował w wysoce kontrastujących środowiskach wyznaczonych ostrym ekotonem, doprowadził do tego, że Astyanax stał się doskonałym modelem do zrozumienia ewolucji zwierząt. Umożliwia to łatwiejsze powiązanie genów i procesów rozwojowych z cechami adaptacyjnymi i selekcją w środowisku. Co więcej, niedawne badania biomedyczne tych cech w Astyanax wykazały, że cechy te mogą występować równolegle z objawami u ludzi8,9,10. Na przykład utrata kontaktów towarzyskich i snu oraz wzrost nadpobudliwości, powtarzające się zachowanie i poziom kortyzolu są podobne do tego, co obserwuje się u ludzi z zaburzeniami ze spektrum autyzmu8.

Aby zająć się złożoną współewolucją wielu zachowań i cech morfologicznych, korzystne jest przetestowanie wielu z nich, aby podkreślić leżące u ich podstaw szlaki genetyczne i molekularne. W niniejszej pracy przedstawiono metody charakteryzujące stopień fenotypów behawioralnych typu jaskiniowego powierzchniowych, jaskiniowych i hybrydowych morfów Astyanaxa. Zachowania ogniskowe analizowane w celu scharakteryzowania fenotypu to zachowania związane z żerowaniem przystosowane do jaskiń (zachowanie przyciągania wibracji, określane odtąd jako VAB) oraz nadpobudliwość/czas trwania snu11,12. Przedstawiono również metodę obrazowania układu sensorycznego związanego z VAB13. Ostatnio dostępnych jest wiele programów śledzących typu open source do przeprowadzania testów behawioralnych14,15. Działają one bardzo dobrze w przypadku krótkich filmów, krótszych niż 10 minut. Staje się to jednak problematyczne, jeśli film jest dłuższy ze względu na intensywny czas obliczeń/śledzenia. Sprawne oprogramowanie dostępne na rynku może być drogie. Przedstawione metody wykorzystują głównie darmowe oprogramowanie i dlatego są uważane za opłacalne i wysokoprzepustowe. Uwzględniono również reprezentatywne wyniki oparte na tych metodach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury są wykonywane zgodnie z wytycznymi opisanymi w "Zasadach opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi" (publikacja Narodowego Instytutu Zdrowia nr 85-23, poprawiona w 1985 roku) oraz zatwierdzonym przez Uniwersytet Hawajski w Manoa Institutional Animal Care and Use Committee protokół dla zwierząt 17-2560-3.

1. Test zachowania przyciągania drgań (VAB) ( ≤ 10 minut na całą procedurę nagrywania)

UWAGA: Użyj kamery czułej na podczerwień lub zbuduj kamerę na podczerwień, modyfikując kamerę internetową USB. Aby zmodyfikować kamerę internetową USB, zapoznaj się ze szczegółowym opisem przedstawionym przez Keene Lab w tym wydaniu z rybami jaskiniowymi na JoVE (From this A. mexicanus issue) lub krótkim opisem w Materiałach Uzupełniających.

  1. Konfiguracja nagrywania
    1. Aby upewnić się, że aparat pozostaje w pozycji, nieruchomy i przy odpowiedniej ogniskowej od nagrywanego obiektu (obiektów), zbuduj czarną ramkę z rurek z polichlorku winylu (PVC) o wymiarach 120 cm wys. x 45 cm dł. x 90 cm szer.
    2. Po zbudowaniu ramy przykryj ją plastikową kurtyną zaciemniającą, taką jak ta przeznaczona dla rolnictwa hydroponicznego.
    3. Na górze ramy umieść czarną akrylową tablicę z okienkiem na kamerę na podczerwień pośrodku o tej samej średnicy, co regulowany obiektyw zmiennoogniskowy z mocowaniem C. Wewnątrz tego pudełka umieść sprzęt testowy VAB ( Rysunek 1).
  2. Aparatura wibracyjna
    UWAGA: Drgania są wytwarzane za pomocą małego generatora funkcyjnego.
    1. W przypadku poniższych metod należy dostroić drgania do amplitudy 0,15 mm i częstotliwości 40 Hz, która jest częstotliwością wywołującą maksymalną reakcję przyciągania5,16.
    2. Podłącz generator funkcyjny do głośnika skierowanego poziomo.
    3. Przymocuj szklany pręt o średnicy 7.5 mm i długości 14 cm do osłony przeciwpyłowej z przodu głośnika za pomocą kleju na gorąco lub kleju do uszczelek.
    4. Prostopadle do tego pręta i skierowany w dół, przymocuj kolejny szklany pręt o średnicy 7.5 mm o długości 4 cm (Rysunek 1).
  3. Test behawioralny
    1. Aklimatyzować doświadczalnego A. mexicanus przez 4 dni w cylindrycznej komorze testowej wypełnionej kondycjonowaną wodą (pH między 6,8 - 7,0, przewodność ok. 700 μS, temperatura ok. 22 °C) w cyklu 12/12 L/D. Sprawdź, czy ryby się zaaklimatyzowały, obserwując ich opóźnienie w żerowaniu. Dłuższe opóźnienie niż w ich domowym zbiorniku wskazuje, że potrzebny jest dłuższy czas aklimatyzacji. Przez cały okres aklimatyzacji karm raz dziennie żywymi naupliami artemii.
    2. Dzień przed dniem próby (po 3 dniach aklimatyzacji) należy zastąpić wodę w komorze testowej świeżą kondycjonowaną wodą.
    3. W dniu próby (po 4 dniach od aklimatyzacji) ryby doświadczalne należy pozbawić pokarmu do czasu zakończenia testu. Nasycenie zmieni ich reakcję na wibracje.
    4. Ustaw parametry nagrywania w VirtualDub freeware17: 15 klatek/s, kodek: x264vfw, czas nagrywania: 3 min 30 s.
    5. Przygotować aparat emitujący drgania (patrz krok 1.2), dostrajając go do 40 Hz. Zobacz Rysunek 1 dla wyjaśnienia aparatury. Opłucz wibrujący szklany pręt wodą dejonizowaną, aby usunąć wszelkie rozpuszczalne w wodzie chemikalia.
    6. Pracując w ciemności, umieść cylinder testowy na stoliku nagrywającym oświetlonym podświetleniem na podczerwień w czarnej skrzynce i pozwól rybom zaaklimatyzować się przez 3 minuty.
      1. Po 3-minutowej aklimatyzacji nagraj wideo przez 3 minuty i 30 sekund. Na początku nagrywania włóż wibrujący szklany pręt do słupa wody (głębokość ok. 0,5 cm).
      2. Unikaj hałasu lub wibracji podczas umieszczania wibrującego szklanego pręta w wodzie, ponieważ ryby mogą wyczuć nawet najdrobniejsze zakłócenia.
      3. Zakończ tę procedurę w ciągu 30 sekund od rozpoczęcia nagrywania wideo, aby upewnić się, że zachowanie zostało nagrane przez więcej niż 3 minuty.
    7. Monitoruj wideo podczas nagrywania, aby upewnić się, że na tym etapie nie wystąpią żadne błędy.
    8. Po zakończeniu nagrywania należy wyjąć wibrujący pręt szklany z cylindrycznej komory testowej i wyjąć komorę testową ze stolika rejestracyjnego. Powtórzyć od 1.3.5 dla następnej ryby.
  4. Analiza wideo
    UWAGA: Konwersja kodeka do formatu, który może załadować ImageJ, działa tylko w systemie operacyjnym Windows18 (Tabela 1).
    1. Przekonwertuj skompresowane wideo avi na czytelny format dla ImageJ i ustaw parametry analizy.
      1. Zainstaluj AviSynth_260.exe (https://sourceforge.net/projects/avisynth2/), pfmap build 178 (http://pismotec.com/pfm/ap/) i avfs ver1.0.0.5 lub ver1.0.0.6 (https://sourceforge.net/projects/avf/). Należy pamiętać, że ta metoda jest wrażliwa na program/wersję. Podane linki do stron internetowych poprowadzą do odpowiednich wersji (Tabela 1).
      2. Uruchom plik wsadowy, klikając dwukrotnie avs_creater.bat (plik uzupełniający). Kliknij prawym przyciskiem myszy plik wideo avs, który chcesz przeanalizować (wybierz jeden z plików avs utworzonych przez avs_creater.bat).
      3. Ponieważ analiza wideo za pomocą wtyczki Tracker w ImageJ wymaga załadowania makra ImageJ (plik uzupełniający Macro_VAB_moko.txt), załaduj makro metodą przeciągnij i upuść do powłoki GUI ImageJ. To makro włączy niektóre skróty klawiszowe dla poniższej analizy.
      4. W katalogu roboczym utwórz nowy folder o nazwie "Process_ImageJ".
      5. Kliknij prawym przyciskiem myszy plik .avs, który chcesz przeanalizować (wybierz jeden z plików avs utworzonych przez avs_creater.bat). Wybierz opcję Szybki montaż. Po zamontowaniu pliku avs jako dysku zewnętrznego otwórz plik avi w ImageJ (plik avi ma nazwę kończącą się na ".avi").
      6. Aby ustawić skalę pomiaru odległości, wybierz średnicę komory testowej, rysując linię prostą w poprzek komory za pomocą narzędzia Zaznaczanie linii prostej, a następnie kliknij przycisk Analizuj > Ustaw funkcję skali. Na przykład wprowadź 9,4 cm, jeśli używasz cylindrycznego naczynia o średnicy wewnętrznej 9,4 cm. Zaznacz pole radiowe opcji Globalne, aby ustandaryzować skalę we wszystkich poniższych analizach wideo.
    2. Konwertuj na stos binarny i uruchom analizę.
      1. Skopiuj obszar komory testowej za pomocą narzędzia do zaznaczania owalu, a następnie kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz opcję Obraz > Duplikuj. W tym momencie określ zakres klatek, które mają zostać zachowane do dalszej analizy, np. zachowaj pierwsze 2700 klatek po wejściu wibrującego pręta do wody (przy 15 klatkach na sekundę są to dokładnie 3 minuty filmu).
      2. Wyczyść zewnętrzną część komory testowej i przekonwertuj na obraz binarny, naciskając skrótu 7 na pasku numerycznym klawiatury.
      3. Po wyczyszczeniu tła i wyświetleniu monitu dodaj czarną kropkę pośrodku, aby wskazać pozycję wibrującego szklanego pręta za pomocą narzędzia do zaznaczania owalu, które jest już ustawione na czarno z funkcją wypełniania. Kliknij OK, a pojawi się monit, aby przejść do regulacji progu.
      4. Ustaw próg, aby utworzyć binarny (całkowicie czarno-biały) obraz ryby. Dostosuj próg tak, aby ryba była widoczna w całych klipach wideo, a następnie wybierz opcję Zastosuj.
      5. Uruchom wtyczkę "Tracker", naciskając skrótu 8 na pasku numerycznym. Ustaw minimalny rozmiar piksela na 100 po wyświetleniu monitu i naciśnij OK, generując odległość między wibrującym prętem a rybą na klatkę przez wszystkie 3 minuty binarnego wideo.
      6. Dostosuj błędne śledzenie generowane przez szum w filmie. Aby to zrobić, sprawdź okno Wyniki, aby zidentyfikować ramki, które zwracają obiekt o numerze 3 lub wyższym, wskazując dodatkowe obiekty w tych ramkach (np. cząsteczki w wodzie lub cień przezroczystego ramienia pręta) oprócz "pręta" i "ryby" w ramce. Usuń wszelkie dodatkowe przedmioty za pomocą pędzla.
      7. Naciśnij skrótu 9 na pasku numerycznym, aby wyeksportować binarny stos obrazów całego filmu (na wypadek, gdyby konieczna była ponowna analiza) oraz plik .xls ze współrzędnymi i danymi odległości (pliki uzupełniające CF01.xls, Threshold_CF01.tif i Trac_CF01.tif). Skrót klawiszowy 9 zamknie również wszystkie pliki powiązane z bieżącym filmem. Powtórz kroki od 1.4.2.1 do 1.4.2.6 dla wszystkich powtórzeń.
      8. Uruchom skrypt makra (plik uzupełniający JoVE_2cmVAB_template_15fps.xlsm), aby skonsolidować wiele plików wyników śledzenia (.xls) w jednym arkuszu kalkulacyjnym i policz liczbę i czas trwania podejść w obszarze 1,5 cm od pręta. Podejścia nie trwające co najmniej 0,5 s nie będą liczone. Zmieniaj parametry dystansu i czasu liczonego jako podejście zgodnie z konkretnymi pytaniami będącymi przedmiotem zainteresowania.
    3. Zwolnij miejsce na dysku komputera po zakończeniu wszystkich analiz. Usuń zamontowane pliki, aby zwolnić miejsce na dysku - pliki avi.avi i .avi.avs (rozszerzenia wygenerowane przez oprogramowanie) - uruchamiając plik wsadowy multiunmountdel.bat w tym samym folderze, w którym avs_creater.bat został uruchomiony w sekcji 1.4.1.2.

2. Test snu i nadpobudliwości (nagranie 24 godziny)

  1. Test behawioralny
    1. Zaaklimatyzować pięć ryb doświadczalnych przez 4 dni lub dłużej w każdej komorze specjalnie zaprojektowanego akrylowego akwarium rejestrującego o pojemności 10 litrów (odpowiednio 45,9 cm x 17,8 cm x 17,8 cm; długość x szerokość x głębokość) wypełnionego klimatyzowaną wodą (patrz krok 1.3.1).
      1. Oddziel każdą pojedynczą komorę czarnymi płytami akrylowymi, tworząc komory o jednakowej wielkości, mierzące 88,9 mm × 177,8 mm × 177,8 mm (Rysunek 2). Pamiętaj, aby przykryć każdy zbiornik, aby ryby nie przeskakiwały między komorami.
      2. Ustaw programowalny timer zasilania, aby automatycznie włączał białe światło LED na 12 godzin i wyłączał się na 12 godzin każdego dnia w okresie aklimatyzacji (npample, włącz światło o 7 rano i wyłącz o 19 wieczorem). Spowoduje to porwanie rytmu okołodobowego ryb (jeśli są one podatne na porwanie).
      3. Użyj nieprzezroczystych, białych płyt akrylowych o podobnych wymiarach do zbiornika o pojemności 10 litrów jako dyfuzorów, aby przepuścić światło białe i podczerwone, aby zapewnić rozproszone światło o równomiernym natężeniu we wszystkich zbiornikach.
      4. Przez cały okres aklimatyzacji należy karmić raz dziennie żywymi naupliami artemii i zapewniać napowietrzanie przez filtry gąbkowe w każdym akwarium.
        UWAGA: Upewnij się, że ryby są karmione o stałych porach (tj. 1 raz dziennie o 9:00 rano), ponieważ pora karmienia może również wpływać na porywanie rytmu okołodobowego19.
      5. Sprawdź, czy ryby się zaaklimatyzowały, obserwując ich opóźnienie w żerowaniu. Dłuższe opóźnienie niż w ich macierzystym zbiorniku wskazuje, że potrzebny jest dłuższy czas na aklimatyzację.
    2. Dzień poprzedzający dzień próby (co najmniej 3 dni przed aklimatyzacją) należy zastąpić wodę w komorze testowej świeżo uzdatnioną wodą (zob. krok 1.3.1).
    3. Ustaw parametr nagrywania w oprogramowaniu VirtualDub 17: 15 klatek/s, kodek: x264vfw, czas nagrywania: 86 400 s (24 h).
    4. Włącz podświetlenie na podczerwień za stolikiem nagrywającym (patrz Rysunek 2). Obserwując obraz na żywo VirtualDub na ekranie, dostosuj położenie każdego akwarium, aby było skierowane w stronę kamery USB.
    5. W dniu nagrywania nakarm każdą rybę żywymi naupliami artemii, usuń wszystkie filtry gąbkowe i włącz podświetlenie na podczerwień.
    6. Rozpocznij nagrywanie 24 godziny rano (na przykład godzina rozpoczęcia to 9 rano, a godzina zakończenia to 9 rano następnego dnia). Rozpocznij nagrywanie wideo i zabezpiecz lokalizację, aby uniknąć zakłóceń. Okresowo sprawdzaj, czy nagrywanie jest uruchomione.
    7. Po 24 godzinach upewnij się, że film został zapisany poprawnie. Prześlij wideo do stacji roboczej komputera, aby śledzić i analizować zachowanie ryb.
  2. Analiza wideo
    1. Najpierw sprawdź jakość wideo, patrząc na oświetlenie. Sprawdź, czy w każdej sekcji znajduje się jedna ryba i czy nie ma żadnych obcych ruchów, które mogą spowodować błędne śledzenie.
    2. Przygotuj maskę, aby uniknąć błędnego śledzenia na zewnątrz akwarium. Zrób dwie maski: jedną dla "parzystych" i jedną dla "nieparzystych" ryb, w oparciu o ich kolejność w zbiornikach.
    3. Utwórz dwa foldery o nazwach "nieparzyste" i "parzyste" dla masek opisanych powyżej. Przenieś plik parametrów śledzenia SwisTrack do każdego z tych folderów.
    4. Otwórz plik parametrów śledzenia oprogramowania śledzącego SwisTrack (plik uzupełniający Tracking_odd.swistrack lub Tracking_even.swistrack). Określ ścieżkę do pliku wideo i pliku maski, a następnie zapisz plik parametrów śledzenia i wyjdź z niego. Dostosuj parametry liczby obiektów blob i maksymalnej liczby pikseli odpowiednio w komponentach "Wykrywanie obiektów blob" i "Śledzenie najbliższego sąsiada" zgodnie z eksperymentami.
    5. Kliknij dwukrotnie, aby uruchomić skrypt oprogramowania do automatyzacji win, który automatycznie otworzy oprogramowanie SwisTrack (plik uzupełniający swistrack_1.exe, swistrack_2.exe, swistrack_3.exe lub swistrack_4.exe - są to te same pliki wykonywalne), które pomaga w aktualizacji adaptacyjnego odejmowania tła w SwisTrack.
    6. Otwórz Tracking_odd.swistrack lub Tracking_even.swistrack w oprogramowaniu SwisTrack, aby załadować plik parametrów śledzenia. Po załadowaniu parametrów naciśnij przycisk uruchom, aby rozpocząć śledzenie.
    7. W ciągu początkowych 9 000 klatek (600 s, tj. pierwsze 10 minut nagranego filmu) sprawdź, czy śledzenie ryb działa, patrząc na adaptacyjne odejmowanie tła, maskę binarną i śledzenie najbliższego sąsiada na liście komponentów SwisTrack (patrz załączony film). Następnie wybierz opcję Adaptacyjne odejmowanie tła z listy Komponent.
    8. Naciśnij przycisk R na klawiaturze, aby wznowić automatyzację wygranej i pozostaw komputer do śledzenia. Śledzenie zajmie 5 - 7 godzin na 24 godziny wideo dla komputera stacjonarnego z 4 rdzeniami procesora i 8 GB pamięci. W zależności od potrzeb uruchamiaj wiele procesów SwisTrack (w tym nieparzyste i parzyste areny pojedynczego pliku wideo) do liczby rdzeni w procesorze. Na przykład 4-rdzeniowe mogą obsłużyć 4 filmy jednocześnie.
    9. Podczas tego śledzenia unikaj używania tego komputera do innych celów, ponieważ program do automatyzacji wygranej automatycznie przesuwa wskaźnik myszy. Początkowe 9 000 ramek zostanie odrzuconych w poniższej procedurze.
    10. Przydziel 3 pliki skryptów Perla (1.fillupGaps2.pl, 2.Calc_fish_id_moko_robust i 3.pl, 3.Sleep_summary_4cm_movingWindow.pl) do folderu zawierającego pliki śledzenia wygenerowane przez SwisTrack w folderach "parzyste" i "nieparzyste" (patrz krok 2.2.3).
    11. Przytnij jedną klatkę wideo z pliku wideo za pomocą VirtualDub i zaimportuj ten klip jako zdjęcie do ImageJ. Wybierz długość akwarium (45,9 cm) w ImageJ i oblicz stosunek pikseli do cm. Napisz stosunek pikseli do cm w 1.fillGaps2.pl w edytorze tekstu i zapisz.
    12. Uruchom program CygWin, emulator systemu Unix. Zlokalizuj folder SwisTrack, który zawiera 3 skrypty Perla, używając polecenia cd w wierszu poleceń.
    13. Uruchom skrypt Perl, wpisując Perl 1.fillGaps.pl. Te trzy skrypty Perla przypiszą każdy plik śledzenia do unikalnej komory akwarium i przeanalizują czas snu oraz odległość pływania, gdy ryby nie śpią. Zakończenie analizy zajmie 1-2 godziny.
    14. Oceń plik tekstowy o nazwie Summary_Sleep.txt, aby określić, czy liczba ramek pominiętych w analizie jest akceptowalnie niska; brakujące mniej niż 15% ramek uważa się za dopuszczalne.
    15. Skopiuj i wklej przeanalizowane wyniki z Summary_Sleep.txt do arkusza kalkulacyjnego z makrem (plik uzupełniający Sleep_12hr12hr_TEMPLATE.xlsm).
    16. Uruchom makro, aby wyodrębnić dane podsumowania plików śledzenia.

3. DASPMI lub DASPEI barwienie neuromasztów mechanosensorycznych

UWAGA: barwienie DASPMI i DASPEI jest światłoczułe i powinno być wykonywane w ciemnych warunkach. Następujący protokół dotyczy zarówno DASPMI, jak i DASPEI, używając DASPMI jako przykładu.

  1. Protokół barwienia
    1. Aby uzyskać w sumie 1 l roztworu podstawowego do barwienia (25 μg/ml), dodać 0,025 g kryształów DASPEI lub DASPMI do 1 l dH2O i pozostawić do rozpuszczenia przez noc. Przechowywać roztwór w temperaturze 4 °C i chronić przed światłem.
    2. Zanurzyć rybę w 2,5 μg/ml DASPMI lub DASPEI rozpuszczonych w kondycjonowanej wodzie (patrz krok 1.3.1) na 45 minut w ciemnym otoczeniu w temperaturze 22 °C.
    3. Po 45 minutach wyjąć ryby z roztworu DASPMI lub DASPEI i znieczulić przez zanurzenie w łaźni lodowej z kondycjonowaną wodą o stężeniu 66,7 μg/ml buforowanej soli 3-aminobenzoesanu metanu z buforem etylu (MS222).
    4. Zamontuj rybę na szalce Petriego i sfotografuj pod mikroskopem fluorescencyjnym. Zrób obrazy z-stack i zapisz je jako pliki .tif do poniższej analizy.
  2. Analiza obrazu za pomocą ImageJ
    1. Wewnątrz folderu zawierającego .tif pliki wklej szablon pliku makra ImageJ (Neuromast_ImageJ.txt) i utwórz nowy folder o nazwie "Process_ImageJ". W pliku makra ImageJ ustaw ścieżkę do bieżącego katalogu.
    2. Uruchom ImageJ i otwórz makro, przeciągając plik makra do graficznego interfejsu użytkownika lub klikając Plik > Otwórz i wybierając plik makra.
    3. Uruchom makro, klikając kolejno opcje Makra > Uruchom makro. Makro automatycznie otworzy plik obrazu do analizy. Jeśli plik obrazu nie zostanie otwarty, kliknij przycisk Makro > Pobierz plik.
    4. W celu kwantyfikacji Neuromast wybierz obszar zainteresowania za pomocą narzędzia Polygon Tool.
    5. Naciśnij skrótu 5, aby zduplikować obszar zainteresowania.
    6. Użyj narzędzia Malowanie, aby usunąć lub dodać kropki dla dodatkowego lub brakującego neuromastu z poprzedniego obrazu, a następnie naciśnij 6. Po trafieniu 6 pojawią się dwa nowe okna: schemat ponumerowanych kropek neuromastów oraz tabela z całkowitą liczbą neuromastów określoną ilościowo.
    7. Naciśnij 7, aby zapisać oba pliki: jeden plik jest przechowywany jako plik obrazu .tif, a drugi jest zapisywany jako plik .xls. Po zapisaniu tych plików otworzy się nowy plik obrazu do analizy.
    8. Skonsoliduj liczbę neuromastów każdej ryby w jednym arkuszu kalkulacyjnym, uruchamiając skrypt makra (SN_Number_Diameter.xlsm).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przedstawione tutaj wyniki są reprezentatywnymi przykładami tego, co można uzyskać za pomocą opisanych metod. W związku z tym, w zależności od warunków eksperymentalnych, wyniki dla ryb jaskiniowych i ryb powierzchniowych mogą nieznacznie odbiegać od zaprezentowanych w niniejszym opracowaniu.

Zachowanie przyciągania wibracyjnego

Reprezentatywne wyniki ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawione metody są łatwo dostępne, ale mogą być skomplikowane do wykonania ze względu na charakter ich darmowego pochodzenia. Dlatego zdecydowanie zaleca się przeprowadzenie próbnych testów i analiz przed jakimkolwiek faktycznym eksperymentem.

Tempo generowania danych może być szybkie po ustaleniu ram eksperymentalnych i analitycznych. Po ustaleniu możliwe jest zarejestrowanie dwóch ryb w ciągu 7 minut w teście VAB, 30 ryb w ciągu 24 godzin w teście aktywności/snu i jednej ryby w ciągu 2,...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy wszystkim członkom laboratorium Yoshizawa, w tym N. Cetraro, N. Simon, C. Valdez, C. Macapac, J. Choi, L. Lu, J. Nguyen, S. Podhorzer, H. Hernandes, J. Fong, J. Kato i I. Lord za opiekę nad rybami eksperymentalnymi użytymi w tym manuskrypcie. Dziękujemy również członkom laboratorium A. Keene, w tym P. Maskowi, za przeszkolenie MY w zakresie montażu kamery CCD na podczerwień. Na koniec chcielibyśmy podziękować Media Lab - College of Social Sciences - School of Communications na University of Hawai'i Mānoa za ich nieocenioną pomoc w tworzeniu filmu, szczególnie B. Smithowi, J. Lamowi i S. White'owi. Prace te były wspierane przez Hawaiian Community Foundation (16CON-78919 i 18CON-90818) oraz granty National Institute of Health NIGMS (P20GM125508) dla MY.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
4-Di-1-ASP (4-(4-(dimetyloaminostyryl)-1-metylopirydyny)MiliporeSigmaD3418
Długość fali 880 nm czarne światłoZaawansowane oświetlenieBL41192-880
avfsfreewareWersja 1.0.0.6http://turtlewar.org/avfs/
AvisynthfreewareWersja 2.6.0http://avisynth.nl/index.php/Main_Page
CygwinfreewareWersja 2.11.0https://www.cygwin.com/
Cylindryczna komora testowa (szklane naczynie Pyrex 325 ml)Corning3140-10010 cm średnica 5 cm wysokości
Ethovision XTNoldus Informacje  Technologia, Wageningen, HolandiaWersja 14https://www.noldus.com/animal-behavior-research/products/ethovision-xt
Akwarium rybne Cylinder Miękka gąbka Kamienny filtr wody,Jardin (przez Amazon.com)NAFiltr gąbkowy do systemu rejestracji snu/nadpobudliwości
krewetek solankowych klasy AKrewetki solankowe bezpośrednieBSEA16Z
ImageJ freewareWersja 1.52ehttps://imagej.nih.gov/ij/
macro 1.8/12.5-75mm obiektyw zmiennoogniskowy C-mountToyoNAPodłącz do USB webkamera za pomocą c-mount, który jest drukowany w drukarce 3D
Regulator neutralnySeachemNA
Odlewany optyk z tworzywa sztucznego Filtr długoprzepustowy IREdmund optyka43-948Pokrój na mały kawałek, aby zmieścił się w CCD kamery internetowej USB
pfmapfreewareBuild 178http://pismotec.com/download/ (w " Pobierz archiwum" link na dole)
Reef Crystals Reef SaltInstant OceanRC15-10
SwisTrackfreewareVersion 4https://en.wikibooks.org/wiki/SwisTrack
Kamera internetowa USB (kamera internetowa LifeCam Studio 1080p HD)MicrosoftQ2F-00013Wytnij 2-2,5 cm z przodu
WinAutomationfreewareWersja 8https://www.winautomation.com/ (bezpłatna samodzielna aplikacja do tej procedury)
System operacyjny WindowsMicrosoft7, 8 lub 10https://www.microsoft.com/en-us/windows
x264vfwfreewareNAhttps://sourceforge.net/projects/x264vfw/
Jaja

Bibliografia

  1. Keene, A. C., Yoshizawa, M., McGaugh, S. E. Biology and Evolution of the Mexican Cavefish. Biology and Evolution of the Mexican Cavefish. , Elsevier Inc. Amsterdam. (2015).
  2. Mitchell, R. W., Russell, W. H., Elliott, W. R. Mexican eyeless characin fishes, genus Astyanax: Environment, distribution, and evolution.Special publications the museum Texas Tech University. (12), Texas Tech Press. Texas. (1977).
  3. Wilkens, H. Evolution and genetics of epigean and cave Astyanax-fasciatus (Characidae, Pisces) - Support for the neutral mutation theory. Evolutionary Biology. 23, 271-367 (1988).
  4. Fumey, J., Hinaux, H., Noirot, C., Thermes, C., Rétaux, S., Casane, D. Evidence for late Pleistocene origin of Astyanax mexicanus cavefish. BMC Evolutionary Biology. 18 (1), 1-19 (2018).
  5. Yoshizawa, M., Gorički, S., Soares, D., Jeffery, W. R. Evolution of a behavioral shift mediated by superficial neuromasts helps cavefish find food in darkness. Current Biology. 20 (18), 1631-1636 (2010).
  6. Moran, D., Softley, R., Warrant, E. J. Eyeless Mexican cavefish save energy by eliminating the circadian rhythm in metabolism. PloS One. 9 (9), e107877(2014).
  7. Moran, D., Softley, R., Warrant, E. J. The energetic cost of vision and the evolution of eyeless Mexican cavefish. Science Advances. 1 (8), e1500363(2015).
  8. Yoshizawa, M., et al. The Evolution of a Series of Behavioral Traits is associated with Autism-Risk Genes in Cavefish. BMC Evolutionary Biology. 18 (1), 89(2018).
  9. Riddle, M. R., et al. Insulin resistance in cavefish as an adaptation to a nutrient-limited environment. Nature. 555 (7698), 647-651 (2018).
  10. Protas, M. E., et al. Genetic analysis of cavefish reveals molecular convergence in the evolution of albinism. Nature Genetics. 38 (1), 107-111 (2006).
  11. Yoshizawa, M., et al. Distinct genetic architecture underlies the emergence of sleep loss and prey-seeking behavior in the Mexican cavefish. BMC Biology. 13 (1), 15(2015).
  12. Duboué, E. R., Keene, A. C., Borowsky, R. L. Evolutionary convergence on sleep loss in cavefish populations. Current Biology. 21 (8), 671-676 (2011).
  13. Fernandes, V. F. L., Macaspac, C., Lu, L., Yoshizawa, M. Evolution of the developmental plasticity and a coupling between left mechanosensory neuromasts and an adaptive foraging behavior. Developmental Biology. 441 (2), 262-271 (2018).
  14. Pérez-Escudero, A., Vicente-Page, J., Hinz, R. C., Arganda, S., de Polavieja, G. G. idTracker: tracking individuals in a group by automatic identification of unmarked animals. Nature Methods. 11, 743(2014).
  15. Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nature Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
  16. Yoshizawa, M., Jeffery, W. R., Van Netten, S. M., McHenry, M. J. The sensitivity of lateral line receptors and their role in the behavior of Mexican blind cavefish (Astyanax mexicanus). Journal of Experimental Biology. 217 (6), (2014).
  17. Lee, A. Virtualdub. , http://www.virtualdub.org/ (2014).
  18. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  19. Cavallari, N., et al. A blind circadian clock in cavefish reveals that opsins mediate peripheral clock photoreception. PLoS Biology. 9 (9), e1001142(2011).
  20. Swimmer, B., Lang, H. H. Surface Wave Discrimination between Prey and Nonprey by the Back Swimmer Notonecta glauca L. (Hemiptera , Heteroptera ). 6 (3), Springer Stable. https://www.jstor.org/stable/4599284 233-246 (1980).
  21. Montgomery, J. C., Macdonald, J. A. Sensory Tuning of Lateral Line Receptors in Antarctic Fish to the Movements of Planktonic Prey. 235 (4785), American Association for the Advancement of Science Stable. https://www.jstor.org/stable/1698962 195-196 (1987).
  22. Prober, D. A., Rihel, J., Onah, A. A., Sung, R. J., Schier, A. F. Hypocretin/orexin overexpression induces an insomnia-like phenotype in zebrafish. The Journal of Neuroscience. 26 (51), 13400-13410 (2006).
  23. Zhdanova, I. V., Wang, S. Y., Leclair, O. U., Danilova, N. P. Melatonin promotes sleep-like state in zebrafish. Brain Research. 903 (1-2), 263-268 (2001).
  24. Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (95), e52321(2015).
  25. Rasband, W. S. Object Tracker. , https://imagej.nih.gov/ij/plugins/tracker.html (2000).
  26. Ferreira, T., Rasband, W. Create Shortcuts. ImageJ User Guide. , https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-31.html#sub:Create-Shortcuts... (2012).
  27. Lochmatter, T., Roduit, P., Cianci, C., Correll, N., Jacot, J., Martinoli, A. SwisTrack. , https://en.wikibooks.org/wiki/SwisTrack (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Zachowanie przyciągania wibracyjnegośledzenie ryb jaskiniowychAstyanax mexicanusbarwienie DASPEIanaliza SwisTracktworzenie masek binarnychprzetwarzanie skryptem Perlobrazowanie z podświetleniem podczerwieniąwysokoprzepustowe śledzenie behawioralne
Śledzenie behawioralne i obrazowanie neuromastu meksykańskich ryb jaskiniowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.