Artykuł metodologiczny

Adsorpcja zarodników jako nierekombinowany system wyświetlania enzymów i antygenów

6.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59102

⸱

19 marca 2019

 ,  , 
1Department of Biology, Federico II University, 2Department of Molecular Medicine and Medical Biotechnology, University of Naples "Federico II"

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół skupia się na wykorzystaniu zarodników bakteryjnych jako "żywego" narzędzia nanobiotechnologicznego do adsorpcji heterologicznych cząsteczek o różnych aktywnościach biologicznych. Przedstawiono również metody pomiaru wydajności adsorpcji.

Streszczenie

Zarodnik bakteryjny to metabolicznie spokojna komórka, utworzona przez szereg warstw ochronnych otaczających odwodnioną cytoplazmę. Ta osobliwa struktura sprawia, że zarodnik jest niezwykle stabilny i odporny, co sugeruje użycie zarodnika jako platformy do wyświetlania heterologicznych cząsteczek. Do tej pory na przetrwalnikach Bacillus subtilis i kilku innych gatunków wykazano różne antygeny i enzymy, początkowo metodą rekombinacyjną, a następnie prostą i skuteczną metodą nierekombinowaną. Nierekombinowany system wyświetlania opiera się na bezpośredniej adsorpcji heterologicznych cząsteczek na powierzchni zarodników, unikając budowy rekombinowanych szczepów i uwalniania genetycznie zmodyfikowanych bakterii do środowiska. Zaadsorbowane cząsteczki są stabilizowane i chronione przez oddziaływanie z zarodnikami, co ogranicza szybką degradację antygenów i utratę aktywności enzymu w niesprzyjających warunkach. Po użyciu, enzymy zaadsorbowane przez zarodniki mogą być łatwo zebrane przy minimalnym zmniejszeniu aktywności i ponownie wykorzystane do dodatkowych rund reakcyjnych. W artykule pokazano, jak adsorbować cząsteczki modelowe do oczyszczonych zarodników B. subtilis, jak oceniać skuteczność adsorpcji oraz jak zbierać zużyte zarodniki w celu recyklingu ich do nowych reakcji.

Wprowadzenie

Systemy wyświetlania mają na celu prezentację biologicznie aktywnych cząsteczek na powierzchni mikroorganizmów i znajdowanie zastosowań w różnych dziedzinach, od przemysłowych po medyczne i środowiskowe biotechnologie. Oprócz fagów1,2 oraz komórek różnych gatunków Gram-ujemnych i -dodatnich3,4,5,6,7, zarodniki bakterii zostały również zaproponowane jako systemy wyświetlania na dwa sposoby8,9.

Ze względu na swoją specyficzną strukturę, a mianowicie odwodnioną cytoplazmę otoczoną szeregiem warstw ochronnych10, zarodnik ma kilka zalet w porównaniu z systemami wyświetlania opartymi na fagach i komórkach8,9. Pierwszą zaletą jest wyjątkowa wytrzymałość i stabilność zarodników w warunkach, które byłyby szkodliwe dla wszystkich innych komórek10,11. Antygeny i enzymy wykazywane przez przetrwalniki są stabilne po długotrwałym przechowywaniu w temperaturze pokojowej12 i chronione przed degradacją przy niskim pH i wysokich temperaturach13. Drugą zaletą zarodników jest bezpieczeństwo wielu gatunków tworzących przetrwalniki. B. subtilis, B. clausii, B. coagulans i kilka innych gatunków są stosowane na całym świecie jako probiotyki i są dostępne na rynku do stosowania u ludzi lub zwierząt od dziesięcioleci14,15. Ten wyjątkowy rekord bezpieczeństwa jest oczywistym ogólnym wymogiem dla systemu wyświetlania powierzchniowego i ma szczególne znaczenie, gdy system jest przeznaczony do użytku przez ludzi lub zwierzęta16. Trzecią, ważną zaletą systemu wyświetlania opartego na zarodnikach jest to, że nie ma ograniczeń co do wielkości cząsteczki, która musi być wystawiona. W systemach opartych na fagach duże białko heterologiczne może wpływać na strukturę kapsydu, podczas gdy w systemach opartych na komórkach może wpływać na strukturę błony lub może ograniczać/upośledzać etap translokacji błony17. Warstwy ochronne otaczające zarodnik składają się z ponad 70 różnych białek10 i są wystarczająco elastyczne, aby przyjąć duże obce białka bez żadnych widocznych wad strukturalnych lub upośledzenia funkcjonalnego8. Ponadto, w przypadku obu systemów wyświetlania opartych na przetrwalnikach, translokacja błonowa białka heterologicznego nie jest wymagana8,9. Rzeczywiście, białka heterologiczne są albo wytwarzane w cytoplazmie komórki macierzystej i składane na zarodniku, który tworzy się w tej samej cytoplazmie, albo adsorbowane na dojrzałym zarodniku 8,9.

Wyświetlanie zarodników zostało początkowo uzyskane poprzez opracowanie systemu genetycznego do inżynierii powierzchni zarodników18. Ten system genetyczny opierał się na i) budowie fuzji genów między genem kodującym białko płaszcza przetrwalnikowego (używanym jako nośnik) a genem kodującym białko, które ma być wyświetlane - obecność sygnałów transkrypcyjnych i translacyjnych genu endogennego będzie kontrolować ekspresję fuzji, oraz ii) integracji genu chimerycznego z B. subtilis chromosomu, aby zapewnić stabilność genetyczną. To podejście rekombinacyjne wykazało różnorodność antygenów i enzymów, wykorzystując różne białka powierzchniowe zarodników jako nośniki i dążąc do różnych potencjalnych zastosowań, od szczepionki śluzówkowej po biokatalizator, bioczujnik, bioremediację lub narzędzie bioanalityczne8,13.

Ostatnio opracowano inne podejście do wyświetlania zarodników19. Ten drugi system jest nierekombinowany i opiera się na spontanicznej i niezwykle ścisłej adsorpcji cząsteczek na powierzchni zarodników9. Antygeny19,20 i enzymy13,21 zostały skutecznie wyświetlone i wykazały, że ta metoda jest znacznie bardziej efektywna niż metoda rekombinowana. To nierekombinowane podejście pozwala na wyświetlanie białek w formie natywnej20 i może być również używane z autoklawowanymi zarodnikami śmierci19. Molekularny mechanizm adsorpcji nie został jeszcze w pełni wyjaśniony. Ładunek ujemny i hydrofobowość zarodnika zostały zaproponowane jako właściwości istotne dla adsorpcji13,19,22. Ostatnio wykazano, że białko modelowe, czerwone białko autofluorescencyjne (mRFP) koralowca Discosoma, po adsorpcji do zarodnika, było w stanie przeniknąć przez warstwy powierzchniowe zlokalizowane w powłoce wewnętrznej23. Jeśli okaże się to prawdą w przypadku innych białek, wewnętrzna lokalizacja heterologicznych białek może wyjaśnić ich zwiększoną stabilność po adsorpcji do zarodników23.

W niedawnym badaniu, dwa enzymy katalizujące dwa kolejne etapy szlaku degradacji ksylanu były niezależnie wyświetlane na zarodnikach B. subtilis i, gdy były inkubowane razem, były w stanie przeprowadzić oba etapy degradacji21. Zarodniki zebrane po reakcji były nadal aktywne i zdolne do kontynuowania degradacji ksylanu po dodaniu świeżego substratu21. Nawet jeśli w drugim procesie reaction21 zaobserwowano utratę około 15% produktu końcowego, to dodatkowym ważnym atutem systemu wyświetlania zarodników jest możliwość ponownego wykorzystania zaadsorbowanych enzymów w reakcjach jedno- jak i wieloetapowych.

Pan et al.24 opisali dodatkowe podejście do wyświetlania heterologicznych białek na powierzchni zarodników: heterologiczne białka (białko endoglukanazy i białko beta-galaktozydazy) wytwarzane w komórce macierzystej podczas zarodnikowania były spontanicznie zamknięte w tworzącej się otoczce zarodników, bez potrzeby stosowania nośnika. Ten dodatkowy system wyświetlania zarodników jest połączeniem dwóch opisanych do tej pory podejść. Rzeczywiście, jest rekombinowany, ponieważ heterologiczne białka zostały zaprojektowane tak, aby ulegały ekspresji w komórce macierzystej podczas zarodnikowania, podczas gdy ich składanie w płaszczu było spontaniczne, a zatem nierekombinowane24. Jednak skuteczność wyświetlania tego dodatkowego podejścia musi zostać przetestowana i porównana z pozostałymi dwoma podejściami przy użyciu tych samych białek heterologicznych.

Obecny protokół wyklucza procesy produkcji i oczyszczania zarodników, które zostały szczegółowo opisane gdzie indziej24. Obejmuje ona reakcję adsorpcji, ocenę skuteczności adsorpcji za pomocą mikroskopii punktowej i fluorescencyjnej oraz recykling zaadsorbowanych enzymów do dodatkowych rund reakcyjnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Reakcja adsorpcji

  1. Inkubować 2, 5 i 10 μg mRFP z 2 x 109 oczyszczonymi zarodnikami B. subtilis typu dzikiego w 200 μl buforu wiążącego, 50 mM cytrynianu sodu, pH 4,0 (16,7 mM cytrynian sodu dwuwodny; 33,3 mM kwas cytrynowy) przez 1 godzinę w temperaturze 25 °C na kołyszącej się wytrząsarce (Rysunek 1).
  2. Odwirować mieszaniny wiążące (13 000 x g przez 10 min) w celu frakcjonowania granulek (P2, P5 i P10) i supernatantów (S2, S5 i S10). Przechowywać supernatanty w celu pośredniej oceny skuteczności adsorpcji opisanej w kroku 3.2.
  3. Przemyć granulki 2x 200 μL buforu wiążącego i ponownie zawiesić je w 100 μl buforu wiążącego i użyć do następnej analizy.
    UWAGA: Reakcja wiązania zachodzi preferencyjnie przy wartości pH niższej niż punkt izoelektryczny białka; zazwyczaj stosuje się 1,5 M soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS), pH 4,0 lub 50 mM cytrynianu sodu, pH 4,0.

2. Bezpośrednia ocena efektywności adsorpcji

  1. Ekstrakcja białek powierzchniowych i analiza western blot
    1. Weź 50 μl reprodukcji zarodników zaadsorbowanych przez mRFP (P2, P5 i P10 z kroku 1.3) i dodaj 50 μl 2x dodecylosiarczanu sodu (SDS)-ditiotreitolu (DTT) (0,1 M Tris-HCl, pH 6,8; 2% SDS; 0,1 M DTT), aby rozpuścić powierzchniowe białka przetrwalnikowe.
    2. Używaj wolnego, oczyszczonego mRFP i ekstraktów z tych samych ilości zarodników, które nie są adsorbowane do białka, jako odpowiednio kontroli pozytywnej i ujemnej.
    3. Po 45 minutach inkubacji w temperaturze 65 °C, odwirować (13 000 x g przez 10 minut) mieszaniny i przeanalizować 10 μl wyekstrahowanych białek (supernatantu) metodą western blot z przeciwciałem monoklonalnym anty-His rozpoznającym znacznik He obecny na N-końcu mRFP (Rysunek 2A).
  2. Obserwacje mikroskopem fluorescencyjnym
    UWAGA: Stosując fluorescencyjne białka heterologiczne lub przeprowadzając analizę immunofluorescencyjną, możliwe jest zlokalizowanie i ilościowe określenie zaadsorbowanych cząsteczek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
    1. Weź 5 μl rekompozycji zaadsorbowanych zarodników z kroku 1.3 i dodaj 95 μL 1x PBS, pH 4,0, aby uzyskać ~1 x 106 zarodników/μL.
    2. Umieścić 5 μl zawiesiny na szkiełku mikroskopowym, przykryć je szkiełkiem nakrywkowym uprzednio potraktowanym poli-l-lizyną przez 30 s i obserwować pod mikroskopem fluorescencyjnym.
    3. Dla każdego pola zapisz obraz z mikroskopii z kontrastem fazowym i obraz z mikroskopii fluorescencyjnej (Rysunek 2B).
      UWAGA: Alternatywnie, zarodniki fluorescencyjne można analizować za pomocą cytofluorymetrii. Ponownie zawiesić łącznie 106 zarodników zaadsorbowanych lub niezaadsorbowanych białkiem heterologicznym w 1 ml 1x PBS, pH 4,0 i przeanalizować zawiesinę za pomocą cytometru przepływowego (Rysunek 2C).
  3. Analiza danych za pomocą ImageJ
    1. Otwórz obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej za pomocą oprogramowania ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/) i sprawdź, czy wszystkie obrazy są w formacie 8-bitowym (punkt menu Obraz | Rodzaj | 8-bitowy).
    2. W razie potrzeby dostosuj kontrast (punkt menu Obraz | Dostosuj | Jasność Kontrast) i sprawdź, czy skala obrazu to PIKSEL (Obraz | Ustaw skalę).
    3. Z menu Analizuj wybierz opcję Ustaw miary. Upewnij się, że wybrano opcje Obszar, Gęstość zintegrowana i Średnia wartość szarości.
    4. Narysuj linię wokół interesującego Cię zarodnika za pomocą dowolnego narzędzia do rysowania/zaznaczania (np. koła, wielokąta lub dowolnego kształtu) (Rysunek 3).
    5. Wybierz Mierz z menu Analizuj (lub naciśnij cmd + M). Pojawia się wyskakujące okienko ze stosem wartości dla tego pierwszego zarodnika (Rysunek 3).
    6. Powtórz te dwa kroki dla co najmniej 50 innych zarodników w polu widzenia wybranym do pomiaru.
    7. Wybierz kilka obszarów bez żadnych zarodników (które nie mają fluorescencji) i powtórz pomiar; będzie to tło.
      UWAGA: Rozmiar nie jest ważny. Te odpowiednie wartości fluorescencji tła zostaną użyte do ręcznego odjęcia tła.
    8. Zaznacz wszystkie dane w oknie Wyniki i skopiuj wyniki do arkusza kalkulacyjnego.
    9. Obliczyć średnią zintegrowanej gęstości i powierzchni wybranych zarodników oraz wartości fluorescencji tła i wykorzystać je do uzyskania skorygowanej całkowitej fluorescencji na komórkę (CTCF) przy użyciu wzoru: CTCF = średnia gęstość zintegrowana - (średnia powierzchnia x średnia fluorescencja tła).
      UWAGA: Alternatywnie, jeśli wszystkie zarodniki wydają się dobrze oddzielone, możliwe jest przeanalizowanie wszystkich zarodników pola obrazu za pomocą funkcji Analizuj cząstki, postępując zgodnie z instrukcją ImageJ. Aby uniknąć sytuacji, w której oprogramowanie odczytuje określone agregaty fluorescencji lub zarodników, wymiar cząstek musi być ustawiony na pikselˆ2 = 50-200 (Rysunek 4).

3. Pośrednia ocena efektywności adsorpcji

  1. Przygotować seryjne rozcieńczenia dla oczyszczonego białka.
    1. Przygotować pierwszą probówkę o pojemności 1,5 ml zawierającą 250 μl oczyszczonego mRFP o końcowym stężeniu 0,5 ng/μl, używając buforu wiążącego. Ta objętość jest wystarczająca do załadowania dwóch pasów ruchu.
    2. Wykonać sześć dwukrotnych rozcieńczeń seryjnych po 250 μl (objętość końcowa) każde, używając buforu wiążącego.
  2. Przygotować dwukrotne seryjne rozcieńczenia dla próbek sklarowanych nad osadem zawierających niezwiązaną frakcję mRFP reakcji adsorpcji (S2, S5 i S10 z kroku 1.2).
    1. Umieścić 100 μl każdego supernatantu w probówce o pojemności 1,5 ml i dodać 100 μl buforu wiążącego. Wykonać sześć dwukrotnych rozcieńczeń seryjnych po 200 μl (objętość końcowa) każde, używając buforu wiążącego.
  3. Wyciąć membranę nitrocelulozową (odcięcie 0,45 μm) o wymiarach 9 cm x 10 cm, aby pokryć obszar 5 (liczba próbek) x 6 (liczba rozcieńczeń) punktów. Membrana nie powinna wystawać poza krawędź uszczelki aparatu do igłówek.
  4. Umieść wstępnie zwilżoną membranę w aparacie do plam punktowych. Usuń wszelkie pęcherzyki powietrza uwięzione między membraną a uszczelką. Przykryj nieużywaną część aparatu taśmą lub folią parafinową, aby zapobiec przepływowi powietrza przez te studzienki.
  5. Zmontuj aparat do igrania w kropki zgodnie z opisem producenta.
  6. Jeśli podczas montażu używana jest próżnia, należy ponownie uwodnić membranę 100 μl 1x PBS na studzienkę, aby zapewnić równomierne wiązanie antygenu i zapobiec powstawaniu halo lub słabego sygnału wykrywania.
  7. Delikatnie wyjmij bufor ze studzienek za pomocą podciśnienia. Gdy tylko roztwór buforowy spłynie ze wszystkich studzienek, zatrzymaj pompę próżniową i odłącz ją.
  8. Załaduj wzorzec na dwa najbardziej zewnętrzne pasy, a próbki na środku (Rysunek 5). Napełnić odpowiednie studzienki 100 μl każdego rozcieńczenia. Ta sama objętość użyta dla każdej studzienki powinna zapewnić jednorodną filtrację wszystkich studzienek na próbki.
  9. Włącz pompę próżniową na 2 minuty, zatrzymaj ją, a następnie pozwól próbce przefiltrować się przez membranę przez przepływ grawitacyjny.
  10. Umyć wszystkie studzienki 100 μl 1x PBS i pozostawić pompę próżniową na pracę przez kolejne 5 minut po całkowitym opróżnieniu buforu płuczącego z aparatu.
  11. Przy włączonym odkurzaczu poluzuj i ostrożnie otwórz aparat do iluminacji punktowej.
  12. Wyłącz próżnię, weź membranę i przetwarzaj ją zgodnie z protokołem western blot.
  13. Wykonaj analizę densytometryczną filtra przy użyciu odpowiedniego oprogramowania, takiego jak ImageJ.
    1. Zmierz zintegrowaną gęstość każdej kropki, obrysowując je okręgiem o tym samym obszarze i używając polecenia Analizuj/Mierz.
    2. Dokonaj korekcji tła obrazu, rysując okrąg w pustym obszarze i mierząc jego zintegrowaną gęstość lub używając polecenia Przetwarzaj/Odejmij tło.
    3. Skoreluj zintegrowaną gęstość punktów wzorcowych z ilością załadowanego białka i uzyskaj linię kalibracyjną (wartości R2 dla krzywych kalibracyjnych powinny przekraczać 0,95).
    4. Użyj krzywej kalibracyjnej, aby ekstrapolować stężenie mRFP w każdej kropce próbki.
    5. Obliczyć stężenie mRFP pozostającego we frakcjach niezwiązanych.
      UWAGA: Aby zapewnić prawidłowe zamknięcie aparatu do igrania, a tym samym poddać membranę równomiernemu ciśnieniu, dokręć zgodnie ze schematem skrzyżowanym po przekątnej, a następnie otwórz pompę próżniową, aby mocniej dokręcić.

4. Zbieranie i ponowne wykorzystanie zarodników

  1. W celu recyklingu zaadsorbowanych zarodników należy przeprowadzić dwie reakcje adsorpcji 2,0 x 109 oczyszczonych zarodników z 10 μg oczyszczonej ksylanazy GH10-XA lub 10 μg oczyszczonej β-ksylozydazy GH3-XT, jak opisano w krokach 1.1-1.3 (Rysunek 6A).
  2. Zebrać granulki zawierające zaadsorbowane przez enzym zarodniki, zawiesić je ponownie w 50 μl optymalnego buforu do testu reakcji enzymatycznej (50 mM bufor fosforanu sodu o pH 6,5; 2,48689 g/L Na2HPO4, 4,88991 g/L NaH2PO4) i wymieszać je ze sobą w celu uzyskania 100 μl mieszaniny zarodników adsorbujących GH10-XA lub GH3-XT.
  3. Dodać substrat (5 mg/ml 4-O-metylo-d-glukuronod-ksylanu [MGX]) i pozostawić reakcje enzymatyczne na 16 godzin w temperaturze 65 °C.
  4. Mieszaninę reakcyjną należy odwirować (przez 15 minut przy 13 000 x g) i przechowywać supernatant zawierający produkt reakcji enzymatycznej.
  5. Zawiesić osad w 100 μl świeżego 50 mM buforu fosforanu sodu o pH 6,5 w obecności nowego podłoża (MGX) (Rysunek 6B).
    UWAGA: Aby adsorpować więcej niż jeden enzym, możliwe jest adsorpowanie obu razem lub pojedynczo niezależnie. Ta ostatnia możliwość ułatwia ilościową analizę wydajności adsorpcji i aktywności każdego enzymu, umożliwiając równowagę stechiometryczną każdego enzymu potrzebnego do reakcji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Prawidłową adsorpcję można ocenić za pomocą metody western blotting. Po zakończeniu reakcji mieszaninę frakcjonuje się poprzez wirowanie i przemywa, a frakcję osadu (Rysunek 1) wykorzystuje się do ekstrakcji białek powierzchniowych. Ekstrakt jest frakcjonowany za pomocą elektroforezy białek w żelu poliakrylamidowym z SDS (SDS-PAGE), przenoszony elektroforetycznie na membranę z polifluorku winylidenu (PVDF), a następnie poddawany reakcji z przeciwciałami pierw...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ten protokół adsorpcji zarodników jest bardzo prosty i nieskomplikowany. Reakcja jest ściśle zależna od pH buforu reakcyjnego, a wydajność adsorpcji jest optymalna przy kwaśnych wartościach pH (pH 5,0 lub niższym). W neutralnych warunkach pH skuteczność adsorpcji jest niska, a przy zasadowych wartościach pH adsorpcja może nie wystąpić. Optymalna adsorpcja uzyskuje się przy użyciu objętości 200 μl w probówkach o pojemności 1,5 ml (lub przy zachowaniu podobnych proporcji) na wytrząsarce kołyszącej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez "Finanziamento di Ricerca di Ateneo" do L. Baccigalupi, tytuł projektu "SP-LAY: Zarodniki bakteryjne jako żywa platforma do wyświetlania białek".

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,1% roztwór poli-L-lizynySigmaP8920
0,45 &mikro; m Nitceluloza Blotting MembraneSartoriusM_Blotting_Membranes
100 razy; obiektywny UPlanF1 Sprzętmikroskopowy Olympus
Bacillus subtilis  szczep NCIB3610Bacillus Genetic Stock Center3A1
BD ACCURI C6 PLUSBDcytometr
BX51OlympusMikroskop
ClarityBiorad1705060
DP70 aparat cyfrowy asprzętmikroskopowy Olympus
Kozioł anty-królik IgG (H + L) Adsorbowane krzyżowo przeciwciało wtórne, FITCThermo fisherF-2754
Kozia IgG Przeciw Królikowi H& L (HRP) Abcamab6721
Monoklonalna anty-polihistydyna− Przeciwciało przeciwko peroksydazieSigmaA7058-1VLsłuży do wykrywania zaadsorbowanych białek prezentujących znacznik 6xhistydyny na końcu C lub N 
Bezpieczny poślizg  szkiełko nakrywkoweszklane SigmaS1815-1PAK
Superbiałe nienaładowane szkiełka mikroskopoweVWR75836-190
U-CA Zmieniacz powiększenia Sprzętdo mikroskopów Olympus
przepływowyfluorescencyjny

Bibliografia

  1. Felici, F., et al. Peptide and protein display on the surface of filamentous bacteriophage. Biotechnology Annual Review. 1, 149-183 (1995).
  2. Cortese, R., et al. Identification of biologically active peptides using random libraries displayed on phage. Current Opinion in Biotechnology. 6, 73-80 (1995).
  3. Sousa, C., Cebolla, A., de Lorenzo, V. Enhanced metalloadsorption of bacterial cells displaying poly-His peptides. Nature Biotechnology. 14, 1017-1020 (1996).
  4. Richins, R., Kaneva, I., Mulchandani, A., Chen, W. Biodegradation of organophosphorus pesticides by surface-expressed organophosphorus hydrolase. Nature Biotechnology. 15, 984-987 (1997).
  5. Wu, J. Y., et al. Expression of immunogenic epitopes of hepatitis B surface antigen with hybrid flagellin proteins by a vaccine strain of Salmonella. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86, 4726-4730 (1989).
  6. Newton, S. M., Jacob, C. O., Stocker, B. A. Immune response to cholera toxin epitope inserted in Salmonella flagellin. Science. 244, 70-72 (1989).
  7. Fischetti, V. A., Medaglini, D., Pozzi, G. Gram-positive commensal bacteria for mucosal vaccine delivery. Current Opinion in Biotechnology. 7, 659-666 (1996).
  8. Isticato, R., Ricca, E. Spore surface display. Microbiology Spectrum. 2 (5), (2014).
  9. Ricca, E., et al. Mucosal vaccine delivery by non-recombinant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 13, 115(2014).
  10. McKenney, P. T., Driks, A., Eichenberger, P. The Bacillus subtilis assembly and functions of the multilayered coat. Nature Reviews Microbiology. 11, 33-44 (2013).
  11. Knecht, L. D., Pasini, P., Daunert, S. Bacterial spores as platforms for bioanalytical and biomedical applications. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 400, 977-989 (2011).
  12. Isticato, R., Cangiano, G., De Felice, M., Ricca, E. Display of molecules on the spore surface. Bacterial Spore Formers: Probiotics and Emerging Applications. Ricca, E., Henriques, A. O., Cutting, S. M. , Horizon Bionsciences. Norfolk, UK. 193-200 (2004).
  13. Sirec, T., et al. Adsorption of β-galactosidase of Alicyclobacillus acidocaldaricus wild type and mutant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 11, 100(2012).
  14. Cutting, S. M. Bacillus probiotics. Food Microbiology. 28, 214-220 (2011).
  15. Baccigalupi, L., Ricca, E., Ghelardi, E. Non-LAB Probiotics: Spore Formers. Probiotics and Prebiotics: Current Research and Future Trends. Venema, K., Do Carmo, A. P. , Caister Academic Press. 93-103 (2014).
  16. Cutting, S. M., Hong, H. A., Baccigalupi, L., Ricca, E. Oral Vaccine Delivery by Recombinant Spore Probiotics. International Reviews of Immunology. 28, 487-505 (2009).
  17. Lee, S. Y., Choi, J. H., Xu, Z. Microbial cell-surface display. Trends in Biotechnology. 21, 45-52 (2003).
  18. Isticato, R., et al. Surface display of recombinant proteins on Bacillus subtilis spores. Journal of Bacteriology. 183, 6294-6301 (2001).
  19. Huang, J. M., et al. Mucosal delivery of antigens using adsorption to bacterial spores. Vaccine. 28, 1021-1030 (2010).
  20. Isticato, R., et al. Non-recombinant display of the B subunit of the heat labile toxin of Escherichia coli wild type and mutant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 12, 98(2013).
  21. Mattossovich, R., et al. Conversion of xylan by recyclable spores of Bacillus subtilis thermophilic enzymes. Microbial Cell Factories. 16, 218(2017).
  22. Pesce, G., et al. Surface charge and hydrodynamic coefficient measurements of Bacillus subtilis by optical tweezers. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 116, 568-575 (2014).
  23. Donadio, G., et al. Localization of a red fluorescence protein adsorbed on wild type and mutant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 15, 153(2016).
  24. Pan, J. G., Choi, S. K., Jung, H. C., Kim, E. J. Display of native proteins on Bacillus subtilis spores. FEMS Microbiology Letters. 358, 209-217 (2014).
  25. Cutting, S., Vander Horn, P. B. Genetic analysis. Molecular Biological Methods for Bacillus. Harwood, C., Cutting, S. , John Wiley & Sons. Chichester, UK. (1990).
  26. Lanzilli, M., et al. Display of the peroxiredoxin Bcp1 of Sulfolobus solfataricus probiotic spores of Bacillus megaterium. New Biotechnology. 46, 38(2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

zarodniki bakteryjneekspozycja enzym wekspozycja antygen wmikroskopia fluorescencyjnaWestern blotanaliza dot blotkwantyfikacja w programie ImageJrecykling zarodnik w

Powiązane artykuły