Method Article

Charakterystyka zmian modyfikacji potranslacyjnej histonów w modelach neurodegeneracyjnej proteinopatii drożdży

DOI:

10.3791/59104

⸱

March 24th, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Chemistry Department, Brooklyn College, 2Ph.D. Program in Biochemistry, Graduate Center of the City University of New York, 3Ph.D. Program in Chemistry, Graduate Center of the City University of New York, 4Ph.D. Programs in Chemistry, Biochemistry, and Biology, Graduate Center of the City University of New York

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół przedstawia procedury eksperymentalne do charakteryzowania zmian w całym genomie w poziomach modyfikacji potranslacyjnych histonów (PTM) występujących w związku z nadekspresją białek związanych z ALS i chorobą Parkinsona w modelach Saccharomyces cerevisiae. Po oddzieleniu SDS-PAGE poszczególne poziomy PTM histonów są wykrywane za pomocą przeciwciał specyficznych dla modyfikacji za pomocą Western blot.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroby neurodegeneracyjne, takie jak stwardnienie zanikowe boczne (ALS) i choroba Parkinsona (PD), powodują utratę setek tysięcy istnień ludzkich każdego roku. Brakuje skutecznych metod leczenia, które mogłyby zatrzymać postęp choroby. Pomimo szeroko zakrojonych wysiłków związanych z sekwencjonowaniem w dużych populacjach pacjentów, większość przypadków ALS i PD pozostaje niewyjaśniona wyłącznie przez mutacje genetyczne. Mechanizmy epigenetyczne, takie jak potranslacyjna modyfikacja białek histonowych, mogą być zaangażowane w etiologię i progresję chorób neurodegeneracyjnych oraz prowadzić do nowych celów interwencji farmaceutycznej. Modele ALS i PD u ssaków in vivo i in vitro są kosztowne i często wymagają długotrwałych i pracochłonnych protokołów eksperymentalnych. W tym miejscu przedstawiamy praktyczne, szybkie i opłacalne podejście do określania zmian w poziomach modyfikacji histonów w całym genomie przy użyciu Saccharomyces cerevisiae jako systemu modelowego. Protokół ten pozwala na kompleksowe badania zmian epigenetycznych związanych z proteinopatiami neurodegeneracyjnymi, które potwierdzają wcześniejsze odkrycia w różnych systemach modelowych, jednocześnie znacznie poszerzając naszą wiedzę na temat epigenomu choroby neurodegeneracyjnej.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroby neurodegeneracyjne to wyniszczające choroby, które mają niewiele lub nie mają żadnych opcji leczenia. Wśród nich szczególnie przerażające są stwardnienie zanikowe boczne (ALS) i choroba Parkinsona (PD). Około 90% przypadków ALS i PD uważa się za sporadyczne, występujące bez rodzinnego wywiadu choroby, podczas gdy pozostałe przypadki występują w rodzinach i są na ogół związane z określoną mutacją genu1,2. Co ciekawe, obie te choroby są związane z błędną lokalizacją i agregacją białek3,4,5,6. Na przykład połączone w mięsaku (FUS) i białko wiążące DNA TAR 43 (TDP-43) to białka wiążące RNA, które błędnie lokalizują się w cytoplazmie i agregują w ALS7,8,9,10,11,12, podczas gdy α-synukleina jest głównym składnikiem agregatów białkowych określanych jako ciała Lewy'ego w PD5,13,14,15.

Pomimo szeroko zakrojonych wysiłków związanych z asocjacją całego genomu w dużych populacjach pacjentów, przytłaczająca większość przypadków ALS i PD pozostaje niewyjaśniona genetycznie. Czy epigenetyka może odgrywać rolę w chorobach neurodegeneracyjnych? Epigenetyka obejmuje zmiany w ekspresji genów zachodzące bez zmian w podstawowej sekwencji DNA16. Główny mechanizm epigenetyczny obejmuje modyfikacje potranslacyjne (PTM) białek histonowych16. W komórkach eukariotycznych materiał genetyczny jest szczelnie owinięty chromatyną. Jednostką zasadową chromatyny jest nukleosom, składający się ze 146 par zasad DNA owiniętych wokół oktamera histonu, złożonego z czterech par histonów (po dwie kopie histonów H2A, H2B, H3 i H4)17. Każdy histon ma N-końcowy ogon, który wystaje z nukleosomu i może być modyfikowany przez dodanie różnych ugrupowań chemicznych, zwykle na resztach lizyny i argininy18. Te PTM są dynamiczne, co oznacza, że można je łatwo dodawać i usuwać, i obejmują grupy takie jak acetylacja, metylacja i fosforylacja. PTM kontrolują dostępność DNA dla maszynerii transkrypcyjnej, a tym samym pomagają kontrolować ekspresję genów18. Na przykład, acetylacja histonów zmniejsza siłę oddziaływania elektrostatycznego między wysoce zasadowym białkiem histonowym a ujemnie naładowanym szkieletem DNA, dzięki czemu geny upakowane przez acetylowane histony są bardziej dostępne, a tym samym wysoce ekspresyjne19. Ostatnio niezwykła swoistość biologiczna poszczególnych histonów PTM i ich kombinacji doprowadziła do hipotezy kodu histonowego20,21, w której białka, które zapisują, usuwają i odczytują histonowe PTM, działają zgodnie w celu modulowania ekspresji genów.

Drożdże to bardzo przydatny model do badania neurodegeneracji. Co ważne, wiele neuronalnych ścieżek komórkowych jest zachowanych od drożdży do ludzi22,23,24. Drożdże podsumowują fenotypy cytotoksyczności i inkluzje białek po nadekspresji FUS, TDP-43 lub α-synukleiny22,23,24,25,26. W rzeczywistości modele Saccharomyces cerevisiae ALS zostały wykorzystane do identyfikacji genetycznych czynników ryzyka u ludzi27. Co więcej, nadekspresja ludzkiej α-synukleiny drożdży pozwoliła na scharakteryzowanie sieci Rsp5 jako celu leczniczego w celu złagodzenia toksyczności α-synukleiny w neuronach28,29.

Tutaj opisujemy protokół wykorzystujący Saccharomyces cerevisiae do wykrywania zmian PTM w całym genomie histonów związanych z neurodegeneracyjnymi proteinopatiami (Rysunek 1). Zastosowanie S. cerevisiae jest bardzo atrakcyjne ze względu na łatwość użycia, niski koszt i szybkość w porównaniu z innymi modelami neurodegeneracji in vitro i zwierzęcymi. Wykorzystując wcześniej opracowane modele ALS i PD22,23,25,26, mamy nadekspresję ludzkiego FUS, TDP-43 i α-synukleiny w drożdżach i odkryliśmy wyraźne zmiany PTM histonów występujące w związku z każdą proteinopatią30. Protokół, który tutaj opisujemy, może zostać ukończony w mniej niż dwa tygodnie od transformacji do analizy danych.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przekształcanie S. cerevisiae za pomocą neurodegeneracyjnych konstruktów białkowych związanych z proteinopatią

  1. Drożdże typu dzikiego (WT) 303 uprawiać w bulionie z ekstraktu drożdżowego, dekstrozy peptonowej (YPD) przez noc z wytrząsaniem (200 obr./min) w temperaturze 30 °C.
  2. Po 12−16 godzinach wzrostu rozcieńczyć drożdże do gęstości optycznej przy 600 nm (OD600) 0,25 za pomocą YPD. Ponieważ do każdej przemiany potrzebne będzie 10 ml płynnej kultury drożdży, należy przygotować 50 ml płynnej kultury drożdży do pięciu przemian odpowiadających konstruktom FUS, TDP-43, a-synukleiny i tylko wektorom (ccdB), a także transformacji kontroli ujemnej bez DNA.
  3. Drożdże uprawiać mieszając w temperaturze 30 °C, aż do osiągnięcia OD600 między 0,60 a 0,80. Zwykle zajmuje to 4-6 godzin.
  4. Trzydzieści minut przed zakończeniem wzrostu drożdży zlinearyzuj konstrukty plazmidowe.
    UWAGA: Użyte tutaj konstrukty plazmidowe muszą być zintegrowane bezpośrednio z genomem, a zatem linearyzacja jest wymagana przed transformacją.
    1. Obliczyć objętość zapasu plazmidu, która wynosi 1 μg. Odejmij tę objętość od 44 μl, aby obliczyć ilość potrzebnej ilości wolnego od nukleazH2O.
    2. Dodać H2O wolne od nukleaz, 5 μl 10x buforu enzymu restrykcyjnego (tabela materiałów), 1 μl enzymu restrykcyjnego NheI (tabela materiałów) i odpowiednią ilość plazmidu (obliczoną w kroku 1.4.1) do probówki mikrowirówkowej. Dokładnie wymieszać, pipetując w górę i w dół, i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut. Plazmid jest teraz zlinearyzowany i gotowy do transformacji.
  5. Gdy kultura drożdży osiągnie OD600 0,6-0,8, zebrać komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i wirować w dół przy 850 x g w temperaturze 4 °C przez 3 minuty. Odrzucić supernatant.
  6. Przemyć osad komórkowy w 10 ml sterylnegoH2Oi odwirować w temperaturze 850 x g w temperaturze 4 °C przez 3 minuty. Odrzucić supernatant. Powtórz 3 razy, w sumie cztery prania.
  7. Na początku trzeciego płukania rozmrozić i gotować 10 μl DNA plemników łososia na reakcję przemiany przez 5 minut na bloku grzewczym.
  8. Zawiesić osad komórkowy w 100 μl dH2O na przemianę i rozbić na odpowiednią liczbę probówek do mikrowirówek. W przypadku pięciu przemian ponownie zawiesić osad w 500 μl dH2O i równomiernie rozbić na pięć oddzielnych probówek do mikrowirówek.
  9. Wirować przez 5 minut przy 850 x g w temperaturze pokojowej (RT) i usunąć całą pozostałą wodę.
  10. Dodać, w następującej kolejności, 50 μl sterylnegoH2O, 240 μl 50% glikolu polietylenowego (PEG), 36 μl 1 M LiAc, 10 μl DNA plemników łososia, 20 μl zlinearyzowanego plazmidowego DNA (lub wody wolnej od nukleaz bez transformacji kontrolnej DNA). Dokładnie wymieszaj po każdym dodaniu i krótko zmieszaj po dodaniu wszystkich składników przemiany.
  11. Inkubować reakcje przemian w temperaturze 42 °C przez 20 min.
    UWAGA: Przeprowadź tę inkubację w łaźni wodnej, aby uzyskać bardziej spójną kontrolę temperatury.
  12. Wirować przy 470 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić każdą komórkę w 200 μl sterylnegoH2O.
  13. Zawiesinę drożdży na płytkach z selektywnymi podłożami i rozprowadzić za pomocą kulek do walcowania lub rozsiewacza. Inkubować płytki przez 2-3 dni w temperaturze 30 °C.
    UWAGA: Płytki zdefiniowane syntetycznie (SD)-He są używane do opisywanych tutaj plazmidów.

2. Badanie tłumienia wzrostu i przechowywania kolonii w zasobach glicerolu

  1. Zaszczepić pojedyncze kolonie z płytek transformacyjnych w 5 ml selektywnej pożywki uzupełnionej 2% rafinozą. Uprawiać na wytrząsarce w temperaturze 30 °C przez noc. Wybierz co najmniej 12 kolonii na transformację.
    UWAGA: Nie oczekuje się żadnych kolonii na płytce kontrolnej transformacji "bez DNA".
  2. Wysterylizuj żabkę szpilkową etanolem, a następnie podpal.
  3. Dla każdej hodowli należy podać 100 μl nasyconej zawiesiny komórek w pierwszym rzędzie płytki 96-dołkowej. Dodać 200 μl sterylnegoH2Odo wszystkich studzienek sąsiednich kolumn studzienkowych. W przypadku rozcieńczeń seryjnych w stosunku 1:5 dodać 50 μl z pierwszej kolumny do sąsiedniej kolumny z tyłu za pomocą pipety wielokanałowej. Dokładnie wymieszać pipetując. Następnie dodać 50 μl z drugiej kolumny do trzeciej kolumny i wymieszać pipetując. Powtórz to dla reszty talerza.
  4. Drożdże należy poszczepić, umieszczając froggera w 96-dołkowej płytce, a następnie stemplować, delikatnie i równomiernie dociskając selektywne płytki z galaktozą i bez galaktozy. Inkubować w temperaturze 30 °C przez 2-3 dni.
    UWAGA: Płytki SD-His i SGal-His są używane do opisywanych tutaj plazmidów.
  5. W przypadku przemian FUS, TDP-43 i a-synukleiny zidentyfikuj kolonię wykazującą największą supresję wzrostu w obecności galaktozy. Wybierz tę kolonię z płytki SD-His i zaszczepij w 10 ml selektywnej pożywki uzupełnionej 2% rafinozą w celu wzrostu przez noc. Do kontroli wektora wybierz kolonię, która nie wykazuje zahamowania wzrostu w obecności galaktozy.
  6. Aby przygotować zapasy glicerolu, połącz 0,5 ml nasyconej płynnej kultury z 0,5 ml 50% glicerolu. Mieszać pipetując w górę i w dół i zamrażać w temperaturze -80 °C.
    UWAGA: Zapasy glicerolu można przechowywać do roku w temperaturze -80 °C.

3. Nadekspresja białek związanych z neurodegeneracyjną proteinopatią u S. cerevisiae

  1. Z zamrożonych zapasów glicerolu ponownie rozprowadzić drożdże na histydynie, 2% pochodnych pożywkach z agarem glukozowym i inkubować w temperaturze 30 °C przez 2-3 dni.
  2. Zaszczepić pojedyncze kolonie dla każdego z modeli nadekspresji i kontrolować w 5 ml selektywnej pożywki płynnej z histydyną uzupełnioną 2% rafinozą. Rosnąć przez wytrząsanie (200 obr./min) w temperaturze 30 °C przez noc.
  3. Hoduj 100 ml płynnej kultury dla każdego z modeli nadekspresji i kontroli (FUS, TDP-43 i kontrola wektorowa; kontrola a-synukleiny i wektora).
    1. Przygotuj 100 ml kultury w selektywnych pożywkach uzupełnionych 2% galaktozą.
    2. Zmierz OD600 kultur nocnych i oblicz ilość kultury nocnej potrzebnej do renderowania kultur nadekspresji przy początkowym OD600 wynoszącym 0,3. Zazwyczaj posiewy nocne osiągają OD600 0,9-10, co wymaga około 5 ml hodowli przez noc, aby rozpocząć 100 ml świeżej hodowli.
    3. Indukować nadekspresję białka poprzez hodowlę drożdży na pożywkach galaktozy (patrz krok 3.3.1) przez 5 godzin (FUS i TDP-43) lub 8 godzin (a-synukleina) z wytrząsaniem w temperaturze 30 °C.
  4. Zmierz OD600 każdej kultury pod koniec okresu indukcji. Ustandaryzuj wszystkie liczby komórek do najniższej wartości OD600. Zebrać posiew w probówkach o pojemności 50 ml, odwirowując przy 850 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
    UWAGA: Jeśli wartości OD600 zmierzone na końcu indukcji wynoszą odpowiednio 0,654 i 0,984 dla 100 ml kultury a-synukleiny i 100 ml kultury kontrolnej, należy zebrać 95 ml kultury a-synukleinowej i 67,1 ml kultury kontrolnej.
  5. Zawiesić osad w 1 ml sterylnego dH2O na każde 10 ml wyhodowanej kultury. Równomiernie rozdrobnić osad, dzieląc 1 ml reprodukcji komórek do probówek do mikrowirówek. Na przykład, jeśli zaczynasz od 100 ml hodowli, ponownie zawieś osad w 10 ml sterylnego dH2O i podziel go na 10 probówek do mikrowirówek.
  6. Wirować przy 850 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, a następnie usunąć supernatant. Zatrzaskowe granulki komórek zamrażać w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C.
    UWAGA: Granulki komórkowe można przechowywać w temperaturze -80 °C przez okres do jednego roku.

4. Liza komórek i western blot w celu wykrycia modyfikacji potranslacyjnych histonów

  1. Liza komórek
    1. Rozmrozić granulki komórek drożdży na lodzie i ponownie zawiesić granulki komórkowe w 100 μL dH2O.
    2. Do resuspensji komórek dodać 300 μl 0,2 M NaOH i 20 μl 2-merkaptoetanolu. Zawiesić pipetując w górę i w dół.
    3. Inkubować komórki na lodzie przez 10 minut, a następnie odwirować przy 3 200 x g na wirówce stołowej przez 30 s w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant.
    4. Zawiesić osad komórkowy w 100 μl 1x barwnika ładującego i gotować przez 10 minut na bloku grzewczym.
      UWAGA: Przepis na 6-krotne obciążenie barwnika można znaleźć w Tabeli Materiałów.
  2. Elektroforeza w żelu poliakryloamidowym dodecylosiarczanu sodu i przenoszenie membrany
    1. Przygotować komorę żelową, umieszczając dwa żele w uchwycie na żel i wypełniając wewnętrzną komorę do góry buforem do pracy i wypełniając komorę zewnętrzną do znaku linii dwóch żeli.
    2. Załadować 15 μl próbki z etapu 4.1.4 na studzienkę do 10-dołkowego żelu poliakrylamidowego o stężeniu 12%. W przypadku pasa drabinki białkowej załaduj 5 μl.
    3. Uruchom żel przez około 45 minut przy napięciu 150 V lub do momentu, gdy przód barwnika dotknie dna żelu.
    4. Podczas pracy żelu przygotuj się do przeniesienia membrany, mocząc podkładki z włókna (po dwie na żel) w buforze transferowym (tabela materiałów) i nasączając membranę z polifluorku winylidenu (PVDF) w metanolu. Przed transferem przepłukać membranę w buforze transferowym.
      UWAGA: Membranę PVDF należy przyciąć do rozmiaru żelu i używać jednej membrany PVDF na każdy przenoszony żel.
    5. Na półsuchym ogniwie aparatu transferowego umieścić "kanapkę" transferową: od dolnej elektrody umieścić (1) wstępnie namoczoną podkładkę z włókna, (2) wstępnie namoczoną i przepłukaną membranę PVDF, (3) żel z kroku 4.2.3 i (4) drugą wstępnie namoczoną podkładkę z włókna.
      UWAGA: Upewnij się, że nie ma pęcherzyków powietrza w "kanapce" do przenoszenia. Delikatnie zwiń "kanapkę" pipetą serologiczną, aby usunąć bąbelki. Po umieszczeniu żelu na membranie PDVF należy uważać, aby jej nie przesuwać.
    6. Przeprowadzić transfer białka, ustawiając zasilacz na 150 mA na 1 godzinę (na jedną "kanapkę").
  3. Wykrywanie histonów PTM z przeciwciałami specyficznymi dla modyfikacji
    1. Usunąć membranę z aparatu transferowego. Spłukać krótko dH2O.
      1. Opcjonalnie sprawdź transfer białek za pomocą barwnika Ponceau-S, wlewając tyle barwnika Ponceau-S, aby pokryć błonę, do małego plastikowego pudełka i inkubując w temperaturze RT z delikatnym wstrząsem przez 30−60 s. Usuń plamę Ponceau-S i spłucz dH2O, aż plama tła zniknie, a pasma białkowe będą widoczne gołym okiem. Kontynuuj płukanie za pomocądH 2O, aż cała plama zostanie usunięta z membrany.
    2. Zablokuj błonę poprzez inkubację blot przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z delikatnym kołysaniem za pomocą buforu blokującego bufor soli fizjologicznej tris (TBS) (Tabela materiałów) w małym pudełku do barwienia. Użyj wystarczającej ilości bufora blokującego, aby zakryć blot.
      UWAGA: Uważaj, aby umieścić membranę pionowo w pudełku do barwienia, tak aby strona membrany, na której leżą białka, nie była skierowana w dół.
    3. Inkubować blot w pojemniku do barwienia przez noc z przeciwciałem specyficznym dla modyfikacji histonów, reagującym w stosunku do drożdży w temperaturze 4 °C. Rozcieńczyć przeciwciało w buforze blokującym TBS zgodnie ze specyfikacją producenta. Uwzględnij również odpowiednią kontrolę obciążenia jądrowego, taką jak anty-całkowity H3 hodowany w innym gatunku gospodarza niż przeciwciało specyficzne dla modyfikacji. Na przykład, jeśli sondujesz H3S10ph za pomocą przeciwciała anty-H3S10ph wyhodowanego u królika, użyj przeciwciała anty-całkowitego H3 podniesionego u myszy jako kontroli obciążenia. W razie potrzeby powtórz to dla każdej plamy.
      UWAGA: Rozcieńczenia przeciwciał można ponownie wykorzystać łącznie trzy razy w ciągu miesiąca. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
    4. Umyj membranę 4x w domowym TBS + 0,1% polisorbat 20 (TBST) przez 5 min z bujaniem przy RT.
    5. Inkubować blot z fluorescencyjnymi przeciwciałami drugorzędowymi w rozcieńczeniach określonych przez producenta (osła anty-królik 680 i osł anty-mysz) przez 1 godzinę w RT.
      UWAGA: Fluorescencyjne przeciwciała drugorzędowe muszą być chronione przed światłem zarówno podczas przechowywania, jak i użytkowania. Przeprowadzić inkubację w ciemnych plastikowych pudełkach lub przykryć folią aluminiową.
    6. Pierz membranę 4x z TBST przez 5 min i pierz z TBS przez 5 min kołysząc w RT.
    7. Wizualizacja blot na fluorescencyjnym systemie obrazowania Western blot przez 2 minuty. Wizualizacja przeciwciał drugorzędowych anty-królików 680 i anty-myszy 800 w kanałach odpowiednio 800 nm i 700 nm.
      UWAGA: Kontrpróby są przeprowadzane niezależnie, począwszy od sekcji 1. Konieczne jest sprawdzenie, czy odpowiedź sygnałowa przeciwciała mieści się w zakresie, w którym odpowiedź sygnałowa jest liniowa, w celu właściwej interpretacji danych w tych eksperymentach.

5. Analiza danych i statystyki

  1. Otwórz obraz plamy w oprogramowaniu do obrazowania (Tabela materiałów). Uzyskaj surową gęstość pasm specyficznych dla modyfikacji w próbkach kontroli wektorowej, TDP-43 i FUS (lub kontroli wektorowej i a-synukleiny), rysując prostokąt, który kadruje pasmo w trybie analizy.
  2. Powtórz krok 5.1 dla ładowania pasm kontrolnych.
    UWAGA: W każdej próbce będzie dostępne pasmo kontroli obciążenia i pasmo specyficzne dla modyfikacji.
  3. Obliczyć gęstość względną pasm specyficznych dla modyfikacji, dzieląc każde pasmo przez gęstość odpowiadającego mu pasma w wektorowej próbie kontrolnej. Spowoduje to znormalizowanie danych do kontrolki wektora.
  4. Obliczyć gęstość względną pasma kontrolnego obciążenia, dzieląc każde pasmo przez gęstość odpowiadającego mu pasma kontroli obciążenia w próbce kontrolnej wektora.
  5. Obliczyć skorygowaną gęstość względną każdego pasma, dzieląc gęstość względną pasma specyficznego dla modyfikacji przez gęstość względną pasma kontrolnego obciążenia dla każdej próbki. Teraz dane można wizualizować w formie histogramu.
    UWAGA: Aby ułatwić przetwarzanie, kroki 5.3–5.5 można wykonać w arkuszu kalkulacyjnym (plik uzupełniający).
  6. Po wielu niezależnych powtórzeniach należy przeprowadzić testy T Welcha między dwiema próbkami kontrolnymi i odpowiednim modelem proteinopatii (kontrola w porównaniu z FUS, kontrola w porównaniu z TDP-43 i kontrola w porównaniu z a-synukleiną) z p = 0,05 jako granicą istotności.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zilustrować tę metodę, wykorzystamy ostatnio opublikowane wyniki30. WT ludzki FUS i TDP-43 ulegały nadekspresji przez 5 godzin, podczas gdy WT α-synukleina ulegała nadekspresji przez 8 godzin. Jako wektorową kontrolę ujemną wykorzystano konstrukt ccdB. Rysunek 2 pokazuje zahamowanie wzrostu w kulturach stałych i płynnych. Drożdże zebrano zgodnie z opisem i przeprowadzono Western blot z przeciwciałami specyficznymi dla modyfikacji. ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj protokół zapewnia prosty, celowy i opłacalny sposób kategoryzacji zmian PTM histonów w całym genomie skorelowanych z proteinopatiami neurodegeneracyjnymi. Chociaż istnieją inne modele ALS i PD, takie jak ludzkie linie komórkowe in vitro i mysie modele32, S. cerevisiae pozostaje atrakcyjny ze względu na łatwość użycia. Na przykład modele drożdży nie wymagają użycia sterylnego kaptura, ani nie wymagają intensywnego szkolenia, które towarzyszy pracy nad hodowlą komórko...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Royenie Tanaz, Hudzie Yousuf i Sadiqa Taasen za pomoc techniczną. Jesteśmy bardzo wdzięczni prof. Jamesowi Shorterowi za hojne dostarczenie odczynników i pomoc intelektualną w projektowaniu eksperymentów z strojeniem sacharozy. Plazmidy drożdży były hojnym darem od prof. Aarona Gitlera (w tym 303Gal-FUS; Plazmid Addgene # 29614). Brooklyn College i Centrum Badań nad Zaawansowaną Nauką (CUNY), a także NIH NINDS Advanced Postdoctoral Transition Award (K22NS09131401) wspierały MPT.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
-Jego suplement DOClontech630415
10x Running BufferMix: 141,65 g glicyny (ThermoFisher BP381-1), 30,3 g zasady Tizma (Sigma-Aldrich T6066), 10 g dodecylosiarczanu sodu (Sigma-Aldrich L3771) i 1 l wody dejonizowanej, pH 8,8.
12% żele poliakrylamidoweBIO-RAD456-1041
2-merkaptoetanolSigma-AldrichM3148
Antyacetylohiston H3 (Lys14) Przeciwciało pierwszorzędoweMilliporeSigma07-353 (nr partii 2762291)Rozcieńczenie: 1/1000
Anty-acetylo-histon H4 (Lys 16) Przeciwciało pierwszorzędoweAbcamab109463 (Nr partii. GR187780)Rozcieńczenie: 1/2000
Przeciwciało pierwszorzędowe antyacetylohistonowe H4 (Lys12) Abcamab46983 (nr partii. GR71882)Rozcieńczenie: 1/5000
Przeciwciało pierwszorzędowe antydimetylohistonu H3 (Lys36) Abcamab9049 (nr partii. GR266894, GR3236147)Rozcieńczenie: 1/1000
Przeciwciało pierwotne anty-histonowe H3Abcamab24834 (nr partii. GR236539, GR174196, GR3194335)Kontrola obciążenia jądrowego; Rozcieńczenie: 1/2000
Przeciwciało antyfosfo-histonowe H2B (Thr129) Pierwszorzędowe przeciwciałoAbcamab188292 (nr partii. GR211874)Rozcieńczenie: 1/1000
Przeciwciało pierwszorzędowe antyfosfo-histonu H3 (Ser10) Abcamab5176 (nr partii. GR264582, GR192662, GR3217296)Rozcieńczenie: 1/1000
BioPhotometer D30Eppendorf6133000010
Naczynie do hodowli komórkowych (100 x 20 mm)Eppendorf30702118
Płytka do hodowli komórkowych, 96-dołkowaEppendorf30730011
/5804 R/5810/5810 REppendorf22625501
Oślica przeciw myszom IRDye 800 CWLI-COR926-32212 (nr partii C60301-05, C61116-02, C80108-05)Rozcieńczenie: 1/5000
Donkey Anti-Rabbit IRDye 860 RDLI-COR926-68073 (nr partii C60217-06, C70323-06, C70601-05, C80116-07)Rozcieńczenie: 1/2500
EtanolSigma-AldrichE7023
Bardzo gruby bibuła (bibuła filtracyjna)BIO-RAD1703968
GalactoseSigma-AldrichG0750Przygotować 20% m/v roztwór podstawowy.
GlukozaSigma-AldrichG8270Przygotuj 20% w/v roztwór podstawowy.
GlycerolSigma-AldrichG5516Przygotować 50% m/v roztwór.
Membrany transferowe Immobilon-FLMilliporeSigmaIPFL00010
Octan litu dwuwodny (LiAc)Sigma-AldrichL4158Przygotować 1 M roztwór.
Ładowanie mieszanki barwników: 1,2 g dodecylosiarczanu sodu, 6 mg błękitu bromofenolowego (Sigma-Aldrich B8026), 4,7 ml glicerolu, 1,2 ml 0,5 M zasady Trizma o pH 6,8, 0,93 g DL-Ditiothreitolu (Sigma-Aldrich D0632) i 2,1 ml wody dejonizowanej.
MetanolThermoFisherA412-4
Mini-PROTEAN Tetra Pionowa komórka elektroforeorezyBIO-RAD1658004
Pipeta wielokanałowaEppendorf2231300045
Bufor enzymatyczny restrykcyjny NEB 2.1, 10xNew England Bio Labs102855-152
Enzym restrykcyjny Nhe INew England Bio Labs101228-710
Qiagen129114nukleaz
LI-COR Biosciences2800-03
OmniTray Hodowla komórek poddana działaniu sterylnej pokrywki, PS (86 x 128 mm)ThermoFisher165218
pAG303GAL-a-synukleina-GFPPrezent od A. Gitler
pAG303GAL-ccdBAddgene14133
pAG303Gal-FUSAddgene29614
pAG303GAL-TDP-43Prezent od A. Gitler
Poli(glikol etylenowy) (PEG)Sigma-AldrichP4338Przygotuj 50% roztwór w/v.
Ponceau S StainSigma-AldrichP3504Mix: 0,5 g 0,1% w/w barwnika Ponceau S, 5 ml 1% v/v kwasu octowego (Sigma-Aldrich 320099) i 500 ml wody dejonizowanej.
PowerPac Basic Power SupplyBIO-RAD164-5050
Rafinoza pentahydratSigma-AldrichR7630Przygotować 10% w/v roztwór podstawowy.
Plemniki łososia DNAAgilent Tech201190
SD-His płytkiMix: 20 g Agar (Sigma-Aldrich A1296), 0,77 g -Suplement DO He, 6,7 g drożdżowej zasady azotowej bez aminokwasów (ThermoFisher 291920) i 900 ml wody dejonizowanej.
SGal-HisWymieszaj: 20 g agaru, 0,77 g suplementu DO He, 6,7 g drożdżowej zasady azotowej bez aminokwasów, 100 ml roztworu galaktozy i 900 ml wody dejonizowanej.
Bufor ładujący dodecylosiarczan sodu Przechowywaćw temperaturze -20 oC. 6X, Wymieszaj: 1,2 g dodecylosiarczanu sodu, 6 mg błękitu bromofenolowego, 0,93 g DL-ditiotreitolu, 2,1 ml wody dejonizowanej, 4,7 ml glicerolu i 1,2 ml 0,5 M zasady trizma, pH 6,8.
Wodorotlenek soduSigma-Aldrich221465Przygotować 0,2 M roztwór.
SacharozaSigma-Aldrich84097Przygotować 20% w/v roztwór podstawowy.
TBS + 0,1% Tween 20 (TBST)Mieszaj: 100 ml 10X TBS, 1 ml Tween 20 (Sigma-Aldrich P7949) i 900 ml wody dejonizowanej.
TBS Bufor blokującyLI-COR927-5000
Trans-Blot SD Półsucha elektroforetyczna komórka transferowaBIO-RAD170-3940
Mieszankatransferowych: 22,5 g glicyny, 4,84 g zasady Tizma, 400 ml metanolu, 1 g dodecylosiarczanu sodu i 1,6 l wody dejonizowanej.
Sól fizjologiczna buforowana trisem (TBS)10X, pH 7,6, roztwór: Wymieszaj 24 g zasady Trizma i 88 g chlorku sodu (Sigma-Aldrich S7653). Napełnij do 1 l wodą dejonizowaną.
WT 303 S. cerevisiae drożdżePrezent od J. Shorter
Ekstrakt drożdżowy Dekstroza peptonowa (YPD)Sigma-AldrichY1375
Wirówka 5804 System obrazowania Odyssey Fc bez Płytki

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Landgrave-Gómez, J., Mercado-Gómez, O., Guevara-Guzmán, R. Epigenetic mechanisms in neurological and neurodegenerative diseases. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 58(2015).
  2. Paez-Colasante, X., Figueroa-Romero, C., Sakowski, S. A., Goutman, S. A., Feldman, E. L. Amyotrophic lateral sclerosis: mechanisms and therapeutics in the epigenomic era. Nature Reviews Neurology. 11 (5), 266-279 (2015).
  3. Beitz, J. M. Parkinson's Disease: a Review. Frontiers in Bioscience. 6, 65-74 (2014).
  4. Kim, H. J., et al. Mutations in prion-like domains in hnRNPA2B1 and hnRNPA1 cause multisystem proteinopathy and ALS. Nature. 495 (7442), 467-473 (2013).
  5. Poewe, W., et al. Parkinson disease. Nature Reviews Disease Primers. 3, https://www.nature.com/articles/nrdp201713 - supplementary-information 17013(2017).
  6. Robberecht, W., Philips, T. The changing scene of amyotrophic lateral sclerosis. Nature Reviews Neuroscience. 14 (4), https://www.nature.com/articles/nrn3430 - supplementary-information 248-264 (2013).
  7. Chen-Plotkin, A. S., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q. TAR DNA-binding protein 43 in neurodegenerative disease. Nature Reviews Neurology. 6 (4), 211-220 (2010).
  8. Couthouis, J., et al. A yeast functional screen predicts new candidate ALS disease genes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (52), 20881-20890 (2011).
  9. Da Cruz, S., Cleveland, D. W. Understanding the role of TDP-43 and FUS/TLS in ALS and beyond. Current Opinion in Neurobiology. 21 (6), 904-919 (2011).
  10. King, O. D., Gitler, A. D., Shorter, J. The tip of the iceberg: RNA-binding proteins with prion-like domains in neurodegenerative disease. Brain Research. 1462, 61-80 (2012).
  11. Neumann, M., et al. FET proteins TAF15 and EWS are selective markers that distinguish FTLD with FUS pathology from amyotrophic lateral sclerosis with FUS mutations. Brain. 134 (9), 2595-2609 (2011).
  12. Neumann, M., et al. Ubiquitinated TDP-43 in Frontotemporal Lobar Degeneration and Amyotrophic Lateral Sclerosis. Science. 314 (5796), 130-133 (2006).
  13. Baba, M., et al. Aggregation of alpha-synuclein in Lewy bodies of sporadic Parkinson's disease and dementia with Lewy bodies. The American Journal of Pathology. 152 (4), 879-884 (1998).
  14. Lotharius, J., Brundin, P. Pathogenesis of parkinson's disease: dopamine, vesicles and α-synuclein. Nature Reviews Neuroscience. 3 (12), 932-942 (2002).
  15. Spillantini, M. G., et al. α-Synuclein in Lewy bodies. Nature. 388 (6645), 839-840 (1997).
  16. Probst, A. V., Dunleavy, E., Almouzni, G. Epigenetic inheritance during the cell cycle. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (3), 192-206 (2009).
  17. Luger, K., Mäder, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 Å resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
  18. Mazzio, E. A., Soliman, K. F. A. Basic concepts of epigenetics. Epigenetics. 7 (2), 119-130 (2012).
  19. Struhl, K. Histone acetylation and transcriptional regulatory. Genes & Development. 12 (5), 599-606 (1998).
  20. Garcia, B. A., Shabanowitz, J., Hunt, D. F. Characterization of histones and their post-translational modifications by mass spectrometry. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (1), 66-73 (2007).
  21. Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
  22. Jovicic, A., et al. Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS. Nature Neuroscience. 18 (9), 1226-1229 (2015).
  23. Sanchez, Y., Lindquist, S. L. HSP104 required for induced thermotolerance. Science. 248 (4959), 1112(1990).
  24. Outeiro, T. F., Lindquist, S. Yeast Cells Provide Insight into Alpha-Synuclein Biology and Pathobiology. Science. 302 (5651), 1772(2003).
  25. Johnson, B. S., et al. TDP-43 Is Intrinsically Aggregation-prone, and Amyotrophic Lateral Sclerosis-linked Mutations Accelerate Aggregation and Increase Toxicity. Journal of Biological Chemistry. 284 (30), 20329(2009).
  26. Sun, Z., et al. Molecular Determinants and Genetic Modifiers of Aggregation and Toxicity for the ALS Disease Protein FUS/TLS. PLOS Biology. 9 (4), e1000614(2011).
  27. Elden, A. C., et al. Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS. Nature. 466 (7310), https://www.nature.com/articles/nature09320 - supplementary-information 1069-1075 (2010).
  28. Wijayanti, I., Watanabe, D., Oshiro, S., Takagi, H. Isolation and functional analysis of yeast ubiquitin ligase Rsp5 variants that alleviate the toxicity of human α-synuclein. The Journal of Biochemistry. 157 (4), 251-260 (2015).
  29. Tardiff, D. F., et al. Yeast Reveal a “Druggable” Rsp5/Nedd4 Network that Ameliorates α-Synuclein Toxicity in Neurons. Science. 342 (6161), 979(2013).
  30. Chen, K., et al. Neurodegenerative Disease Proteinopathies Are Connected to Distinct Histone Post-translational Modification Landscapes. ACS Chemical Neuroscience. 9 (4), 838-848 (2018).
  31. Flick, J. S., Johnston, M. Two systems of glucose repression of the GAL1 promoter in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 10 (9), 4757(1990).
  32. Fernandez-Santiago, R., Ezquerra, M. Epigenetic Research of Neurodegenerative Disorders Using Patient iPSC-Based Models. Stem Cells International. 2016, 9464591(2016).
  33. Armakola, M., et al. Inhibition of RNA lariat debranching enzyme suppresses TDP-43 toxicity in ALS disease models. Nature Genetics. 44 (12), 1302-1309 (2012).
  34. Tibshirani, M., et al. Cytoplasmic sequestration of FUS/TLS associated with ALS alters histone marks through loss of nuclear protein arginine methyltransferase 1. Human Molecular Genetics. 24 (3), 773-786 (2015).
  35. Masala, A., et al. Epigenetic Changes Associated with the Expression of Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) Causing Genes. Neuroscience. 390, 1-11 (2018).
  36. Eryilmaz, I. E., et al. Epigenetic approach to early-onset Parkinson’s disease: low methylation status of SNCA and PARK2 promoter regions. Neurological Research. 39 (11), 965-972 (2017).
  37. Daniele, S., et al. Epigenetic Modifications of the α-Synuclein Gene and Relative Protein Content Are Affected by Ageing and Physical Exercise in Blood from Healthy Subjects. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 3740345(2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Histone ModificationYeast ModelNeurodegenerative DiseaseWestern BlotProtein OverexpressionHistone AcetylationEpigenetic AnalysisSaccharomyces CerevisiaeALS PD ModelsPost translational Modification

Related Articles