Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Hodowla zielonych mikroalg w fotobioreaktorach z kolumnami bąbelkowymi i test na obecność obojętnych lipidów

21.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59106

⸱

7 stycznia 2019

 ,  , 
1Department of Biosystems Engineering, Auburn University

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół budowy fotobioreaktorów z bąbelkowymi kolumnami na skalę laboratoryjną i wykorzystania ich do hodowli mikroalg. Dostarcza również metody określania tempa wzrostu kultury i neutralnej zawartości lipidów.

Streszczenie

Istnieje duże zainteresowanie badaniem mikroalg do zastosowań inżynieryjnych, takich jak produkcja biopaliw, produktów o wysokiej wartości oraz do przetwarzania odpadów. Ponieważ większość nowych badań rozpoczyna się na skalę laboratoryjną, istnieje zapotrzebowanie na opłacalne metody hodowli mikroalg w powtarzalny sposób. W tym miejscu komunikujemy skuteczne podejście do hodowli mikroalg w fotobioreaktorach na skalę laboratoryjną oraz do pomiaru wzrostu i neutralnej zawartości lipidów w tych algach. Dołączona jest również instrukcja, jak skonfigurować system fotobioreaktora. Chociaż przykładowe organizmy to gatunki Chlorella i Auxenochlorella, system ten można przystosować do uprawy szerokiej gamy mikroalg, w tym kokultur glonów z gatunkami innymi niż glony. Kultury podstawowe są najpierw hodowane w butelkach w celu wytworzenia inokulum dla systemu fotobioreaktora. Inokulum glonów jest zagęszczane i przenoszone do fotobioreaktorów w celu uprawy w trybie wsadowym. Próbki są pobierane codziennie w celu odczytu gęstości optycznej. Pod koniec hodowli wsadowej komórki są zbierane za pomocą wirówki, myte i liofilizowane w celu uzyskania końcowego stężenia suchej masy. Końcowe stężenie suchej masy służy do stworzenia korelacji między gęstością optyczną a stężeniem suchej masy. Zmodyfikowana metoda Folcha jest następnie stosowana do ekstrakcji całkowitych lipidów z liofilizowanej biomasy, a ekstrakt jest oznaczany pod kątem neutralnej zawartości lipidów za pomocą testu mikropłytki. Test ten został opublikowany wcześniej, ale uwzględniono tutaj kroki protokołu, aby podkreślić krytyczne etapy procedury, w których często występują błędy. Opisany tutaj system bioreaktorów wypełnia niszę między prostą hodowlą w kolbach a w pełni kontrolowanymi bioreaktorami komercyjnymi. Nawet przy zaledwie 3-4 powtórzeniach biologicznych na zabieg, nasze podejście do hodowli glonów prowadzi do ścisłych odchyleń standardowych w testach wzrostu i lipidów.

Wprowadzenie

Zastosowanie mikroalg w inżynierii i biotechnologii wzbudziło duże zainteresowanie w ostatnich latach. Mikroalgi są badane pod kątem zastosowania w oczyszczaniu ścieków1,2,3,4, produkcja biopaliw5,6,7,8, oraz produkcja nutraceutyków i innych produktów o wysokiej wartości9,10. Glony są również modyfikowane genetycznie w coraz szybszym tempie w celu poprawy ich przydatności do określonych zastosowań inżynieryjnych11,12. W związku z tym istnieje duże zainteresowanie eksperymentami z organizmami istotnymi dla przemysłu w kontrolowanych warunkach. Celem tej metody jest przedstawienie skutecznego podejścia do hodowli mikroalg w kontrolowanym środowisku laboratoryjnym oraz pomiar wzrostu i neutralnej zawartości lipidów w tych algach. Poprawa tempa wzrostu i neutralna zawartość lipidów w mikroalgach zostały zidentyfikowane jako dwa kluczowe wąskie gardła na drodze do komercjalizacji biopaliw z alg13.

Do hodowli glonów do celów eksperymentalnych stosowano szeroki zakres podejść. Ogólnie rzecz biorąc, podejścia te można podzielić na uprawę na dużą skalę na zewnątrz i uprawę na małą skalę w pomieszczeniach. Uprawa na wolnym powietrzu w fotobioreaktorach i otwartych stawach jest odpowiednia do eksperymentów mających na celu zwiększenie skali procesów, które zostały już udowodnione w skali laboratoryjnej (np. w celu przetestowania skali nowego szczepu glonów o wysokiej zawartości lipidów)14. Jednak uprawa na małą skalę w pomieszczeniach jest odpowiednia przy opracowywaniu nowych lub ulepszonych szczepów glonów lub przeprowadzaniu eksperymentów mających na celu zrozumienie mechanizmów biologicznych. W tych ostatnich przypadkach wymagany jest wysoki stopień kontroli eksperymentalnej, aby wydobyć subtelne zmiany w zachowaniu biologicznym. W tym celu często wymagane są kultury akseniczne, aby zminimalizować złożone czynniki biotyczne związane z innymi organizmami (np. bakteriami, innymi glonami), które nieuchronnie rosną w dużych systemach zewnętrznych. Nawet podczas badania interakcji między glonami a innymi organizmami odkryliśmy, że wykorzystanie ściśle kontrolowanych warunków eksperymentalnych jest pomocne podczas badania wymiany molekularnej między organizmami15,16,17.

W kategorii uprawy glonów na małą skalę, zastosowano szereg podejść. Być może najczęstszym podejściem jest hodowla glonów w kolbach Erlenmeyera na stole do wytrząsania pod lekkim bankiem18,19. Wymiana tlenu i CO2 odbywa się poprzez dyfuzję bierną przez korek piankowy w górnej części kolby. Niektórzy badacze udoskonalili tę konfigurację poprzez aktywne napowietrzanie kolb20. Innym podejściem jest uprawa glonów w butelkach, zmieszanych z mieszadłem i aktywnym napowietrzaniem. Pomimo ich prostoty stwierdziliśmy, że stosowanie kolb i butelek często prowadzi do niespójnych wyników wśród kontrprób biologicznych. Przypuszczalnie jest to spowodowane efektami położenia - różne pozycje otrzymują różne ilości światła, które również wpływają na temperaturę wewnętrznego reaktora. Codzienna rotacja reaktorów do nowych pozycji może pomóc, ale nie łagodzi problemu, ponieważ niektóre etapy wzrostu glonów (np. wczesny wykładniczy) są bardziej wrażliwe na efekty pozycyjne niż inne (np. faza logarytmiczna).

Na przeciwległym biegunie technologicznego zaawansowania znajdują się w pełni kontrolowane komercyjne fotobioreaktory. Systemy te stale monitorują i dostosowują warunki w reaktorze, aby zoptymalizować wzrost glonów. Posiadają programowalne oświetlenie, kontrolę temperatury w czasie rzeczywistym i kontrolę pH. Niestety, są one drogie i zazwyczaj kosztują kilka tysięcy dolarów za reaktor. Większość czasopism naukowych i inżynieryjnych wymaga biologicznej replikacji wyników, co wymaga zakupu wielu bioreaktorów. Przedstawiamy tutaj system reaktora z kolumną bąbelkową, który wypełnia granicę między prostym (kolba) a wyrafinowanym (w pełni kontrolowany bioreaktor) podejściem do hodowli glonów na skalę laboratoryjną. Kolumny pęcherzykowe wykorzystują unoszące się pęcherzyki gazu, aby ułatwić wymianę gazową i mieszanie reaktora. Takie podejście zapewnia pewien stopień kontroli nad oświetleniem i temperaturą, ale robi to w sposób opłacalny. Co więcej, stwierdziliśmy, że system ten daje bardzo spójne wyniki wśród kontrprób biologicznych, zmniejszając wymaganą liczbę powtórzeń biologicznych potrzebnych do uzyskania statystycznie istotnych wyników w porównaniu z podejściem kolbowym lub butelkowym. Użyliśmy również tego systemu do udanej hodowli mieszanin glonów i bakterii21. Oprócz uprawy glonów przedstawiamy procedurę pomiaru neutralnej zawartości lipidów w hodowanych algach. Ta ostatnia metoda została opublikowana w innym miejscu22, ale tutaj zamieszczamy procedurę, aby dostarczyć instrukcje krok po kroku, jak skutecznie ją zastosować.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Konfiguracja fotobioreaktorów kolumnowych z pęcherzykami

  1. Przygotuj zestaw wentylowanych pokrywek z plastikowych nakrętek do szklanych butelek o pojemności 1 L oraz probówek do hybrydyzacji (schemat i zdjęcia przedstawiono na Rysunku 1). Wykonaj pokrywki do nawilżacza, pułapki mieszającej, każdego fotobioreaktora airlift oraz każdego reaktora butelkowego.
    1. Wywierć w pokrywce otwory o średnicy ¼”: 2 otwory są wymagane dla pokrywek bioreaktora i nawilżacza; 3 otwory są wymagane dla pułapki mieszającej.
    2. Nasuń oring ¼” na gwint montażowego złącza Luer 1/8”, a następnie wsuń go w otwór ¼” wywiercony w pokrywce (Rysunek 1A).
    3. Nasuń drugi oring ¼” na gwint w taki sposób, aby pokrywka znalazła się pomiędzy dwoma oringami. Nakręć nakrętkę kontrującą na gwint i dokręć ją, aby unieruchomić złącze Luer.
    4. Zatrzaśnij pierścienie blokujące na wystającym z pokrywki męskim złączu Luer. Powtórz kroki 1.1.2–1.1.4 dla każdego otworu w pokrywce.
    5. W przypadku pokrywek przeznaczonych do kolumn bąbelkowych i reaktorów butelkowych, przymocuj żeńskie złącza Luer 1/8” z króćcem do odcinków wężyka PVC o średnicy wewnętrznej 1/8” i długości 1,5”. Przymocuj je do każdego z wystających męskich złączy Luer na pokrywce.
    6. Podłącz zawór zwrotny (skierowany z dala od pokrywki) do wolnego końca jednego z odcinków wężyka 1/8”.
      UWAGA: Będzie on służył jako port wylotowy dla bioreaktora.
    7. Podłącz męskie złącze Luer z króćcem do drugiego odcinka wężyka 1/8” wystającego z pokrywki. Zatrzaśnij obrotowy pierścień blokujący i przymocuj do niego filtr powietrza 0.2 μm.
      UWAGA: Będzie on służył jako port wlotowy do reaktora.

Schemat montażu butelki i konfiguracja do wymiany gazowej, w tym szczegóły pokrywki, pierścienie O-ring i system rurek.
Rycina 1. Schemat i zdjęcia konstrukcji bioreaktorów. (A) Schemat konstrukcji pokrywek bioreaktora, (B) zdjęcie zmontowanej pokrywki bioreaktora oraz (C) zdjęcie zmontowanej pokrywki użytej do nawilżacza. Należy pamiętać, że złączki nawilżacza powinny być pokryte wodoodpornym silikonem, aby zapewnić szczelne połączenie z pokrywką. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Zmontować system dostarczania powietrza (schemat i zdjęcie przedstawiono na Rysunku 2A i 2B).
    1. Do wlotów i wylotów z tyłu każdego rotametru przymocować złączki z gwintem 1/8” NPT i kolcami.
      UWAGA: Rotametry 200-2,500 cm3/min służą do modulacji ciśnienia powietrza przed nawilżaczem, rotametry 100-1,000 cm3/min do reaktorów butelkowych, rotametry 50-500 cm3/min do bioreaktorów z napowietrzaniem (air lift), a rotametry 5-50 cm3/min do regulacji przepływu CO2. Zaleca się zamontowanie rotametrów na sztywnej powierzchni (np. plastikowej płycie), aby nie przewróciły się podczas pracy.
    2. Zakręcić źródło sprężonego powietrza, a następnie połączyć je z elastycznym wężem PVC o średnicy wewnętrznej (ID) ¼” za pomocą opaski zaciskowej. Zredukować średnicę węża do 1/8” ID za pomocą złączki żeńskiej ¼” z kolcem oraz złączki męskiej 1/8” z kolcem.
    3. Wolny koniec węża 1/8” ID podłączyć do wlotu rotametru 200-2,500 cm3/min.
      UWAGA: Wylot tego rotametru będzie zasilał butelkę nawilżacza za pomocą węża 1/8” ID.
    4. Wąż 1/8” podłączyć do wlotu wentylowanej pokrywy (do połączenia użyć złączki żeńskiego Luera z kolcem). Następnie drugi odcinek węża 1/8” podłączyć do wnętrza złączki montażowej panelowej.
      UWAGA: Odcinek ten będzie zwisać do wnętrza nawilżacza i napowietrzać wodę.
    5. Do obu końców odcinka węża 1/8” ID przymocować złączki żeńskiego Luera 1/8” z kolcem i za pomocą tego elementu połączyć wylot nawilżacza z wlotem pułapki mieszającej.
    6. W ten sam sposób, jak w punkcie 1.2.5, podłączyć wylot regulatora CO2 do drugiego portu pułapki mieszającej.
    7. Zbudować kolektor z węży 1/8” i wieloportowych złączek z kolcami 1/8” (patrz Rysunek 2C), aby zasilić bloki rotametrów powietrzem.
      UWAGA: Rotametry te będą służyć do zasilania bioreaktorów. Należy unikać łączenia więcej niż 6 rotametrów szeregowo. Aby rozbudować system, należy zastosować równoległe bloki rotametrów. Należy upewnić się, że całkowite zapotrzebowanie na przepływ dla wszystkich reaktorów jest mniejsze niż 2,500 cm3/min (w przeciwnym razie przed nawilżaczem będzie potrzebny większy rotametr).
    8. Wylot (3rd port) pułapki mieszającej połączyć z nowo zbudowanymi blokami rotametrów za pomocą węża 1/8” i żeńskiego Luera 1/8” z kolcem.
    9. Do wylotów każdego rotametru w bloku podłączyć odpowiednio długie węże 1/8”, aby dostarczyć powietrze do bioreaktorów. Oznaczyć końce węży oraz rotametry w bloku.
    10. Wokół wszystkich portów na pokrywach nawilżacza i pułapki mieszającej nałożyć wodoodporny silikon, aby zapewnić ich szczelność powietrzną.

Schemat układu sprężonego powietrza z nawilżaczem, zestawem rotametrów; proces zasilania bioreaktora.
Rysunek 2. Schemat i zdjęcia montażu systemu kolumny bąbelkowej. (A) Schemat systemu napowietrzania, (B) zdjęcie nawilżacza, pułapki mieszającej i zestawu rotametrów oraz (C) zdjęcie kolektorów służących do połączenia zestawów rotametrów. Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

  1. Przygotuj akwaria, mieszadła magnetyczne i oświetlenie (Rycina 3).
    OSTRZEŻENIE: System ten wymaga dużej liczby gniazdek elektrycznych i odpowiedniej wydajności obwodu, aby obsłużyć wszystkie komponenty. Należy unikać łączenia wielu listew zasilających i przedłużaczy szeregowo, ponieważ stwarza to zagrożenie elektryczne. Ze względu na obecność wody w systemie, zaleca się stosowanie gniazdek i listew zasilających z wyłącznikiem różnicowoprądowym (GFI).
    1. Ustaw niskoprofilowe mieszadła magnetyczne na wypoziomowanej powierzchni, która jest wystarczająco wytrzymała, aby utrzymać ciężar wypełnionych wodą akwariów.
    2. Umieść małe drewniane lub plastikowe bloczki (nieco wyższe niż płytki mieszadła) wokół obwodu mieszadeł, aby podtrzymywały ciężar akwariów.
      OSTRZEŻENIE: Należy unikać stawiania akwariów bezpośrednio na płytkach mieszadła, ponieważ ich ciężar może doprowadzić do zniszczenia urządzeń.
    3. Umieść akwaria nad płytkami mieszadeł i bloczkami wsporczymi, a następnie napełnij je wodą.
    4. Wytnij z sztywnej plastikowej płyty dopasowaną do wymiarów akwarium pokrywę. W pokrywie wytnij otwory, które umożliwią wsuwanie i wysuwanie probówek do hybrydyzacji. Wytnij również otwór na grzałkę do akwarium.
    5. Ustaw banki lamp fluorescencyjnych obok akwarium, aby zapewnić poziome oświetlenie bioreaktorów. Podłącz bank lamp do programatora czasowego, aby ustawić cykl dnia i nocy.

Schemat zestawu bioreaktora: butelka z mieszadłem magnetycznym, system airlift, lampy fluorescencyjne do wzrostu kultury.
Rysunek 3. Schemat systemowy bioreaktorów butelkowych (po lewej) oraz fotobioreaktorów kolumnowych z pęcherzykami (po prawej). Rysunek został zmodyfikowany na podstawie pracy Higgins et al.17. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

2. Przygotowanie inokulum mikroalg

  1. Pozyskać inokulum mikroalg z kultury kriosprzechowywanej, wysiewanej na płytkę lub kultury płynnej.
    UWAGA: Zaleca się, aby organizmy kriosprzechowywane zostały wysiane na płytki przed użyciem w charakterze inokulum, aby upewnić się, że komórki są żywotne, a otrzymana kultura jest akseniczna. Pożywka agarowa (np. ATCC #5 sporulating agar)21 jest pożywką bogatą, która dobrze sprawdza się przy reanimacji gatunków Chlorella i Auxenochlorella z przechowywania kriogenicznego.
  2. Przygotować 2,4 L pożywki mineralnej odpowiedniej dla konkretnego gatunku mikroalg.
    UWAGA: Przykłady obejmują pożywkę N823 dla gatunków Chlorella oraz pożywkę N8-NH421 dla gatunków Auxenochlorella. Zastosowanie pożywki odpowiedniej dla szczepu alg jest jednym z najważniejszych kroków zapewniających intensywny wzrost alg.
  3. Rozdzielić 2,4 L pożywki mineralnej w równych częściach do trzech szklanych butelek o pojemności 1 L, dodać do każdej butelki mieszadła magnetyczne i zamontować wentylowane pokrywki (Rysunek 1) w każdej z nich. Upewnić się, że rurka napowietrzająca znajduje się po stronie wlotowej i że w każdej butelce znajduje się mieszadło.
  4. Zautoklawować butelki z zapasem, stosując cykl sterylizacji cieczy (121 °C) przez 30 min. W tym samym czasie zautoklawować 100 mL wody dejonizowanej (dH2O) oraz kilka probówek 1,5 mL, które zostaną później wykorzystane do wysiewu. Pozostawić pożywkę do ochłodzenia przez noc. Alternatywnie, schłodzić reaktor do temperatury pokojowej, a następnie napowietrzać przez 2 h przed inokulacją.
  5. W komorze z laminarnym przepływem powietrza (BSC) zaszczepić mikroalgi z płytki lub aksenicznej kultury płynnej do butelek z zapasem. W kolejnych krokach stosować techniki sterylne w celu utrzymania akseniczności kultur.
    1. Dodać 20 mL zautoklawowanej dH2O do sterylnej probówki wirówkowej 50 mL. Za pomocą sterylnej jednorazowej pętlki 10 µL pobrać kilka pojedynczych kolonii z płytki z kroku 2.1. Zanurzyć pętlkę w probówce 50 mL i wypłukać komórki alg do 20 mL zautoklawowanej dH2O. Wstrząsnąć probówką 50 mL, aby przygotować jednorodny roztwór mikroalg.
    2. Pipetą serologiczną sterylną 10 mL przenieść 6 mL roztworu mikroalg do każdej butelki z zapasem. Zakręcić butelkę, aby równomiernie wymieszać mikroalgi z pożywką.
  6. Za pomocą sterylnej pipety serologicznej 2 mL pobrać próbki o objętości 1 mL z każdej butelki z zapasem i przenieść je do sterylnych probówek 1,5 mL.
    UWAGA: W tym kroku nie zaleca się stosowania mikropipet ze względu na ryzyko kontaminacji. Mocno dokręcić wentylowane pokrywki butelek z zapasem.
  7. Umieścić butelki z zapasem na mieszadłach magnetycznych (~150 rpm) i dostosować szybkość przepływu powietrza, stężenie CO2 oraz poziom oświetlenia odpowiednio do gatunku. Codziennie zmieniać położenie butelek z zapasem.
  8. Rozcieńczyć próbki 1 mL pobrane w kroku 2.6 (zazwyczaj dobrze sprawdza się rozcieńczenie 100-krotne w sterylnej wodzie) i wysiać metodą rozlewową na bogatą pożywkę agarową.
    UWAGA: Płytki te mogą służyć do sprawdzania wystąpienia kontaminacji, a także jako źródło przyszłego inokulum alg do dalszych doświadczeń.
  9. Co dwa dni pobierać próbki z butelek (w BSC), aby sprawdzić wzrost mikroalg.
    Umieścić próbki w mikropłytce 96-dołkowej w trzech powtórzeniach (200 µL) i mierzyć gęstość optyczną (OD) przy 550 nm i 680 nm co dwa dni, aż OD osiągnie wartość 0,2-0,3 (co zazwyczaj zajmuje 5-7 dni).
  10. Zakończyć inkubację i odstawić butelki z zapasem na blat na 24-48 h, aby umożliwić sedymentację komórek alg pod wpływem grawitacji.
    UWAGA: Osadzone komórki zostaną następnie wykorzystane do zaszczepienia fotobioreaktorów kolumnowych z napowietrzaniem. Jeśli pożądane jest szybsze zebranie komórek, można je odwirować przy nieprzekraczającej 1 000 x g sile odśrodkowej.

3. Hodowla mikroalg w fotobioreaktorach kolumnowych z napowietrzaniem

  1. Dzień przed zaszczepieniem bioreaktora należy przygotować odpowiednie pożywki i przelać 200 mL (lub pożądaną objętość) do probówek fotobioreaktora kolumnowego z pęcherzykami (probówek hybrydyzacyjnych). Probówki z pożywkami i założonymi przepuszczalnymi nakrętkami należy wysterylizować w autoklawie.
    UWAGA: W przypadku stosowania ścieków jako pożywki do wzrostu, należy wysterylizować puste bioreaktory w autoklawie, a następnie dodać ścieki przefiltrowane sterylnie (jeśli wymagana jest kultura akseniczna).
  2. Skoncentrować osiadłe mikroalgi, usuwając nadsącz za pomocą pompy próżniowej. W każdej butelce powinno pozostać mniej niż 100 mL pożywki, unikając jednocześnie usunięcia osiadłych alg.
    UWAGA: Procedurę tę należy przeprowadzić w BSC, stosując techniki sterylną. Prosty aparat próżniowy można zbudować, wykorzystując kolbę próżniową lub butelkę. Na końcu rurki należy zamocować sterylną pipetę serologiczną.
  3. Zawiesinę alg należy resuspenderować i przenieść do sterylnych probówek wirówkowych o pojemności 50 mL. Wirować przy 1 000 ×g przez 5 min w celu dalszej koncentracji alg.
  4. W BSC należy usunąć odpowiednią ilość nadsączu, aby uzyskać całkowitą objętość ~80 mL koncentratu alg dla 12 fotobioreaktorów. Należy unikać odsysania osadu. Koncentrat alg należy przenieść do sterylnego pojemnika (lub ponownie do butelki po zapasie alg).
  5. Do każdego fotobioreaktora należy dodać 6 mL zawiesiny alg za pomocą sterylnej pipety serologicznej o pojemności 10 mL.
  6. Wszystkie inne związki, których nie można autoklawować (np. roztwory witamin), należy przefiltrować sterylnie (za pomocą strzykawki z filtrem 0,2 μm lub filtra próżniowego) i dodać w odpowiednich ilościach.
  7. Bioreaktory należy delikatnie zamieszać wirowym ruchem, aby wymieszać algi z pożywką.
  8. Za pomocą pipety serologicznej należy pobrać próbkę o objętości 2 mL z każdego bioreaktora i przenieść ją do probówki o pojemności 2 mL. Próbkę o objętości 2 mL należy pobierać (w BSC) co 24 h w celu monitorowania postępów hodowli. Należy sprawdzić pH próbki za pomocą pasków testowych i w razie potrzeby skorygować parametry reaktora, stosując 3 M NaOH lub 3 M HCl.
  9. Należy mocno dokręcić nakrętki bioreaktorów i umieścić wszystkie bioreaktory w kąpieli wodnej w akwarium. Należy dostosować napowietrzanie, stężenie CO2 oraz oświetlenie do poziomu odpowiedniego dla danego gatunku. Pozycję bioreaktorów należy zmieniać każdego dnia po pobraniu próbek (Krok 3.8).
  10. Do dołków mikropłytki 96-dołkowej należy nanieść po 200 µL każdej próbki hodowli w trzech powtórzeniach. Należy zmierzyć gęstość optyczną (OD) przy 550 nm i 680 nm.
    1. W ostatnim dniu okresu hodowli należy zmierzyć OD przy różnych stopniach rozcieńczenia (np. 1x, 2x, 4x, 8x, 16x i 32x), aby ustalić korelację między OD a rzeczywistą suchą masą po zbiorach (krok 4).
  11. Probówkę z próbką 2 mL należy wirować przy 12 000 ×g przez 5 min.
  12. Nadsącz należy przefiltrować przez niesterylny filtr strzykawkowy 0,2 µm i przechowywać nadsącz (oraz osad, jeśli jest potrzebny) w temperaturze nie wyższej niż -20 °C do długoterminowego przechowywania i późniejszych analiz zmian w składzie pożywki.

4. Zbiór i liofilizacja biomasy mikroalg

  1. Za pomocą cylindra miarowego odmierzyć stałą objętość kultury alg z każdego bioreaktora (np. 160 mL z bioreaktora, który pierwotnie zawierał 200 mL pożywki) i przenieść do probówek do wirowania. Między każdym pomiarem przepłukać cylinder miarowy dH2O.
  2. Wirować przy 4,696 x g przez 5 min. Usunąć nadsącz, ostrożnie odsysając go próżniowo.
  3. Przenieść osady do oznakowanych probówek 50 mL. Przepłukać probówki do wirowania dH2O i przenieść zawartość do probówek 50 mL. Upewnić się, że całkowita objętość w probówce nie przekracza 45 mL.
  4. Przemyć osady algowe dH2O w celu usunięcia soli.
    1. Wirować probówki 50 mL przy 4,696 x g przez 5 min i usunąć nadsącz.
    2. Dodać 40 mL dH2O do każdej probówki 50 mL; wymieszać za pomocą wstrząsacza vortex. Ponownie wirować przy 4,696 x g przez 5 min i usunąć nadsącz.
    3. Powtórzyć krok 4.4.2.
  5. Oznaczyć i zważyć puste probówki do wirowania 15 mL na wadze analitycznej o dokładności do 4 miejsc po przecinku (oznaczyć zarówno nakrętkę, jak i probówkę, a następnie zważyć je razem). Zważyć jedną probówkę na każdą kulturę alg. Każdą probówkę 15 mL zważyć dwukrotnie, aby zminimalizować błąd pomiaru.
  6. Po ostatnim przemyciu usunąć nadsącz i dodać 7,5 mL dH2O do każdej probówki 50 mL. Wymieszać wstrząsaczem vortex i przenieść zawiesiny algowe do wcześniej zważonych probówek 15 mL. Przepłukać probówki 50 mL dodatkową ilością dH2O i przelać ciecz do probówek 15 mL. Unikać przekraczania całkowitej objętości 12 mL w probówkach 15 mL.
  7. Wirować probówki 15 mL przy 4,696 x g przez 5 min i zlać nadsącz. Zamrozić probówki z osadami w temperaturze -80 °C przez co najmniej 30 min w celu przygotowania do liofilizacji.
  8. Liofilizować przez noc lub do całkowitego wysuszenia.
  9. Zważyć i zapisać masę liofilizowanych probówek 15 mL z algami.

5. Ekstrakcja lipidów przy użyciu zmodyfikowanej metody Folcha24

  1. Odważ 20 mg liofilizowanej biomasy alg do 2 mL polipropylenowej probówki z nakrętką (sprawdź etykietę producenta, aby upewnić się, że produkt nadaje się do ekstrakcji przy użyciu kulek).
  2. Dodaj 1,5 mL rozpuszczalnika Folcha (2:1 chloroform/metanol) do każdej probówki 2 mL (zawierającej 20 mg liofilizowanych alg). Wsyp ~0,5 mL kulek cyrkonowo-krzemionkowych (0,5 mm) do każdej probówki, aż poziom cieczy osiągnie 2 mL.
    OSTROŻNIE: Chloroformem i metanolem należy operować w dygestorium, unikając wdychania oparów oraz kontaktu ze skórą.
  3. Homogenizuj próbki alg w młynku kulkowym przez 20 s przy prędkości 6,5 m/s. Przenieś probówki na lód na 30 s, aby schłodzić próbki. Powtórz tę procedurę jeszcze pięć razy, aby w pełni wyekstrahować lipidy.
  4. Przefiltruj homogenat przez strzykawkę 5 mL z dyskiem z drucianej siatki ze stali nierdzewnej (#60 mesh), aby oddzielić kulki, zbierając filtrat do probówki 15 mL.
  5. Przemyj kulki 1,5 mL rozpuszczalnika Folcha, wypychając ciecz strzykawką w razie potrzeby. Powtórz to płukanie jeszcze dwa razy i zbierz cały filtrat do probówki 15 mL, uzyskując końcową objętość około 6 mL.
  6. Dodaj 1,2 mL 0,9% (w/v) roztworu NaCl do ekstraktu Folcha w probówce 15 mL i wymieszaj za pomocą wortexa.
    UWAGA: W razie potrzeby można użyć większej ilości rozpuszczalnika Folcha do płukania kulek (użyj 0,2x całkowitej objętości płukania roztworem 0,9% NaCl, aby wywołać rozwarstwienie faz).
  7. Odwiruj probówki 15 mL przy 6,000 ×g przez 5 min. Odczytaj objętość dolnej fazy chloroformowej (zielonej) z dokładnością do 0,1 mL, korzystając z podziałki na ściance probówki 15 mL. Przenieś dolną fazę do szklanej fiolki (z nakrętką) za pomocą szklanej pipety Pasteura.
  8. Przechowuj lipidy w temperaturze -20 °C (lub -80 °C, jeśli ekstrakt ma zostać wykorzystany do analizy kwasów tłuszczowych).

6. Oznaczenie lipidów obojętnych metodą mikropłytek (na podstawie Higgins et al. 201422)

  1. Przygotować roztwory zapasowe. Przygotować 10 mL standardu oleju roślinnego o stężeniu 1 mg/mL w chloroformie i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    UWAGA: W tym teście można zastosować dowolny olej roślinny, ponieważ metoda nie jest czuła na rodzaje kwasów tłuszczowych. Przygotować 10 mL roztworu Nile Red o stężeniu 200 µg/mL w dimetylosulfotlenku (DMSO) i przechowywać w ciemności w temperaturze pokojowej.
  2. Podgrzać suchy blok do mikropłytek do 55 °C w dygestorium. Podczas podgrzewania rozcieńczyć ekstrakty lipidowe oraz standard oleju roślinnego 3-krotnie metanolem.
    UWAGA: Stopień rozcieńczenia można zmienić w zależności od zawartości lipidów w algach, jednak taki poziom sprawdza się w przypadku większości Chlorella.
  3. W przypadku każdej rozcieńczonej próbki dodać 80 µL do polipropylenowej mikropłytki 96-dołkowej w czterech powtórzeniach.
    OSTRZEŻENIE: Nie zaleca się stosowania wyrobów z polistyrenu w kontakcie z rozpuszczalnikami organicznymi.
  4. W przypadku ślepej próby rozpuszczalnika nanieść 80 µL mieszaniny metanol/chloroform w stosunku 2:1 w czterech powtórzeniach. W przypadku standardów dodać 10, 30, 60, 90 i 120 µL rozcieńczonego standardu oleju roślinnego w czterech powtórzeniach.
  5. Umieścić mikropłytkę w suchym grzejniku blokowym w temperaturze 55 °C na 20-30 min, aż do całkowitego odparowania rozpuszczalnika. W czasie odparowywania rozpuszczalnika przygotować roboczy roztwór Nile Red (wymagane 200 µL roztworu o stężeniu 1 µg/ml na dołek płytki). Na przykład w przypadku dwunastu próbek i pełnego zestawu standardów wymagane jest 16 mL roztworu o stężeniu 1,0 µg/mL; przygotować go, rozpuszczając 80 µL roztworu zapasowego 200 µg/mL (w DMSO) w 16 mL dH2O.
  6. Wyjąć mikropłytkę z bloku grzewczego i pozostawić do ostygnięcia do temperatury pokojowej. Dodać 30 µL alkoholu izopropylowego do każdego dołka i wymieszać, pipetując w górę i w dół. Upewnić się, że wszystkie kanały pipety mieszają roztwór i resuspendują lipidy, uzyskując jednorodny zielony płyn.
  7. Dodać 200 µL roztworu Nile Red (1 µg/mL) do każdego dołka i wymieszać, pipetując w górę i w dół 10 razy. Inkubować płytkę przez 5 min w temperaturze pokojowej. W czasie oczekiwania przygotować 50% roztwór wybielacza, mieszając wybielacz (6% podchlorynu) z dH2O. Wymagane jest 20 µL na dołek. Przygotowanie 3 mL 50% wybielacza jest wystarczające dla 12 próbek i pełnego zestawu standardów.
  8. Dodać 20 µL roztworu wybielacza do każdego dołka mikropłytki i wymieszać dokładnie, pipetując w górę i w dół 5 razy. Inkubować przez 30 min w temperaturze pokojowej.
  9. Po 30 min mierzyć fluorescencję w próbkach co 5-10 min przy wzbudzeniu 530 nm i emisji 575 nm z auto odcięciem ustawionym na 570 nm, aż sygnał z próbek alg się ustabilizuje. Zazwyczaj wystarczająca jest całkowita inkubacja przez 60 min.
  10. Sporządzić krzywą kalibracyjną dla standardów oleju roślinnego (w zakresie 0-40 ng oleju/dołek).
    UWAGA: Dopasowanie liniowe sprawdza się przy niskich stężeniach oleju (<30 ng/dołek), a w przypadku standardów przekraczających 30 ng/dołek można zastosować dopasowanie wielomianowe. Wykorzystać tę korelację do ilościowego oznaczenia neutralnych lipidów w dołkach z próbkami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Niniejsza procedura pozwala na uzyskanie danych z przebiegu czasowego gęstości optycznej alg przy OD 550 nm (Rycina 4A). Dane dotyczące gęstości optycznej i stężenia suchej masy mogą zostać skorelowane (Rycina 4B). Osiąga się to najpierw poprzez obliczenie końcowego stężenia suchej masy alg po etapie liofilizacji. Następnie można skorelować gęstość optyczną rozcieńczeń seryjnych kultury (wykonanych w ostatnim dniu pobierania prób...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Najważniejszą kwestią przy hodowli glonów jest zrozumienie specyficznych potrzeb organizmu lub grupy organizmów. Opisany tutaj system uprawy glonów może być wykorzystywany do hodowli szerokiej gamy glonów, ale konkretne czynniki abiotyczne (temperatura, pożywka, pH, natężenie światła, poziomCO2 , szybkość napowietrzania) muszą być dostosowane do potrzeb organizmu. Należy zauważyć, że opisane tutaj parametry zostały wykorzystane do uprawy Chlorelli i Auxenochlorella. Organizmy te mają znaczeni...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Wsparcie dla tych badań zostało zapewnione przez USDA National Institute of Food and Agriculture Hatch Project ALA0HIGGINS oraz Auburn University Offices of the Rektor, Vice President for Research oraz Samuel Ginn College of Engineering. Wsparcia udzielił również grant NSF CBET-1438211.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Materiały eksploatacyjne do konfiguracji fotobioreaktora transportu powietrznego
1 L Butelki z tworzywa sztucznegoCorning16157-191Do reaktorów butelkowych, nawilżaczy
Zacisk węża 1/2"Home DepotUC953Alub odpowiednik
1/4" żeński luer do zadzioruNordson biomedyczny NordsonFTLL360-60051/4" ID, PP
Rurki PVC do autoklawy 1/4" ID, 3/8" ODThermo-Nalgene63013-24450'1
/4" in O-ringiGrainger1REC5#010 Średnio twardy silikonowy O-ring, 0,239" ID, 0,379"OD.
1/8 "żeński luer do zadzioruNordson biomedicalFTLL230-6005
1/8 "ID, 1/4" OD autoklawowalne rurki PVCThermo-Nalgene63013-608250'1
/8" męski przędzenie luer do zadzioruNordson biomedicalMLRL013-6005
1/8" wieloportowy zadziorNordsonbiomedical 4PLL230-60051/8" wieloportowy zadzior
1/8 "NPT do zadzioruNordson biomedical18230-60051/8" 200 series Barb
1/8" do montażu panelowego LuerNordson biomedical NordsonMLRLB230-60051/8", PP
10 galonówWalmart802262Może pomieścić do 8 bioreaktorów w zależności od układu
Przepływomierz 100-1000 ccmDwyerRMA-13-SSVDo reaktorów butelkowych
2 stopy fluorescencyjny bank światłaAgrobriteFLT24 T5
Przepływomierz 200-2500 ccmDwyerRMA-14-SSVDo regulacji powietrza przed nawilżaczem
Butelki Pyrex 250 mlCorning16157-136Do mieszania gazów po nawilżaczu
Przepływomierz 50-500 ccmDwyerRMA-12-SSVDo reaktorów rurowych hybrydyzacyjnych
Przepływomierz 5-50 ccmDwyerRMA-151-SSVDo kontroli natężenia przepływu CO2
Filtry powietrza 0,2 i mikro; mWhatman/ Fisher09-745-1APolyvent, 28 mm, 0,2 i mikro; m, PTFE, 50 sztuk
Zawory zwrotneVWR89094-714
Pokrywki Corning do butelek z pyreksuVWR89000-23310 pokrywek GL45
Żeńska nasadka końcowa luerNordson biomedicalNordson FTLLP-6005Żeńska stabilna
PP Rurki hybrydyzacyjneCorning32645-03035x300 mm, opakowanie 2 sztuk
Zegar świetlnyWalmart556393626
Nakrętki zabezpieczająceNordson biomedicalNordson LNS-31/4", czerwony nylon
Niskoprofilowe mieszadło magnetyczneVWR10153-690Mieszadło magnetyczne niskoprofilowe
Męska nasadka końcowa typu luerNordson biomedycznaNordson LP4-6005Wtyczka męska PP
Wirujący pierścień blokujący typu luerNordson biomedyczny NordsonFSLLR-6005
Mieszadła - długieVWR58949-04038,1 mm, do reaktorów butelkowych
Mieszadła - średnieVWR58949-03425 mm, do probówek do hyridyzacji
Materiały eksploatacyjne i odczynniki do hodowli glonów
0,2 i mikro; m FiltryVWR28145-49113 mm, PTFE, do filtrowania zużytych pożywek z pobierania próbek z codziennej
hodowli Strzykawki 1 mlAir-tite89215-216Do filtrowania zużytych pożywek z dziennego pobierania próbek posiewu
Probówki 1,5 mlVWR87003-294Sterylne (lub równoważne)
10 ml Pipety serologiczneGreiner Bio-One82050-482Sterylne (lub równoważne)
100 mm talerze VWR25384-342Szalki Petriego 100x15 mm do układania w stosy, sterylne
probówki 15 mlGreiner Bio-One82050-276Sterylne (lub równoważne), polipropylenowe
2 ml Serologiczne końcówki do pipetGreiner Bio-One82051-584Sterylne (lub równoważne)
Probówki 2 mlVWR87003-298Sterylne (lub równoważne)
probówki 50 mlGreiner Bio-One82050-348Sterylna (lub równoważna), polipropylenowa
96-dołkowa mikropłytkaGreiner Bio-One89089-578Polistyren z pokrywką, płaskie dno
Pętle do zakładania VWR80094-478Sterylny (lub równoważny)
zbiornik ciekłego dwutlenku węgla i regulatorAirgasCD-50
Materiały eksploatacyjne i odczynniki do ekstrakcji lipidów i oznaczania lipidów obojętnych
2 ml probówki z kulkamiVWR10158-556Rurka polipropylenowa z pokrywką
96-dołkowe mikropłytkiGreiner Bio-One82050-774Polipropylen, płaskie dno
WybielaczWalmart550646751Używaj tylko zwykłego wybielacza, nie czyszcząc wybielacza
ChloroformBDHBDH1109-4LG
DimetylosulfotlenekBDHBDH1115-1LP
Alkohol izopropylowyBDHBDH1133-1LP
MetanolBDHBDH20864.400
Czerwień nilowaVWRTCN0659-5G
Końcówki do pipet PasteuraVWR14673-010
Chlorek soduBDHBDH9286-500G
Olej roślinnyWalmart9276383Każdy olej roślinny powinien działać, o ile jest świeży
Kulki cyrkonowe/krzemionkowe (średnica 0,5 mm)Produkty biospec11079105z
Equipment
Analytical balanceMettler-ToledoXS205DUZ dokładnością co najmniej 4 miejsc po przecinku
Homogenizator kulekOmni19-040E
Mikrowirówka stołowaThermoHeraeus Fresco 21 z 24x2W tym wirnik zdolny do obsługi probówek 1,5 i 2 ml
Suchy grzejnik blokowyVWR75838-282W zestawie suchy blok do mikropłytki
LiofilizatorLabconco7670520System liofilizacji 2,5L
Duża wirówka stołowaThermoHeraeus Megafuge 16R TissueW zestawie wirniki zdolne do obsługi butelek o pojemności 400 ml, probówek 50 ml i probówek 15 ml
Czytnik mikropłytekUrządzenia molekularneSpectraMax M2Możliwość odczytu absorbancji i fluorescencji
Mieszalnik wirowyVWR10153-838
akwarium

Bibliografia

  1. Prandini, J. M., et al. Enhancement of nutrient removal from swine wastewater digestate coupled to biogas purification by microalgae Scenedesmus spp. Bioresource Technology. , 67-75 (2016).
  2. Liu, C., et al. Phycoremediation of dairy and winery wastewater using Diplosphaera sp. MM1. Journal of Applied Phycology. 28 (6), 3331-3341 (2016).
  3. Passero, M., Cragin, B., Coats, E. R., McDonald, A. G., Feris, K. Dairy Wastewaters for Algae Cultivation, Polyhydroxyalkanote Reactor Effluent Versus Anaerobic Digester Effluent. BioEnergy Research. 8 (4), 1647-1660 (2015).
  4. Hodgskiss, L. H., Nagy, J., Barnhart, E. P., Cunningham, A. B., Fields, M. W. Cultivation of a native alga for biomass and biofuel accumulation in coal bed methane production water. Algal Research. 19, 63-68 (2016).
  5. Gao, C., et al. Oil accumulation mechanisms of the oleaginous microalga Chlorella protothecoides revealed through its genome, transcriptomes, and proteomes. BMC Genomics. 15, (2014).
  6. Burch, A. R., Franz, A. K. Combined nitrogen limitation and hydrogen peroxide treatment enhances neutral lipid accumulation in the marine diatom Phaeodactylum tricornutum. Bioresource Technology. 219, 559-565 (2016).
  7. Brennan, L., Owende, P. Biofuels from microalgae--A review of technologies for production, processing, and extractions of biofuels and co-products. Renewable Sustainable Energy Reviews. 14 (2), 557-577 (2009).
  8. Branyikova, I., et al. Microalgae - Novel highly efficient starch producers. Biotechnology and Bioengineering. 108 (4), 766-776 (2010).
  9. Chalima, A., et al. Utilization of Volatile Fatty Acids from Microalgae for the Production of High Added Value Compounds. Fermentation. 3 (4), (2017).
  10. Harun, R., Singh, M., Forde, G. M., Danquah, M. K. Bioprocess engineering of microalgae to produce a variety of consumer products. Renewable and Sustainable Energy Reviews. 14 (3), 1037-1047 (2010).
  11. Liu, L., et al. Development of a new method for genetic transformation of the green alga Chlorella ellipsoidea. Molecular biotechnology. 54 (2), 211-219 (2013).
  12. Cheng, J., et al. Mutate Chlorella sp. by nuclear irradiation to fix high concentrations of CO2. Bioresource Technology. 136, 496-501 (2013).
  13. Davis, R., Aden, A., Pienkos, P. T. Techno-economic analysis of autotrophic microalgae for fuel production. Applied Energy. 88 (10), 3524-3531 (2011).
  14. Sales, C. M., Au, Comparison of Scale in a Photosynthetic Reactor System for Algal Remediation of Wastewater. Journal of Visualized Experiments. (121), e55256(2017).
  15. Higgins, B. T., et al. Cofactor symbiosis for enhanced algal growth, biofuel production, and wastewater treatment. Algal Research. 17, 308-315 (2016).
  16. Higgins, B., et al. Algal-bacterial synergy in treatment of winery wastewater. Nature Clean Water. 1 (6), (2017).
  17. Higgins, B. T., et al. Impact of thiamine metabolites and spent medium from Chlorella sorokiniana on metabolism in the green algae Auxenochlorella prototheciodes. Algal Research. 33, 197-208 (2018).
  18. Lépinay, A., et al. First insight on interactions between bacteria and the marine diatom Haslea ostrearia: Algal growth and metabolomic fingerprinting. Algal Research. 31, 395-405 (2018).
  19. Franchino, M., Comino, E., Bona, F., Riggio, V. A. Growth of three microalgae strains and nutrient removal from an agro-zootechnical digestate. Chemosphere. 92 (6), 738-744 (2013).
  20. Choix, F. J., Lopez-Cisneros, C. G., Mendez-Acosta, H. O. Azospirillum brasilense Increases CO2 Fixation on Microalgae Scenedesmus obliquus, Chlorella vulgaris, and Chlamydomonas reinhardtii Cultured on High CO2 Concentrations. Microbial Ecology. 76 (2), 430-442 (2018).
  21. Higgins, B., VanderGheynst, J. Effects of Escherichia coli on mixotrophic growth of Chlorella minutissima and production of biofuel precursors. PLoS One. 9 (5), e96807(2014).
  22. Higgins, B., Thornton-Dunwoody, A., Labavitch, J. M., VanderGheynst, J. S. Microplate assay for quantitation of neutral lipids in extracts from microalgae. Analytical Biochemistry. 465, 81-89 (2014).
  23. Tanadul, O. U., Vandergheynst, J. S., Beckles, D. M., Powell, A. L., Labavitch, J. M. The impact of elevated CO2 concentration on the quality of algal starch as a potential biofuel feedstock. Biotechnology and Bioengineering. 111 (7), 1323-1331 (2014).
  24. Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
  25. Higgins, B. T., et al. Informatics for improved algal taxonomic classification and research: A case study of UTEX 2341. Algal Research. 12, 545-549 (2015).
  26. Garrett, R. H., Grisham, C. M. Biochemistry. , 5th Edition, Cengage Learning. 578-730 (2012).
  27. de-Bashan, L. E., Trejo, A., Huss, V. A. R., Hernandez, J. -P., Bashan, Y. Chlorella sorokiniana UTEX 2805, a heat and intense, sunlight-tolerant microalga with potential for removing ammonium from wastewater. Bioresource Technology. 99 (11), 4980-4989 (2008).
  28. Wang, Q., Higgins, B., Ji, H., Zhao, D. Annual International Meeting of the ASABE. , American Society of Agricultural and Biological Engineers. Detroit, MI. (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Fotobioreaktor kolumnowy z napowietrzaniemhodowla mikroalgoznaczanie lipid w oboj tnychmetoda Folchapomiar g sto ci optycznejliofilizacja biomasypozyskiwanie przez wirowaniefluorescencja czerwieni nilowejmonitorowanie wzrostu alggatunki Chlorella
Hodowla zielonych mikroalg w fotobioreaktorach z kolumnami bąbelkowymi i test na obecność obojętnych lipidów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.