Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Analiza wychwytu endocytarnego i transportu wstecznego do sieci trans-Golgiego z wykorzystaniem funkcjonalizowanych nanociał w hodowanych komórkach

8.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59111

⸱

21 lutego 2019

 , 
1Biozentrum, University of Basel

W tym artykule

Podsumowanie

Wsteczny transport białek z powierzchni komórki do Golgiego jest niezbędny do utrzymania homeostazy błony. W tym miejscu opisujemy metodę biochemicznej analizy transportu białek rekombinowanych z powierzchni komórki do Golgiego przy użyciu funkcjonalizowanych nanociał w komórkach HeLa.

Streszczenie

Transport białek i błon z powierzchni komórki do Golgiego i dalej jest niezbędny dla homeostazy, tożsamości organelli i fizjologii. Aby zbadać ruch białek wstecznych, opracowaliśmy niedawno wszechstronny zestaw narzędzi oparty na nanociałach do analizy transportu z powierzchni komórki do kompleksu Golgiego, za pomocą obrazowania stałych i żywych komórek, mikroskopii elektronowej lub biochemicznie. Zaprojektowaliśmy funkcjonalizowane nanociała białka anty-zielonej fluorescencji (GFP) - małe, monomeryczne spoiwa białkowe o wysokim powinowactwie - które można zastosować do linii komórkowych wyrażających interesujące białka błonowe z zewnątrzkomórkową grupą GFP. Derywatyzowane nanociała związane z reporterami GFP są specjalnie internalizowane i transportowane na barana wzdłuż tras sortowania reporterów. Nanociała funkcjonalizowano za pomocą fluoroforów w celu śledzenia transportu wstecznego za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i obrazowania na żywo, za pomocą peroksydazy askorbinianowej 2 (APEX2) w celu zbadania ultrastrukturalnej lokalizacji kompleksów reporter-nano za pomocą mikroskopii elektronowej oraz za pomocą motywów siarczanowania tyrozyny (TS) w celu oceny kinetyki nadejścia sieci trans-Golgiego (TGN). W tym artykule metodologicznym przedstawiamy ogólną procedurę bakteryjnej ekspresji i oczyszczania funkcjonalizowanych nanociał. Ilustrujemy potężne zastosowanie naszego narzędzia za pomocą nanociał modyfikowanych mCherry i TS do analizy wychwytu endocytarnego i przybycia TGN białek ładunkowych.

Wprowadzenie

Ruch wsteczny białek i lipidów z powierzchni komórki do różnych przedziałów wewnątrzkomórkowych jest kluczowy dla utrzymania homeostazy błony, aby zrównoważyć wydzielanie i recykling składników następczych maszyn transportowych1,2. Po internalizacji poprzez endocytozę zależną lub niezależną od klatryny, ładunek białkowy i lipidowy najpierw zasiedla wczesne endosomy, skąd są dalej przekierowywane wzdłuż układu endo-lizosomalnego, zawracane do błony plazmatycznej lub kierowane do sieci trans-Golgiego (TGN). Recykling z endosomów i/lub powierzchni komórki do TGN jest częścią cyklu funkcjonalnego wielu następczych transbłonowych receptorów ładunkowych, takich jak zależne od kationów i niezależne od kationów receptory mannozo-6-fosforanu (CDMPR i CIMPR) dostarczające nowo zsyntetyzowane hydrolazy lizosomalne z TGN do późnych endosomów i lizosomów3,4,5, sortilin i SorLA6,7, a Wntless (WLS) transportuje ligandy Wnt na powierzchnię komórki8,9,10,11. Inne białka odzyskane z powrotem do TGN to TGN46 i pokrewne z nim izoformy12,13,14, SNAREs (rozpuszczalne receptory przyłączeniowe czynnika fuzji wrażliwe na N-etylomaleimid)15,16,17, białko prekursorowe amyloidu (APP)18,19, białko progresywnej ankylozy (ANK)20, transportery metali, takie jak ATP7A/B lub DMT121,22, oraz enzymy przetwarzania transbłonowego, w tym karboksypeptydaza D, furyna lub BACE123,24,25. Oprócz tych endogennych białek, toksyny bakteryjne i roślinne (np. toksyna Shiga i, rycyna i abryna) porywają wsteczne mechanizmy transportowe, aby dotrzeć do ER w celu retrotranslokacji do cytozolu26,27,28,29.

Aby bezpośrednio analizować ruch wsteczny, wcześniej opracowaliśmy zestaw narzędzi oparty na nanociałach do oznaczania i śledzenia białek ładunkowych od powierzchni komórki do przedziałów wewnątrzkomórkowych30. Nanociała reprezentują nową rodzinę spoiw białkowych pochodzących z homodimerycznych przeciwciał opartych wyłącznie na łańcuchach ciężkich (hcAb), które naturalnie występują u wielbłądowatych i ryb chrzęstnych31,32. Stanowią one zmienną domenę łańcucha ciężkiego (VHH) hcAb i mają wiele zalet w porównaniu z konwencjonalnymi przeciwciałami (np. IgG): Są monomeryczne, małe (~15 kDa), wysoce rozpuszczalne, pozbawione wiązań dwusiarczkowych, mogą ulegać ekspresji bakteryjnej i są wybierane pod kątem wysokiego powinowactwa wiązania33,34,35,36. Aby nasze narzędzie do nanowirusa było wszechstronne i miało szerokie zastosowanie, zastosowaliśmy funkcjonalizowane nanociała anty-GFP do znakowania powierzchniowego i śledzenia białek znakowanych GFP w ich domenie zewnątrzkomórkowej/świetlnej. Poprzez funkcjonalizację nanociał za pomocą mCherry, peroksydazy askorbinianowej 2 (APEX2)37 lub sekwencji siarczanowania tyrozyny (TS), wsteczny transport prawdziwych transbłonowych białek ładunkowych można analizować za pomocą obrazowania stałych i żywych komórek, mikroskopii elektronowej lub biochemicznie. Ponieważ siarczanowanie tyrozyny, w którym pośredniczą sulfotransferazy tyrozyloproteinowe (TPST1 i TPST2) jest modyfikacją potranslacyjną ograniczoną do trans-Golgiego/TGN, możemy bezpośrednio badać transport i kinetykę interesujących białek z powierzchni komórki do tego wewnątrzkomórkowego przedziału Golgiego38,39,40.

W tym artykule o metodach opisujemy łatwość produkcji funkcjonalizowanych nanociał (VHH-2xTS, -APEX2, -mCherry i pochodnych) nadających się do wielu zastosowań do analizy transportu wstecznego w komórkach ssaków30. Koncentrujemy się głównie na wykorzystaniu nanonika modyfikowanego w miejscu TS do analizy ruchu wewnątrzkomórkowego od powierzchni komórki do przedziału zasiarczenia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Transformacja bakteryjna za pomocą funkcjonalizowanych nanociał

UWAGA: Ten protokół został zoptymalizowany do wyrażania, oczyszczania i analizy funkcjonalizowanych nanociał anty-GFP, jak wcześniej opisano30. Derywatyzacja z innymi cząstkami białkowymi może wymagać modyfikacji tego standardowego protokołu.

  1. Rozmrozić bakterie chemokompetentne (~100 μL) nadające się do ekspresji białek (np. komórki Escherichia coli Rosetta BL21 (DE3)) poprzez umieszczenie ich na lodzie.
    nuta: Przygotuj chemokompetentne komórki bakteryjne zgodnie ze standardowymi procedurami laboratoryjnymi. Alternatywnie, chemicznie kompetentne komórki bakteryjne można kupić na rynku.
  2. Dodaj 50 ng plazmidu kodującego funkcjonalizowane nanociała. Aby umożliwić wystarczającą specyficzną dla miejsca biotynylację reportera nano podczas ekspresji bakteryjnej, należy również dodać trzykrotny nadmiar (150 ng) plazmidu o ekspresji bakteryjnej kodującego ligazę biotyny BirA (patrz również Tabela 1 w celu uzyskania informacji o plazmidzie). Delikatnie pipetować w górę i w dół.
    nuta: Jeśli biotynylacja nanotonu nie jest konieczna lub reportery nanocząsteczkowe są pozbawione peptydu akceptora biotyny (BAP), kotransformacja z plazmidem kodującym BirA nie jest wymagana.
  3. Inkubuj komórki bakteryjne przez 30 minut na lodzie.
  4. Szok termiczny komórek bakteryjnych poprzez umieszczenie ich na 1 minutę w temperaturze 42 °C w łaźni wodnej lub bloku grzewczym.
  5. Dodać 1 ml pożywki bulionowej Luria (LB) o temperaturze pokojowej (RT) i inkubować przekształcone bakterie w wytrząsarce termicznej przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, aby umożliwić fenotypową ekspresję genów oporności. Aby przygotować 1 l pożywki LB, zrównoważyć 5 g ekstraktu drożdżowego, 10 g tryptonu i 10 g NaCl, napełnić wodą i sterylizować w autoklawie. Jeśli funkcjonalizowany nanonik został subklonowany w wektorze ekspresyjnym zawierającym oporność na ampicylinę/karbenicylinę, krok 1.5 można pominąć.
  6. Osadzaj bakterie w 11 000 x g przez 1 minutę i ponownie zawieś w 100 μl świeżej pożywki LB.
  7. Zawiesinę bakterii należy umieścić na płytkach LB zawierających odpowiednie antybiotyki (np. z 50 μg/ml kanamycyny i 50 μg/ml karbenicyliny, gdy bakterie zostały przekształcone w komutację z reporterem nanoma i BirA, jak podano powyżej (krok 1.2)).
  8. Umieścić płytki LB w inkubatorze w temperaturze 37 °C i pozostawić do wzrostu na noc (O/N).
    nuta: Protokół można w tym miejscu wstrzymać, przechowując płytkę LB z wyhodowanymi koloniami w temperaturze 4 °C. Użyj parafilmu do uszczelnienia płytek LB.

2. Bakteryjna hodowla płynów i indukcja funkcjonalizowanej ekspresji nanoma

  1. Pobrać z płytki kolonię bakterii zawierającą interesujący nas wektor i pozwolić mu rosnąć w kolbie zawierającej 20 ml pożywki LB uzupełnionej antybiotykami O/N w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C (patrz również krok 1.7 dotyczący antybiotyków selekcyjnych).
  2. Następnego dnia rozcieńczyć wyhodowaną 20 ml kultury bakteryjnej w kolbie zawierającej 1 l pożywki LB z antybiotykami selekcyjnymi.
  3. Kontynuować inkubację kultury bakteryjnej w temperaturze 37 °C, aż osiągnie OD600 0,6-0,7. Pozwól kulturze ostygnąć do temperatury pokojowej przed wywołaniem ekspresji białka.
  4. Indukować ekspresję białek funkcjonalizowanych nanociał i BirA przez dodanie 1 ml 1 M izopropylo-β-d-tiogalaktopiranozydu (IPTG) do końcowego stężenia 1 mM induktora (rozcieńczenie 1:1,000). Dodać również 10 ml 20 mM roztworu podstawowego d-biotyny, co daje 200 μM d-biotyny w pożywce wzrostowej, aby umożliwić biotynylację epitopu BAP obecnego w funkcjonalizowanych nanociałach (patrz również Tabela 1 w celu uzyskania informacji o plazmidzie)
    nuta: Podstawowy roztwór d-biotyny przygotowuje się w ddH2O i wprowadza do roztworu przez krople dodawania 500 mM NaH2PO4 . Alternatywnie, d-biotyna może być również rozpuszczona w DMSO. Aby wytworzyć nanociała połączone z APEX2 (VHH-APEX2), podłoże LB musi być dodatkowo uzupełnione 1 mM chlorowodorkiem kwasu 5-aminolewulinowego (dALA) w celu pobudzenia hemu. dALA przygotowuje się w postaci 100 mM roztworu podstawowego w ddH2O.
  5. Inkubować indukowaną przez IPTG 1 l kulturę bakteryjną w temperaturze 30 °C przez 4 godziny dla VHH-2xTS, w temperaturze 20 °C lub RT O/N dla VHH-APEX2 lub w temperaturze 16 °C O/N dla VHH-mCherry (patrz również Tabela 1 w celu uzyskania informacji o plazmidzie).
    nuta: Warunki wyrażenia dla nowej konstrukcji nanonury muszą zostać zoptymalizowane przez eksperymentatora.
  6. Przenieść kulturę bakteryjną z kolby do butelki wirowej o pojemności 1 l i zagnieździć komórki w granulkach w temperaturze 5 000 x g w temperaturze 4 °C przez 45 minut. Zdekantować supernatant i kontynuować oczyszczanie.
    UWAGA: W tym miejscu można wstrzymać działanie protokołu, przechowując osad bakteryjny w temperaturze -80 °C na czas nieokreślony. Granulka do VHH-APEX2 lub VHH-mCherry jest zazwyczaj odpowiednio brązowawa (ze względu na wbudowany hem) lub różowy.

3. Oczyszczanie funkcjonalizowanych nanociał

  1. W razie potrzeby rozmrozić zamrożone osady bakteryjne na lodzie (patrz również krok 2.6).
  2. Dodać 30 ml lodowatego buforu wiążącego (20 mM imidazolu w 1x PBS) do osadu komórek bakteryjnych i ponownie zawiesić, pipetując w górę iw dół. Przenieś zawieszone bakterie do oznakowanej probówki o pojemności 50 ml.
  3. Uzupełnić 30 ml buforu wiążącego 200 μg/ml lizozymu, 20 μg/ml DNazy I, 1 mM MgCl2 i 1 mM fluorku fenylometylosulfonylu (PMSF) i inkubować najpierw przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C na wytrząsarce typu end-over-end.
  4. Mechanicznie zmodyfikować komórki bakteryjne w probówce o pojemności 50 ml, umieszczając końcówkę sonikatora w zawiesinie. Stosuj stałe 3 impulsy po 1 minutę z 1-minutowymi okresami chłodzenia pomiędzy nimi.
  5. Odwirować lizat bakteryjny w temperaturze 15 000 x g w temperaturze 4 °C przez 45 minut w celu osadzenia szczątków i nienaruszonych komórek. Przenieść sonikowany lizat komórek bakteryjnych do odpowiedniej butelki wirowej w celu odwirowania lub podzielić lizat na kilka probówek o pojemności 5 ml do wirowania stołowego.
  6. Przenieść supernatant do nowej probówki o pojemności 50 ml i wyrzucić granulowane resztki.
  7. Oczyszczony lizat należy przechowywać na lodzie podczas przygotowywania oczyszczania metodą chromatografii powinowactwa do unieruchomionych metali (IMAC). Aby wyizolować funkcjonalizowane nanociała znakowane histydyną, należy użyć jednorazowych kolumn He (patrz Tabela materiałów), które umożliwiają szybkie i proste oczyszczanie grawitacyjne.
    nuta: Alternatywnie można również zastosować oczyszczanie okresowe zamiast kolumn komercyjnych.
  8. Ustawia swoje kolumny na metalowym stojaku.
    1. Zmniejsz roztwór do przechowywania kolumn i zrównoważ kolumnę He z 10 ml buforu wiążącego (20 mM imidazolu w 1x PBS).
    2. Opróżnij przez przepływ grawitacyjny (przepływ można odrzucić).
  9. Stopniowo ładuj oczyszczony lizat bakteryjny (~30 ml) na kolumnę. Opróżnij przez przepływ grawitacyjny (przepływ można odrzucić).
  10. Przemyć kolumnę He 2x 10 ml buforu wiążącego (20 mM imidazolu w 1x PBS).
  11. Eluować nanociała za pomocą 2 ml buforu elucyjnego (500 mM imidazolu w 1x PBS) do probówki o pojemności 2 ml i zastosować wymianę buforową.
  12. Wymiana.
    1. Zrównoważyć kolumnę odsalającą (patrz tabela materiałów) umieszczoną w adapterze kolumny probówki o pojemności 50 ml 5 razy z 5 ml 1x PBS.
    2. Pozwól, aby bufor dostał się do wypełnionego łoża. Odrzuć przepływ.
    3. Po piątym wyrównaniu PBS obracać kolumnę z prędkością 1 000 x g przez 2 minuty.
    4. Odrzuć przepływ.
    5. Umieść kolumnę z adapterem na nowej probówce o pojemności 50 ml. Załadować 2 ml eluowanego funkcjonalizowanego nanonika (z kroku 3.11) do kolumny odsalającej w równowadze z PBS i wirować w temperaturze 1 000 x g przez 2 minuty i zebrać eluat.
      nuta: Zamiast komercyjnych kolumn odsalających, dializa może być stosowana do wymiany składu buforowego.
  13. Oznaczyć stężenie białka (nanociała) w eluacie za pomocą testu bicynchoninowego (BCA) lub testu Bradforda zgodnie z instrukcjami producenta.
    nuta: W przypadku testów wychwytu nanocząsteczki za pomocą linii komórkowych reporterowych GFP optymalne jest stężenie wyjściowe 2-10 mg/ml.

4. Walidacja funkcjonalizowanego wyrażenia nanoma (barwienie Coomassie)

  1. Przygotuj 10-12,5% żele do elektroforezy w żelu dodecylosiarczanu sodu i poliakryloamidu (SDS-PAGE) zgodnie ze standardowymi protokołami.
    nuta: Alternatywnie można użyć dostępnych w handlu prefabrykowanych żeli gradientowych.
  2. Odmierzyć pipetą 20 μg oczyszczonego, funkcjonalizowanego nanonika do probówki o pojemności 1,5 ml i gotować w buforze próbki w temperaturze 95 °C przez 5 min.
    nuta: Na przykład dodać 10 μl roztworu podstawowego nanonu o stężeniu 2 mg/ml do probówki o pojemności 1,5 ml z 10 μl buforu do 2 x próbki. Jeśli objętość jest zbyt mała, należy dodatkowo rozcieńczyć nanonik w PBS przed dodaniem buforu próbki.
  3. Załadować oczyszczoną nanonikę ugotowaną w buforze próbki do żelu poliakryloamidowego SDS i postępować zgodnie ze standardowym protokołem PAGE, aż barwnik odniesienia (np. błękit bromofenolowy) dotrze do końca żelu rozdzielającego, a następnie nastąpi barwienie i odbarwienie Coomassie.
  4. Barwienie i odbarwienie żelem Coomassie.
    1. Odlać żel i zabarwić go roztworem barwiącym Coomassie (5% 10 g/l roztworu podstawowego Coomassie w 10% kwasie octowym i 45% metanolu w ddH2O) przez 20-30 minut w temperaturze pokojowej na ruchomej platformie wstrząsającej. Żel powinien być całkowicie pokryty roztworem barwiącym.
    2. Odbarwić żel 2-3 razy roztworem odbarwiającym (7,5% kwasu octowego i 15% metanolu wddH2O) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, przed pozostawieniem żelu O/N do dalszego odbarwiania.
      UWAGA: Nadmiar Coomassie można skutecznie wchłonąć, umieszczając ręczniki papierowe w kuchni wokół żelu.
  5. Zobrazuj żel za pomocą wybranego imagera lub aparatu fotograficznego.
    nuta: Ekspresja nano może być dalej zwalidowana przez analizę immunoblot przy użyciu przeciwciał skierowanych przeciwko jego epitopom (patrz również Figura 1A).

5. Wychwyt funkcjonalizowanych nanociał przez hodowane komórki do barwienia fluorescencyjnego

  1. W kapturze do hodowli komórkowej nasiona ~ 400 000 do 500 000 komórek HeLa stabilnie eksprymujących białko reporterowe znakowane GFP na 18-milimetrowych szklanych szkiełkach nakrywkowych (nr 1,5H) w 35-milimetrowych szalkach lub 6-dołkowych klastrach z kompletną pożywką zawierającą antybiotyki (zmodyfikowana pożywka Dulbecco's Modified Eagle, DMEM, uzupełniona 10% płodową surowicą cielęcą (FCS), 100 jednostek/ml streptomycyny, 2 mM l-glutaminy, i 1,5 μg/ml puromycyny).
    nuta: Tutaj używamy komórek HeLa stabilnie eksprymujących EGFP-Calnexin, EGFP-CDMPR i TfR-EGFP w celach ilustracyjnych. Oprócz stabilnych linii komórkowych można również stosować przejściowo transfekowane komórki HeLa. Na tym etapie stabilne linie komórkowe mogą być współhodowane z rodzicielskimi nietransdukowanymi komórkami HeLa, w celu bezpośredniego porównania.
  2. Inkubować komórki O/N w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 7,5% CO2 w celu proliferacji.
    nuta: Następnego dnia komórki powinny mieć konfluencję ~80%.
  3. Odpipetować 2 μl roztworu podstawowego nanonu o stężeniu 2 mg/ml do probówki o pojemności 15 lub 50 ml zawierającej 2 ml kompletnej pożywki (objętość ta jest wystarczająca do pokrycia szalki o średnicy 35 mm lub jednego dołka 6-dołkowego klastra, dostosować objętość pożywki i nanocząsteczki proporcjonalnie, aby uwzględnić więcej szalek lub klastrów kultur komórkowych).
    nuta: Dla celów ilustracji używamy tutaj VHH-mCherry, ponieważ nie jest wymagane dalsze barwienie przeciwciałami, aby zobaczyć, że nanobody został zinternalizowany przez reporterów EGFP (patrz Rysunek 2C).
  4. Usunąć pożywkę wzrostową z komórek i dodać 2 ml wstępnie podgrzanej kompletnej pożywki zawierającej 2 μg/ml funkcjonalizowanego nanonika na 35-milimetrową szalkę lub jednostkę 6-dołkową.
  5. Inkubować komórki przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 7,5% CO2 , aby umożliwić wychwyt nanokomórek za pośrednictwem reportera.
    nuta: W zależności od planowanego eksperymentu, czas wychwytu nanobody musi być dostosowany. W przedstawionym tu eksperymencie 1 godzina jest wystarczająca do osiągnięcia stałego stanu wychwytu nanobody przez EGFP-CDMPR i TfR-EGFP.
  6. Usuń pożywkę i umyj komórki 2-3 razy 1 ml 1x PBS w temperaturze pokojowej.
  7. Utrwalić komórki 1 ml 3% paraformaldehydu (PFA) przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  8. Usunąć roztwór PFA i utrwalić pozostały utrwalacz 1 ml 50 mM NH4Cl w 1x PBS przez 5 minut w RT.
    UWAGA: 3% PFA należy utylizować oddzielnie jako odpad utrwalający.
  9. Umyj komórki 3 razy 1 ml 1x PBS w temperaturze pokojowej tonacji.
  10. Przepuszczalność komórek za pomocą 1 ml 0,1% Triton X-100 w 1x PBS przez 10 minut w RT.
    nuta: Chociaż nie jest wymagana przepuszczalność, fluorescencja EGFP i mCherry jest lepsza, gdy następnie komórki są osadzone w podłożu montażowym.
  11. Umyj komórki 3 razy 1 ml 1x PBS w temperaturze pokojowej tonacji.
  12. Umieść szkiełka nakrywkowe za pomocą kleszczyków na kropli (~100 μL) 1% BSA w 1x PBS zawierającym 5 μg/ml DAPI (4',6-diamidyno-2-fenyloindol) na 5 minut w temperaturze pokojowej.
  13. Umieść szkiełka nakrywkowe z powrotem w naczyniu/studzience i umyj 3 razy 1 ml 1x PBS w temperaturze pokojowej.
  14. Oznacz szkiełka podstawowe i zamontuj ogniwa za pomocą Fluoromount-G. Pozostaw podłoże montażowe do stwardnienia w ciemności przez 3-4 godziny i przechowuj szkiełka w temperaturze 4 °C pod ochroną przed światłem.
  15. Obrazowanie wzorów barwienia przy użyciu wybranego mikroskopu (np. Skanowania punktowego konfokalnego mikroskopu pionowego).

6. Wychwyt funkcjonalizowanych nanociał przez hodowane komórki (do analizy zasiarczeń)

  1. W kapturze do hodowli komórkowej nasiona ~ 400 000 do 500 000 komórek HeLa stabilnie wyrażających białko reporterowe znakowane GFP na szalkach 35 mm lub na 6-dołkowych klastrach z kompletną pożywką zawierającą antybiotyki (zmodyfikowana pożywka Dulbecco's Modified Eagle, DMEM, uzupełniona 10% płodową surowicą cielęcą (FCS), 100 jednostek/ml streptomycyny, 2 mM l-glutaminy i 1,5 μg / ml puromycyny).
    nuta: Jak wspomniano powyżej, używamy tutaj komórek HeLa stabilnie eksprymujących EGFP-Calnexin, EGFP-CDMPR i TfR-EGFP w celach ilustracyjnych. Oprócz stabilnych linii komórkowych można również stosować przejściowo transfekowaną HeLa.
  2. Inkubować komórki O/N w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 7,5% CO2 w celu proliferacji.
    nuta: Następnego dnia komórki powinny mieć konfluencję ~80%.
  3. Usunąć całą pożywkę, przemyć 2 razy 1x PBS w temperaturze pokojowej i zagłodzić komórki pożywką bezsiarczanową (SFM) przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 7,5%CO2.
    nuta: SFM przygotowuje się przez dodanie 10 ml roztworu aminokwasów MEM (50x), 5 ml L-glutaminy (200 mM), 5 ml roztworu witamin (100x) i 900 μL CaCl2·2H2O do 500 ml zrównoważonych soli Eagle's. Przepuścić przez filtr 0,22 μm i podwielokrotność.
  4. W wentylowanym okapie lub na stole przeznaczonym do pracy radioaktywnej przygotować pożywkę do znakowania siarczanów zawierającą 0,5 mCi/ml [35S] siarczanu w postaci soli sodowej w SFM.
    ostrożność: Ostrożnie obchodzić się ze wszystkimi roztworami zawierającymi radioaktywność. Pracuj tylko w wyznaczonych okapach lub ławkach. Wszystkie materiały (końcówki, rurki, płytki itp.) lub płuczące mające kontakt z radioaktywnością muszą być zbierane i utylizowane oddzielnie. Zrób to również dla wszystkich poniższych kroków (kroki 6.5-6.20).
  5. Dodać VHH-2xTS w 1x PBS do pożywki do znakowania siarczanów do końcowego stężenia 2 μg/mL.
    nuta: Jako kontrolę należy również uwzględnić VHH-std lub inną nanobody pozbawioną miejsc TS, aby zademonstrować specyficzne oznakowanie.
  6. Zastąp SFM 0,7 ml siarczanowego podłoża znakującego zawierającego 0,5 mCi/ml siarczanu [35S] i 2 μg/ml VHH-2xTS i inkubuj komórki przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w inkubatorze o sile 7,5% CO2 przeznaczonym do pracy z radioaktywnością.
    nuta: W zależności od planowanego eksperymentu należy dostosować czas zasiarczenia nanocząsteczki. Ponadto, aby określić kinetykę przybycia TGN, etykietowanie przeprowadza się dla różnych czasów (np. dla 10 min, 20 min, 30 min itp.).
  7. Usuń podłoże do etykietowania i umyj komórki 2-3 razy lodowatym 1x PBS na płycie chłodzącej lub lodzie.
  8. Dodać 1 ml buforu do lizy (PBS zawierającego 1% Triton X-100 i 0,5% deoksycholanu) uzupełnionego 2 mM PMSF i 1x koktajlem inhibitorów proteazy i inkubować komórki przez 10-15 minut na platformie kołyszącej w temperaturze 4 °C.
  9. Zeskrobać i przenieść lizat do probówki o pojemności 1,5 ml, zmieszać lizat i umieścić na 10-15 minut na rotatorze typu end-over-end w temperaturze 4 °C.
  10. Przygotować lizat pojądrowy przez odwirowanie w temperaturze 10 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  11. Używając nowej probówki o pojemności 1,5 ml, przygotuj 20-30 μl zawiesiny kulek niklowych w probówce o pojemności 1,5 ml i przemyj raz 1x PBS, delikatnie granulując je w ilości 1,000 x g przez 1 min.
    nuta: Zamiast kulek niklowych można użyć kulek streptawidyny (jeśli nanobody jest biotynylowany) lub kulek białka A z IgG przeciwko epitopowi nanonika (znacznik T7 lub HA).
  12. Przenieść lizat pojądrowy do probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej kulki niklu i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C na rotatorze typu end-over-end w celu wyizolowania nanociał. Usunąć podwielokrotność (50–100 μl) lizatu pojądrowego i zagotować w buforze próbki SDS w celu przeprowadzenia dalszej analizy immunoblot całkowitego nanociała związanego z komórką, reportera GFP i kontroli obciążenia.
  13. Umyj kulki 3 razy za pomocą 1x PBS lub buforu do lizy, delikatnie granulując w 1.000 x g przez 1 min.
    nuta: W celu bardziej rygorystycznego mycia kulek 20 mM imidazol może być zawarty w PBS lub buforze do lizy.
  14. Ostrożnie usunąć cały bufor płuczący z kulek, dodać 50 μl buforu do 2 próbek i gotować przez 5 minut w temperaturze 95 °C.
  15. Załaduj oba ugotowane kulki na żel midi 12,5% SDS-PAGE i uruchom zgodnie ze standardowym protokołem PAGE, aż barwnik referencyjny (np. błękit bromofenolowy) dotrze do końca żelu separującego.
    nuta: Analizę immunoblot całkowitego nanociała związanego z komórką, reportera GFP i kontroli obciążenia można również przeprowadzić przy użyciu mini 12,5% SDS-PAGE lub prefabrykowanego żelu gradientowego.
  16. Utrwalić żel separacyjny w ~30 ml buforu utrwalającego (10% kwasu octowego i 45% metanolu w ddH2O) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, przemyć żel trzykrotnie ~50 ml wody dejonizowanej i przygotować do suszenia żelu.
  17. Suszenie żeli SDS-PAGE.
    1. Ostrożnie umieść utrwalony żel na rozciągniętej folii spożywczej i przykryj go wstępnie przyciętą bibułą filtracyjną.
    2. Umieść żel bibułą filtracyjną w dół na platformie suszącej, załóż pokrywę próżniową i włącz pompę próżniową w celu suszenia żelu. Suszyć żel przez 3-5 godzin.
    3. Usuń folię spożywczą i umieść wysuszony żel w kasecie autoradiograficznej wyposażonej w ekran luminoforowy.
  18. Autoradiogram obrazu za pomocą Phosphor Screen Imager. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta.
    nuta: W zależności od siły sygnału, wysuszone żele muszą być dłużej naświetlane za pomocą ekranów luminoforowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W celu zbadania wstecznego transportu białek do różnych komórkowych miejsc docelowych, opracowaliśmy niedawno narzędzie oparte na nanoprzeciwciałach przeciwko GFP, służące do znakowania i śledzenia rekombinowanych białek fuzyjnych z powierzchni komórki30. W niniejszym materiale przedstawiamy bakteryjną produkcję takich zmodyfikowanych nanoprzeciwciał oraz demonstrujemy ich zastosowanie w badaniu pobierania endocytycznego za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i imm...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Nanociała reprezentują nową klasę rusztowań wiążących białka, które mają wiele zalet w porównaniu z konwencjonalnymi przeciwciałami: są małe, stabilne, monomeryczne, mogą być wybrane pod kątem wysokiego powinowactwa i nie mają wiązań dwusiarczkowych 33,35,44,45. Są one wykorzystywane w wielu zastosowaniach, takich jak systemy hodowli komórkowych i organizmy w biologii rozwoju 46,47,48,49, jako ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Grant 31003A-162643 przez Szwajcarską Narodową Fundację Nauki. Dziękujemy Nicole Beuret i Biozentrum Imaging Core Facility (IMCF) za wsparcie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przeciwciało anty-GFPSigma-Aldrich118144600001Produkt jest dystrybuowany przez Sigma-Aldrich, ale wytwarzany przez Roche
Przeciwciało anty-His6Bethyl LaboratoriesA190-114A Przeciwciało
anty-aktynoweEMD MilliporeMAB1501
Koza anty-królik HRPSigma-AldrichA-0545
Koza anty-mysz HRPSigma-AldrichA-0168
4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI)Sigma-AldrichD9542rozpuszczony w 1x PBS/1%BSA
Dimetylosulfotlenek (DMSO)ApplichemA3672
D-biotynaSigma-AldrichB4501rozpuszczony w sterylnym 500 mM NaH2PO4 lub kwas
5-aminolewuilnowy DMSO (dALA) chlorowodorekSigma-AldrichA3785rozpuszczony w sterylnej wodzie
DNase IApplichemA3778rozpuszczony w sterylnej wodzie
LizozymSigma-Aldrich18037059001Produkt jest dystrybuowany przez Sigma-Aldrich, ale produkowany przez Roche
Brefeldin A (BFA)Sigma-AldrichB5936
PuromycinInvivogenant-pr-1
Penicylina/StreptomycynaBioconcept4-01F00-H
L-glutaminaApplichemA3704
Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s medium (DMEM)Sigma-AldrichD5796
Surowica cielęca płodu (FCS)BiowestS181B-500
Siarka-35 jako siarczan soduHartmann AnalyticsARS0105Produkt zawiera 5 mCi
Zbilansowane sole Earle'aSigma-AldrichE6267
MEM roztwór aminokwasów (50x)Sigma-AldrichM5550
MEM roztwór witamin (100x)Sigma-AldrichM6895
cOmplete, Mini koktajl inhibitorów proteazySigma-Aldrich11836153001Produkt jest dystrybuowany przez Sigma-Aldrich, ale produkowany przez Roche
Isopropyl-β-D-tiogalaktopiranozyd (IPTG)ApplichemA1008rozpuszczony w sterylnej wodzie, zapas to 1 M
sól disodowa karbenicylinyApplichemA1491rozpuszczony w sterylnej wodzie, zapas to 100 mg/ml
Siarczan kanamycynyApplichemA1493rozpuszczony w sterylnej wodzie, zapas to 100 mg/ml
Coomassie-R (Brilliant Blue)Sigma-AldrichB-0149
Paraformaldehyd (PFA)ApplichemA3813
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma-AldrichA2153
Fluoromount-GSouthern Biotech0100-01
Ni Sepharose High PerformanceGE Healthcare17-5268-01
Jego kolumny GraviTrapGE HealthcareGE11-0033-99
Jego zestaw buforowyGE HealthcareGE11-0034-00
Jednorazowe kolumny odsalające PD10GE HealthcareGE17-0851-01
Żele Mini-Protean TGX, 4-20%, 15-dołkowyBio-Rad456-1096
Dulbecco' s sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS) bez Ca2+/Mg2+Sigma-AldrichD8537
Szalki 35 mmFalcon353001
6-dołkoweTPP92406
Szkiełka nakrywkowe szklane (nr 1,5H)VWR631-0153
Fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF)ApplichemA0999.0025rozpuszczony w 40% DMSO 60% izopropanolu, zapas 500 mM
TryptoneApplichemA1553
Ekstrakt drożdżowyApplichemA1552
Sześciowodny chlorek magnezuMerck Millipore105833rozpuszczony w sterylnej wodzie, zapas 1 M
Dwuwodny chlorek wapniaMerck Millipore102382rozpuszczony w sterylnej wodzie, zapas wynosi 1 M
Chlorek soduMerck Millipore106404rozpuszczony w sterylnej wodzie, zapas wynosi 5 M

Bibliografia

  1. Johannes, L., Popoff, V. Tracing the retrograde route in protein trafficking. Cell. 135 (7), 1175-1187 (2008).
  2. Bonifacino, J. S., Rojas, R. Retrograde transport from endosomes to the trans-Golgi network. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 7 (8), 568-579 (2006).
  3. Duncan, J. R., Kornfeld, S. Intracellular movement of two mannose 6-phosphate receptors: return to the Golgi apparatus. Journal of Cell Biology. 106 (3), 617-628 (1988).
  4. Ghosh, P., Dahms, N. M., Kornfeld, S. Mannose 6-phosphate receptors: new twists in the tale. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 4 (3), 202-212 (2003).
  5. Doray, B., Ghosh, P., Griffith, J., Geuze, H. J., Kornfeld, S. Cooperation of GGAs and AP-1 in packaging MPRs at the trans-Golgi network. Science. 297 (5587), 1700-1703 (2002).
  6. Pallesen, L. T., Vaegter, C. B. Sortilin and SorLA regulate neuronal sorting of trophic and dementia-linked proteins. Molecular Neurobiology. 45 (2), 379-387 (2012).
  7. Gustafsen, C., et al. Sortilin and SorLA display distinct roles in processing and trafficking of amyloid precursor protein. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (1), 64-71 (2013).
  8. Yu, J., et al. WLS retrograde transport to the endoplasmic reticulum during Wnt secretion. Developmental Cell. 29 (3), 277-291 (2014).
  9. Harterink, M., et al. A SNX3-dependent retromer pathway mediates retrograde transport of the Wnt sorting receptor Wntless and is required for Wnt secretion. Nature Cell Biology. 13 (8), 914-923 (2011).
  10. Port, F., et al. Wingless secretion promotes and requires retromer-dependent cycling of Wntless. Nature Cell Biology. 10 (2), 178-185 (2008).
  11. McGough, I. J., et al. SNX3-retromer requires an evolutionary conserved MON2:DOPEY2:ATP9A complex to mediate Wntless sorting and Wnt secretion. Nature Communications. 9 (1), 3737(2018).
  12. Banting, G., Ponnambalam, S. TGN38 and its orthologues: roles in post-TGN vesicle formation and maintenance of TGN morphology. Biochimica et Biophysica Acta. 1355 (3), 209-217 (1997).
  13. Banting, G., Maile, R., Roquemore, E. P. The steady state distribution of humTGN46 is not significantly altered in cells defective in clathrin-mediated endocytosis. Journal of Cell Science. 111 (Pt 23), 3451-3458 (1998).
  14. Ponnambalam, S., Rabouille, C., Luzio, J. P., Nilsson, T., Warren, G. The TGN38 glycoprotein contains two non-overlapping signals that mediate localization to the trans-Golgi network. The Journal of Cell Biology. 125 (2), 253-268 (1994).
  15. Mallard, F., et al. Early/recycling endosomes-to-TGN transport involves two SNARE complexes and a Rab6 isoform. The Journal of Cell Biology. 156 (4), 653-664 (2002).
  16. Lewis, M. J., Nichols, B. J., Prescianotto-Baschong, C., Riezman, H., Pelham, H. R. Specific retrieval of the exocytic SNARE Snc1p from early yeast endosomes. Molecular Biology of the Cell. 11 (1), 23-38 (2000).
  17. Hirst, J., et al. Distinct and overlapping roles for AP-1 and GGAs revealed by the "knocksideways" system. Current biology. 22 (18), 1711-1716 (2012).
  18. Burgos, P. V., et al. Sorting of the Alzheimer's disease amyloid precursor protein mediated by the AP-4 complex. Developmental Cell. 18 (3), 425-436 (2010).
  19. Choy, R. W., Cheng, Z., Schekman, R. Amyloid precursor protein (APP) traffics from the cell surface via endosomes for amyloid beta (Abeta) production in the trans-Golgi network. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States. 109 (30), E2077-E2082 (2012).
  20. Seifert, W., et al. The progressive ankylosis protein ANK facilitates clathrin- and adaptor-mediated membrane traffic at the trans-Golgi network-to-endosome interface. Human Molecular Genetics. 25 (17), 3836-3848 (2016).
  21. Tabuchi, M., Yanatori, I., Kawai, Y., Kishi, F. Retromer-mediated direct sorting is required for proper endosomal recycling of the mammalian iron transporter DMT1. Journal of Cell Science. 123 (Pt 5), 756-766 (2010).
  22. La Fontaine, S., Mercer, J. F. Trafficking of the copper-ATPases, ATP7A and ATP7B: role in copper homeostasis. Archives of Biochemistry and Biophysics. 463 (2), 149-167 (2007).
  23. Burd, C. G. Physiology and pathology of endosome-to-Golgi retrograde sorting. Traffic. 12 (8), 948-955 (2011).
  24. Chia, P. Z., Gasnereau, I., Lieu, Z. Z., Gleeson, P. A. Rab9-dependent retrograde transport and endosomal sorting of the endopeptidase furin. Journal of Cell Science. 124 (Pt 14), 2401-2413 (2011).
  25. Wahle, T., et al. GGA proteins regulate retrograde transport of BACE1 from endosomes to the trans-Golgi network. Molecular and Cellular Neurosciences. 29 (3), 453-461 (2005).
  26. Johannes, L., Goud, B. Surfing on a retrograde wave: how does Shiga toxin reach the endoplasmic reticulum. Trends in Cell Biology. 8 (4), 158-162 (1998).
  27. van Deurs, B., Tonnessen, T. I., Petersen, O. W., Sandvig, K., Olsnes, S. Routing of internalized ricin and ricin conjugates to the Golgi complex. Journal of Cell Biology. 102 (1), 37-47 (1986).
  28. Sandvig, K., van Deurs, B. Membrane traffic exploited by protein toxins. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 18, 1-24 (2002).
  29. Sandvig, K., et al. Retrograde transport of endocytosed Shiga toxin to the endoplasmic reticulum. Nature. 358 (6386), 510-512 (1992).
  30. Buser, D. P., Schleicher, K. D., Prescianotto-Baschong, C., Spiess, M. A versatile nanobody-based toolkit to analyze retrograde transport from the cell surface. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States. 115 (27), E6227-E6236 (2018).
  31. Hamers-Casterman, C., et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363 (6428), 446-448 (1993).
  32. Greenberg, A. S., et al. A new antigen receptor gene family that undergoes rearrangement and extensive somatic diversification in sharks. Nature. 374 (6518), 168-173 (1995).
  33. Bieli, D., et al. Development and Application of Functionalized Protein Binders in Multicellular Organisms. International Review of Cell and Molecular Biology. 325, 181-213 (2016).
  34. Muyldermans, S. Nanobodies: natural single-domain antibodies. Annual Review of Biochemistry. 82, 775-797 (2013).
  35. Helma, J., Cardoso, M. C., Muyldermans, S., Leonhardt, H. Nanobodies and recombinant binders in cell biology. Journal of Cell Biology. 209 (5), 633-644 (2015).
  36. Harmansa, S., Affolter, M. Protein binders and their applications in developmental biology. Development. 145 (2), (2018).
  37. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).
  38. Huttner, W. B. Tyrosine sulfation and the secretory pathway. Annual Review of Physiology. 50, 363-376 (1988).
  39. Baeuerle, P. A., Huttner, W. B. Tyrosine sulfation is a trans-Golgi-specific protein modification. The Journal of Cell Biology. 105 (6 Pt 1), 2655-2664 (1987).
  40. Stone, M. J., Chuang, S., Hou, X., Shoham, M., Zhu, J. Z. Tyrosine sulfation: an increasingly recognised post-translational modification of secreted proteins. New Biotechnology. 25 (5), 299-317 (2009).
  41. Leitinger, B., Brown, J. L., Spiess, M. Tagging secretory and membrane proteins with a tyrosine sulfation site. Tyrosine sulfation precedes galactosylation and sialylation in COS-7 cells. The Journal of Biological Chemistry. 269 (11), 8115-8121 (1994).
  42. Snider, M. D., Rogers, O. C. Intracellular movement of cell surface receptors after endocytosis: resialylation of asialo-transferrin receptor in human erythroleukemia cells. Journal of Cell Biology. 100 (3), 826-834 (1985).
  43. Shi, G., et al. SNAP-tag based proteomics approach for the study of the retrograde route. Traffic. 13 (7), 914-925 (2012).
  44. Kaiser, P. D., Maier, J., Traenkle, B., Emele, F., Rothbauer, U. Recent progress in generating intracellular functional antibody fragments to target and trace cellular components in living cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1844 (11), 1933-1942 (2014).
  45. Dmitriev, O. Y., Lutsenko, S., Muyldermans, S. Nanobodies as Probes for Protein Dynamics in Vitro and in Cells. The Journal of Biological Chemistry. 291 (8), 3767-3775 (2016).
  46. Harmansa, S., Hamaratoglu, F., Affolter, M., Caussinus, E. Dpp spreading is required for medial but not for lateral wing disc growth. Nature. 527 (7578), 317-322 (2015).
  47. Harmansa, S., Alborelli, I., Bieli, D., Caussinus, E., Affolter, M. A nanobody-based toolset to investigate the role of protein localization and dispersal in Drosophila. eLife. 6, (2017).
  48. Caussinus, E., Kanca, O., Affolter, M. Fluorescent fusion protein knockout mediated by anti-GFP nanobody. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (1), 117-121 (2012).
  49. Rothbauer, U., et al. Targeting and tracing antigens in live cells with fluorescent nanobodies. Nature Methods. 3 (11), 887-889 (2006).
  50. Pardon, E., et al. A general protocol for the generation of Nanobodies for structural biology. Nature Protocols. 9 (3), 674-693 (2014).
  51. Steyaert, J., Kobilka, B. K. Nanobody stabilization of G protein-coupled receptor conformational states. Current Opinion in Structural Biology. 21 (4), 567-572 (2011).
  52. Manglik, A., Kobilka, B. K., Steyaert, J. Nanobodies to Study G Protein-Coupled Receptor Structure and Function. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 57, 19-37 (2017).
  53. Zimmermann, I., et al. Synthetic single domain antibodies for the conformational trapping of membrane proteins. eLife. 7, (2018).
  54. De Genst, E., et al. Molecular basis for the preferential cleft recognition by dromedary heavy-chain antibodies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States. 103 (12), 4586-4591 (2006).
  55. Truttmann, M. C., et al. HypE-specific nanobodies as tools to modulate HypE-mediated target AMPylation. The Journal of Biological Chemistry. 290 (14), 9087-9100 (2015).
  56. Ashour, J., et al. Intracellular expression of camelid single-domain antibodies specific for influenza virus nucleoprotein uncovers distinct features of its nuclear localization. Journal of Virology. 89 (5), 2792-2800 (2015).
  57. Yamagata, M., Sanes, J. R. Reporter-nanobody fusions (RANbodies) as versatile, small, sensitive immunohistochemical reagents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States. 115 (9), 2126-2131 (2018).
  58. Pleiner, T., Bates, M., Gorlich, D. A toolbox of anti-mouse and anti-rabbit IgG secondary nanobodies. Journal of Cell Biology. 217 (3), 1143-1154 (2018).
  59. Fridy, P. C., et al. A robust pipeline for rapid production of versatile nanobody repertoires. Nature Methods. 11 (12), 1253-1260 (2014).
  60. Robinson, M. S., Sahlender, D. A., Foster, S. D. Rapid inactivation of proteins by rapamycin-induced rerouting to mitochondria. Developmental Cell. 18 (2), 324-331 (2010).
  61. Meyer, C., et al. mu1A-adaptin-deficient mice: lethality, loss of AP-1 binding and rerouting of mannose 6-phosphate receptors. The EMBO Journal. 19 (10), 2193-2203 (2000).
  62. Utskarpen, A., Slagsvold, H. H., Iversen, T. G., Walchli, S., Sandvig, K. Transport of ricin from endosomes to the Golgi apparatus is regulated by Rab6A and Rab6A. Traffic. 7 (6), 663-672 (2006).
  63. Mallard, F., Johannes, L. Shiga toxin B-subunit as a tool to study retrograde transport. Methods in Molecular Medicine. 73, 209-220 (2003).
  64. Mallard, F., et al. Direct pathway from early/recycling endosomes to the Golgi apparatus revealed through the study of shiga toxin B-fragment transport. Journal of Cell Biology. 143 (4), 973-990 (1998).
  65. Plaut, R. D., Carbonetti, N. H. Retrograde transport of pertussis toxin in the mammalian cell. Cellular Microbiology. 10 (5), 1130-1139 (2008).
  66. Johannes, L., Tenza, D., Antony, C., Goud, B. Retrograde transport of KDEL-bearing B-fragment of Shiga toxin. The Journal of Biological Chemistry. 272 (31), 19554-19561 (1997).
  67. Saint-Pol, A., et al. Clathrin adaptor epsinR is required for retrograde sorting on early endosomal membranes. Developmental Cell. 6 (4), 525-538 (2004).
  68. Amessou, M., Popoff, V., Yelamos, B., Saint-Pol, A., Johannes, L. Measuring retrograde transport to the trans-Golgi network. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 15 Unit 15 10 (2006).
  69. Niewoehner, J., et al. Increased brain penetration and potency of a therapeutic antibody using a monovalent molecular shuttle. Neuron. 81 (1), 49-60 (2014).
  70. Villasenor, R., Schilling, M., Sundaresan, J., Lutz, Y., Collin, L. Sorting Tubules Regulate Blood-Brain Barrier Transcytosis. Cell Reports. 21 (11), 3256-3270 (2017).
  71. Dick, G., Grondahl, F., Prydz, K. Overexpression of the 3'-phosphoadenosine 5'-phosphosulfate (PAPS) transporter 1 increases sulfation of chondroitin sulfate in the apical pathway of MDCK II cells. Glycobiology. 18 (1), 53-65 (2008).
  72. Fruholz, S., Fassler, F., Kolukisaoglu, U., Pimpl, P. Nanobody-triggered lockdown of VSRs reveals ligand reloading in the Golgi. Nature Communications. 9 (1), 643(2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Nanoprzeciwcia a GFPsulfatacja tyrozynyobrazowanie ywych kom rekmikroskopia elektronowaekspresja bakteryjnatransport bia ek
Analiza wychwytu endocytarnego i transportu wstecznego do sieci trans-Golgiego z wykorzystaniem funkcjonalizowanych nanociał w hodowanych komórkach
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.