Method Article

Przygotowanie tkanek i barwienie immunologiczne tkanek twarzoczaszki myszy i kości nieodwapnionej

DOI:

10.3791/59113

⸱

May 10th, 2019

 ,  , 
1The State Key Laboratory Breeding Base of Basic Science of Stomatology (Hubei-MOST) & Key Laboratory for Oral Biomedicine of Ministry of Education, School and Hospital of Stomatology, Wuhan University, 2Department of Biologic and Materials Sciences, School of Dentistry, University of Michigan

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół do wykrywania i ilościowego określania poziomów białek podczas morfogenezy/patogenezy twarzoczaszki poprzez barwienie immunologiczne na przykładzie tkanek twarzoczaszki myszy. Ponadto opisano metodę przygotowania i kriosekcji nieodwapnionych tkanek twardych od młodych myszy w celu barwienia immunologicznego.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Barwienie immunologiczne tkanek zapewnia wysoce specyficzne i niezawodne wykrywanie interesujących białek w danej tkance. Tutaj opisujemy kompletny i prosty protokół wykrywania ekspresji białek podczas morfogenezy/patogenezy twarzoczaszki na przykładzie tkanek twarzoczaszki myszy. Protokół składa się z przygotowania i kriosekcji tkanek, immunofluorescencji pośredniej, akwizycji obrazu i kwantyfikacji. Ponadto opisano metodę przygotowania i kriosekcji nieodwapnionych tkanek twardych do barwienia immunologicznego na przykładzie tkanek twarzoczaszki i kości długich. Metody te mają kluczowe znaczenie dla określenia ekspresji białek i zmian morfologicznych/anatomicznych w różnych tkankach podczas morfogenezy/patogenezy twarzoczaszki. Stosuje się je również do innych tkanek z odpowiednimi modyfikacjami. Wiedza z zakresu histologii i wysoka jakość przekrojów mają kluczowe znaczenie dla wyciągania wniosków naukowych z wyników eksperymentów. Potencjalne ograniczenia tej metodologii obejmują między innymi swoistość przeciwciał i trudności w oznaczaniu ilościowym, które również zostały tutaj omówione.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Twarz jest kluczowym elementem ludzkiej tożsamości i składa się z kilku różnych typów tkanek, takich jak nabłonek, mięśnie, kości, chrząstki, ząb. Tkanki te pochodzą ze wszystkich trzech listków zarodkowych: ektodermy, endodermy i mezodermy1,2. Dla prawidłowego wzorcowania i rozwoju tkanek twarzoczaszki, proliferacja, śmierć i różnicowanie komórek muszą być wysoce skoordynowane i regulowane przez określone szlaki sygnałowe, takie jak szlaki Wnt, Fgf, Hh i Bmp3,4,5. Wady proliferacji, przeżywalności lub różnicowania komórek prowadzą do wad rozwojowych twarzoczaszki, które należą do najczęściej występujących wrodzonych wad wrodzonych. Myszy transgeniczne są użytecznymi narzędziami do badania mechanizmów morfogenezy i patogenezy twarzoczaszki1,2,3,4,5. Zrozumienie zmian w strukturach twarzoczaszki podczas rozwoju i patogenezy pomoże wyjaśnić kluczowe zasady rozwoju, a także mechanizmy wad rozwojowych twarzoczaszki1,2,3,4,5.

Barwienie całych lub wyciętych tkanek specyficznymi przeciwciałami jest nieocenioną techniką do określania przestrzennego rozkładu interesujących białek 6. Formalnie barwienie immunologiczne tkanek może opierać się na immunohistochemii (IHC) lub immunofluorescencji (IF). W porównaniu z nieprzezroczystym produktem reakcji wytwarzanym przez IHC za pomocą substratu chromogennego, takiego jak 3,3'-diaminobenzydyna (DAB), IF obejmuje zastosowanie koniugatów fluorescencyjnych widocznych pod mikroskopią fluorescencyjną. W związku z tym IF może wyraźnie odróżniać dodatnie komórki od szumu tła i umożliwia ilościową analizę i ulepszanie obrazów w prosty sposób przez oprogramowanie takie jak ImageJ i Adobe Photoshop7,8. Całe podejście do barwienia wierzchowania działa na małych blokach tkanki (o grubości mniejszej niż 5 mm), które mogą dostarczyć trójwymiarowych informacji o lokalizacji białek/antygenów bez konieczności rekonstrukcji z sekcji9,10. Jednak w porównaniu z wycinkami tkanek, barwienie immunologiczne całej góry jest czasochłonne i wymaga dużych objętości roztworów przeciwciał. Nie wszystkie przeciwciała są zgodne z podstawowym podejściem opartym na całym wierzchowaniu. Ponadto niepełna penetracja przeciwciał spowoduje nierównomierne barwienie lub barwienie fałszywie ujemne. Tutaj skupimy się na immunofluorescencyjnym wykrywaniu białek/antygenów na wyciętych tkankach. W przypadku tkanek twardych (np. głowy, zęba, kości długiej) odkładanie się wapnia podczas rozwoju/patogenezy sprawia, że próbka jest trudna do przekrojenia i łatwo spłukiwana podczas leczenia barwieniem immunologicznym11,12. Większość obecnie dostępnych protokołów odwapnia twarde tkanki przed ich osadzeniem, aby ułatwić sekcjonowanie, co jest czasochłonne i może zniszczyć morfologię i antygeny próbek w przypadku niewłaściwego obchodzenia się z nimi11,12. Aby przezwyciężyć te problemy, zoptymalizowaliśmy podejście do kriosekcji twardych tkanek bez odwapnienia, co doprowadziło do lepszej wizualizacji ich morfologii i rozmieszczenia białek sygnałowych.

Opisany tutaj protokół jest używany do określania zmian morfometrycznych i histologicznych w tkankach twarzoczaszki transgenicznych myszy BMP. W szczególności protokół obejmuje (1) pobranie i wypreparowanie tkanek głowy, (2) przekrój i barwienie immunologiczne markerów eksperymentalnych (Ki67, pSmad1/5/9) wraz z barwieniem TUNEL, (3) obrazowanie skrawków za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego i wreszcie (4) analizę i ilościowe określenie wyników. Opisano również protokół przygotowania i kriosekcji tkanek twardych bez odwapnienia13. Metody te są zoptymalizowane pod kątem tkanek twarzoczaszki. Stosuje się je również do innych tkanek w różnym wieku próbek z odpowiednimi modyfikacjami.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty na myszach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Uniwersytetu Michigan dotyczącymi humanitarnej opieki i wykorzystywania zwierząt w badaniach. Wszystkie procedury na zwierzętach użyte w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystania (IACUC) na Uniwersytecie Michigan (Protokół #PRO00007715).

1. Przygotowanie tkanek

  1. Przygotowanie tkanek zarodkowych
    1. Przygotuj jedno 10-milimetrowe naczynie i kilka 3,5-milimetrowych szalek zawierających sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) oraz jedną 12-dołkową płytkę hodowlaną zawierającą 2 ml 4% paraformaldehydu (PFA) w PBS w każdym dołku dla każdej ciężarnej myszy. Umieść wszystkie szalki Petriego i talerz na lodzie.
      nuta: Obsługa 4% PFA w dygestorium.
    2. Wypreparuj zarodki ciężarnych myszy w lodowatym PBS za pomocą kleszczy i nożyczek, jak opisano wcześniej14.
      1. Krótko mówiąc, poddaj eutanazji ciężarną mysz z CO2, chwyć kleszczem skórę poniżej środka brzucha i przetnij tylko skórę, a następnie delikatnie pociągnij za skórę, aby oddzielić ją od leżącej pod spodem ściany mięśni brzucha.
      2. Następnie wciąć się w jamę brzuszną zgodnie z tą samą linią nacięcia skóry. Usuń macicę zawierającą sznur zarodków i usuń zarodki, delikatnie odcinając ścianę macicy. Tkanki pozazarodkowe, takie jak woreczek żółtkowy i owodnia, zostaną usunięte.
      3. Wytnij i odizoluj głowę od każdego zarodka.
    3. Przenieś każdą głowę do każdego dołka 12-dołkowej płytki zawierającej 4% PFA za pomocą plastikowej pipety transferowej lub kleszczyków. Utrwalać próbki w 4% PFA w temperaturze 4 °C przez 4 godziny. Próbki płukać w PBS w temperaturze 4 °C, delikatnie wstrząsając, przez 12 h.
      nuta: W przypadku zarodków młodszych niż 16,5 dzień zarodkowy (E16,5) należy przymocować główki zarodków za pomocą 4% PFA bezpośrednio po izolacji. W przypadku zarodków o stężeniu E16,5 lub nowszym należy usunąć z głów skórę i tkankę tłuszczową i kilkakrotnie spłukać w lodowatym PBS przed utrwaleniem.
    4. Głowice Cryoprotect.
      1. Przenieść każdą głowę do nowej 12-dołkowej płytki zawierającej 2 ml 30% sacharozy w PBS za pomocą plastikowej pipety lub kleszczyków. Delikatnie mieszać w temperaturze 4 °C, aż główka opadnie na dno naczynia.
    5. Osadź głowice.
      1. Przenieś kriochronioną głowicę do formy zawierającej związek o optymalnej temperaturze cięcia (OCT). Równoważyć próbki w OCT przez kilka minut. Dostosuj położenie i kierunek próbek za pomocą kleszczy.
      2. Umieść formę na suchym lodzie do zamrożenia. Powstałe krioformy należy przechowywać w plastikowej torbie w temperaturze -80 °C, aż będą gotowe do kriosekcji.
        nuta: Przycięta strona próbek musi być skierowana w stronę dolnej części formy do zatapiania.
  2. Przygotowanie poporodowych nieodwapnionych tkanek twardych
    1. Poddaj się eutanazji w wieku 3 tygodni lub 3 miesięcy myszy z CO2. Usuń skórę i tkankę tłuszczową. Wytnij i odizoluj głowę lub kości długie od myszy.
    2. Zamocuj i zabezpiecz krioprotekcjonalnie głowę lub kość długą myszy zgodnie z opisem w krokach 1.1.3–1.1.4.
    3. Zanurz w 8% żelatynie w podobny sposób, jak w kroku 1.1.5. Przechowywać krioformy w plastikowej torbie w temperaturze -80 °C do czasu kriosekcji.
      nuta: Odwapnienie nie jest tutaj konieczne. Aby przygotować 8% żelatyny, wymieszaj 8 g żelatyny ze 100 ml PBS i zagotuj w kuchence mikrofalowej. Należy pamiętać, że mieszanina łatwo się kipi.

2. Kriosekcja

  1. Ustawić temperaturę kriostatu na -18 °C dla tkanek miękkich zanurzonych w OCT lub -25 °C i niższą dla nieodwapnionych tkanek twardych zanurzonych w żelatynie. Próbki należy przechowywać w komorze kriostatu przez około 30 minut, aby zrównoważyły się z temperaturą kriostatu.
  2. Usuń blok z krioformy. Zamroź blok na uchwycie próbki (uchwycie na chusteczkę) poprzez montaż z kroplą OCT. Przycięta strona próbki powinna znajdować się jak najdalej od uchwytu (skierowana w stronę operatora).
  3. Załaduj uchwyt mocowany na bloku na uchwyt kriostatu. Wyreguluj uchwyt ostrza tak, aby kąt ostrza wynosił 3°–5° w stosunku do próbki.
  4. Pobrać skrawki 10 μm na powlekane szkiełka mikroskopowe. Całkowicie wysuszyć sekcje w temperaturze pokojowej, a następnie przechowywać je w temperaturze -80 °C.

3. Barwienie histologiczne i obrazowanie mikroskopowe

  1. Barwienie immunofluorescencyjne
    1. Wyjmij szkiełka w temperaturze od -80 °C. Utrzymuj szkiełka w temperaturze RT przez 1 godzinę, aby wyschły na powietrzu. Przepłukać szkiełka w 0,1% PBST (0,1% eterze tert-oktylofenylowym glikolu polietylenowego w PBS; patrz tabela materiałów) trzy razy przez 5 minut każdy, aby wypłukać skrawki OCT i przepuszczalności.
    2. Opcjonalnie wykonaj pobieranie antygenu (opcjonalnie).
      1. Rozgrzej bufor cytrynianowy (10 mM cytrynian sodu o pH 6) w naczyniu barwiącym w parowarze lub łaźni wodnej do temperatury 95–100 °C. Zanurzyć szkiełka w buforze cytrynianowym, inkubować przez 10 minut.
      2. Wyjmij naczynie barwiące z naczynia do gotowania na parze lub łaźni wodnej do RT. Schładzaj szkiełka w temperaturze RT przez 20 minut lub dłużej15.
        nuta: Jako alternatywę należy użyć buforu Tris-EDTA (10 mM zasady Tris, 1 mM EDTA, 0,05% Tween 20, pH 9,0) lub buforu EDTA (1 mM EDTA, 0,05% Tween 20, pH 8,0) do pobierania antygenu pod wpływem ciepła. Oprócz gorącego parowaru używaj szybkowaru, kuchenki mikrofalowej lub łaźni wodnej do pobierania antygenu pod wpływem ciepła. Inną alternatywą jest indukowane enzymatycznie pobieranie antygenu za pomocą trypsyny lub pepsyny. Zoptymalizuj stężenie i czas obróbki pobierania enzymatycznego, aby uniknąć uszkodzenia skrawków. Zoptymalizuj metodę pobierania antygenu dla każdej kombinacji przeciwciało/antygen.
    3. Inkubować każde szkiełko z 200 μl roztworu blokującego (5% surowicy osła rozcieńczonej w 0,1% PBST) w temperaturze pokojowej przez 30 minut, a następnie usunąć roztwór blokujący bez spłukiwania.
    4. Inkubować każde szkiełko ze 100 μl pierwszorzędowego przeciwciała lub przeciwciał rozcieńczonych w roztworze blokującym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub O/N w temperaturze 4 °C. Przepłukać szkiełka podstawowe za pomocą PBS trzy razy przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    5. Inkubować każde szkiełko z 100 μl przeciwciała drugorzędowego rozcieńczonego w roztworze blokującym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Przepłukać szkiełka w PBS trzy razy przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Chronić szkiełka przed światłem.
    6. Zamontuj zjeżdżalnie.
      1. Dodaj dwie krople pożywki zapobiegającej blaknięciu z DAPI (4', 6-diamidino-2-fenyloindol) na szkiełko. Następnie przykryj szkiełkiem nakrywkowym.
      2. Przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności do momentu przygotowania do sporządzenia obrazu.
        nuta: Alternatywnie, najpierw oznacz jądra barwnikiem DAPI lub Hoechst 33324 rozcieńczonym w stosunku 1:2,000 w PBS w temperaturze pokojowej, a następnie połącz glicerolem.
  2. Barwienie końcowym znacznikiem końca deoksynukleotydylu dUTP (TUNEL).
    nuta: Dwuniciowy DNA z końcami 3'-hydroksylowymi (końce DNA 3'OH) utworzy się podczas apoptozy w komórce. Tutaj zapewniamy protokół, który znakuje wolne końce DNA 3'OH in situ poprzez znakowanie fragmentów DNA nukleotydem digoksygeninowym z wykorzystaniem końcowej transferazy deoksynukleotydylotransferazy (TdT) przez specyficzne barwienie przy użyciu komercyjnego zestawu (patrz Tabela materiałów).
    1. Opcjonalnie wybarwij skrawki przeciwciałami pierwszorzędowymi i przeciwciałami drugorzędowymi znakowanymi Alexa Fluor-488 przed barwieniem TUNEL. Przepłukać szkiełka w PBS trzy razy po 10 minut każda.
      nuta: Ten etap jest opcjonalny w przypadku podwójnego barwienia białka i TUNEL na tym samym szkiełku.
    2. Inkubować każde szkiełko ze 100 μl proteinazy K (10 μg/ml w 10 mM Tris pH 7,5 i 5 mM EDTA) przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Przepłukać szkiełka podstawowe za pomocą PBS trzy razy po 10 minut w temperaturze RT.
      nuta: Dostosuj czas inkubacji i temperaturę proteinazy K dla każdego typu tkanki. W przypadku odcinków 10 μm główek zarodków utrwalonych w 4% PFA, inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Oprócz metody wykorzystującej proteinazę K, w razie potrzeby należy zastosować alternatywne metody leczenia, w tym (1) świeżo przygotowany 0,1% eter tert-oktylofenylowy glikolu polietylenowego, 0,1% cytrynian sodu, 10 min w temperaturze 37 °C; (2) 0,25%–0,5% pepsyny w HCl (pH 2) lub 0,25% trypsyny, 10 min w temperaturze 37 °C; oraz (3) napromienianie mikrofalowe 0,1 M buforem cytrynianowym (pH 6).
    3. Na każde szkiełko nanieść 200 μl roztworu blokującego (5% surowicy osła rozcieńczonej w 0,1% PBST), inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut, strzepnąć roztwór blokujący bez spłukiwania.
    4. Nanieść 50 μl buforu równowagowego dostarczonego z zestawu na każde szkiełko w temperaturze pokojowej przez co najmniej 10 sekund. Strząsnąć bufor bez spłukiwania.
    5. Przygotować mieszaninę reakcyjną (enzym TdT o sile roboczej) mieszając enzym TdT z buforem reakcyjnym dostarczonym przez zestaw w stosunku 3:7. Nanieść 50 μl mieszaniny reakcyjnej na każde szkiełko i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Strząśnij bufor bez spłukiwania.
    6. Na każde szkiełko nanieść 200 μl buforu zatrzymującego (rozcieńczony w stosunku 1:30 rozcieńczony w ddH2O) dostarczonego przez zestaw, a następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Przepłukać szkiełka podstawowe PBS trzy razy przez 10 minut każde.
    7. Oznaczyć przeciwciałem rodaminy.
      1. Na każde szkiełko nanieść 50 μl wstępnie podgrzanego (RT) koniugatu anty-digoksygeniny (rodaminy) (rozcieńczonego w stosunku 1:1 w roztworze blokującym). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut w ciemności.
      2. Przepłukać szkiełka PBS trzy razy przez 10 minut każda. Zamontuj slajdy zgodnie z krokiem 3.1.6.

4. Akwizycja obrazowania

  1. Użyj kontroli pozytywnych (tkanki dodatnie dla antygenu docelowego) do sprawdzenia znakowania sygnału i kontroli ujemnych (pomiń przeciwciało pierwszorzędowe, kontrolę izotypu lub tkanki ujemne dla antygenu docelowego) do oceny tła obrazów pod mikroskopem fluorescencyjnym.
  2. Ustaw warunki sprzętu i aparatu (ekspozycje i inne ustawienia ogólne) do obrazowania w oparciu o intensywność sygnału kontroli ujemnych i dodatnich.
    nuta: Warunki te różnią się w zależności od (1) kamer i mikroskopów używanych do obrazowania, (2) przeciwciał i (3) tkanek w każdym eksperymencie. Typowe warunki stosowane w przypadku tkanek twarzoczaszki to ISO 200 z czasem ekspozycji od 1/100 s do 1 s w zależności od jakości i swoistości przeciwciał. Odpowiednie powiększenia różnią się w zależności od wielkości próbek i celu eksperymentów.
  3. Uzyskuj obrazy za pomocą konwencjonalnego mikroskopu epifluorescencyjnego lub mikroskopu konfokalnego. Uzyskuj obrazy (w tym obrazy odpowiadających im formantów) w tych samych warunkach dla każdego kanału koloru. Zapisuj obrazy w tym samym formacie (tiff jest najlepszy do zachowania informacji).

5. Kwantyfikacja fluorescencji

UWAGA: Statystyczne porównanie barwienia między różnymi grupami będzie w wielu przypadkach bardziej pouczające. Dzięki obrazom immunofluorescencyjnym określ ilościowo względny poziom białka, mierząc gęstość sygnału, zliczając komórki dodatnie lub obliczając obszary dodatnie. Do celów analizy statystycznej minimalna liczba próbek niezależnych biologicznie wynosi 3. Typową metodą jest wygenerowanie co najmniej trzech przekrojów z każdej próbki i wykonanie zdjęć dla co najmniej trzech reprezentatywnych obszarów w każdej sekcji.

  1. Kwantyfikacja intensywności fluorescencji za pomocą ImageJ
    1. Otwórz oprogramowanie i użyj opcji Analizuj > ustaw pomiary, aby sprawdzić, czy wybrano tylko Obszar i Gęstość zintegrowaną. Użyj opcji Plik > Otwórz, aby otworzyć obrazy do analizy.
    2. Użyj paska narzędzi, aby wybrać ikonę kwadratu lub koła po lewej stronie. Zaznacz obszar do analizy na obrazie za pomocą narzędzia do zaznaczania. Użyj opcji Analizuj > Mierz, aby uzyskać odczyt wybranego obszaru i zintegrowanej gęstości w oknie Wyniki. Wybierz region obok komórki dodatniej, która nie ma fluorescencji, aby odczytać tło.
    3. Powtórz krok 5.1.2, aby przeanalizować inne obrazy. Dostosowano obszar do analizy, aby pasował do obszaru na pierwszym obrazie.
    4. Skopiuj wszystkie dane w oknie Wyniki i wklej je do arkusza kalkulacyjnego po zakończeniu analizy.
    5. Obliczyć skorygowaną intensywność fluorescencji (CTCF) jako gęstość zintegrowaną — (obszar wybranej komórki x średnia fluorescencja odczytów tła). Porównaj różnicę skorygowanej całkowitej fluorescencji komórek między próbkami i sporządź wykres.
  2. Kwantyfikacja dodatniej liczby komórek w obrazach fluorescencyjnych za pomocą ImageJ
    1. Ręczne zliczanie komórek.
      1. Użyj ImageJ > Plugins > Analysis, aby zainstalować wtyczkę Cell Counter.
      2. Użyj opcji Plik > Otwórz, aby otworzyć obrazy do analizy. Użyj wtyczek > Analysis > Licznika komórek, aby otworzyć okno Licznik i okno Wyniki.
        >nuta: Licznik komórek nie działa na stosach. Aby zliczyć stosy, podłącz Plot Z Axis Profile, a następnie użyj Image > Stacks > Plot Z Axis Profile, aby monitorować intensywność ruchomego ROI za pomocą narzędzia do śledzenia cząstek. To narzędzie może być ręczne lub automatyczne.
      3. Kliknięcie jednego z przycisków u dołu okna Licznik w celu rozpoczęcia liczenia. Kliknij bezpośrednio na komórce/obiekcie, który ma być liczony do zakończenia.
      4. Kliknij przycisk Wyniki w oknie Liczba. Łączna liczba zliczonych komórek zostanie wyświetlona w oknie Wyniki. Zapisz dziennik wyników jako arkusz kalkulacyjny i przeanalizuj.
    2. Automatyczne zliczanie komórek.
      1. Użyj opcji Plik > Otwórz, aby otworzyć obrazy do analizy. Zanim przejdziesz dalej, przekonwertuj obraz RGB na obraz w skali szarości.
      2. Użyj opcji Image > Adjust > Threshold (Dopasuj próg), aby zaznaczyć wszystkie obszary, które mają zostać policzone.
      3. Użyj opcji Analizuj > Analizuj cząstki, aby uzyskać liczbę komórek/cząstek. Ustaw zakres prawidłowego rozmiaru cząstek (np. 100-Nieskończoność) zamiast domyślnego 0-Nieskończoność, aby zliczać komórki/cząstki w określonym zakresie. Zapisz dziennik wyników jako arkusz kalkulacyjny i analizuj.
        UWAGA:         Aby uzyskać inne informacje z obrazu, oprócz obszaru, przejdź do Analizuj > Ustaw pomiary i zaznacz pole obok potrzebnych informacji.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Embrionalne sekcje tkanek twarzoczaszki
Postępując zgodnie z powyższymi krokami, głowy zostały wypreparowane z zarodków kontrolnych (P0-Cre) lub zmutowanych (konstytutywnie aktywowany Bmpr1a w komórkach grzebienia nerwowego, P0-Cre; caBmpr1a) w dniu embrionalnym (E) 16,5 lub 18,5. Po utrwaleniu w 4% PFA przez 4 godziny, próbki zanurzono w OCT i poddano kriosekcji koronalnej. Powstałe skrawki poddano barwieniu immunologicznemu przeciwciałami przeciwko...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół przygotowania głowy myszy i nieodwapnionych tkanek kostnych oraz kriosekcji w celu barwienia immunologicznego proliferacji komórek, śmierci komórki i markerów sygnalizacyjnych BMP. Szczegółowo opisujemy również strategię pozyskiwania danych ilościowych z obrazów immunofluorescencyjnych. Metody te mogą być również stosowane do innych tkanek z odpowiednimi modyfikacjami.

Warunki przygotowania tkanek różnią się w zależności od wielkości i rodzaju tkanek. C...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health (R01DE020843 do Y.M.), International FOP Association (Y.M.) oraz grant od National Natural Science Foundation of China (31500788 do J.Y.).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Taśma klejącaLeica#39475214
Alexa fluor 488-kozie przeciwciało wtórne anty-królikaInvitrogenA-11034
Mocowanie zapobiegające blaknięciu z DAPIInvitrogenP36931
Albumina surowicy bydlęcejSigmaA2153
Szkiełka nakrywkoweKriostatmarki Fisher 12-545-E
LeicaCM1850
EDTASigmaE6758
Mikroskop fluorescencyjnyOlympusBX51
GelatinSigmaG1890
In Situ  Zestaw do wykrywania śmierci komórkowejMilliporeS7165
Szkiełka mikroskopoweFisher Brand12-550-15
OCT CompoundFisher Healthcare23-730-571
Paraformaldehyd (PFA)SigmaP6148 
Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)SigmaP4417
Glikol polietylenowy  eter tert-oktylofenylowySigmaT9284Triton X-100
Proteinaza KInvitrogenAM2542
Przeciwciało anty-Ki67 królikaTechnologia sygnalizacji komórkowej9129Parti#:3; RRID:AB_2687446
Królicze przeciwciało anty-pSmad1/5/9Technologia sygnalizacji komórkowej13820Lot#:3; RRID:AB_2493181
Cytrynian soduSigma1613859
sacharozaSigmaS9378
TrisSigma10708976001

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Trinh, L. eA., Fraser, S. E. Imaging the cell and molecular dynamics of craniofacial development: challenges and new opportunities in imaging developmental tissue patterning. Current Topics in Developmental Biology. 115, 599-629 (2015).
  2. Marcucio, R., et al. Facial morphogenesis: physical and molecular interactions between the brain and the face. Current Topics in Developmental Biology. 115, 299-320 (2015).
  3. Graf, D., et al. Common mechanisms in development and disease: BMP signaling in craniofacial development. Cytokine & Growth Factor Reviews. 27, 129-139 (2016).
  4. Snider, T. N., Mishina, Y. Cranial neural crest cell contribution to craniofacial formation, pathology, and future directions in tissue engineering. Birth Defects Research Part C: Embryo Today. 102 (3), 324-332 (2014).
  5. Mishina, Y., Snider, T. N. Neural crest cell signaling pathways critical to cranial bone development and pathology. Experimental Cell Research. 325 (2), 138-147 (2014).
  6. Van Hecke, D. Routine Immunohistochemical Staining Today: Choices to Make, Challenges to Take. Journal of Histotechnology. 1, 45-54 (2002).
  7. Xiao, C., Dan-Bi, C. Double staining immunohistochemistry. North American Journal of Medical Sciences. 2 (5), 241-245 (2010).
  8. Zongli, Q., et al. Comparison of immunofluorescence and immunohistochemical staining with anti-insulin antibodies on formalin-fixed paraffin-embedded human pancreatic tissue microarray sections. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 10 (3), 3671-3676 (2017).
  9. Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea. Journal of Visualized Experiments. (107), e53561(2016).
  10. Dun, X. P., Parkinson, D. B. Whole mount immunostaining on mouse sciatic nerves to visualize events of peripheral nerve regeneration. Methods in Molecular Biology. 1739, 339-348 (2018).
  11. Akkiraju, H., et al. An Improved Immunostaining and Imaging Methodology to Determine Cell and Protein Distributions within the Bone Environment. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (3), 168-178 (2016).
  12. González-Chávez, S. A., et al. Assessment of different decalcifying protocols on Osteopontin and Osteocalcin immunostaining in whole bone specimens of arthritis rat model by confocal immunofluorescence. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 6 (10), 1972-1983 (2013).
  13. Kapelsohn, K. Improved Methods for Cutting, Mounting, and Staining Tissue for Neural Histology. Protocol Exchange. , (2015).
  14. Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system. Journal of Visualized Experiments. (85), e50803(2014).
  15. Shi, S. R., et al. Antigen retrieval techniques: current perspectives. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 49 (8), 931-937 (2001).
  16. Adell, T., et al. Immunohistochemistry on paraffin-embedded planarian tissue sections. Methods in Molecular Biology. 1774, 367-378 (2018).
  17. Griffioen, H. A., et al. Gelatin embedding to preserve lesion-damaged hypothalami and intracerebroventricular grafts for vibratome slicing and immunocytochemistry. Journal of Neuroscience Methods. 43, 43-47 (1992).
  18. Sarkar, S., et al. In situ demonstration of Fluoro-Turquoise conjugated gelatin for visualizing brain vasculature and endothelial cells and their characterization in normal and kainic acid exposed animals. Journal of Neuroscience Methods. 219 (2), 276-284 (2013).
  19. Oorschot, V., et al. A novel flat‐embedding method to prepare ultrathin cryosections from cultured cells in their in situ orientation. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 50, 1067-1080 (2002).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Tissue PreparationImmunostainingMouse CraniofacialUndecalcified BoneCryosectioningImmunofluorescenceProtein DetectionGelatin EmbeddingAntibody StainingFluorescence Quantification

Related Articles