Method Article

Przygotowanie tkanek i barwienie immunologiczne tkanek twarzoczaszki myszy i kości nieodwapnionej

DOI:

10.3791/59113

⸱

May 10th, 2019

 ,  , 
1The State Key Laboratory Breeding Base of Basic Science of Stomatology (Hubei-MOST) & Key Laboratory for Oral Biomedicine of Ministry of Education, School and Hospital of Stomatology, Wuhan University, 2Department of Biologic and Materials Sciences, School of Dentistry, University of Michigan

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół do wykrywania i ilościowego określania poziomów białek podczas morfogenezy/patogenezy twarzoczaszki poprzez barwienie immunologiczne na przykładzie tkanek twarzoczaszki myszy. Ponadto opisano metodę przygotowania i kriosekcji nieodwapnionych tkanek twardych od młodych myszy w celu barwienia immunologicznego.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Barwienie immunologiczne tkanek zapewnia wysoce specyficzne i niezawodne wykrywanie interesujących białek w danej tkance. Tutaj opisujemy kompletny i prosty protokół wykrywania ekspresji białek podczas morfogenezy/patogenezy twarzoczaszki na przykładzie tkanek twarzoczaszki myszy. Protokół składa się z przygotowania i kriosekcji tkanek, immunofluorescencji pośredniej, akwizycji obrazu i kwantyfikacji. Ponadto opisano metodę przygotowania i kriosekcji nieodwapnionych tkanek twardych do barwienia immunologicznego na przykładzie tkanek twarzoczaszki i kości długich. Metody te mają kluczowe znaczenie dla określenia ekspresji białek i zmian morfologicznych/anatomicznych w różnych tkankach podczas morfogenezy/patogenezy twarzoczaszki. Stosuje się je również do innych tkanek z odpowiednimi modyfikacjami. Wiedza z zakresu histologii i wysoka jakość przekrojów mają kluczowe znaczenie dla wyciągania wniosków naukowych z wyników eksperymentów. Potencjalne ograniczenia tej metodologii obejmują między innymi swoistość przeciwciał i trudności w oznaczaniu ilościowym, które również zostały tutaj omówione.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Twarz jest kluczowym elementem ludzkiej tożsamości i składa się z kilku różnych typów tkanek, takich jak nabłonek, mięśnie, kości, chrząstki, ząb. Tkanki te pochodzą ze wszystkich trzech listków zarodkowych: ektodermy, endodermy i mezodermy1,2. Dla prawidłowego wzorcowania i rozwoju tkanek twarzoczaszki, proliferacja, śmierć i różnicowanie komórek muszą być wysoce skoordynowane i regulowane przez określone szlaki sygnałowe, takie jak szlaki Wnt, Fgf, Hh i Bmp3,4,5. Wady proliferacji, przeżywalności lub różnicowania ko....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty na myszach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Uniwersytetu Michigan dotyczącymi humanitarnej opieki i wykorzystywania zwierząt w badaniach. Wszystkie procedury na zwierzętach użyte w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystania (IACUC) na Uniwersytecie Michigan (Protokół #PRO00007715).

1. Przygotowanie tkanek

  1. Przygotowanie tkanek zarodkowych
    1. Przygotuj jedno 10-milimetrowe naczynie i kilka 3,5-milimetrowych szalek zawierających sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) oraz jedną 12-dołkową płytkę ho....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Embrionalne sekcje tkanek twarzoczaszki
Postępując zgodnie z powyższymi krokami, głowy zostały wypreparowane z zarodków kontrolnych (P0-Cre) lub zmutowanych (konstytutywnie aktywowany Bmpr1a w komórkach grzebienia nerwowego, P0-Cre; caBmpr1a) w dniu embrionalnym (E) 16,5 lub 18,5. Po utrwaleniu w 4% PFA przez 4 godziny, próbki zanurzono w OCT i poddano kriosekcji koronalnej. Powstałe skrawki poddano barwieniu immunologicznemu przeciwciałami przeciwko.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół przygotowania głowy myszy i nieodwapnionych tkanek kostnych oraz kriosekcji w celu barwienia immunologicznego proliferacji komórek, śmierci komórki i markerów sygnalizacyjnych BMP. Szczegółowo opisujemy również strategię pozyskiwania danych ilościowych z obrazów immunofluorescencyjnych. Metody te mogą być również stosowane do innych tkanek z odpowiednimi modyfikacjami.

Warunki przygotowania tkanek różnią się w zależności od wielkości i rodzaju tkanek. C.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health (R01DE020843 do Y.M.), International FOP Association (Y.M.) oraz grant od National Natural Science Foundation of China (31500788 do J.Y.).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Taśma klejącaLeica#39475214
Alexa fluor 488-kozie przeciwciało wtórne anty-królikaInvitrogenA-11034
Mocowanie zapobiegające blaknięciu z DAPIInvitrogenP36931
Albumina surowicy bydlęcejSigmaA2153
Szkiełka nakrywkoweKriostatmarki Fisher 12-545-E
LeicaCM1850
EDTASigmaE6758
Mikroskop fluorescencyjnyOlympusBX51
GelatinSigmaG1890
In Situ  Zestaw do wykrywania śmierci komórkowejMilliporeS7165
Szkiełka mikroskopoweFisher Brand12-550-15
OCT CompoundFisher Healthcare23-730-571
Paraformaldehyd (PFA)SigmaP6148 
Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)SigmaP4417
Glikol polietylenowy  eter tert-oktylofenylowySigmaT9284Triton X-100
Proteinaza KInvitrogenAM2542
Przeciwciało anty-Ki67 królikaTechnologia sygnalizacji komórkowej9129Parti#:3; RRID:AB_2687446
Królicze przeciwciało anty-pSmad1/5/9Technologia sygnalizacji komórkowej13820Lot#:3; RRID:AB_2493181
Cytrynian soduSigma1613859
sacharozaSigmaS9378
TrisSigma10708976001

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Trinh, L. eA., Fraser, S. E. Imaging the cell and molecular dynamics of craniofacial development: challenges and new opportunities in imaging developmental tissue patterning. Current Topics in Developmental Biology. 115, 599-629 (2015).
  2. Marcucio, R., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Tissue PreparationImmunostainingMouse CraniofacialUndecalcified BoneCryosectioningImmunofluorescenceProtein DetectionGelatin EmbeddingAntibody StainingFluorescence Quantification

Related Articles