Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wholemount Hybrydyzacja in situ dla zarodków Astyanax

7.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59114

⸱

2 marca 2019

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Cincinnati

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół umożliwia wizualizację ekspresji genów u embrionalnych ryb jaskiniowych Astyanax. Podejście to zostało opracowane w celu maksymalizacji sygnału ekspresji genów, przy jednoczesnej minimalizacji niespecyficznego barwienia tła.

Streszczenie

W ostatnich latach opublikowano szkic genomu ślepej meksykańskiej ryby jaskiniowej (Astyanax mexicanus), ujawniający tożsamość sekwencji tysięcy genów. Wcześniejsze badania nad tym wyłaniającym się systemem modelowym opierały się na kompleksowych badaniach całego genomu, które zidentyfikowały liczne loci cech ilościowych (QTL) związane z różnymi fenotypami związanymi z jaskiniami. Jednak zdolność do łączenia genów będących przedmiotem zainteresowania z dziedziczną podstawą zmian fenotypowych pozostaje poważnym wyzwaniem. Jedną z technik, która może ułatwić głębsze zrozumienie roli rozwoju w ewolucji troglomorficznej, jest hybrydyzacja in situ w całości wierzchowanej. Technika ta może być wykorzystana do bezpośredniego porównania ekspresji genów między formami jaskiniowymi i powierzchniowymi, nominacji genów kandydujących leżących u podstaw ustalonego QTL, identyfikacji genów będących przedmiotem zainteresowania na podstawie badań sekwencjonowania nowej generacji lub opracowania innych podejść opartych na odkryciach. W niniejszym raporcie przedstawiamy prosty protokół, wsparty elastyczną listą kontrolną, który może być szeroko zaadaptowany do użytku znacznie wykraczającego poza prezentowany system badania. Mamy nadzieję, że ten protokół może służyć jako szerokie źródło informacji dla społeczności Astyanax i nie tylko.

Wprowadzenie

Hybrydyzacja in situ jest powszechną metodą barwienia utrwalonych tkanek w celu wizualizacji wzorców ekspresji genów1. Technika ta jest stosowana od lat w innych tradycyjnych systemach modelowych 2 i nietradycyjnych3, dla różnych badań biologicznych. Jednak do pomyślnego wykonania tej procedury konieczne jest wykonanie kilku kroków i odczynników. Dla badaczy, którzy nigdy nie stosowali tej techniki, zainicjowanie procesu może być onieśmielające ze względu na wiele związanych z nim kroków. Co więcej, długotrwały charakter tej procedury sprzyja błędom technicznym, które mogą być trudne do rozwiązania.

Ogólnym celem tego artykułu jest przedstawienie prostej i nieskomplikowanej metody, która sprawi, że ta technika hybrydyzacji stanie się dostępna dla szerokiego grona odbiorców. Aby ograniczyć wprowadzanie błędów, prezentujemy proste podejście, które zapewnia wysokiej jakości barwienie ekspresji genów i minimalizuje niespecyficzny sygnał tła. Procedura ta jest podobna do innych podejść opracowanych w tradycyjnych systemach modelowych, takich jak Danio rerio4. W tym przypadku staramy się ułatwić staranne wdrożenie każdego kroku za pomocą listy kontrolnej do pobrania (Plik Uzupełniający 1), aby promować staranne wdrożenie protokołu. Uzasadnieniem takiego postępowania jest ułatwienie organizacji przez wiele etapów związanych z tą procedurą. Ten artykuł jest odpowiedni dla badaczy zainteresowanych przeprowadzeniem pełnej hybrydyzacji in situ w rozwijających się zarodkach, ale jeszcze nie wykonali tej procedury. Zaletą wybranego podejścia dla badaczy Astyanax jest to, że zostało ono przetestowane i sprawdzone zarówno na rybach jaskiniowych, jak i powierzchniowych, co ułatwia porównawcze analizy ekspresji. Przedstawiona metoda może być wykorzystana przez badaczy w badaniach nad Astyanaxem i innymi systemami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu w Cincinnati (Protokół #10-01-21-01).

1. Fiksacja

  1. Wyizoluj żądaną liczbę zarodków Astyanax mexicanus ze zbiornika hodowlanego i utrwal ~50 zarodków na raz. Jeśli zarodki są duże i stare, może być konieczne utrwalenie 25 na raz, aby zapewnić równomierne utrwalenie.
  2. W zależności od wieku zarodka należy zastosować metodę znieczulenia zatwierdzoną przez IACUC. W przypadku starszych zarodków z funkcjonującym układem nerwowym należy złożyć zarodki w ofierze poprzez przedawkowanie środka znieczulającego. W związku z tym umieść zarodki w roztworze ~1% tricainy (buforowanym do pH 7,4), aby zminimalizować ból i dyskomfort dla organizmu.
  3. Gdy zarodki przestaną reagować na dotyk, zastąp wodę systemową zawierającą trikainę i dodaj ~1 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS, pH 7,4).
  4. Usuń roztwór PBS i dodaj 1 ml 4% paraformaldehydu (PFA). Utrwalać zarodki przez noc w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: PFA jest niebezpieczny (tj. jest łatwopalny i działa drażniąco na skórę i płuca), należy obchodzić się z nim ostrożnie.

2. Odwodnienie

  1. Aby odwodnić zarodki, usuń roztwór utrwalający i spłucz 1 ml PBS. Umieścić fiolki zawierające zarodki pod kątem (od 30° do 45°) na wytrząsarce platformowej podczas płukania. Kontynuuj mycie zarodków dwukrotnie, po 5 minut na pranie.
  2. Jeśli zarodki nadal mają kosmówkę, umieść wszystkie 50 zarodków na szalce Petriego o wymiarach 100 mm x 25 mm i ostrożnie odizoluj je od kosmówki za pomocą dwóch zestawów kleszczyków zegarmistrzowskich (np. kleszczy #5) pod mikroskopem.
    UWAGA: Podczas czynności opisanych poniżej i przez pozostałą część protokołu należy ostrożnie usunąć cały płyn z poprzedniego kroku za pomocą czystych, szklanych pipet Pasteura przed dodaniem następnego roztworu
  3. Odwodnić zarodki w serii coraz bardziej skoncentrowanych płukań metanolem (MeOH) opisanych poniżej. Rozcieńczenia opierają się na całkowitej objętości 1 ml z 500 μl roztworu znajdującego się w każdej szklanej fiolce o pojemności 4 ml. Wszystkie etapy suszenia należy wykonać w temperaturze pokojowej (RT) na wytrząsarce platformowej.
    1. Ostrożnie usunąć roztwór PBS. Dodać 25% roztwór MeOH (250 μL MeOH + 750 μL PBS). Delikatnie potrząsaj na wytrząsarce platformowej przez 5 minut.
    2. Ostrożnie usuń 25% roztwór MeOH. Dodać 50% roztwór MeOH (500 μL MeOH + 500 μL PBS). Delikatnie potrząsaj na wytrząsarce platformowej przez 5 minut.
    3. Ostrożnie usuń 50% roztwór MeOH. Dodać 75% roztwór MeOH (750 μL MeOH + 250 μL PBS). Delikatnie potrząsaj wytrząsarką platformową przez 5 minut.
    4. Ostrożnie usuń 75% roztwór MeOH. Dodać 100% roztwór MeOH (1 ml MeOH). Delikatnie potrząsaj na wytrząsarce platformowej przez 5 minut. Powtórz ten krok 3 razy.
  4. W tym momencie należy przechowywać odwodnione zarodki, w razie potrzeby, w szklanych fiolkach w temperaturze -20 °C (przez długi czas). Alternatywnie przejdź bezpośrednio do dnia 1 protokołu.

3. Dzień 1: Nawodnienie

  1. Pobrać odwodnione zarodki z zamrażarki w temperaturze -20 °C (lub przejść bezpośrednio od kroku 2.5).
  2. Posortuj zarodki za pomocą pipety Pasteura. Można sortować na podstawie morfotypu (tj. jaskini i/lub powierzchni) oraz liczby genów ocenianych w każdym eksperymencie. Zwykle nie ma więcej niż 12 zarodków w jednej fiolce po posortowaniu. Aby utrzymać porządek, użyj kolorowej taśmy laboratoryjnej, aby oznaczyć fiolki i pipety dla każdego genu. Zarodki pozostaną w tej samej fiolce przez cały czas trwania protokołu.
    UWAGA: Umieść końcówkę pipety Pasteura w 100% EtOH, aby wysterylizować ją między użyciami.
  3. Ustawić łaźnię wodną z wytrząsaniem na temperaturę 70 °C, aby można ją było użyć w późniejszym etapie. Ostrożnie pobrać MeOH z fiolek z posortowanymi zarodkami i zastąpić 500 μl nowego 100% MeOH. Umyć krótko (~1 min) na wytrząsarce platformowej.
  4. Nawadniaj zarodki w rosnącym stężeniu 1x PBS za pomocą Tween 20 (PBT, patrz poniżej) na wytrząsarce platformowej. Rozcieńczenia oparto na końcowej objętości rozcieńczenia 1 ml z 500 μl w każdej fiolce.
    1. Dodać 25% roztwór PBT (250 μl PBT, 750 μl MeOH). Delikatnie potrząsaj na wytrząsarce platformowej przez 5 minut.
    2. Ostrożnie usuń 25% roztwór PBT. Dodać 50% roztwór PBT (500 μl PBT, 500 μl MeOH). Delikatnie potrząsaj na wytrząsarce platformowej przez 5 minut.
    3. Ostrożnie usuń 50% roztwór PBT. Dodać 75% roztwór PBT (750 μl PBT, 250 μL MeOH). Delikatnie potrząsaj na wytrząsarce platformowej przez 5 minut.
    4. Ostrożnie usuń 75% roztwór PBT. Dodaj 100% roztwór PBT (1 ml PBT). Delikatnie potrząsaj na wytrząsarce platformowej przez 5 minut. Powtórz ten krok 3 razy.

4. Dzień 1: Trawienie i utrwalanie

  1. Przygotować roztwór proteinazy K (PK), dodając 1 μl PK (20 mg/ml) do 2 ml PBT.
  2. W oczekiwaniu na kolejne kroki, należy uzyskać zamrożone porcje hybrydyzacyjnych (Hyb- i Hyb+; patrz Plik Uzupełniający 2 i Plik Uzupełniający 3) oraz PFA z przechowywania w temperaturze -20 °C.
    1. Pozwól PFA rozmrozić się w temperaturze pokojowej.
    2. Umieścić porcje Hyb- i Hyb+ w obracającej się łaźni wodnej o temperaturze 70 °C. Umieść wszystkie odczynniki i fiolki w małej "uszczelce" z siatkowym dnem, wewnątrz pływającego aparatu do kąpieli wodnej. Umożliwia to łatwe dodawanie i wyjmowanie probówek i fiolek z obracającej się łaźni wodnej o temperaturze 70 °C.
  3. Delikatnie dodać roztwór farmakokinetyczny do fiolki (fiolek) zarodków, upewniając się, że wszystkie tkanki są całkowicie pokryte roztworem. Trawić zarodki przez ~12 min w roztworze roboczym PK na platformie shaker.
    UWAGA: Długość trawienia może być zmieniana przez badacza, aby zapewnić optymalne wyniki.
  4. Delikatnie odciągnąć roztwór farmakokinetyczny i na krótko zalać fiolkę PBT, aby rozcieńczyć pozostałą farmakokinetykę.
  5. Odciągnąć roztwór PBT i zastąpić go 500 μl nowego PBT. Pozostaw roztwór do spłukania na wytrząsarce platformy przez 5 minut.
  6. Odciągnąć PBT i zastąpić 500 μl rozmrożonego 4% PFA. Pozostawić zarodki do inkubacji przez 20 minut na wytrząsarce platformowej w temperaturze pokojowej.
  7. Odciągnąć 4% PFA i na krótko zalać fiolkę PBT, aby rozcieńczyć pozostały PFA. Odbierz PBT i zastąp go 500 μl świeżego PBT. Pozwól zarodkom płukać się przez 5 minut na wytrząsarce platformowej. Powtórz ten krok jeszcze 4 razy.

5. Dzień 1: Prehybrydyzacja

  1. Umieścić 500 μl wstępnie podgrzanego roztworu Hyb- do fiolki. Ostrożnie umieścić fiolkę w łaźni wodnej o temperaturze 70 °C (wewnątrz uszczelek), nie wstrząsając, na 5 minut.
  2. Pobrać roztwór Hyb- i zalać fiolkę 500 μl wstępnie podgrzanego roztworu Hyb+. Umieścić fiolkę z powrotem w łaźni wodnej o temperaturze 70 °C z potrząsaniem (40 obr./min). Inkubować przez 4 godziny lub przez noc.
    UWAGA: 4-godzinna inkubacja zapewni kompletny protokół in situ, który będzie trwał łącznie 4 dni. Tutaj ten krok jest przedstawiony jako inkubacja przez noc, w wyniku której powstanie protokół trwający łącznie 5 dni.

6. Dzień 2: Hybrydyzacja

  1. Umieścić porcję Hyb+ z zamrażarki o temperaturze -20 °C w gorącej łaźni wodnej na 5 minut.
  2. Pobrać Hyb+ z fiolki i zastąpić 500 μl wstępnie podgrzanego Hyb+. Do tego roztworu ostrożnie dodać 2 μl sondy RNA do każdej fiolki. Delikatnie zakręcić fiolką, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie sondy.
  3. Roztwór Hyb+ (z dodaną sondą) inkubować w gorącej łaźni wodnej o temperaturze 70 °C przez noc, wstrząsając z prędkością 40 obr.
    UWAGA: Można ponownie użyć roztworu Hyb+ (z sondą). W tym celu należy pobrać Hyb+ z sondą z pierwszego uruchomienia z zamrażarki o temperaturze -20 °C i umieścić go w gorącej łaźni wodnej na 5 minut. Zastąp Hyb+ z protokołu dnia 1 na Hyb+ z sondą i pozostaw na noc do inkubacji w gorącej kąpieli wodnej.

7. Dzień 3: Przygotowanie roztworu

  1. Przygotuj probówki do mikrowirówek oznaczone jako Hyb+ z sondą RNA "genu zainteresowania". Przygotuj serię rozcieńczeń, które zostaną użyte w dniu 3.
    1. Używając 6 oddzielnych probówek, przygotować następującą serię rozcieńczeń Hyb- i soli fizjologicznej cytrynianu sodu (SSC, 0 do 100%) w objętości 1 ml i umieścić je w łaźni wodnej wytrząsającej o temperaturze 70 °C: Probówka 1 = 100% Hyb- (1 ml Hyb-): Probówka 2 = 25% 2x SSC (250 μL 2x SSC, 750 μL Hyb-); Probówka 3 = 50% 2x SSC (500 μL 2x SSC, 500 μL Hyb-); Probówka 4 = 75% 2x SSC (750 μL 2x SSC, 250 μL Hyb-); Probówka 5 = 100% 2x SSC (1 ml 2x SSC); Probówka 6 = 100% 0,2x SSC (2 ml 0,2x SSC).
      UWAGA: Zachowaj czujność na stężenie SSC, ponieważ zmienia się ono z 2x na 0,2x.
    2. Używając 4 oddzielnych probówek, przygotować następujące serie rozcieńczeń PBT i SSC w objętości 1 ml i umieścić w RT: Probówka 1 = 25% PBT (250 μL PBT, 750 μL 0,2x SSC); Rurka 2 = 50% PBT (500 μL PBT, 500 μL 0,2x SSC); Rurka 3 = 75% PBT (750 μL PBT, 250 μL 0,2x SSC); Probówka 4 = 100% PBT (1 ml PBT).
    3. Przygotować probówkę z 2 ml buforu kwasu maleinowego zawierającego roztwór roboczy Tween 20 (MABT).
    4. Przygotować dwie stożkowe probówki o pojemności 15 ml z roztworem blokującym. Do każdej probówki dodać 0,2 g odczynnika blokującego do 10 ml MABT (patrz plik uzupełniający 4). Umieść obie probówki na mieszadle nutacyjnym (lub wytrząsarce platformowej) do całkowitego rozpuszczenia w roztworze (do 3 godzin).

8. Dzień 3: Usunięcie sondy

  1. Odciągnąć roztwór Hyb+ (z sondą) szklaną pipetą Pasteura i umieścić go w sterylnej, oznakowanej probówce do mikrowirówki. Zachowaj tę probówkę w zamrażarce w temperaturze -20 °C do wykorzystania w przyszłości (jeśli etykietowanie sondą się powiedzie).
  2. Ostrożnie dodać 500 μl ciepłych rozcieńczeń SSC/Hyb- (wskazanych poniżej). Inkubować w każdym z poniższych roztworów przez 10 minut w łaźni wodnej o temperaturze 70 °C.
    1. Inkubować sekwencyjnie ze 100% Hyb- (1 ml Hyb-), 25% 2x SSC (250 μL z 2x SSC, 750 μL Hyb-), 50% 2x SSC (500 μL z 2x SSC, 500 μL Hyb-), 75% 2x SSC (750 μL z 2x SSC, 250 μL Hyb-), 100% 2x SSC (1 ml z 2x SSC), 100% 0,2x SSC (2 ml 0,2x SSC).
  3. Wykonując ostatni krok, inkubuj w każdym z poniższych roztworów przez 10 minut każde. W RT na wytrząsarce platformowej odbywają się wszystkie następujące inkubacje: 25% PBT (250 μL PBT, 750 μL 0,2x SSC), 50% PBT (500 μL PBT, 500 μL 0,2x SSC), 75% PBT (750 μL PBT, 250 μL 0,2x SSC), 100% PBT (1 ml PBT).
  4. Po 10 minutach inkubacji usunąć 100% PBT i dodać 500 μl MABT do każdej fiolki. Powtórz ten krok dwa razy przez 5 minut.

9. Dzień 3: Blokowanie

  1. Usunąć MABT z każdej fiolki i zalać wstępnie zmieszanym roztworem blokującym z jednej z probówek (przygotowanych w kroku 7.1.4). Umieścić fiolkę na mieszadle nutacyjnym na ~4 h w temperaturze pokojowej.
  2. Dodać 2 μl fragmentów Anti-DIG-AP Fab do drugiej fiolki z 10 ml roztworu blokującego (przygotowanego w kroku 7.1.4) i krótko odwirować.
  3. Napełnić każdą fiolkę prawie całkowicie roztworem blokującym (~5 ml) i umieścić na mieszalniku nutującym na noc w lodówce w temperaturze 4 °C.

10. Dzień 4: Płukanki MABT

  1. Przygotować fiolkę z 10% normalną surowicą kozią (NGS) w MABT (dodać 100 μl NGS do 900 μL MABT).
  2. Pobrać roztwór blokujący z każdej fiolki i dodać 500 μl mieszaniny NGS/MABT do każdej fiolki. Pozostawić zarodki do inkubacji przez 25 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce platformowej.
  3. Zastąp mieszaninę NGS/MABT 500 μl 100% MABT. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce platformy. Wykonuj to płukanie jeszcze 11 razy w ciągu dnia co 30 minut.
  4. Napełnić fiolkę 100% MABT i umieścić na noc w mieszalniku nutującym w lodówce lub komorze typu walk-in w temperaturze 4 °C.

11. Dzień 5: Wizualizacja sondy

  1. Przygotować 50 ml porcji buforu fosfatazy alkalicznej (AP) (patrz plik uzupełniający 5). Połącz następujące elementy w stożkowej probówce o pojemności 50 ml owiniętej folią aluminiową, aby ograniczyć ekspozycję na światło: 5 ml 1 M Tris (pH 9,5), 5 ml 50 mM MgCl2, 5 ml 1% Tween 20, 5 ml 1 M NaCl, 30 ml ddH2O.
  2. Usunąć MABT i zastąpić 1 ml buforu AP (probówka owinięta folią). Pozwól mu myć się przez 5 minut. Zrób to dwukrotnie, aby zapewnić całkowite usunięcie MABT.
  3. Usunąć bufor AP i zastąpić 1 ml buforu AP 3,5 μl 5-bromo-4-chloro-3'-indolilofosforanu (BCIP) i 4,5 μl nitro-niebieskiego tetrazolu (NBT). Zastępować świeżo przygotowanym buforem AP/NBT/BCIP raz na godzinę, aż do zakończenia reakcji. Uważnie monitoruj, sprawdzając co 15 minut, aby reakcja barwienia zachodziła aż do osiągnięcia pożądanego poziomu zabarwienia. Jeśli osad zacznie się tworzyć, wymień roztwór wcześniej.
  4. Zatrzymaj reakcję barwienia, płucząc zarodki w świeżym 100% buforze AP (bez NBT/BCIP) przez 5 minut. Kontynuuj płukanie w PBT, aż do osiągnięcia optymalnych poziomów sygnału (przy minimalnej ilości barwienia tła). Kontynuować płukanie próbek zwiększającymi się rozcieńczeniami PBT w buforze AP w następujący sposób: 25% PBT (250 μl PBT, 750 μl buforu AP), płukać przez 5 minut; 50% PBT (500 μL PBT, 500 μL AP Buffer), płukać przez 5 min; 75% PBT (750 μL PBT, 250 μL buforu AP), płukać przez 5 min.
  5. Opłucz zarodki w ~5 ml 100% PBT na mieszadle nutującym, aż do osiągnięcia pożądanego minimalnego zabarwienia tła. Kilkakrotnie zamień na świeży PBT. Może to potrwać do kilku dni.
  6. Po zakończeniu płukania umyj zarodki w 500 μl sterylnego PBS na wytrząsarce platformowej. Wykonaj to płukanie dwukrotnie przez 5 minut. Po umyciu PBS należy utrwalić próbki w 500 μl 4% PFA przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na wytrząsarce platformowej. Alternatywnie, utrwalić przez noc w 1 ml 4% PFA w lodówce w temperaturze 4 °C.
  7. Zastąp utrwalacz świeżym, sterylnym PBS. Wykonaj to płukanie co najmniej dwa razy przez 5 minut. Umieść zarodki w ~4 ml w 100% sterylnego PBS i przechowuj przez długi czas w temperaturze 4 °C.

12. Obrazowanie

  1. Uzupełnić płytkę obrazową na szalce Petriego, używając 3% agarozy i buforu TAE.
    UWAGA: Ilości zależą od tego, ile talerzy jest potrzebnych. Talerze mogą być wielokrotnie używane. Zaleca się, aby płytka prostokątna forma została umieszczona na szalce Petriego podczas stygnięcia żelu w celu stworzenia wgłębienia do przechowywania zarodków na szalce.
  2. Umieścić zarodki na płytce w PBS.
    UWAGA: Najlepiej jest delikatnie wysypywać zarodki na płytkę zamiast je pipetować, ponieważ stwierdzono, że przyklejają się do wnętrza plastikowych pipet.
  3. Użyj mikroskopii świetlnej, aby uwidocznić każdy zarodek. Użyj sondy, aby manewrować zarodkami do pożądanej pozycji.
  4. Zrób zdjęcie, gdy zarodek znajdzie się w pożądanej pozycji. Należy pamiętać, że ważne jest, aby zrobić zdjęcia zarodków w ciągu kilku tygodni od zakończenia barwienia, aby uniknąć potencjalnej degradacji plamy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W niniejszym raporcie przedstawiamy prostą i bezpośrednią metodę znakowania embrionów Astyanax w celu przeprowadzenia wysokiej jakości analizy ekspresji genów. Technikę tę można zrealizować w ciągu czterech lub pięciu dni, a każdy główny etap procedury został przedstawiony na schemacie z kodowaniem kolorystycznym (Rysunek 1). Po zakończeniu procesu zabarwione embriony powinny wykazywać ciemnofioletowy znak chromatyczny w tkankach wykazujących ekspres...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ze względu na podatność RNA na degradację, jednym z najbardziej krytycznych etapów protokołu jest sterylna synteza sondy RNA. Jeśli jednak sonda zostanie starannie wygenerowana i zapewni dobre wyniki, może być ponownie wykorzystana w kolejnych reakcjach barwienia. Drugim kluczowym krokiem jest staranna produkcja wszystkich odczynników używanych w całym protokole. Ponieważ protokół ten obejmuje kilka dni i wiele małych kroków, ważne jest, aby wszystkie odczynniki były dokładnie produkowane i przechowywane w sterylny sposó...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy pragną podziękować członkom laboratorium Grossa za pomocne komentarze do tego manuskryptu. Pragniemy podziękować czterem uczniom szkół średnich, którzy korzystali z tego protokołu podczas letnich staży w 2017 i 2018 roku, w tym Christine Cao, Michaelowi Wardenowi, Aki Li i Davidowi Nwankwo. HL był wspierany przez UC Biology STEM Fellowship latem 2017 roku. Prace te były wspierane przez granty z National Science Foundation (DEB-1457630 dla JBG) oraz National Institutes of Dental and Craniofacial Research (NIH; DE025033 do JBG).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pipeta serologiczna 10 mlVWR89130-888
1000 ml Jednostka filtracyjnaVWR89220-698
15 ml PipetaVWR-Greiner82050-278
25 mlVWR89130-890
250 ml Jednostka filtrującaVWR89220-694
Pipeta serologiczna 5 mlVWR89130-886
50 ml stożkowyVWR-Falcon21008-940
500 ml Jednostka filtracyjnaVWR89220-696
Anty-Digoxigenin-AP, fragmenty FabSigma-Roche11093274910
BCIPSigma-AldrichB8503-1G1 g
Roztwór blokującySigma-Roche11 096 176 00150 g
Kwas cytrynowyFisher ScientificA104-500500 g
Zestaw do etykietowania DIG RNA (SP6/T7)Sigma-Roche11175025910
probówki EppendorfVWR20170-577
EtanolFisher-Decon04-355-2231 Gal
FormamidThermo Fisher Scientific17899100 mL
Szklane fiolki do depilacjiVWR66011-041szklane Dr
Fisher Scientific13-678-8A
HClThermal-ScientificPharmco-AAPER284000ACS500 mL
HeparynaSigmaH3393-25KU
Chlorek magnezu krystalicznyFisher ScientificM33-500500 g
Kwas maleinowySigmaM0375-100g100g
MetanolFisher ScientificA452-44L
Woda molekularna (bez RNaz)VWR7732-18-5500 ml
NaClFisher ScientificS271-33 kg
granulki NaOHFisher ScientificS318-500500 g
Podłoże NBT w proszkuThermoFisher Scientific340351 g
Normalna surowica koziaFisher-Invitrogen31873
Mikser nutującyVWR82007-202
ParaformaldehydSigma158127-500g500 g
PBS 10xFisher ScientificBP399-2020L
Proteinaza K (200mg/10ml)Qiagen1913310 mL
Pipety plastikoweVWR-SAMCO14670-147
RNAzywaSigmaR2020-250mL250 mL
Kąpiel wodna z wytrząsaniem 12 lVWR10128-12612 L
Standardowa wytrząsarka analogowaVWR89032-092
TrisSigma Millipore-OmniPur9210-500GM500 g
tRNA DrożdżeFisher-Invitrogen1540101125 mg
Tween 20SigmaP9416-50mL50 ml
Vortex-Genie 2Fisher Scientific-Scientific Industries, Inc50-728-002
Chlorek litu (LiCl)Sigma-Aldrich203637-10G10 g
serologiczna 1 Pipety

Bibliografia

  1. Valentino, K. L., Eberwine, J. H., Barchas, J. D. In situ hybridization: Application to neurobiology. , Oxford University Press. Oxford. (1987).
  2. Mugrauer, G., Alt, F. W., Ekblom, P. N-myc proto-oncogene expression during organogenesis in the developing mouse as revealed by in situ hybridization. The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1325-1335 (1988).
  3. Kerney, R., Gross, J. B., Hanken, J. Early cranial patterning in the direct‐developing frog Eleutherodactylus coqui revealed through gene expression. Evolution & Development. 12 (4), 373-382 (2010).
  4. Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).
  5. Cheung, M., Briscoe, J. Neural crest development is regulated by the transcription factor Sox9. Development. 130 (23), 5681-5693 (2003).
  6. Knight, R. D., Nair, S., Nelson, S. S., Afshar, A., Javidan, Y., Geisler, R., Rauch, G. J., Schilling, T. F. lockjaw encodes a zebrafish tfap2a required for early neural crest development. Development. 130 (23), 5755-5768 (2003).
  7. Yang, J. W., Jeong, B. C., Park, J., Koh, J. T. PHF20 positively regulates osteoblast differentiation via increasing the expression and activation of Runx2 with enrichment of H3K4me3. Scientific Reports. 7 (1), 8060(2017).
  8. Ganju, R. K., Brubaker, S. A., Meyer, J., Dutt, P., Yang, Y., Qin, S., Newman, W., Groopman, J. E. The α-chemokine, stromal cell-derived factor-1α, binds to the transmembrane G-protein-coupled CXCR-4 receptor and activates multiple signal transduction pathways. Journal of Biological Chemistry. 273 (36), 23169-23175 (1998).
  9. Cai, Y., Xin, X., Yamada, T., Muramatsu, Y., Szpirer, C., Matsumoto, K. Assignments of the genes for rat pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (Adcyap1) and its receptor subtypes (Adcyap1r1, Adcyap1r2, and Adcyap1r3). Cytogenetic and Genome Research. 71 (2), 193-196 (1995).
  10. Stolt, C. C., Rehberg, S., Ader, M., Lommes, P., Riethmacher, D., Schachner, M., Bartsch, U., Wegner, M. Terminal differentiation of myelin-forming oligodendrocytes depends on the transcription factor Sox10. Genes & Development. 16 (2), 165-170 (2002).
  11. Kimura, T., Takehana, Y., Naruse, K. pnp4a is the causal gene of the Medaka Iridophore mutant guanineless. G3: Genes, Genomes, Genetics. 7 (4), 1357-1363 (2017).
  12. Monsoro-Burq, A. H. A rapid protocol for whole-mount in situ hybridization on Xenopus embryos. Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4809(2007).
  13. Schulz, C. In situ hybridization to Drosophila testes. Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4764(2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Analiza ekspresji genówtrawienie proteinazą Kbufor do hybrydyzacjiroztwór blokującybarwienie w buforze APobrazowanie za pomocą mikroskopii świetlnejryba jaskiniowa ryba powierzchniowadetekcja sond RNA
Wholemount Hybrydyzacja in situ dla zarodków Astyanax
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.