Artykuł metodologiczny

Jednoczesny zapis elektrokardiograficzny i inwazyjny pomiar ciśnienia krwi u szczurów

15.8K wyświetleń

DOI:

10.3791/59115

31 stycznia 2019

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy konfigurację do jednoczesnego rejestrowania elektrokardiografii i ciśnienia krwi w tętnicy (BP) u szczurów doświadczalnych, która może być wykonana za pomocą standardowego sprzętu w obiektach dla zwierząt i może być zastosowana do badań fizjologicznych lub farmakologicznych w celu zbadania patogennych lub terapeutycznych mechanizmów w medycynie sercowo-naczyniowej.

Streszczenie

Dla badań związanych z fizjologią lub patofizjologią układu krążenia, ciśnienie krwi (BP) i elektrokardiografia są podstawowymi parametrami obserwacyjnymi. Badania koncentrujące się na modelach chorób sercowo-naczyniowych, potencjalnych celach terapeutycznych dla układu sercowo-naczyniowego lub środkach farmaceutycznych wymagają oceny ogólnoustrojowego ciśnienia tętniczego i zmian rytmu serca. W sytuacjach, gdy systemy telemetrii radiowej nie są dostępne lub niedrogie, technika kaniulacji tętnicy udowej jest alternatywnym sposobem uzyskania zapisów fal ciśnienia wewnątrztętniczego i ogólnoustrojowych pomiarów ciśnienia tętniczego. Ta technika jest ekonomiczna i może być wykonywana przy użyciu standardowego sprzętu w pomieszczeniach dla zwierząt. Jednak inwazyjny zapis ciśnienia tętniczego wymaga kaniulacji małych tętnic, co może być trudną umiejętnością chirurgiczną. Tutaj przedstawiamy protokoły krok po kroku dotyczące zabiegów kaniulacji tętnicy udowej. Kluczowe procedury obejmują kalibrację systemu gromadzenia danych, wypreparowanie tkanek i kaniulację tętnicy udowej oraz konfigurację systemu kaniulacji tętniczej do rejestracji ciśnienia. Uwzględniono również procedury rejestracji elektrokardiografii powierzchniowej. Prezentujemy również przykłady zapisów ciśnienia tętniczego u szczurów z prawidłowym i nadciśnieniowym ciśnieniem. Protokół ten umożliwia wiarygodne bezpośrednie zapisy ciśnienia układowego z jednoczesną elektrokardiografią.

Wprowadzenie

Ciśnienie krwi (BP) i elektrokardiografia (EKG) są podstawowymi parametrami fizjologii układu krążenia i medycyny. Eksperymentalne modele zwierzęce są szeroko stosowane w badaniach biomedycznych nad różnymi chorobami sercowo-naczyniowymi, takimi jak nadciśnieniowa niewydolność serca1, a procedury zapisu EKG i pomiaru ciśnienia krwi mogą być wykonywane u szczurów doświadczalnych.

Istnieją trzy metody pomiaru ciśnienia tętniczego u szczurów: kaniulacja dotętnicza (inwazyjna)2, pletyzmografia mankietu ogonowego (nieinwazyjna)3, oraz telemetria radiowa (inwazyjna). Na wiarygodność pomiaru ciśnienia krwi za pomocą pletyzmografii mankietu ogonowego może mieć wpływ obchodzenie się ze zwierzętami podczas rejestracji. Na przykład mankiet ogonowy nie docenia podstawowych zmian ciśnienia krwi, które zachodzą jednocześnie podczas faz unieruchamiania i pomiaru4. Telemetria radiowa jest uważana za najlepszą "złotą standardową" technikę monitorowania ciśnienia krwi i tętna u zwierząt obudzonych i swobodnie poruszających się5. Ponieważ jednak sprzęt i oprogramowanie do telemetrii radiowej są kosztowne, kaniulacja dotętnicza jest również szeroko stosowana jako ekonomiczna alternatywa.

Kaniulacja wewnątrztętnicza wymaga znacznych umiejętności mikrochirurgicznych, ale daje rzeczywiste przebiegi ciśnienia tętniczego. Ciśnienie krwi można rejestrować za pomocą cewnika wypełnionego solą fizjologiczną wprowadzanego do tętnicy promieniowej, udowej lub ramiennej. Ta metoda bezpośredniego inwazyjnego pomiaru ciśnienia tętniczego wymaga przedoperacyjnego przygotowania zwierząt, znieczulenia, unieruchomienia zwierząt laboratoryjnych, umiejętności chirurgicznych w zakresie preparowania tkanek i kaniulacji tętnic oraz odpowiedniej kalibracji przed uzyskaniem pomiaru.

EKG na powierzchni gryzoni jest podobne do EKG u ludzi. EKG szczura ma sekwencje załamków P, kompleksów QRS, załamków T i odstępów QT6. Załamek P, interwał PR, zespół QRS i załamki T odzwierciedlają odpowiednio depolaryzację przedsionków, przewodzenie impulsów z przedsionka do węzła przedsionkowo-komorowego, depolaryzację komorową i repolaryzację. Przedział QT definiuje się jako okres od zainicjowania fali Q do punktu końcowego fali T, w którym powraca ona do izoelektrycznej linii bazowej1.

EKG wskazuje na fazę skurczu i rozkurczu serca; dlatego jednoczesny zapis powierzchniowego EKG koreluje z inwazyjnym pomiarem ciśnienia tętniczego. Stosując kombinację metodologii, możliwe jest wyjaśnienie zmian patofizjologicznych w modelu choroby lub efektów farmakologicznych leku lub terapii w medycynie sercowo-naczyniowej.

Spontaniczny szczep szczura z nadciśnieniem tętniczym (SHR) został uzyskany przez chów wsobny szczurów Wistar z wysokim ciśnieniem krwi w Japonii. Ciśnienie krwi wzrasta od 5 do 10 tygodnia życia i staje się nieruchome między 30 a 35 tygodniem życia7. Szczury Wistar-Kyoto (WKY) mają skurczowe ciśnienie krwi około 130 mmHg7 i są powszechnie stosowane jako kontrola normo-tensyjna. Wykorzystaliśmy SHR i WKY, aby zademonstrować wynik wewnątrztętniczej kaniulacji BP i zapisu EKG.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie opisane eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Uniwersytetu Medycznego w Kaohsiung.

1. Opieka nad zwierzętami

  1. Aby uniknąć trudnej kaniulacji ze względu na mały rozmiar tętnicy, należy używać szczurów o masie ciała powyżej 200 g.
  2. Wyjmij karmę z klatki i szybkie szczury na noc.
  3. Podawaj wodę ad libidum, chyba że istnieje specjalny projekt eksperymentalny.

2. Przygotowanie do eksperymentu

  1. Zaopatrz się w następujące materiały: kleszcze z zębami (Ryc. 1A), nożyczki chirurgiczne (Ryc. 1B), kleszcze z cienkimi końcówkami (Ryc. 1C, 1D), kleszcze z kątowymi końcówkami (Ryc. 1E), zacisk naczyniowy buldoga (Ryc. 1F), jedwabny sznurek o długości około 20 cm (Rysunek 1G), mikronożyczki ( Rysunek 1H), kaniula dotętnicza, sterylna rurka z polietylenu (PE) o średnicy wewnętrznej 0,5 mm i średnicy zewnętrznej 0,9 mm, o długości 25–30 cm, podłączona do igły 26 G x 1/2'' (Rysunek 1I), dwa trójdrogowe zawory odcinające (Rysunek 1J) do połączenia kaniuli wewnątrztętniczej i przetwornika ciśnienia (Rysunek 1K)) oraz strzykawki o pojemności 1 ml wypełnione solą fizjologiczną zawieraną heparyną (100 j.m./ml).
  2. Przygotowanie zwierząt
    1. Znieczulić szczura poprzez inhalację izofluranu (umieszczając szczury w komorze indukcyjnej o wymiarach 25 cm x 25 cm x 14 cm nasyconej 4% izofluranem, a następnie stosując nosecone z 3% izofluranem).
      nuta: Jeśli zwierzę nie jest wystarczająco znieczulone, zwiększ szybkość przepływu izofluranu.
    2. Przetestuj odruch bólowy, ściskając palce u stóp.
    3. Umieść szczura w pozycji leżącej na wstępnie przyciętej płycie styropianowej (lub grubym kartonie). Przymocuj cztery nogi za pomocą gumek, aby unieruchomić ciało (Rysunek 2A).
      nuta: Aby uniknąć potencjalnych zakłóceń podczas zapisu EKG, powierzchnia umieszczenia nie może przewodzić prądu elektrycznego.
  3. Przygotuj aparaty do rejestracji ciśnienia tętniczego i EKG. Dołącz analogowy moduł wejściowy do odbierania sygnałów, przetwornik ciśnienia z kompatybilnym koncentratorem, trzy bipolarne przewody elektrokardiogramowe z końcówką igłową oraz komputer z odpowiednim oprogramowaniem.

3. Kalibracja przetwornika ciśnienia

  1. Przed rozpoczęciem rejestracji ciśnienia tętniczego należy przeprowadzić kalibrację za pomocą standardowego ciśnieniomierza rtęciowego (Rysunek 1L).
  2. Zdejmij mankiet ciśnieniowy z ciśnieniomierza i podłącz trójdrożny kran na rurce do pompowania do przetwornika ciśnienia (Rysunek 1K) systemu akwizycji danych.
  3. Przykręć zawór spustowy powietrza zgodnie z ruchem wskazówek zegara. Miej oko na miernik i kontynuuj pompowanie żarówki. Gdy manometr pokaże 100 mmHg, przełącz zawór trójdrogowy na połączenie z przetwornikiem ciśnienia. Do kalibracji użyj ciśnienia 100 mmHg. Współczynnik konwersji do obliczania BP zostanie określony automatycznie.
  4. Zwolnij ciśnienie, przekręcając zawór spustowy powietrza w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, aż ciśnienie ciśnieniomierza powróci do zera.
  5. Powtórz krok 3.2 z ciśnieniem 200 mmHg.
  6. Odłącz przetwornik ciśnienia od ciśnieniomierza rtęciowego.
  7. Podłączyć przetwornik ciśnienia do trójdrogowego zaworu odcinającego cewnika PE (Rysunek 1I).

4. Mini-chirurgia kaniulacji tętnicy udowej

  1. Identyfikacja i wycięcie powierzchni skóry (Rysunek 2)
    1. Zidentyfikuj miejsce bruzdy pachwinowej (wgłębienie na styku brzucha i uda) (linia przerywana w Rysunek 2A).
    2. Ściśnij całą warstwę skóry w środku bruzdy pachwinowej. Przed nacięciem futro można ogolić lub usunąć z miejsca nacięcia za pomocą elektrycznych maszynek do strzyżenia lub kremu do depilacji.
    3. Podnieś skórę i odetnij ją nożyczkami chirurgicznymi w orientacji mniej więcej równoległej do uda ipsilateralnego (Ryc. 2B). Nerw i naczynia udowe znajdują się pod odsłoniętą tkanką podskórną (Rysunek 2C).
  2. Wypreparowanie tkanki w celu odsłonięcia tętnicy udowej
    1. Wypreparuj tkankę za pomocą kleszczy z cienkimi końcówkami, warstwa po warstwie. Zatrzymaj sekcję na poziomie naczyń udowych. Upewnij się, że sekcja nie uszkadza naczyń znajdujących się pod spodem.
    2. Ostrożnie użyj kleszczy (Rysunek 1C lub 1D), aby oczyścić tkankę miękką wzdłuż nerwu udowego i naczyń krwionośnych, aby uzyskać dobrą obserwację. Nerw ma teksturę przypominającą włókna. Żyła jest ciemnofioletowa, a tętnica pulsacyjna (Ryc. 3A).
    3. Użyj kleszczyków z ukośnymi końcówkami (Rysunek 1E), aby przedłużyć odsłoniętą długość tętnicy i żyły udowej (Rysunek 3B).
  3. Kaniulacja tętnicy udowej (Rysunek 3)
    1. Użyj kleszczy, aby oddzielić żyłę udową od tętnicy i przyłóż zacisk buldoga do tętnicy udowej tak czaszkowo, jak to możliwe (Rysunek 3C).
    2. Zrób luźny krawat z dwóch jedwabnych sznurków, jeden tuż pod zaciskiem buldoga, a drugi na ogonowym końcu odsłoniętej tętnicy udowej (Rysunek 3D).
    3. Zrób mały otwór nad brzuszną stroną tętnicy udowej (ryc. 3E) za pomocą mikronożyczek ( Ryc. 1H).
    4. Włóż końcówkę cewnika PE przez mały otwór i przesuń cewnik czaszkowo.
      nuta: Nie należy skręcać podczas przesuwania cewnika PE. Siła skręcająca może skręcić tętnicę udową i spowodować zwężenie światła.
    5. Usuń zacisk bulldog po bezpiecznym wsunięciu cewnika PE do światła tętnicy udowej.
      UWAGA: Miej oko na cewnik PE podczas wyjmowania zacisku buldoga z tętnicy udowej. Obserwacja wstecznego przepłukiwania krwi do cewnika PE w połączeniu z obserwacją pulsu potwierdza jego umieszczenie w świetle tętnicy.
    6. Zaciśnij górny jedwabny sznurek, aby zabezpieczyć pozycję cewnika PE.
      nuta: Każde przypadkowe pociągnięcie lub przemieszczenie cewnika PE może spowodować poważne krwawienie.
    7. Zaciśnij dolny jedwabny sznurek, aby zapobiec krwawieniu z ogonowej strony tętnicy udowej.
  4. Potwierdzenie powodzenia kaniulacji tętnicy udowej
    1. Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml wstrzyknij 0,1–0,2 ml heparynizowanej soli fizjologicznej do tętnicy udowej. Opór przy wstrzykiwaniu musi być niewielki. Jeśli zauważy się wyraźny opór po wstrzyknięciu, należy ponownie sprawdzić całą kaniulę.
      nuta: Upewnij się, że trójdrogowe zawory odcinające są odpowiednio przełączone przed zastosowaniem jakiegokolwiek podciśnienia lub wstrzyknięcia soli fizjologicznej do kaniuli tętnicy udowej. W tym momencie każde wstrzyknięcie do przetwornika ciśnienia będzie wymagało ponownej kalibracji.
    2. Sprawdź, czy wokół miejsca kaniulacji nie ma sączenia. Jeśli nie, przykryj pole operacyjne mokrym wacikiem.

5. Zapis ciśnienia krwi

  1. Po płynnym przepłukaniu cewnika PE, przymocuj trójdrożny kran cewnika PE do kranu na przetworniku ciśnienia (Rysunek 4).
  2. Upewnij się, że w systemie kaniulacji nie ma pęcherzyków powietrza. Sprawdź również złącza przyłączeniowe kranu trójdrogowego.
  3. Uruchom system akwizycji danych z częstotliwością próbkowania 1,000 Hz, aby zarejestrować ciśnienie krwi. Zademonstrowane zostaną fale ciśnienia tętniczego (Rysunek 6).
  4. Pozwól całemu zestawowi ustabilizować się przez co najmniej 3-5 minut. W przypadku sygnałów niestabilnych czas stabilizacji można wydłużyć do 15 minut.
  5. Okresowo sprawdzaj miejsce kaniulacji, aby upewnić się, że nie ma krwawienia.
    UWAGA: Podczas pozyskiwania danych z przetwornika ciśnienia ważne jest, aby umieścić przetwornik na poziomie serca zwierzęcia.

6. Powierzchniowe EKG

  1. Sprawdź trzy przewody bipolarnego EKG, aby upewnić się, że dodatnie, ujemne i referencyjne elektrody platynowe są nienaruszone.
  2. Włóż przewody podskórnie na lewej przedniej nodze, prawej przedniej nodze i prawej tylnej nodze (Rysunek 5).
  3. Podłącz koncentratory elektrod do specjalnie zbudowanego wzmacniacza EKG o częstotliwości próbkowania 1,000 Hz i częstotliwości filtra 3–500 Hz. Podczas nagrywania utrzymuj przewody EKG stabilnie. Ruch odprowadzeń EKG może powodować niestabilne linie podstawowe i artefakty.

7. Eutanazja zwierząt po zakończeniu eksperymentu

  1. Po zakończeniu zapisu ciśnienia tętniczego i EKG należy zatrzymać system akwizycji. Wyjmij elektrody. Podwiązać tętnicę udową poprzez zaciśnięcie wcześniej założonego jedwabnego sznurka zaraz po wyjęciu cewnika PE.
  2. Umieść szczury pojedynczo w widocznej komorze eutanazyjnej podłączonej do butli ze sprężonym dwutlenkiem węgla (CO2 ). Szczelnie uszczelnij górę.
  3. Wprowadź 100% CO2 z szybkością napełniania około 10% do 30% objętości komory na minutę.
  4. Nie spuszczaj wzroku ze szczura; brak oddechu i wyblakły kolor oczu powinny pojawić się w ciągu 2-3 min.
    nuta: Jeżeli ustanie ruchu oddechowego nie nastąpi po 3 minutach, należy sprawdzić system pod kątem szybkości napełnienia komory, dopływu CO2 lub nieszczelności.
  5. Utrzymuj przepływ CO2 do komory jeszcze przez 1 minutę po ustaniu oddychania.
  6. Upewnij się, że zatrzymanie krążenia i oddechu oraz zanotować stałe i rozszerzone źrenice, aby potwierdzić zgon.
    nuta: Jeśli szczur nie jest martwy, ale znajduje się w narkozie CO2, należy zastosować wtórną metodę eutanazji, taką jak torakotomia obustronna.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Szczury SHR oraz normotensyjne szczury Wistar-Kyoto WKY zakupiono z National Laboratory Animal Center (Tajpej, Tajwan). Wszystkie zwierzęta przebywały w pomieszczeniu z kontrolowaną temperaturą (20−22 °C), z nielimitowanym dostępem do wody i standardowej karmy, przy zachowaniu 12-godzinnego cyklu światło/ciemność.

Wykorzystano sześć 47-tygodniowych szczurów, których masę ciała zmierzono przed pomiarem BP i ECG. Reprezentatywne z...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Inwazyjna kaniulacja tętnicza pozwala na bardzo dokładny pomiar ciśnienia tętniczego. Można to zrobić za pomocą rurki PE bez konieczności stosowania drogiego cewnika. Inwazyjny pomiar ciśnienia tętniczego może być również wykonywany jednocześnie z zapisem powierzchniowego EKG.

Główną krzywą uczenia się tej metody jest umiejętność eksperymentalna wymagana do kanniulacji małych naczyń krwionośnych. W doświadczonych rękach skuteczna skuteczność kaniulacji tętnicy udowej może zbliżyć się do 100%. ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez tajwańskie Ministerstwo Nauki i Technologii przyznaje MOST 104-2314-B-037-080-MY3 i MOST 107-2314-B-037-110 dla HCL oraz Tajwańskie Narodowe Instytuty Badawcze Zdrowia granty NHRI-EX107-10724SC.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Rurka polietylenowaBECTON DICKINSON427401średnica wewnętrzna 0,5 mm, średnica zewnętrzna 0,9 mm
Igła 26 G x 1/2""TERUMO160426D
Kleszcze AdsonTOP Line12-54012 cm (4,75") Długie, proste, 1 x 2 zęby
Zacisk naczyniowy BulldogTeleflex3575818 mm
Komputer AUSUSX453M
Zewnętrzne urządzenie do rejestracji sygnału analogowegoiWorxT5141538Umożliwia to rejestrację do trzech kanałów EKG, EMG lub EEG, a także GSR (przewodnictwo skóry) z jednego wejścia iWire w module rejestrującym.
Kleszcze GraefeNarzędzia chirurgiczne AESCULAPBD312RMIKRO KLESZCZE OPATRUNKOWE, ZAKRZYWIONE, ZĄBKOWANE, 105 mm, 4 1/8 
Ciśnieniomierz MecurySpiritCK-101
Przetwornik ciśnieniaiWorxIworxBP100
Kleszcze SemkenMEDE TECHNIK10-104100 mm
OprogramowanieLabScribe3
Nożyczki chirurgiczneHEBU1714o długości 14,5 cm
(1 ml)TERUMO160426D
Kran trójdrogowyCole-ParmerEW-30600-23
Kleszcze z końcówkąWorld Precision Instruments504506długości 11 cm, końcówki 0,1 x 0,06 mm
Nożyczki VannasWorld Instrumenty precyzyjne500086długości 8,5 cm, proste, końcówki 0,025 x 0,015 mm, bardzo cienkie ostrza 7 mm
Strzykawka

Bibliografia

  1. Shiou, Y. -L., Huang, I. C., Lin, H. -T., Lee, H. -C. High fat diet aggravates atrial and ventricular remodeling of hypertensive heart disease in aging rats. Journal of the Formosan Medical Association. , (2017).
  2. Parasuraman, S., Raveendran, R. Measurement of invasive blood pressure in rats. Journal of Pharmacology, Pharmacotherapeutics. 3 (2), 172-177 (2012).
  3. Fink, G. D. Does Tail-Cuff Plethysmography Provide a Reliable Estimate of Central Blood Pressure in Mice? Journal of the American Heart Association: Cardiovascular and Cerebrovascular Disease. 6 (6), e006554(2017).
  4. Wilde, E., et al. Tail-Cuff Technique and Its Influence on Central Blood Pressure in the Mouse. Journal of the American Heart Association: Cardiovascular and Cerebrovascular Disease. 6 (6), (2017).
  5. Braga, V. A., Prabhakar, N. R. Refinement of Telemetry for Measuring Blood Pressure in Conscious Rats. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science : JAALAS. 48 (3), 268-271 (2009).
  6. Kaese, S., Verheule, S. Cardiac electrophysiology in mice: a matter of size. Frontiers in Physiology. 3 (345), (2012).
  7. Okamoto, K., Aoki, K. Development of a strain of spontaneously hypertensive rats. Japanese Circulation Journal. 27, 282-293 (1963).
  8. Van Vliet, B. N., Chafe, L. L., Antic, V., Schnyder-Candrian, S., Montani, J. P. Direct and indirect methods used to study arterial blood pressure. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 44 (2), 361-373 (2000).
  9. Alam, M. A., Parks, C., Mancarella, S. Long-term Blood Pressure Measurement in Freely Moving Mice Using Telemetry. Journal of Visualized Experiments. (111), e53991(2016).
  10. Irvine, R. J., White, J., Chan, R. The influence of restraint on blood pressure in the rat. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 38 (3), 157-162 (1997).
  11. Nvd Vosse, F., Stergiopulos, N. Pulse Wave Propagation in the Arterial Tree. Annual Review of Fluid Mechanics. 43 (1), 467-499 (2011).
  12. Cosson, E., et al. Aortic stiffness and pulse pressure amplification in Wistar-Kyoto and spontaneously hypertensive rats. The American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology. 292 (5), H2506-H2512 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Kanulacja t tnicy udowejrejestracja ci nienia t tniczegokalibracja przetwornika ci nieniatechnika sekcji tkaneksystem akwizycji danychjednoczesny pomiar ci nienia t tniczego i EKGszczurzy model sercowo naczyniowyinwazyjny pomiar ci nienia t tniczegoprotok procedury chirurgicznej

Powiązane artykuły