Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Test ATAC-seq z niskim zanieczyszczeniem mitochondrialnym DNA z pierwotnych ludzkich limfocytów T CD4 +

12.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59120

⸱

22 marca 2019

 ,  , 
1Department of Biology, Boston University, 2Department of Computer Science and Engineering, University of California San Diego, 3Bioinformatics Program, Boston University

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół do przeprowadzenia testu sekwencjonowania chromatyny dostępnego dla transpozazy (ATAC-seq) na aktywowanych ludzkich limfocytach CD4+. Protokół został zmodyfikowany w celu zminimalizowania zanieczyszczających odczytów mitochondrialnego DNA z 50% do 3% poprzez wprowadzenie nowego buforu do lizy.

Streszczenie

ATAC-seq stał się powszechnie stosowaną metodologią w badaniach epigenetyki ze względu na szybkie i proste podejście do mapowania chromatyny dostępnej w całym genomie. W tym artykule przedstawiamy ulepszony protokół ATAC-seq, który zmniejsza zanieczyszczenie odczytów mitochondrialnego DNA. Podczas gdy poprzednie protokoły ATAC-seq zmagały się ze średnio 50% zanieczyszczeniem odczytów mitochondrialnego DNA, zoptymalizowany bufor lizy wprowadzony w tym protokole zmniejsza zanieczyszczenie mitochondrialnego DNA średnio o 3%. Ten ulepszony protokół ATAC-seq pozwala na prawie 50% redukcję kosztów sekwencjonowania. Pokazujemy, w jaki sposób można przygotować te wysokiej jakości biblioteki sekwencyjne ATAC z aktywowanych limfocytów CD4 +, dostarczając instrukcje krok po kroku od izolacji limfocytów CD4 + z krwi pełnej poprzez analizę danych. Ten ulepszony protokół ATAC-seq został zwalidowany w szerokim zakresie typów komórek i będzie natychmiast przydatny dla naukowców badających dostępność chromatyny.

Wprowadzenie

Test do sekwencjonowania chromatyny dostępnej dla transpozazy (ATAC-seq) szybko stał się wiodącą metodą badania architektury chromatyny. ATAC-seq może identyfikować regiony dostępnej chromatyny poprzez proces tagmentacji, fragmentacji i znakowania DNA przez ten sam enzym, w celu wytworzenia bibliotek, za pomocą których sekwencjonowanie może określić dostępność chromatyny w całym genomie. W tym procesie tagowania pośredniczy nadpoaktywna transpozaza Tn5, która przecina tylko otwarte regiony chromatyny z powodu nukleosomicznej przeszkody sterycznej. Podczas cięcia, transpozaza Tn5 wstawia również adaptery sekwencjonowania, które pozwalają na szybką budowę biblioteki przez PCR i sekwencjonowanie nowej generacji chromatyny dostępnej w całym genomie1,2.

ATAC-seq stało się preferowaną metodą do określania regionów dostępności chromatyny ze względu na stosunkowo prosty i szybki protokół, jakość i zakres informacji, które można określić na podstawie jego wyników, oraz niewielką ilość wymaganego materiału wyjściowego. W porównaniu do DNase-seq3 (który również mierzy dostępność chromatyny w całym genomie), MNase-seq4 (który określa pozycje nukleosomów w otwartych regionach genomu) i FAIRE-seq5, ATAC-seq jest szybszy, tańszy i bardziej powtarzalny1. Jest również bardziej czuły, pracując z materiałem wyjściowym składającym się z zaledwie 500 jąder, w porównaniu do 50 milionów jąder wymaganych dla DNase-seq3. ATAC-seq ma również możliwość dostarczania większej ilości informacji o architekturze chromatyny niż inne metody, w tym o regionach wiązania czynnika transkrypcyjnego, pozycjonowaniu nukleosomów i otwartych regionach chromatyny1. Sprawdzono skuteczne, jednokomórkowe protokoły sekwencyjne ATAC, które dostarczają informacji na temat architektury chromatyny na poziomie pojedynczej komórki6,7.

ATAC-seq został użyty do scharakteryzowania architektury chromatyny w szerokim spektrum badań i typów komórek, w tym roślin8, humans9, i wielu innych organizmów. Miało to również kluczowe znaczenie w identyfikacji epigenetycznej regulacji stanów chorobowych7. Jednak najczęściej stosowany protokół ATAC-seq ma główną wadę sekwencjonowania zanieczyszczeń z mitochondrialnego DNA. W niektórych zestawach danych ten poziom zanieczyszczenia może sięgać nawet 60% wyników sekwencjonowania1. W terenie podejmowane są wspólne wysiłki w celu zmniejszenia tych zanieczyszczających odczytów mitochondrialnych, aby umożliwić bardziej efektywne zastosowanie ATAC-seq7,10,11. Tutaj prezentujemy ulepszony protokół ATAC-seq, który zmniejsza wskaźnik zanieczyszczenia mitochondrialnego DNA do zaledwie 3%, co pozwala na zmniejszenie kosztów sekwencjonowania o około 50%10. Jest to możliwe dzięki usprawnionemu procesowi izolacji i aktywacji limfocytów CD4+ oraz ulepszonemu buforowi do lizy, który ma kluczowe znaczenie dla zminimalizowania zanieczyszczenia mitochondrialnego DNA.

Ten zmodyfikowany protokół ATAC-seq został zweryfikowany z szerokim zakresem komórek pierwotnych, w tym ludzkimi pierwotnymi komórkami jednojądrzastymi krwi obwodowej (PBMCs)10, ludzkimi pierwotnymi monocytami i mysimi komórkami dendrytycznymi (niepublikowane). Został również z powodzeniem wykorzystany do badania linii komórkowych czerniaka w zgrupowanym, regularnie rozmieszczonym ekranie krótkich powtórzeń palindromicznych (CRISPR) elementów niekodujących11. Dodatkowo pakiet do analizy danych opisany w tym protokole i udostępniony na GitHub zapewnia nowym i doświadczonym badaczom narzędzia do analizy danych ATAC-seq. ATAC-seq jest najskuteczniejszym testem do mapowania dostępności chromatyny w całym genomie, a modyfikacje istniejącego protokołu, które zostały tutaj wprowadzone, pozwolą naukowcom uzyskać wysokiej jakości dane o niskim zanieczyszczeniu mitochondrialnego DNA, zmniejszając koszty sekwencjonowania i poprawiając przepustowość ATAC-seq.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Ten ulepszony protokół zawiera instrukcje krok po kroku dotyczące wykonywania sekwencji ATAC limfocytów CD4+, od materiału wyjściowego krwi pełnej poprzez analizę danych (Rysunek 1).

1. Izolacja limfocytów T CD4+ z krwi pełnej

UWAGA: Materiałem wyjściowym dla tego protokołu jest 15 ml świeżej krwi pełnej pobranej przy użyciu standardowych procedur, co pozwala na wybór źródła materiału wyjściowego na podstawie wymagań badawczych. Skaluj protokół zgodnie z potrzebami. Wstępnie podgrzej sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) + 2% płodową surowicę cielęcą (FCS) do temperatury pokojowej (RT) i dostosuj wirówkę do RT przed rozpoczęciem procedury wzbogacania limfocytów T CD4 +.

  1. Dodaj 750 μl ludzkiego koktajlu wzbogacającego limfocyty T CD4 + do 15 ml krwi pełnej w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i delikatnie wymieszaj przez odwrócenie. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Po zakończeniu inkubacji dodać 15 ml PBS + 2% FCS do probówki i delikatnie wymieszać przez odwrócenie.
  2. Przygotować świeżą stożkową probówkę o pojemności 50 ml z 15 ml pożywki o dużej gęstości. Ostrożnie ułóż rozcieńczoną próbkę krwi na wierzchu pożywki gęstościowej, uważając, aby nie zakłócić tworzącego się interfejsu pożywki gęstości/krwi. Wirować przez 20 minut przy 1 200 x g i RT z przyspieszeniem ustawionym na 1 i hamulcem opadającym WYŁĄCZONY.
    nuta: Bardzo ważne jest, aby ustawić przyspieszenie na 1 i wyłączyć hamulec opadający w wirówce, aby uniknąć przerwania warstwy komórkowej w ośrodku gęstościowym.
  3. Pobrać wzbogacone limfocyty T CD4 + z granicy faz pożywka gęstości/osocza za pomocą wąskiej pipety do transferu łodygi. Przenieś zebrane komórki do świeżej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Odwirować zebrane limfocyty T CD4+ przez 8 minut przy 423 x g i RT.
    nuta: Upewnij się, że przyspieszenie wirówki zostało ustawione w pozycji 9, a hamulec opadający w pozycji ON dla kroku 1.3 i wszystkich kolejnych kroków.
  4. Odrzucić supernatant i dwukrotnie przemyć osad komórkowy 50 ml PBS + 2% FCS, odwirowując przez 8 minut przy 423 x g i RT. Odrzucić końcowe płukanie supernatantem i zawiesić przemyte osady komórkowe w 2 ml PBS + 2% FCS.
  5. Policz komórki za pomocą hemocytometru. Aby kontynuować pracę z sekwencją ATAC, przejdź do kroku 2.3. Aby zamrozić komórki do późniejszego przetworzenia, przejdź do kroku 1.6.
  6. Dodać 1 ml świeżej pożywki do zamrażania (90% FCS + 10% sultlenku dimetylu) na 1 milion komórek. Podwielokrotność 1 ml komórek w pożywce zamrażającej w bezpiecznych probówkach kriogenicznych. Umieścić probówki w temperaturze -80 °C na noc w pojemniku do powolnego zamrażania. Następnego dnia przenieś probówki do ciekłego azotu w celu długotrwałego przechowywania.
    UWAGA: 1 milion limfocytów T CD4 + zostanie wyizolowany na 2 ml pierwotnej objętości krwi pełnej. Zamrozić 500 000 komórek w 1 ml podwielokrotności pożywki do zamrażania. Przygotuj świeżą pożywkę do zamrażania przy każdym użyciu.

2. Aktywacja i oczyszczanie limfocytów T CD4+

UWAGA: Ten szybki protokół aktywacji i oczyszczania limfocytów T CD4+ wymaga tylko 48 godzin, a daje 95% żywotnych, aktywowanych limfocytów T CD4+. Schłodzić wirówkę do temperatury 4 °C przed rozpoczęciem protokołu.

  1. Rozmrozić 1 fiolkę (500 000) limfocytów T CD4 + w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, aż lód się rozpuści. Delikatnie przenieś komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 9 ml wstępnie podgrzanej pożywki Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640) uzupełnionej 10% FCS, zwanej dalej kompletnym RPMI.
    UWAGA: Nie pozwól, aby komórki całkowicie się rozmroziły, aby uniknąć narażenia na DMSO.
  2. Wirować przez 6 minut w temperaturze 1500 x g i temperaturze 4 °C. Wyrzucić supernatant i delikatnie zawiesić osad w 2 ml pełnej prędkości obrotowej. Powtórz wirowanie w dół, odrzuć supernatant i delikatnie zawieś komórki w 0,5 ml pełnego RPMI.
  3. Policz komórki za pomocą hemocytometru. Dostosuj gęstość zawiesiny komórek za pomocą pełnego RPMI, aby pokryć 50 000 komórek w 200 μl na dołek 96-dołkowej okrągłej płytki dennej.
    nuta: Z jednej zamrożonej probówki z 500 tys. limfocytów T CD4 + umieść 10 dołków po 50 000 limfocytów T CD4 + w 200 μl na studzienkę.
  4. Przygotować kulki magnetyczne sprzężone z ludzkimi przeciwciałami anty-CD3 i anty-CD28 aktywatorem T.
    1. Porcję 12,5 μl ludzkich kulek aktywatora T CD3/CD28 na próbkę sekwencyjną ATAC do probówki o pojemności 1,5 ml. Umyj koraliki 1 ml 1x PBS i umieść probówkę na magnesie na 1 minutę.
    2. Ostrożnie wyjmij i wyrzuć przezroczysty supernatant, wyjmij probówkę z magnesu i zawieś kulki w 13 μl pełnych obr./min na próbkę ATAC-seq.
      UWAGA: Oblicz ilość potrzebnych kulek na podstawie liczby przetwarzanych próbek ATAC-seq. Protokół ten wymaga 12,5 μl kulek CD3/CD28 na 500 000 komórek, co stanowi jedną próbkę sekwencyjną ATAC.
  5. Aktywuj limfocyty T CD4 +. Zbierz 500 000 komórek w 2,1 ml kompletnej pożywki RPMI w stożkowej probówce o pojemności 15 ml i dodaj 12,5 μl wstępnie umytych ludzkich kulek aktywatora T. Delikatnie wymieszaj, odwracając rurkę.
  6. Delikatnie przenieś komórki z kulkami do sterylnego zbiornika i umieść 200 μl komórek z kulkami w dołku 96-dołkowej płytki z okrągłym dnem za pomocą pipety wielokanałowej. Inkubować przez 48 godzin w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  7. Po inkubacji odwirować 96-dołkową płytkę przez 8 minut przy 423 x g i RT. Usunąć 100 μl pożywki na basenik z płytki 96-dołkowej, zbierając ją do stożkowej probówki przed wyrzuceniem, aby upewnić się, że nie ma utraty kulek. Ponownie zawiesić osad komórek w pozostałych 100 μl i zebrać wszystko w probówce o pojemności 1,5 ml.
    UWAGA: 10 dołków aktywowanych limfocytów T zostanie zebranych w objętości 1 ml.
  8. Wykonaj izolację CD4+. Dodaj 50 μl wstępnie umytych sprzężonych kulek CD4 do 500 000 komórek w 1 ml pełnego RPMI. Połącz koraliki i komórki za pomocą pipety. Inkubować przez 20 minut w temperaturze 4 °C w lodówce. Mieszaj kulki i mieszaninę komórek co 6 min.
    nuta: Protokół ten ma być stosowany dla jednej próbki 500 000 komórek. W razie potrzeby dostosować dla dwóch lub więcej próbek po 500 000.
  9. Po zakończeniu inkubacji umieścić probówkę na magnesie na 2 minuty. Usunąć i wyrzucić supernatant, gdy jest czysty. Umyj komórki związane kulkami, wyjmując probówkę z magnesu, zawieszając komórki związane z kulkami w 1 ml PBS + 2% FCS, wymieniając probówkę na magnesie na 1 minutę i wyrzucając przezroczysty supernatant. Powtórz ten proces, w sumie 3 prania.
    nuta: Uważaj, aby nie wyrzucić żadnych koralików podczas prania.
  10. Po ostatnim umyciu umieść probówkę na magnesie na 1 minutę. Wyjmij i wyrzuć supernatant i umieść granulat na lodzie. Przejdź do sekcji 3 (ATAC-seq).

3. ATAC-seq

UWAGA: W tym kroku, jądra są izolowane z aktywowanych limfocytów T CD4+ dla sekwencji ATAC. Bufor do lizy stosowany w tym protokole został ulepszony, aby był łagodniejszy dla jąder, co skutkuje bardziej wydajnym trawieniem i wyższą jakością wyników. Wszystkie etapy wirowania w sekcji 3 są wykonywane za pomocą wirówki o stałym kącie nachylenia utrzymywanej w temperaturze 4 °C. Schłodzić wirówkę przed rozpoczęciem protokołu.

  1. Wykonać izolację jąder. Ponownie zawiesić kulki i komórki za pomocą buforu do lizy na zimno (10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0,03% polisorbat 20). Natychmiast odwirować przy 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć i wyrzucić supernatant.
  2. Przeprowadź reakcję transpozazy. Zawiesić izolowany osad jądrowy za pomocą 50 μl mieszaniny transpozazy Tn5 (tabela 1). Inkubować w termocyklerze przez 30 minut w temperaturze 37 °C z pokrywką o temperaturze 40 °C, po zakończeniu utrzymywać w temperaturze 4 °C.
  3. Po poddaniu działaniu opon termicznych należy natychmiast wykonać szybkie wirówkę stołową, odwirować w dół i umieścić probówkę na magnesie na 1 minutę, aby usunąć kulki z produktu.
  4. Przenieś przezroczysty supernatant z probówki na magnesie do kolumny oczyszczającej DNA. Przemyć kolumnę raz 250 μl buforu PB i dwukrotnie 750 μl buforu PE. Eluować próbkę w 10 μl buforu elucyjnego. Przejdź bezpośrednio do kroku 3.5.
    nuta: Ten etap amplifikuje fragmenty DNA za pomocą ligowanych adapterów, zwanych tutaj biblioteką ATAC-seq. W celu multipleksowania kilku bibliotek ATAC-seq do uruchomienia na jednym torze NGS, należy użyć nieindeksowanego Primera 1 dla wszystkich próbek i innego indeksowanego Primera 2 dla poszczególnych próbek (Tabela 2). Podkłady stosuje się w stężeniach roboczych 1,25 μM.
  5. Ustawić początkową reakcję amplifikacji PCR w probówce PCR bez nukleazy, łącząc składniki w kolejności i objętości określonej w tabeli 3. Umieść probówkę PCR w termocyklerze i uruchom program amplifikacji PCR w warunkach cyklicznych, jak określono w tabeli 4.
  6. Monitorować reakcję metodą qPCR. Ustawić reakcję qPCR w probówce PCR bez nukleazy, łącząc składniki w kolejności i ilości określonej w tabeli 5. Umieścić w maszynie qPCR i cykl zgodnie z tabelą 6.
    1. Aby określić optymalną liczbę dodatkowych cykli amplifikacji dla pozostałych 45 μl reakcji, należy utworzyć wykres z numerem cyklu na osi x i fluorescencją względną (RFU) na osi y. Optymalna liczba dodatkowych cykli amplifikacji to jedna trzecia liczby cykli potrzebnych do osiągnięcia przez reakcję qPCR plateau.
      UWAGA: Monitorowanie reakcji za pomocą qPCR pozwala na określenie optymalnej liczby cykli PCR pożądanych w celu uzyskania optymalnej amplifikacji fragmentu biblioteki przy jednoczesnej minimalizacji odchylenia zawartości i rozmiaru GC.
  7. Zakończyć końcową amplifikację PCR pozostałych 45 μl reakcji PCR. Umieść probówkę PCR z reakcją amplifikacji z kroku 3.5 z powrotem w termocyklerze i uruchom program zgodnie z opisem w tabeli 7.
    nuta: Dla próbek przetworzonych w sposób opisany w niniejszym protokole optymalna łączna liczba cykli amplifikacji PCR została określona na 12.
  8. Po zakończeniu amplifikacji należy oczyścić biblioteki za pomocą zestawu do czyszczenia PCR zgodnie z protokołem producenta, eluując 25 μl buforu elucyjnego.
    nuta: Wzmocnione biblioteki mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C do 48 godzin lub zamrażane w temperaturze -20 °C w celu długotrwałego przechowywania.

4. Analiza jakości biblioteki ATAC-seq

UWAGA: Ważne jest, aby sprawdzić jakość i ilość bibliotek ATAC-seq przed sekwencjonowaniem nowej generacji. Jakość i ilość bibliotek powinna być oceniana przy użyciu dostępnych na rynku zestawów (patrz Spis materiałów).

  1. Oceń jakość i ilość bibliotek ATAC-seq za pomocą platformy opartej na mikrofluidyce do wymiarowania, kwantyfikacji i kontroli jakości DNA. Zobacz Rysunek 2 dla reprezentatywnych wyników oceny jakości.
    nuta: Stężenie bibliotek ATAC-seq musi wynosić >1 ng/μl, aby uzyskać wysokiej jakości wyniki sekwencjonowania. Średnio uzyskano 30 nM w 25 μL.

5. Sekwencjonowanie i analiza danych

UWAGA: Ten potok analizy pozwala użytkownikom kontrolować jakość procedury mapowania odczytów, dostosowywać współrzędne do projektu eksperymentalnego i wywoływać piki dla dalszej analizy. Poniżej znajdują się wiersze poleceń i wyjaśnienie wykonywania. Pakiet do analizy danych jest dostępny pod adresem (https://github.com/s18692001/bulk_ATAC_seq).

  1. Sekwencjonowanie przygotowanych bibliotek na sekwenatorze nowej generacji do średniej głębokości odczytu wynoszącej 42 miliony odczytów na próbkę.
  2. Oszacuj jakość odczytów sekwencjonowania, sprawdzając pliki wygenerowane przez pakiet oprogramowania FastQC12 za pomocą polecenia:
    fastqc -o
  3. W razie potrzeby przytnij podstawy odczytów przez oprogramowanie Trimmomatic13, zgodnie z kontrolą jakości FastQC, za pomocą polecenia (dla końcówki parą):
    java -jar <ścieżka do pliku trimmomatic jar> PE HEADCROP:
  4. Wyrównaj odczyty do ludzkiego genomu referencyjnego (hg38) przez Bowtie214 oprogramowanie:
    bowtie2 -x -1 -S
    nuta: Argument -x służy nazwie podstawowej indeksu genomu referencyjnego, a -S służy wynikom formatu SAM.
  5. Sprawdź jakość zmapowanych odczytów za pomocą Samtools15 flagstat package:
    samtools flagstat
  6. Posortuj zmapowany plik odczytów i usuń duplikaty za pomocą Picard16 tool:
    java -jar picard.jar SortSam INPUT= OUTPUT= SORT_ORDER=współrzędne" i "java -jar picard.jar MarkDuplicates INPUT= OUTPUT= REMOVE_DUPLICATES=PRAWDA
  7. Indeksuj plik BAM, przytnij nieużywane odczyty chromosomów i przesuń współrzędne dla eksperymentalnego powodu ATAC-seq17:
    java -jar picard.jar BuildBamIndex INPUT=
    samtools idxstats | cięcie -f 1 | grep -v chrY | grep -v chrM | grep -v chrUn | xargs samtools view -b >
    bedtools bamtobed -i >
    awk 'BEGIN {OFS = "\t"} ; {if ($6 == "+") drukuj $1, $2 + 4, $3 + 4, $4, $5, $6; w przeciwnym razie drukuj $1, $2 - 5, $3 - 5, $4, $5, $6}'
  8. Usuń odczyty, które są przesunięte na koordynację ujemną:
    awk '{if ($2 > 0) print $1 "\t" $2 "\t" $3 "\t" $4 "\t" $5 "\t" $6 }' .
  9. Przekonwertuj plik BED na plik BAM dla następującej analizy DiffBind18:
    bedtools bedtobam -i -g
  10. Wykonaj wywołanie szczytowe przez DiffBind18 pakiet oprogramowania:
    macs2 callpeak -t -f BAM -g hs -nomodel --nolambda --keep-dup all --call-summits --outdir <Ścieżka do katalogu wyjściowego> -n -B -q 0.01 --bdg --shift -100 --extsize 200
    nuta: Po przefiltrowaniu spodziewaj się mediany 37 milionów odczytów na próbkę. Zanieczyszczenie mitochondrialnego DNA będzie mieścić się w przedziale od 0,30% do 5,39% (średnio 1,96%). Wskaźnik wielokrotnych odczytów zmapowanych będzie niski (6,7%-56%, średnio 19%) i stosunkowo wysoki odsetek użytecznych odczytów jądrowych (60%-92%, średnio 79%).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Z 15 mL świeżej krwi całkowitej niniejszy protokół pozwala uzyskać średnio 1 milion komórek T CD4+. Komórki te mogą być zamrożone w celu późniejszego przetwarzania lub użyte natychmiast. Żywotność komórek T CD4+, świeżych lub rozmrożonych, była konsekwentnie >95%. Ta metoda izolacji komórek T CD4+ zapewnia elastyczność w zakresie materiału wyjściowego i czasu pobrania. Ulepszony protokół ATAC-seq generuje ostateczną bibliotekę o stężeniu większym niż 1 ng/µL, przeznaczoną do sekwencjon...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Zmodyfikowany protokół ATAC-seq przedstawiony w tym artykule zapewnia powtarzalne wyniki przy minimalnym zanieczyszczeniu mitochondrialnego DNA. Protokół został wykorzystany do pomyślnego scharakteryzowania architektury chromatyny ludzkich pierwotnych PBMC10, ludzkich monocytów, mysich komórek dendrytycznych (niepublikowanych) i hodowanych linii komórkowych czerniaka11. Przewidujemy, że ten ulepszony stan lizy może potencjalnie działać również w przypadku innych typów komór...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Atsede Siba za wsparcie techniczne. C.S.C. jest wspierany przez grant NIH 1R61DA047032.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1x PBS, sterylneGibco10010023Można używać innych porównywalnych produktów.
5810/5810  Wirówka z chłodzeniem R Swing Bucket z wiadrami probówkowymi 50 mL, 15 ml i 1,5 mlEppendorf22625501Można używać innych porównywalnych produktów.
96 Well Round Bottom PlateThermo Scientific163320Można używać innych porównywalnych produktów.
System stacji taśmowych Agilent 4200AgilentG2991AASugerowany do oceny jakości.
CryotubesThermo Scientific374081Może korzystać z innych porównywalnych produktów.
DMSOSigmaD8418Może korzystać z innych porównywalnych produktów.
Dynabeads Ludzki aktywator T CD3/CD28Invitrogen Life Technologies11131DKrytyczny składnik
Dynabeads Zestaw nietkniętych ludzkich komórek T CD4Invitrogen Life Technologies11346DKrytyczny składnik
DynamagnetInvitrogen Life Technologies12321DKrytyczny składnik
FCSGemini Bio Products100-500Może używać innych porównywalnych Produktów.
Zestaw DNA o wysokiej czułościAgilent50674626Sugerowany do oceny jakości.
Chlorek magnezu, sześciowodny, klasa biologii molekularnejSigmaM2393Można używać innych porównywalnych produktów.
Zestaw do oczyszczania MinElute PCR (bufor PB, bufor PE, bufor elucyjny)Qiagen28004Składnik krytyczny
Mr. FrostyThermo Scientific5100-0001Może używać innych porównywalnych produktów.
NaCl, klasa biologii molekularnejSigmaS3014Może używać innych porównywalnych produktów.
NEBNext High Fidelity 2x PCR Master MixNew England BioLabsM0541komponentem krytycznym
Nextera (2x bufor TD, enzym Tn5)IlluminaFC1211030Critical Component
Zero Nuclease Sterylne dH20Gibco10977015Może korzystać z innych porównywalnych produktów.
Polysorbate 20 (Tween20)SigmaP9416Może korzystać z innych porównywalnych produktów.
PowerUp SYBR Green Master MixApplied BiosystemsA25780Precyzyjny składnik o krytycznym elemencie
Thermo ScientificTSGP02Może korzystać z innych porównywalnych produktów.
Zestaw do oczyszczania QIAquick PCRQiagen28104Zestaw
do oznaczania kubitów oInvitrogen Life TechnologiesQ32851Sugerowany do oceny jakości.
Qubit FlouroMeterInvitrogen Life TechnologiesQ33226Sugerowany do oceny jakości.
Rosette Sep Human CD4+ Density MediumStem Cell Technologies15705Critical Component
Rosette Sep Human CD4+ Enrichment CocktailStem Cell Technologies15022Komponent krytyczny
RPMI-1640Gibco11875093Może korzystać z innych porównywalnych produktów.
Sterylny ResevoirThermo Scientific8096-11Może używać innych porównywalnych produktów.
Termocykler T100 z podgrzewaną pokrywąBioRad1861096Może korzystać z innych porównywalnych produktów.
Tris-HCLSigmaT5941Może korzystać z innych porównywalnych produktów.
Zestaw do przygotowania biblioteki DNA z krytycznym składniku dsDNA HS

Bibliografia

  1. Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
  2. Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide. Current Protocols in Molecular Biology. 21, 1-29 (2015).
  3. Song, L., Crawford, G. E. DNase-seq: a high-resolution technique for mapping active gene regulatory elements across the genome from mammalian cells. Cold Spring Harbor Protocols. (2), (2010).
  4. Pajoro, A., Muiño, J. M., Angenent, G. C., Kaufmann, K. Profiling Nucleosome Occupancy by MNase-seq: Experimental Protocol and Computational Analysis. Methods in Molecular Biology. 1675, 167-181 (2018).
  5. Giresi, P. G., Kim, J., McDaniell, R. M., Iyer, V. R., Lieb, J. D. FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin. Genome Research. 17 (6), 877-885 (2007).
  6. Rosenberg, A. B., et al. Single-cell profiling of the developing mouse brain and spinal cord with split-pool barcoding. Science. 360 (6385), 176-182 (2018).
  7. Corces, M. R., et al. Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution. Nature Genetics. 48 (10), 1193-1203 (2016).
  8. Lu, Z., Hofmeister, B. T., Vollmers, C., DuBois, R. M., Schmitz, R. J. Combining ATAC-seq with nuclei sorting for discovery of cis-regulatory regions in plant genomes. Nucleic Acids Research. 45 (6), e41(2017).
  9. Lara-Astiaso, D., et al. Chromatin state dynamics during blood formation. Science. 345 (6199), 943-949 (2014).
  10. Gate, R. E., et al. Genetic determinants of co-accessible chromatin regions in activated T cells across humans. Nature Genetics. , (2018).
  11. Sanjana, N. E., et al. High-resolution interrogation of functional elements in the noncoding genome. Science. 353 (6307), 1545-1549 (2016).
  12. Andrews, S. FastQC A Quality Control tool for High Throughput Sequence Data. Babraham Bioinformatics. , Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc (2018).
  13. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  14. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  15. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  16. Broad Institute. Picard Tools. , Available from: http://broadinstitute.github.io/picard/ (2018).
  17. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
  18. Stark, R., Brown, G. DiffBind: Differential Binding Analysis of ChIP-Seq Peak Data. , Available from: http://bioconductor.org/packages/devel/bioc/vignettes/DiffBind/inst/doc/DiffBind.pdf (2018).
  19. Corces, M. R., et al. An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues. Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).
  20. Wu, J., et al. The landscape of accessible chromatin in mammalian preimplantation embryos. Nature. 534 (7609), 652-657 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Protok ATAC seqizolacja j der kom rkowychtranspozaza Tn5aktywacja kulek magnetycznychizolacja kom rekprzygotowanie bibliotekiredukcja koszt w sekwencjonowaniadost pno chromatyny
Test ATAC-seq z niskim zanieczyszczeniem mitochondrialnym DNA z pierwotnych ludzkich limfocytów T CD4 +
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.