Izolacja i transfer adoptywny komórek dendrytycznych prezentujących antygen traktowany wysoką solą

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół izolacji komórek dendrytycznych z mysich śledzion, poprzez magnetyczne sortowanie komórek, a następnie transfer adoptywny do naiwnych myszy. Model komórek dendrytycznych aktywowanych solą został wybrany, aby wyjaśnić krok po kroku procedury adoptywnej cytometrii transferowej i przepływowej.

Streszczenie

Nadmierne spożycie soli w diecie przyczynia się do stanu zapalnego i odgrywa istotną rolę w rozwoju nadciśnienia. Wcześniej odkryliśmy, że komórki dendrytyczne (DC) prezentujące antygen mogą wyczuwać podwyższony poziom sodu zewnątrzkomórkowego, co prowadzi do aktywacji oksydazy NADPH i tworzenia adduktów białka izolewuglandyny (IsoLG). Te addukty białka IsoLG reagują z własnymi białkami i promują stan podobny do autoimmunologicznego i nadciśnienia. Opracowaliśmy i zoptymalizowaliśmy najnowocześniejsze metody badania funkcji DC w nadciśnieniu tętniczym. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół izolacji, leczenia in vitro z podwyższonym poziomem sodu i adoptywnego transferu mysich komórek CD11c ⁺ śledziony do myszy biorców w celu zbadania ich roli w nadciśnieniu.

Wprowadzenie

Nadmiar soli w diecie jest głównym czynnikiem ryzyka nadciśnienia. ^1,2 Amerykańskie Towarzystwo Kardiologiczne zaleca jednak maksymalne spożycie 2 300 miligramów (mg) sodu (Na⁺) dziennie; mniej niż 10% populacji USA przestrzega tego zalecenia. ^3,4 Niewielkie zmniejszenie spożycia Na⁺ obniża ciśnienie krwi i zmniejsza roczną liczbę nowych przypadków choroby niedokrwiennej serca i udaru mózgu w USA o 20%. ⁵ Głównym problemem związanym z nadmiernym spożyciem soli jest to, że 50% populacji z nadciśnieniem tętniczym wykazuje wrażliwość na sól, zdefiniowaną jako wzrost ciśnienia krwi o 10 mmHg po obciążeniu Na⁺ lub podobny spadek ciśnienia krwi po ograniczeniu Na⁺ i diurezie. ⁶ Wrażliwość na sól występuje również u 25% osób z prawidłowym ciśnieniem i jest niezależnym predyktorem zgonów i zdarzeń sercowo-naczyniowych. ^7,8 Mechanizmy wykrywania soli w nadciśnieniu obejmującym nerki zostały dobrze zbadane; jednak ostatnie badania sugerują, że komórki odpornościowe mogą wyczuwać Na⁺. ^9,10

Ostatnie dowody sugerują, że zmiany w obchodzeniu się z Na⁺ przez nerki mogą powodować akumulację Na⁺ w śródmiąższu i sprzyjać stanom zapalnym. ^11,12 Nasze laboratorium i inne wykazały, że komórki zarówno wrodzonego, jak i nabytego układu odpornościowego przyczyniają się do zaostrzenia nadciśnienia. ^9,13,14,15 Różne bodźce nadciśnieniowe, w tym angiotensyna II, noradrenalina i sól, powodują, że makrofagi, monocyty i limfocyty T przenikają do nerek i naczyń krwionośnych oraz sprzyjają zatrzymywaniu Na⁺, zwężeniu naczyń krwionośnych, podwyższeniu ciśnienia krwi i uszkodzeniu narządów końcowych. ^{9,16,17,18,19,20} We wcześniejszych badaniach odkryliśmy, że DC gromadzą addukty białka izolewukleryny (IsoLG) w odpowiedzi na różne bodźce nadciśnieniowe, w tym angiotensynę II i nadciśnienie solne DOCA. ¹⁴ IsoLGs są wysoce reaktywnymi produktami peroksydacji lipidów, które szybko i kowalencyjnie przekształcają się w lizyny na białkach, a ich akumulacja jest związana z aktywacją DC. ¹⁴ Niedawno ustaliliśmy, że podwyższony poziom Na⁺ jest silnym bodźcem do tworzenia adduktów białka IsoLG w mysich DCs.⁹ Wejście Na⁺ do DC odbywa się za pośrednictwem transporterów wrażliwych na amilorydy. Na⁺ jest następnie wymieniany na wapń (Ca²⁺) przez wymiennik Na⁺/Ca²⁺. Ca²⁺ aktywuje kinazę białkową C (PKC), która aktywuje oksydazę NADPH, prowadząc do zwiększonego tworzenia ponadtlenków (O₂^·-) i białka IsoLG. ⁹ Adoptywny transfer DC narażonych na sól powoduje nadciśnienie w odpowiedzi na subpresorową dawkę angiotensyny II. ⁹

Identyfikacja DC11c⁺ z tkanek była wcześniej ograniczona do immunohistochemii i RT-PCR, a izolacja DC była ograniczona do sortowania komórek za pomocą cytometrii przepływowej. Chociaż sortowanie komórek metodą cytometrii przepływowej jest potężną metodą izolacji komórek odpornościowych, jest kosztowne, czasochłonne i prowadzi do niskiej wydajności żywych komórek. Dlatego zoptymalizowaliśmy krok po kroku protokół trawienia tkanek, stymulacji in vitro i adoptywnego transferu CD11c⁺ DC w celu zbadania nadciśnienia.

Protokół

Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Vanderbilt zatwierdził procedury opisane w niniejszym dokumencie. Myszy są trzymane i opiekowane zgodnie z Przewodnikiem dotyczącym opieki i wykorzystywania zwierząt laboratoryjnych (National Academies Press. Revised 2010).

1. Izolacja śledziony od myszy

1. Przygotuj 1640 RPMI: 10% FBS, 0,10 mM HEPES, 1 mM pirogronianu sodu, 50 μM β-merkaptoetanolu i 1% penicyliny/streptomycyny.
2. Poddaj eutanazji 10-12 tygodniowe samce myszy C57bl/6 przez wdychanie CO₂ . Spryskaj klatkę piersiową i boki myszy 70% etanolem. Po lewej stronie ostrożnie otwórz skórę i jamę otrzewnej, aby odsłonić śledzionę.
3. Za pomocą małych kleszczy ostrożnie przesuń jelita i wątrobę na lewą stronę myszy i za pomocą cienkich nożyczek delikatnie wytnij śledzionę.
   nuta: Ten krok należy wykonać bardzo ostrożnie, ponieważ uszkodzenie przewodu pokarmowego może wywołać zanieczyszczenie.
4. Umieść każdą wyciętą śledzionę w oznakowanej stożkowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej 3 ml pożywki RPMI 1640.

2. Wytwarzanie zawiesin jednokomórkowych ze śledziony

UWAGA: Śledziona może zostać zdysocjowana na jednokomórkową zawiesinę poprzez połączenie mechanicznej dysocjacji z trawieniem enzymatycznym.

1. Przygotować roztwór do trawienia śledziony, dodając kolagenazę D (1 mg/ml; 0,29 j./mg liofilizowaną) i DNazę I (0,1 mg/ml) do przygotowanej pożywki RPMI 1640 (patrz krok 1.1)
2. Za pomocą kleszczy przenieś śledzionę do rurki C (rurki dysocjacyjnej) zawierającej 3 ml roztworu do trawienia śledziony.
3. Przeprowadzić dysocjację mechaniczną za pomocą półautomatycznego homogenizatora zgodnie z instrukcjami producenta.
   1. Umieść rurkę C na półautomatycznym homogenizatorze, upewniając się, że rurka C jest szczelnie umieszczona na obracającym się ramieniu. Po umieszczeniu rurki C naciśnij przycisk start na półautomatycznym homogenizatorze, aby uruchomić protokół Spleen 04.01 przez 60 s.
      nuta: Dysocjację mechaniczną można również przeprowadzić, umieszczając filtr 40 μm na stożkowej rurce o pojemności 50 ml i delikatnie przecierając śledzionę przez filtr. Po zmieleniu śledziony przepłukać filtr 40 μm 10 ml pożywki RPMI.
4. Po dysocjacji mechanicznej należy odłączyć probówkę od homogenizatora i przeprowadzić trawienie enzymatyczne. Inkubować próbki przez 15 minut w temperaturze 37 °C przy ciągłej rotacji (20 obr./min).
5. Przenieść roztwór, pipetując do stożkowej probówki o pojemności 50 ml po przefiltrowaniu przez sitko o średnicy 40 μm. Umyj sitko 40 μm 10 ml PBS (dPBS) firmy Dulbecco. Odwirować komórki przy sile 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
6. Po odwirowaniu całkowicie odessać supernatant i przemyć osad przez ponowne wymieszanie w 10 ml dPBS. Wirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.

3. Izolacja CD11c⁺ DC z zawiesiny pojedynczej komórki śledziony

1. Zawiesić osad komórkowy w 5 ml dPBS i policzyć liczbę komórek za pomocą hemocytometru i wykluczenia błękitu trypanowego.
2. Granulować komórki, odwirowując w temperaturze 300 x g, przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
3. Całkowicie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 400 μl magnetycznie aktywowanego buforu do sortowania komórek (MAC).
4. Dodać 100 μl mikrogranulek CD11c (patrz tabela materiałów) na 1 x 10⁸ komórek.
5. Zawiesinę komórkową należy zwirować i inkubować przez 10 minut w lodówce w temperaturze 4 °C.
6. Dodaj 10 ml buforu MACs, aby umyć komórki. Wirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
7. Całkowicie odessać supernatant i ponownie zawiesić w 500 μl buforu MAC.

4. Separacja magnetyczna DCs CD11c⁺

UWAGA: Separacja magnetyczna odbywa się ręcznie za pomocą separatora magnetycznego (patrz Tabela materiałów) wyposażonego w kolumny LS. Separacja magnetyczna może być również wykonywana automatycznie za pomocą automatycznego separatora magnetycznego. (patrz Tabela materiałów).

1. Umieść kolumnę LS w polu magnetycznym separatora MAC i stożkową rurkę o pojemności 15 ml pod każdą kolumną, aby zebrać przepływ.
2. Przepłukać kolumnę LS 3 ml buforu.
3. Umieścić zawiesinę komórek na każdej kolumnie LS i zebrać przepływowy przepływ zawierający nieoznakowane komórki.
4. Przemyć kolumnę LS 3 ml buforu MAC zbierającego nieznakowane komórki, które przez nią przechodzą. Umyj kolumnę LS jeszcze 2 razy.
5. Wyjmij kolumnę LS z separatora magnetycznego. Dodaj 5 ml buforu MAC do każdej kolumny i natychmiast wypłucz magnetycznie znakowane komórki, mocno zanurzając kolumnę LS w czystej stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
   nuta: Ważne jest, aby wykonać podwójną izolację komórek CD11c w celu uzyskania zawiesiny komórek o wysokiej czystości. Dlatego powtórz kroki od 3.1 do 4.5. i odniesienie Rysunek 4 dla standardów czystości. Ten etap poprawia czystość komórek CD11c⁺ do 90–95%.
6. Określ liczbę DC CD11c⁺ na hemocytometrze za pomocą wykluczenia błękitu trypanowego. Rozcieńczyć próbkę komórkową w rozcieńczeniu 1:1 w 0,4% roztworze błękitu trypanowego.
   UWAGA: Komórki niezdolne do życia zostaną zabarwione na niebiesko, podczas gdy żywe komórki pozostaną niewybarwione.
   1. Aby to zrobić, ostrożnie napełnij hemocytometr 10 μl rozcieńczenia próbki komórki i inkubuj przez 1 minutę.
   2. Policz komórki w 4 kwadratach o wymiarach 1 x 1 mm² w komorze, która została załadowana, aby określić liczbę żywotnych komórek.

5. Obróbka in vitro o wysokiej zawartości soli w CD11c⁺ DC

1. Przygotować pożywkę hodowlaną DC, dodając 10% FBS, 0,1 mM HEPES, 1 mM pirogronianu sodu, 50 μM β-merkaptoetanolu i 1% penicyliny/streptomycyny do 500 ml 1640 RPMI.
2. Przygotuj 10 pożywek do hodowli komórek o wysokiej zawartości soli (400 mM), ważąc 1,17 g NaCl i umieszczając go w sterylnej probówce sokoła o pojemności 50 ml. Dodać 50 ml sterylnej pożywki do hodowli komórek prądu stałego (przygotowanej w kroku 5.1) do probówki Falcona o pojemności 50 ml i wirować, aż NaCl znajdzie się w roztworze.
3. Natychmiast przefiltruj pożywkę hodowlaną DC o wysokiej zawartości soli za pomocą filtracji próżniowej przez filtr 0,2 μm w okapie do hodowli komórkowych.
4. Odwirować każdą zawiesinę komórkową ze śledziony przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4ºC. Zawiesić każdą osadkę komórkową w pożywce hodowlanej prądu stałego o stężeniu 1 x 10⁶ komórek/ml.
5. Odpipetować 900 μl (około 1 x 10⁶ komórek) zawiesiny DC w 24-dołkowej płytce Falcon z płaskim dnem. Dodać 100 μl pożywki hodowlanej prądu stałego o wysokiej zawartości soli do każdej studzienki, aby uzyskać końcowe stężenie sodu 190 mM. Oznaczyć płytkę i umieścić w inkubatorze CO₂ o temperaturze 37 °C na 48 godzin.

6. Adoptywny transfer CD11c⁺ DC o wysokiej zawartości soli

1. Po stymulacji in vitro przez 48 godzin wyjąć płytkę z inkubatora z humififikowanym CO₂ w temperaturze 37 °C.
2. Odpipetować pożywkę do hodowli komórkowych w górę i w dół, aby ponownie zawiesić CD11c⁺ DC. Odpipetować całą zawiesinę CD11c⁺ DC do odpowiedniej oznaczonej probówki o pojemności 1,6 ml. Powtórz ten krok dla każdej studni z osobna.
3. Odwirować każdą zawiesinę CD11c⁺ DC o sile 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant. Zawiesić osad DC w 100 μl sterylnego dPBS.
4. Narysować zawiesinę DC do strzykawki o pojemności 1 ml wyposażonej w igłę 27 G 1/2 cala.
5. Umieść naiwnego samca 10-tygodniowego myszy C57bl/6 pod 2% izofluranem, aby uzyskać stabilną płaszczyznę chirurgiczną. Sprawdź poziom znieczulenia przy braku odruchu pedałowania. Po uzyskaniu stabilnej płaszczyzny operacyjnej powoli i ostrożnie wprowadzić igłę do przestrzeni zadoczodołowej pod kątem około 30°.
   nuta: Skos igły 27 G powinien być skierowany w dół, z dala od oka, aby zapobiec uszkodzeniu oka.
6. Powoli i płynnie wstrzykiwaj zawiesinę DC CD11c⁺ (około 1 x 10⁶ ogniw). Po zakończeniu wstrzyknięcia należy ostrożnie wyjąć igłę w przestrzeń zadoczodołową, mając świadomość, że nie uszkodzić oka.
   nuta: Po wstrzyknięciu krwawienie powinno być niewielkie lub nie powinno być go wcale. Adoptywny transfer DC CD11c⁺ można również przeprowadzić przy użyciu metody iniekcji dożylnej (np. Żyła ogonowa). Myszy kontrolne otrzymują CD11c ⁺ DC, które były hodowane w normalnych pożywkach solnych.
7. Usuń myszy ze stożka nosowego i monitoruj je przez około 30 minut podczas rekonwalescencji po znieczuleniu.

7. Przygotowanie 14-dniowej niskiej dawki angiotensyny II (140 ng/kg/min)

1. Przygotować bufor angiotensyny II, dodając 500 μl 5 M NaCl i 300 μl kwasu octowego. Quantum Satis (QS) do 30 ml dejonizowanego H₂0.
2. Rozpuścić angiotensynę II w roztworze podstawowym o stężeniu 5 mg/ml w buforze angiotensyny II. Rozcieńczyć roztwór podstawowy angiotensyny II dodatkowym buforem, aby osiągnąć końcowe stężenie takie, aby minipompa osmotyczna dostarczała angiotensynę II w ilości 140 ng/kg/min, w zależności od masy ciała każdej myszy.
   nuta: Niezbędna angiotensyna II (mg) = (masa myszy (g) x 0,2 mg/dzień x 14 dni)/1,000
   Przygotowana angiotensyna II (mg) = (niezbędna angiotensyna II x 260 μL) / szybkość pompowania (0,25 μL/godz.)
   Objętość zapasowa angiotensyny II (μL) = Gotowa angiotensyna II / stężenie podstawowe (5 mg / ml) x 1 000
   Objętość rozcieńczonego (μL) = 270 - objętość podstawowa angiotensyny II
3. Dodać objętość podstawową angiotensyny II do rozcieńczalnika (buforu angiotensyny II) w oparciu o objętości obliczone w kroku 7.2.
4. Pod sterylnym kapturem do hodowli komórkowych otwarta minipompa osmotyczna.
5. Dodać rozcieńczony roztwór angiotensyny II i usunąć powietrze ze strzykawki i igły. Wprowadzić dołączoną igłę do dna minipompy osmotycznej i powoli wstrzykiwać roztwór angiotensyny II, jednocześnie powoli i ostrożnie wycofując igłę z pęcherza.
6. Włóż całkowicie głowicę minipompy osmotycznej do pęcherza osmotycznego, uważając, aby powietrze nie dostało się do pęcherza.

8. Implantacja 14-dniowych minipomp osmotycznych Angiotensyna II o niskiej dawce

1. Dziesięć dni po adoptyjnym przeniesieniu CD11c⁺ DC, umieść myszy w komorze izofluranu, aby rozpocząć znieczulenie, a następnie przenieś myszy do stożka nosa, aby stale otrzymywać 2% izofluranu w celu uzyskania i utrzymania odpowiedniej płaszczyzny operacyjnej.
2. Usuń sierść wzdłuż grzbietowej strony szyi za pomocą maszynki do strzyżenia, aby przygotować miejsce operacji. Przed rozpoczęciem zabiegu oczyść ogolony obszar 70% etanolem, a następnie 7,5% betadyną.
3. Wykonaj małe nacięcie (około 1,5 cm) w skórze. Wprowadzić hemostatyki do nacięcia, aby utworzyć podskórną kieszeń do umieszczenia minipompy osmotycznej.
4. Włożyć minipompkę do kieszonki podskórnej. Zamknij ranę skóry 2-3 zszywkami chirurgicznymi i nałóż kolejną aplikację 7,5% betadyny na ranę i zszywki, aby zapobiec infekcji.
5. Monitoruj myszy przez 30–60 minut podczas rekonwalescencji po znieczuleniu przed powrotem do klatek.
   nuta: Myszy należy monitorować do 3–4 dni po wszczepieniu minipompy osmotycznej.

9. Izolacja śledziony myszy biorców do analizy cytometrycznej przepływowej

1. Po 14 dniach infuzji angiotensyny II w małej dawce należy wyizolować śledziony od myszy otrzymujących in vitro DC o wysokiej zawartości soli poprzez transfer adoptywny. Postępuj zgodnie z instrukcjami wymienionymi powyżej (kroki 1 i 2).

10. Barwienie powierzchni

1. Przenieść splenocyty, które są ponownie zawieszone w 1x PBS, do probówki FACS z polistyrenu i odwirować przy 350 x g przez 8 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant po odwirowaniu. Przemyć dwukrotnie 1 ml buforu MAC i odwirować (350 x g, 8 min, 4 °C).
   1. Podziel splenocyty równo na różne probówki FACS z polistyrenu w zależności od pożądanej liczby paneli cytometrii przepływowej.
2. Aby przeprowadzić barwienie żywotności żywych/martwych komórek, umyj komórki 1x PBS i odwiruj (350 x g, 8 min, 4 °C). Zawiesić w 1 ml 1x PBS i dodać 1 μl barwnika żywotności komórek (patrz tabela materiałów). Inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C (w lodówce lub na lodzie) przykryć folią w celu ochrony przed światłem.
3. Podczas inkubacji barwienia żywotności komórek należy przygotować koktajl przeciwciał do barwienia powierzchni komórki w odpowiedniej objętości buforu MACS.
4. Umyć komórki 1 ml buforu MACS, odwirować (350 x g, 8 min, 4 °C) i ponownie zawiesić każdą komórkę z 100 μl koktajlu przeciwciał. Inkubować chronić przed światłem przez 30 min w temperaturze 4 °C.
   nuta: Każde przeciwciało cytometrii przepływowej jest unikalne i jest bardzo przydatne i zalecane w celu określenia optymalnej ilości potrzebnego przeciwciała poprzez wykonanie krzywej miareczkowania dawki dla każdego specyficznego przeciwciała.
5. Przemyć komórki dwukrotnie 1 ml buforu MACS i ponownie zawiesić splenocyty w odpowiedniej ilości buforu MACS do analizy cytometrii przepływowej.

Wyniki

Rysunek 1 przedstawia schemat opisanych powyżej kroków. Izolowane mysie śledziony są sortowane pod kątem CD11c⁺ DC przez magnetyczne sortowanie komórek i siane w normalnych pożywkach solnych (NS; 150 mmol NaCl) lub pożywkach o wysokiej zawartości soli (HS; 190 mmol NaCl) przez 48 godzin. CD11c ⁺ DC są następnie adoptywnie przenoszone przez wstrzyknięcie retroorbitalne do naiwnych myszy biorców. Dziesięć dni później myszom wszczepia się m...

Dyskusja

W obecnym protokole zoptymalizowaliśmy procedury izolowania DC CD11c ⁺ ze śledziony myszy i adoptywnego przenoszenia ich do naiwnych zwierząt w celu zbadania roli DC w nadciśnieniu wywołanym solą. Protokół ten można dostosować do izolowania i adoptywnego przenoszenia innych podzbiorów komórek odpornościowych, w tym makrofagów, monocytów i adaptacyjnych komórek odpornościowych, w tym limfocytów T i B. Zoptymalizowaliśmy proces trawienia śledziony, aby osiągnąć odpowiednią przeżywalność komórek i stabilność mark...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
APC/Cy7 Anti-Mouse CD11c	Biolegend	117324
bufor uruchomiony autoMACS	Miltenyi Biotec	130-091-221
CD11c Mikrokulki Ultrapure	Miltenyi Biotec	130-108-338
Kolagenaza D	Roche	11088866001
DNase I	Roche	10104159001
DPBS bez wapnia i magnezu	Corning	21-031-CV
Odczynnik blokujący FcR	Miltenyi Biotec	130-092-575
FITC anty-mysz CD45	Biolegend	103108
GentleMACS C rurka	Miltenyi Biotec	130-096-334
Dysocjator GentleMACS	Miltenyi Biotec	130-093-235	Protokół użytkowania: Śledziona 04.01
LIVE/DEAD zestaw do naprawy fioletowych barwników martwych komórek	Invitrogen	L34964
LS Kolumny	Miltenyi Biotec	130-042-401
Separator QuadroMAC	Miltenyi Biotec	130-090-976
RPMI 1640 średni	Gibco	11835-030