Budowa i zastosowanie komory do stymulacji elektrycznej w celu zwiększenia różnicowania osteogennego w mezenchymalnych komórkach macierzystych/zrębowych in vitro

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół budowy komory do hodowli komórek, przeznaczonej do wystawiania komórek na różne rodzaje stymulacji elektrycznej, oraz jej zastosowanie w leczeniu mezenchymalnych komórek macierzystych w celu zwiększenia różnicowania osteogennego.

Streszczenie

Mezenchymalne komórki macierzyste/zrębowe (MSC) były szeroko stosowane w celu wspomagania gojenia kości w metodach inżynierii tkankowej. Wykazano, że stymulacja elektryczna (EStim) zwiększa różnicowanie osteogenne MSC in vitro i wspomaga gojenie kości w warunkach klinicznych. W tym artykule opisano budowę komory do hodowli komórek EStim i jej zastosowanie w leczeniu MSC pochodzącego ze szpiku kostnego szczurów w celu zwiększenia różnicowania osteogennego. Stwierdziliśmy, że leczenie MSCs EStim przez 7 dni powoduje znaczny wzrost różnicowania osteogennego i, co ważne, ten efekt proosteogenny utrzymuje się długo po (7 dniach) odstawieniu EStim. To podejście polegające na wstępnym traktowaniu MSCs za pomocą EStim w celu zwiększenia różnicowania osteogennego może być wykorzystane do optymalizacji wyników leczenia z zakresu inżynierii tkanki kostnej, a tym samym pomóc im w osiągnięciu pełnego potencjału terapeutycznego. Oprócz tej aplikacji, ta komora i protokół hodowli komórek EStim mogą być również używane do badania innych zachowań komórek wrażliwych na EStim, takich jak migracja, proliferacja, apoptoza i mocowanie rusztowania.

Wprowadzenie

Wzrost urazów i/lub wad kostnych wywołanych chorobą jest leczony za pomocą różnych kombinacji terapii komórkowej i technologii medycyny regeneracyjnej. MSCs są komórkami z wyboru w takich zabiegach, ze względu na ich stosunkowo wysoką aktywność osteogenną, skuteczność izolacji i ekspansji oraz bezpieczeństwo¹. Aby zmaksymalizować ich aktywność osteogenną, a tym samym zoptymalizować ich skuteczność terapeutyczną, wprowadzono kilka metod manipulowania MSCs przed ich zastosowaniem w tych terapiach (zgodnie z recenzją Mauney et al.²). Jedną z takich metod jest EStim, która, jak wykazano, zwiększa różnicowanie osteogenne MSC in vitro³ i wspomaga gojenie kości in vivo⁴. Pomimo rosnącej liczby badań koncentrujących się na leczeniu MSCs za pomocą EStim, optymalny schemat maksymalizacji proosteogennego efektu EStim nie został jeszcze zdefiniowany.

Inne metody in vitro wykorzystujące EStim wykorzystują mostki solne zanurzone w pożywce hodowlanej, która oddziela komórki od metalowych elektrod⁵. Zaletą tego rozwiązania jest to, że dostarczanie EStim przez mostki solne eliminuje wprowadzanie chemicznych produktów ubocznych (np. korozji elektrod metalowych), które mogą być cytotoksyczne. Pomimo tej zalety, mostki solne są kłopotliwe w obsłudze, a dostarczany przez nie EStim różni się od tego dostarczanego w modelach in vivo, co utrudnia skorelowanie wyników uzyskanych przy użyciu tych dwóch systemów. Konfiguracje, które dostarczają EStim za pośrednictwem metalowych lub węglowych elektrod zamocowanych w studzienkach hodowli komórkowych (jak recenzowali Hronik-Tupaj i Kaplan⁶) lepiej symulują urządzenia używane in vivo; Jednak urządzenia te są trudne do czyszczenia/sterylizacji między użyciami, a liczba komórek, które można badać w jednym eksperymencie, jest ograniczona. Zaprojektowaliśmy prezentowaną tutaj komorę EStim specjalnie po to, aby rozwiązać problemy z ograniczeniami tych innych konfiguracji. Podczas gdy większość naszego doświadczenia z korzystaniem z tej komory EStim dotyczyła hodowli 2D i 3D zawierających MSCs pochodzące ze szpiku kostnego i tkanki tłuszczowej^3,4, główną zaletą tej komory jest to, że jest wszechstronna i przy stosunkowo niewielkich zmianach może być dostosowana do badania innych typów komórek w różnych warunkach.

Tutaj opisujemy budowę komory do hodowli komórek EStim; następnie demonstrujemy jej zastosowanie, traktując MSCs różnymi schematami EStim i mierząc wynikający z tego wpływ na różnicowanie osteogenne. Różnicowanie osteogenne MSC ocenia się na podstawie odkładania się wapnia, aktywności fosfatazy alkalicznej i ekspresji genów markerów osteogennych. Co ważne, w poprzednich eksperymentach, w których stosowano tę konfigurację, zaobserwowaliśmy, że te pro-osteogenne efekty utrzymują się długo po przerwaniu leczenia EStim.

Protokół

1. Konstrukcja komory do hodowli komórkowej z elektrostymulacją

1. Aby zbudować komorę do EStim, należy zebrać dwie pokrywki standardowych płytek hodowlanych 6-dołkowych; drut platynowy o czystości 99,99%, o długości 60 cm i średnicy 0,5–1 mm; miedź powlekaną srebrem, o długości 70 cm i średnicy 0,6 mm; szczypce tnące; zestaw z lutownicą; jedną tubkę kleju nadprzewodzącego; jedną kostkę zaciskową do przewodów, sześć małych diod LED 2,2 V (opcjonalnie); jedną tubkę niekorozyjnego silikonowego spoiwa (opcjonalnie); jedną rolkę czarnej izolacyjnej taśmy elektrycznej; standardowy, elastyczny, izolowany miedziany przewód elektryczny (0,14 mm²), o długości 2 m (Tabela materiałów).
2. W pokrywce płytki 6-dołkowej wyznaczyć i wywiercić dwa otwory (o średnicy ~1 mm), w odstępie 25 mm, blisko krawędzi zewnętrznej każdego z sześciu dołków (łącznie 12 otworów), jak pokazano na Rysunku 1A,B.
3. Za pomocą szczypiec tnących odciąć dwanaście odcinków drutu platynowego o długości 5 cm. Każdy z drutów zgiąć ręcznie w kształt litery L, tak aby jeden koniec miał 3 cm, a drugi 2 cm. Odciąć drut powlekany srebrem na dwa odcinki po 35 cm.
4. W każdy wywiercony otwór włożyć dłuższy (3 cm) zgięty koniec drutu platynowego (od wewnątrz na zewnątrz), pozostawiając 1–2 mm wystające na zewnątrz pokrywki, a następnie zgiąć go pęsetą. Przymocować druty platynowe w otworach pokrywki za pomocą kleju nadprzewodzącego i pozostawić do wyschnięcia na około 6 h.
5. Przylutować końcówki wszystkich sześciu drutów platynowych (które później będą służyć jako katody, patrz Rysunek 1A) wystające z pokrywek do jednego z przewodów powlekanych srebrem. Powtórzyć tę procedurę, przylutowując pozostałe sześć drutów platynowych (które będą służyć jako anody) do drugiego przewodu powlekanego srebrem.
   1. W obwodzie pomiędzy każdą z sześciu par elektrod platynowych anoda-katoda można dodać diody LED, aby potwierdzić funkcjonalność podczas eksperymentów (opcjonalnie). Pod każdą diodą LED umieścić kawałek czarnej taśmy izolacyjnej, aby zapobiec wystawieniu komórek w płytkach hodowlanych na światło LED (Rysunek 1C).
6. Przykleić kostkę zaciskową do lewego górnego rogu pokrywki płytki 6-dołkowej i podłączyć oba przewody powlekane srebrem do terminali wejściowych, jak pokazano na Rysunku 1C.
7. Wyciąć fragment o wymiarach 20 mm x 20 mm z lewego górnego rogu drugiej pokrywki płytki 6-dołkowej (Rysunek 1B, Pokrywka Nr 2), aby zrobić miejsce dla kostki zaciskowej na pierwszej pokrywce. Przykryć pierwszą pokrywkę, wyposażoną w elektrody, drugą pokrywką i skleić je taśmą klejącą.
   1. Aby poprawić wiązanie obu pokrywek, można użyć silikonowego spoiwa (opcjonalnie). W tym celu pokryć pokrywkę z elektrodami srebrowymi warstwą spoiwa silikonowego o grubości 3–5 mm i przykryć ją drugą pokrywką, pozostawiając spoiwo do wyschnięcia przez 12 h.
8. Podłączyć jeden koniec dwóch standardowych izolowanych przewodów miedzianych do terminali wyjściowych złączki przewodów, a drugie końce do wtyków typu banan (4 mm).
   UWAGA: Długość tych przewodów zależy od odległości między półką w inkubatorze, na której będą przechowywane komórki, a zasilaczem znajdującym się poza inkubatorem (Rysunek 1D).
9. Dozę (napięcie) i schemat podawania EStim do komórek dostosować poprzez regulację zasilacza DC.
   1. Włączyć zasilacz, naciskając przycisk ON/OFF na przednim panelu. Aktywować kanał 1, naciskając przycisk 1.
   2. Nacisnąć przycisk Nr 4 (V-set), aby ustawić napięcie. Nacisnąć przyciski 2, . i 5, aby ustawić wyjście obciążenia na 2,5 V. Nacisnąć Enter.
   3. Upewnić się, że wyjście obciążenia 2,5 V (2 500 mV) odpowiada EStim wynoszącemu 100 mV/mm, zgodnie z następującym uproszczonym równaniem:
      V_EStim = ; lub
      V = V_EStim × d
      Gdzie V = napięcie wyjściowe zasilacza w miliwoltach; d = odległość między elektrodami w milimetrach; V_EStim = napięcie stymulacji w miliwoltach na milimetr.
      UWAGA: To uproszczenie ma zastosowanie tylko w przypadku stałego napięcia DC. Opór między medium a komórkami jest pomijalny, ponieważ elektrody nie mają bezpośredniego kontaktu z komórkami; zamiast tego EStim jest dostarczany do komórek poprzez medium.

2. Hodowla mezenchymalnych komórek macierzystych w medium osteogennym

1. Należy zakupić i przechowywać dostępne komercyjnie MSC szczura (patrz Tabela Materiałów) w ciekłym azocie do dnia przeprowadzenia eksperymentu. Alternatywnie można wyizolować MSC z innych zwierząt zgodnie z protokołami opublikowanymi w innych źródłach^7,8, zgodnie z lokalnymi regulacjami instytucjonalnymi dotyczącymi wykorzystania zwierząt doświadczalnych.
2. W dniu eksperymentu należy wyjąć z przechowywania w ciekłym azocie jedną fiolkę (1 x 10⁶ komórek) MSC i szybko (w ciągu 1 min) rozmrozić komórki w łaźni wodnej podgrzanej do 37 °C.
   1. W warunkach sterylnych w komorze z laminarnym przepływem powietrza należy przenieść zawartość fiolki do probówki typu Falcon 50 mL i dodać 9 mL podgrzanego do 37 °C pożywki podstawowej (NM), składającej się z modyfikowanej pożywki Eagle'a Dulbecco (DMEM; 1x) z 10% inaktywowanym ciepłem płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% roztworem penicyliny/streptomycyny. Komórki należy osadzić przez 5 min w wirówce przy 300 x g.
   2. W komorze z laminarnym przepływem powietrza należy usunąć nadsącz i ostrożnie resuspendować osad komórkowy w 12 mL podgrzanej do 37 °C pożywki NM. Resuspendowane komórki należy przenieść do butelki hodowlanej T-75.
3. Komórki należy hodować w temperaturze 37 °C, przy 5% CO₂ i 5% O₂ do momentu osiągnięcia konfluencji 80%–90% (po około 3–5 dniach).
4. Należy przeprowadzić pasażowanie komórek.
   UWAGA: Wszystkie operacje, z wyjątkiem wirowania i inkubacji, należy wykonywać w warunkach sterylnych w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
   1. Po osiągnięciu konfluencji 80%–90% należy odzyskać komórki za pomocą roztworu do odrywania komórek. Należy odessać pożywkę hodowlaną, przemyć 2x 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS), dodać 5 mL 1x roztworu do odrywania komórek i zwrócić komórki do inkubatora na 5 min.
   2. Po ododerwaniu komórek należy dodać taką samą ilość pożywki hodowlanej, aby zneutralizować roztwór do odrywania. Komórki należy zebrać do probówki typu Falcon 50 mL i wirować przy 300 x g przez 5 min.
   3. Należy usunąć pożywkę i resuspendować komórki w 1 mL świeżej pożywki podstawowej. Liczbę żywych komórek należy ocenić za pomocą barwienia błękitem trypanu.
   4. Należy zasiać 1 x 10⁶ komórek w nowej butelce T-75 z 12 mL podgrzanej pożywki NM. Komórki należy hodować w temperaturze 37 °C, przy 5% CO₂ i 5% O₂ do momentu osiągnięcia konfluencji 80%–90%.
      UWAGA: Pasażowanie komórek (kroki 2.4.1–2.4.4) można powtórzyć kilka razy, aż do uzyskania wymaganej liczby komórek. Nie należy używać komórek powyżej 8 pasażu.
5. Należy zasiać 9 x 10⁴ komórek w 3 mL NM (10% inaktywowana ciepłem płodowa surowica bydlęca, 1% penicylina/streptomycyna, DMEM) w każdym dołku 6-dołkowej płytki hodowlanej. Komórki należy inkubować przez 1 dzień w temperaturze 37 °C, przy 5% CO₂ i 5% O₂.
6. Następnego dnia należy odessać pożywkę hodowlaną i nanieść 3 mL pożywki do różnicowania osteogenicznego (OM; pożywka podstawowa uzupełniona o 10^-7 M dekzametazon, 10 mM β-glicerynofosforan i 0,05 mM askorbinian-2-fosforan).
7. Płytkę 6-dołkową z komórkami należy umieścić w inkubatorze i inkubować w temperaturze 37 °C, przy 5% CO₂ i 5% O₂ przez noc.

3. Poddawanie MSC stymulacji elektrycznej (EStim)

1. W dniu poddania komórek stymulacji elektrycznej (EStim), należy wysterylizować elektrody w 70% roztworze etanolu przez 30 min, a następnie suszyć je pod światłem UV w komorze bezpieczeństwa przez kolejne 30 min.
2. W komorze z laminarnym przepływem powietrza należy przykryć płytkę 6-dołkową z hodowanymi MSC pokrywką wyposażoną w elektrody, upewniając się, że elektrody są całkowicie zanurzone w medium (w razie potrzeby należy dodać medium). Przenieść przykrytą płytkę 6-dołkową (komorę EStim) z komórkami do inkubatora i podłączyć przewody do zasilacza.
3. Ustawić zasilacz na wyjściowe napięcie obciążenia 2,5 V i poddać komórki stymulacji EStim przez 1 h^3,9.
4. Po stymulacji należy odłączyć zasilacz i wyjąć komorę EStim z inkubatora. W warunkach sterylnych zamienić pokrywkę z elektrodami na standardową pokrywkę do płytki 6-dołkowej.
5. Przenieść komórki z powrotem do inkubatora i pozostawić je na noc. Oczyścić elektrody, najpierw za pomocą PBS, a następnie w 70% roztworze etanolu. Nagromadzone produkty korozji z powierzchni elektrod usunąć za pomocą drobnoziarnistego papieru ściernego.
6. Powtarzać kroki 3.1–3.5 przez 6 kolejnych dni. W 4. dniu, przed zastosowaniem EStim i w warunkach sterylnych, należy wymienić medium hodowlane, odsysając 1,5 mL medium i zastępując je 1,5 mL uprzednio ogrzanego świeżego OM.
7. Po zastosowaniu EStim przez 7 kolejnych dni, utrzymywać komórki w hodowli przez dodatkowe 7 dni, wymieniając medium co 3–4 dni.

4. Pomiary różnicowania osteogenicznego

1. Przeanalizuj zmiany morfologii komórek pod mikroskopem.
2. Aby ocenić wpływ EStim na różnicowanie osteogenne MSC, zmierzyć poziom odkładania wapnia, aktywność fosfatazy alkalicznej oraz ekspresję genów markerów osteogennych, zgodnie z opisem w innych opracowaniach^3,9.

Wyniki

Aby ocenić wpływ stymulacji elektrycznej (EStim) o natężeniu 100 mV/mm na różnicowanie osteogenne MSC, komórki poddane EStim przez 3, 7 i 14 dni lub niepoddane stymulacji (grupa kontrolna) przeanalizowano w 14. dniu hodowli, oceniając zmiany morfologiczne oraz odkładanie wapnia (Rycina 2). Przeprowadzono to poprzez obrazowanie komórek z wykorzystaniem mikroskopii w polu jasnym (zmiany morfologiczne) lub poprzez utrwalenie komórek w 4% roztworze paraformaldehy...

Dyskusja

W tym artykule opisano budowę komory oraz metodę leczenia mezenchymalnych komórek macierzystych EStim, która skutkuje zwiększonym różnicowaniem osteogennym.

Przedstawiona konfiguracja EStim nie wymaga specjalnego sprzętu/wiedzy i może być wykonywana w standardowym laboratorium biologii/biochemii komórek macierzystych przez młodszych badaczy. Jednak podczas budowy i użytkowania studzienki EStim należy zachować szczególną ostrożność w kilku krytycznych krokach. Podczas obchodzenia się z elektrod...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Estim fabrication
Banana connector/Jack	adapter Poppstars	1008554	2 sztuki
Szczypce tnące	Knipex	78 03 125
Zasilacz DC (0-30V/0-3A)	B& K Precision	Model 9130B	Można użyć dowolnego modelu podobnego
Izolowane przewody elastyczne (0,14 mm2)	Conrad Electronic International	604794, 604093	2 sztuki
Niekorozyjna guma silikonowa	Dow Corning	3140 RTV	*można kupić w wielu sklepach
Drut platynowy (999,5/1000; 1mm ø)	Junker Edelmetalle	00D-3010	0,6 m potrzebne do 1 komory Estim
70% roztwór etanolu	dowolny		Sterylizacja komory Estim
Drut miedziany pokryty srebrem (0,6 mm ø)	Conrad Electronic International	409334 - 62	≈ 70 cm potrzebne na 1 urządzenie Estim
Zestaw lutowniczy	Conrad Electronic International	1611410 - 62	Można użyć dowolnego modelu podobnego
Pokrywka płytki TPP 6-dołkowa	Sigma-Aldrich	Z707759-126EA	2 pokrywki do komory Estim
2,2V przewodowe okrągłe diody LED	Conrad Electronic International	599525 - 62	6 sztuk
UHU Super klej	UHU GmbH & Co. KG	n/a	*można kupić w wielu sklepach
Kultura MSC
β-Glicerofosforan sól disodowa hydrat	Sigma-Aldrich	G9422	osteogenna hodowla
komórkowa DMEM, niska glukoza, suplement GlutaMAX, pirogronian	Thermo-Fischer Scientific	21885025	hodowla
komórkowa DPBS, bez wapnia, bez magnezu	Thermo-Fischer Hodowla	komórek	14190144
Deksametazon	Sigma-Aldrich	D4902	hodowla komórek osteogennych
Surowica bydlęca płodu	Thermo-Fischer Naukowa	hodowla komórkowa	10500064
50 ml Probówka Falcon	Sarstedt	62,547,004	hodowla komórkowa
Kwas L-askorbinowy	Sigma-Aldrich	A4544	osteogenna hodowla komórek
Penicylina/Streptomycyna	Thermo-Fischer Scientific	15140122	hodowla komórkowa
Mezenchymalne komórki macierzyste szczura Sprague-Dawley (SD), pochodzenie szpiku kostnego	Cyagen	RASMX-01001
Roztwór do odwarstwiania komórek	Termo-Fischer Scientific	A1110501	hodowla komórkowa, odwarstwienie komórek
TC Flask, T75	Sarstedt	833911302	hodowla komórkowa
Płytki 6-dołkowe TPP	Sigma-Aldrich	Z707759-126EA	Hodowla komórkowa
Trypan Blue Dye, 0,4% roztwór	Bio-Rad	1450021	liczba komórek

naukowych