Budowa i zastosowanie komory do stymulacji elektrycznej w celu zwiększenia różnicowania osteogennego w mezenchymalnych komórkach macierzystych/zrębowych in vitro

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół budowy komory do hodowli komórek, przeznaczonej do wystawiania komórek na różne rodzaje stymulacji elektrycznej, oraz jej zastosowanie w leczeniu mezenchymalnych komórek macierzystych w celu zwiększenia różnicowania osteogennego.

Streszczenie

Mezenchymalne komórki macierzyste/zrębowe (MSC) były szeroko stosowane w celu wspomagania gojenia kości w metodach inżynierii tkankowej. Wykazano, że stymulacja elektryczna (EStim) zwiększa różnicowanie osteogenne MSC in vitro i wspomaga gojenie kości w warunkach klinicznych. W tym artykule opisano budowę komory do hodowli komórek EStim i jej zastosowanie w leczeniu MSC pochodzącego ze szpiku kostnego szczurów w celu zwiększenia różnicowania osteogennego. Stwierdziliśmy, że leczenie MSCs EStim przez 7 dni powoduje znaczny wzrost różnicowania osteogennego i, co ważne, ten efekt proosteogenny utrzymuje się długo po (7 dniach) odstawieniu EStim. To podejście polegające na wstępnym traktowaniu MSCs za pomocą EStim w celu zwiększenia różnicowania osteogennego może być wykorzystane do optymalizacji wyników leczenia z zakresu inżynierii tkanki kostnej, a tym samym pomóc im w osiągnięciu pełnego potencjału terapeutycznego. Oprócz tej aplikacji, ta komora i protokół hodowli komórek EStim mogą być również używane do badania innych zachowań komórek wrażliwych na EStim, takich jak migracja, proliferacja, apoptoza i mocowanie rusztowania.

Wprowadzenie

Wzrost urazów i/lub wad kostnych wywołanych chorobą jest leczony za pomocą różnych kombinacji terapii komórkowej i technologii medycyny regeneracyjnej. MSCs są komórkami z wyboru w takich zabiegach, ze względu na ich stosunkowo wysoką aktywność osteogenną, skuteczność izolacji i ekspansji oraz bezpieczeństwo¹. Aby zmaksymalizować ich aktywność osteogenną, a tym samym zoptymalizować ich skuteczność terapeutyczną, wprowadzono kilka metod manipulowania MSCs przed ich zastosowaniem w tych terapiach (zgodnie z recenzją Mauney et al.²). Jedną z takich metod jest EStim, która, jak wykazano, zwiększa różnicowanie osteogenne MSC in vitro³ i wspomaga gojenie kości in vivo⁴. Pomimo rosnącej liczby badań koncentrujących się na leczeniu MSCs za pomocą EStim, optymalny schemat maksymalizacji proosteogennego efektu EStim nie został jeszcze zdefiniowany.

Inne metody in vitro wykorzystujące EStim wykorzystują mostki solne zanurzone w pożywce hodowlanej, która oddziela komórki od metalowych elektrod⁵. Zaletą tego rozwiązania jest to, że dostarczanie EStim przez mostki solne eliminuje wprowadzanie chemicznych produktów ubocznych (np. korozji elektrod metalowych), które mogą być cytotoksyczne. Pomimo tej zalety, mostki solne są kłopotliwe w obsłudze, a dostarczany przez nie EStim różni się od tego dostarczanego w modelach in vivo, co utrudnia skorelowanie wyników uzyskanych przy użyciu tych dwóch systemów. Konfiguracje, które dostarczają EStim za pośrednictwem metalowych lub węglowych elektrod zamocowanych w studzienkach hodowli komórkowych (jak recenzowali Hronik-Tupaj i Kaplan⁶) lepiej symulują urządzenia używane in vivo; Jednak urządzenia te są trudne do czyszczenia/sterylizacji między użyciami, a liczba komórek, które można badać w jednym eksperymencie, jest ograniczona. Zaprojektowaliśmy prezentowaną tutaj komorę EStim specjalnie po to, aby rozwiązać problemy z ograniczeniami tych innych konfiguracji. Podczas gdy większość naszego doświadczenia z korzystaniem z tej komory EStim dotyczyła hodowli 2D i 3D zawierających MSCs pochodzące ze szpiku kostnego i tkanki tłuszczowej^3,4, główną zaletą tej komory jest to, że jest wszechstronna i przy stosunkowo niewielkich zmianach może być dostosowana do badania innych typów komórek w różnych warunkach.

Tutaj opisujemy budowę komory do hodowli komórek EStim; następnie demonstrujemy jej zastosowanie, traktując MSCs różnymi schematami EStim i mierząc wynikający z tego wpływ na różnicowanie osteogenne. Różnicowanie osteogenne MSC ocenia się na podstawie odkładania się wapnia, aktywności fosfatazy alkalicznej i ekspresji genów markerów osteogennych. Co ważne, w poprzednich eksperymentach, w których stosowano tę konfigurację, zaobserwowaliśmy, że te pro-osteogenne efekty utrzymują się długo po przerwaniu leczenia EStim.

Protokół

1. Budowa komory do hodowli komórek do stymulacji elektrycznej

1. Aby zbudować komorę EStim należy zebrać dwie pokrywki standardowych 6-dołkowych płytek do hodowli komórkowych; drut 99,99% platynowy o długości 60 cm i średnicy 0,5–1 mm; drut miedziany pokryty srebrem o długości 70 cm i średnicy 0,6 mm; szczypce do cięcia; zestaw lutownicy; jedna tubka kleju nadprzewodzącego; jednożyłowe złącze listwy zaciskowej, sześć małych diod LED 2,2 V (opcjonalnie); jedna tubka niekorozyjnej silikonowej powłoki klejącej (opcjonalnie); jedna rolka czarnej taśmy elektroizolacyjnej; standardowy, elastyczny, izolowany miedziany przewód elektryczny (0,14^mm2), o długości 2 m (Tabela materiałów).
2. W pokrywie płytki 6-dołkowej oznaczyć, a następnie wywiercić dwa otwory (o średnicy ~1 mm) w odległości 25 mm od siebie, w pobliżu zewnętrznej krawędzi każdego z sześciu dołków (w sumie 12 otworów), jak pokazano na rysunku 1A,B.
3. Wytnij dwanaście 5-centymetrowych odcinków drutu platynowego za pomocą szczypiec tnących. Zegnij każdy z drutów ręcznie w kształt litery L, pozostawiając jeden koniec o długości 3 cm, a drugi o długości 2 cm. Pokrój drut pokryty srebrem na dwie długości 35 cm.
4. Włóż dłuższy (3 cm) zagięty koniec jednego drutu platynowego (od wewnątrz na zewnątrz) do każdego wywierconego otworu, pozostawiając 1–2 mm wystające z zewnętrznej strony pokrywy, zegnij go za pomocą kleszczy. Zabezpiecz platynowe druty w otworach pokrywy klejem nadprzewodzącym i pozostaw do wyschnięcia na około 6 godzin.
5. końcówki wszystkich sześciu platynowych drutów (które później posłużą jako katody, patrz Rysunek 1A) wystających z pokryw do jednego z drutów pokrytych srebrem. Powtórz tę samą procedurę, pozostałe sześć drutów platynowych (które później posłużą jako anody) do drugiego drutu pokrytego srebrem.
   1. Dodaj diody LED w obwodzie między każdą z sześciu par platynowych elektrod anoda-katoda, aby potwierdzić funkcjonalność podczas eksperymentów (opcjonalnie). Umieść kawałek czarnej taśmy izolacyjnej pod każdą diodą LED, aby zapobiec wystawieniu komórek na płytkach hodowlanych na działanie światła LED ( Rysunek 1C).
6. Przyklej złącze listwy zaciskowej przewodu do lewego górnego rogu pokrywy płytki 6-dołkowej i podłącz oba posrebrzane przewody do zacisków wejściowych, jak pokazano na Rysunek 1C.
7. Wytnij przekrój o wymiarach 20 mm x 20 mm z lewego górnego rogu drugiej pokrywy płytki 6-dołkowej (Rysunek 1B, pokrywa nr 2), aby umieścić złącze listwy zaciskowej na pierwszej pokrywie. Przykryj pierwszą pokrywę, wyposażoną w elektrody, drugą pokrywą i sklej je taśmą klejącą.
   1. Aby poprawić wiązanie dwóch pokrywek, użyj silikonowej powłoki klejącej (opcjonalnie). W tym celu przykryj wieczko srebrnymi elektrodami warstwą kleju silikonowego o grubości 3–5 mm i przykryj drugą pokrywką, pozostawiając 12 godzin do wyschnięcia kleju.
8. Podłącz jeden koniec dwóch standardowych izolowanych przewodów miedzianych do zacisków wyjściowych złącza przewodu, a drugi koniec do męskich złączy bananowych (4 mm).
   UWAGA: Długość tych przewodów zależy od odległości od półki w inkubatorze, gdzie będą przechowywane komórki, do zasilacza, na zewnątrz inkubatora (Rysunek 1D).
9. Dostosuj dawkę (napięcie) i schemat EStim dostarczanego do ogniw, regulując zasilanie prądem stałym.
   1. Włącz zasilanie, naciskając przycisk ON/OFF na panelu przednim. Aktywuj kanał 1, naciskając przycisk 1.
   2. Naciśnij przycisk Nr. 4 (V-set), aby ustawić napięcie. Naciśnij przyciski 2, . i 5, aby ustawić wyjście obciążenia na 2.5 V. Naciśnij Enter.
   3. Upewnij się, że wyjście obciążenia 2,5 V (2,500 mV) odpowiada EStim 100 mV/mm, zgodnie z poniższym, uproszczonym równaniem.
      V_EStim = ; or
      V = V_EStim × d
      Tutaj V = napięcie wyjściowe zasilacza w miliwoltach; d = odległość między elektrodami w milimetrach; V_EStim = napięcie stymulacji w miliwoltach na milimetr.
      UWAGA: To uproszczenie dotyczy tylko w przypadku stałego napięcia DC. Rezystancja między medium a ogniwami jest znikoma, ponieważ elektrody nie mają bezpośredniego kontaktu z ogniwami; zamiast tego EStim jest dostarczany do komórek za pośrednictwem pożywki.

2. Hodowla mezenchymalnych komórek macierzystych w pożywce osteogennej

1. Zakup i przechowywanie dostępnych w handlu MSCs szczurów (patrz Tabela Materiałów) w ciekłym azocie do dnia eksperymentu. Alternatywnie, należy odizolować MSC od innych zwierząt zgodnie z protokołami opublikowanymi gdzie indziej^7,8 zgodnie z lokalnymi przepisami instytucjonalnymi dotyczącymi wykorzystywania zwierząt doświadczalnych.
2. W dniu eksperymentu należy wyjąć jedną fiolkę (1 x 10⁶ komórek) MSCs z magazynu ciekłego azotu i szybko (w ciągu 1 minuty) rozmrozić komórki w łaźni wodnej podgrzanej do 37 °C.
   1. W sterylnych warunkach, w kapturze z przepływem laminarnym, odpipetować zawartość fiolki do probówki sokoła o pojemności 50 ml i dodać 9 ml normalnej pożywki (NM) podgrzanej do temperatury 37 °C, składającej się ze zmodyfikowanej pożywki Eagle's (DMEM; 1x) firmy Dulbecco z 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% roztworem penicyliny/streptomycyny. Granulować komórki przez 5 minut, odwirowując przy 300 x g.
   2. W okapie z przepływem laminarnym usunąć supernatant i ostrożnie ponownie zawiesić osad komórkowy w 12 ml NM podgrzanym do temperatury 37 °C. Przenieść zawieszone komórki do kolby do hodowli komórek T-75.
3. Hodować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO₂, 5% O_{2 ,} aż osiągną zbieżność 80%–90% (po około 3–5 dniach).
4. Przejście komórek.
   UWAGA: Wszystkie operacje z wyjątkiem wirowania i inkubacji należy wykonywać w sterylnych warunkach w okapie z przepływem laminarnym.
   1. Po osiągnięciu zbieżności 80%–90% odzyskaj komórki za pomocą roztworu do odłączania komórek. Odessać pożywkę do hodowli komórkowych, przemyć 2x solą fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS), dodać 5 ml 1x roztworu do odrywania komórek i zwrócić komórki do inkubatora na 5 minut.
   2. Po odłączeniu komórek dodaj równą ilość pożywki hodowlanej, aby dezaktywować roztwór odłączający. Zbierz komórki do probówki sokoła o pojemności 50 ml i wiruj je w masie 300 x g przez 5 minut.
   3. Wyrzucić pożywkę i ponownie zawiesić komórki w 1 ml świeżej normalnej pożywki. Oceń liczbę żywotnych komórek za pomocą barwienia błękitem trypanowym.
   4. Wysiewaj 1 x 10⁶ komórek w nowej kolbie T-75 z 12 ml wstępnie podgrzanego NM. Hodować komórki w temperaturze 37 °C, 5 % CO₂, 5 % O_{2 aż} do osiągnięcia 80–90% konfluencji.
      UWAGA: Pasaż komórek (kroki 2.4.1–2.4.4) można powtórzyć kilka razy, aż do uzyskania wymaganej liczby komórek. Nie używaj komórek starszych niż przejście 8.
5. Wysiewaj 9 x 10⁴ komórek w 3 ml NM (10% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej, 1% penicyliny/streptomycyny, DMEM) w każdym dołku 6-dołkowej płytki hodowlanej. Inkubować komórki przez 1 dzień w temperaturze 37 °C, 5 % CO₂, 5 % O_{2 .}
6. Następnego dnia odessać pożywkę hodowlaną i zastosować 3 ml pożywki do różnicowania osteogennego (OM; normalna pożywka uzupełniona ^10-7 M deksametazonem, 10 mM β-glicerofosforanu i 0,05 mM kwasu askorbinowego-2-fosforanu).
7. Umieścić 6-dołkową płytkę z komórkami w inkubatorze i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ i 5% O₂ przez noc.

3. Leczenie MSCs za pomocą EStim

1. W dniu, w którym ogniwa są poddawane działaniu EStim, sterylizuj elektrody w 70% roztworze etanolu przez 30 minut, a następnie susz je w świetle UV w komorze bezpieczeństwa przez dodatkowe 30 minut.
2. W okapie z przepływem laminarnym przykryj 6-dołkową płytkę zawierającą hodowane MSCs pokrywką wyposażoną w elektrody, upewniając się, że elektrody są całkowicie zanurzone w pożywce (jeśli to konieczne, dodaj pożywkę). Przenieś zakrytą płytkę 6-dołkową (komora EStim) wraz z komórkami do inkubatora i podłącz jej przewody do zasilania.
3. Ustaw zasilanie na wyjście obciążenia 2,5 V i traktuj ogniwa EStim przez 1 h^3,9.
4. Po stymulacji należy odłączyć zasilanie i wyjąć komorę EStim z inkubatora. W sterylnych warunkach wymień pokrywkę wyposażoną w elektrody na standardową pokrywkę z 6-dołkową pokrywką.
5. Włóż komórki z powrotem do inkubatora i pozostaw je na noc. Oczyść elektrody, najpierw PBS, a następnie 70% roztworem etanolu. Oczyść nagromadzone produkty korozji z powierzchni elektrody drobnym papierem ściernym.
6. Powtarzaj kroki 3.1–3.5 przez 6 kolejnych dni. W 4 dniu, przed zastosowaniem EStim i w sterylnych warunkach, zmień pożywkę, odsysając 1,5 ml pożywki i zastępując ją 1,5 ml wstępnie podgrzanego świeżego OM.
7. Po zastosowaniu EStim przez 7 kolejnych dni utrzymuj komórki w hodowli przez dodatkowe 7 dni, wymieniając pożywkę co 3-4 dni.

4. Pomiary różnicowania osteogennego

1. Analizuj zmiany morfologii komórek pod mikroskopem.
2. Aby ocenić wpływ EStim na różnicowanie osteogenne MSC, zmierz odkładanie wapnia, aktywność fosfatazy alkalicznej i ekspresję genów markerów osteogennych, jak opisano w innym miejscu^3,9.

Wyniki

Aby ocenić wpływ 100 mV/mm EStim na osteogenne różnicowanie MSC, komórki leczone EStim przez 3, 7 i 14 dni lub nieleczone (kontrola) zostały przeanalizowane w 14 dniu hodowli, oceniając zmiany morfologiczne i odkładanie wapnia (Rysunek 2). Dokonano tego poprzez obrazowanie komórek za pomocą mikroskopii jasnego pola (zmiany morfologii) lub poprzez utrwalenie komórek w 4% roztworze paraformaldehydu, barwienie ich 0,02% roztworem czerwieni alizarynowej, a następnie obrazo...

Dyskusja

W tym artykule opisano budowę komory oraz metodę leczenia mezenchymalnych komórek macierzystych EStim, która skutkuje zwiększonym różnicowaniem osteogennym.

Przedstawiona konfiguracja EStim nie wymaga specjalnego sprzętu/wiedzy i może być wykonywana w standardowym laboratorium biologii/biochemii komórek macierzystych przez młodszych badaczy. Jednak podczas budowy i użytkowania studzienki EStim należy zachować szczególną ostrożność w kilku krytycznych krokach. Podczas obchodzenia się z elektrod...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Estim fabrication
Banana connector/Jack	adapter Poppstars	1008554	2 sztuki
Szczypce tnące	Knipex	78 03 125
Zasilacz DC (0-30V/0-3A)	B& K Precision	Model 9130B	Można użyć dowolnego modelu podobnego
Izolowane przewody elastyczne (0,14 mm2)	Conrad Electronic International	604794, 604093	2 sztuki
Niekorozyjna guma silikonowa	Dow Corning	3140 RTV	*można kupić w wielu sklepach
Drut platynowy (999,5/1000; 1mm ø)	Junker Edelmetalle	00D-3010	0,6 m potrzebne do 1 komory Estim
70% roztwór etanolu	dowolny		Sterylizacja komory Estim
Drut miedziany pokryty srebrem (0,6 mm ø)	Conrad Electronic International	409334 - 62	≈ 70 cm potrzebne na 1 urządzenie Estim
Zestaw lutowniczy	Conrad Electronic International	1611410 - 62	Można użyć dowolnego modelu podobnego
Pokrywka płytki TPP 6-dołkowa	Sigma-Aldrich	Z707759-126EA	2 pokrywki do komory Estim
2,2V przewodowe okrągłe diody LED	Conrad Electronic International	599525 - 62	6 sztuk
UHU Super klej	UHU GmbH & Co. KG	n/a	*można kupić w wielu sklepach
Kultura MSC
β-Glicerofosforan sól disodowa hydrat	Sigma-Aldrich	G9422	osteogenna hodowla
komórkowa DMEM, niska glukoza, suplement GlutaMAX, pirogronian	Thermo-Fischer Scientific	21885025	hodowla
komórkowa DPBS, bez wapnia, bez magnezu	Thermo-Fischer Hodowla	komórek	14190144
Deksametazon	Sigma-Aldrich	D4902	hodowla komórek osteogennych
Surowica bydlęca płodu	Thermo-Fischer Naukowa	hodowla komórkowa	10500064
50 ml Probówka Falcon	Sarstedt	62,547,004	hodowla komórkowa
Kwas L-askorbinowy	Sigma-Aldrich	A4544	osteogenna hodowla komórek
Penicylina/Streptomycyna	Thermo-Fischer Scientific	15140122	hodowla komórkowa
Mezenchymalne komórki macierzyste szczura Sprague-Dawley (SD), pochodzenie szpiku kostnego	Cyagen	RASMX-01001
Roztwór do odwarstwiania komórek	Termo-Fischer Scientific	A1110501	hodowla komórkowa, odwarstwienie komórek
TC Flask, T75	Sarstedt	833911302	hodowla komórkowa
Płytki 6-dołkowe TPP	Sigma-Aldrich	Z707759-126EA	Hodowla komórkowa
Trypan Blue Dye, 0,4% roztwór	Bio-Rad	1450021	liczba komórek