Artykuł metodologiczny

Wspomagane głębokim sekwencjonowaniem, spontaniczne badanie supresorowe w drożdżach rozszczepienia Schizosaccharomyces pombe

8.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59133

⸱

7 marca 2019

 ,  , 
1Department of Biology, Wake Forest University, 2Center for Molecular Communication and Signaling, Wake Forest University

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentujemy prosty protokół ekranu tłumiącego w drożdżach rozszczepienia. Metoda ta jest skuteczna, wolna od mutagenów i selektywna w przypadku mutacji, które często występują w pojedynczym locus genomu. Protokół jest odpowiedni do izolowania supresorów, które łagodzą defekty wzrostu w płynnej kulturze, które są spowodowane mutacją lub lekiem.

Streszczenie

Genetyczne badanie przesiewowe pod kątem zmutowanych alleli, które tłumią defekty fenotypowe spowodowane mutacją, jest skutecznym podejściem do identyfikacji genów, które należą do blisko powiązanych szlaków biochemicznych. Wcześniejsze metody, takie jak analiza syntetycznej macierzy genetycznej (SGA) i techniki mutagenezy losowej z wykorzystaniem ultrafioletu (UV) lub chemikaliów, takich jak metanosulfonian etylu (EMS) lub N-etylo-N-nitrozomocznik (ENU), były szeroko stosowane, ale często są kosztowne i pracochłonne. Ponadto te metody badań przesiewowych oparte na mutagenach są często związane z poważnymi skutkami ubocznymi dla organizmu, wywołując wiele mutacji, które zwiększają złożoność izolowania supresorów. W tym miejscu przedstawiamy prosty i skuteczny protokół identyfikacji mutacji supresorowych u mutantów, które powodują defekt wzrostu w Schizosaccharomyces pombe. Sprawność komórek z niedoborem wzrostu w standardowych bogatych pożywkach płynnych lub syntetycznych pożywkach płynnych może być monitorowana w celu odzyskania za pomocą automatycznego 96-dołkowego czytnika płytek przez dłuższy czas. Gdy komórka nabywa mutację supresorową w kulturze, jej potomkowie konkurują z komórkami rodzicielskimi. Odzyskane komórki, które mają konkurencyjną przewagę wzrostu nad komórkami rodzicielskimi, można następnie wyizolować i krzyżować wstecznie z komórkami rodzicielskimi. Mutacje supresorowe są następnie identyfikowane za pomocą sekwencjonowania całego genomu. Stosując to podejście, udało nam się wyizolować wiele supresorów, które łagodzą poważne defekty wzrostu spowodowane utratą Elf1, ATPazy z rodziny AAA +, która jest ważna w transporcie jądrowym mRNA i utrzymaniu stabilności genomu. Obecnie w S. pombe znajduje się ponad 400 genów z mutantami nadającymi wadę wzrostu. Ponieważ wiele z tych genów jest niescharakteryzowanych, sugerujemy, że nasza metoda przyspieszy identyfikację nowych interakcji funkcjonalnych dzięki temu przyjaznemu dla użytkownika, wysokowydajnemu podejściu.

Wprowadzenie

Podstawą zrozumienia funkcjonalnych powiązań między genami jest umiejętność identyfikacji molekularnych mechanizmów, dzięki którym złożone cechy genetyczne rozchodzą się, tworząc różne fenotypy1. U drożdży rozszczepialnych, Schizosaccharomyces pombe (S. pombe), większość genów kodujących białka jest zbędna dla żywotności2. Wynik ten nie świadczy o nieistotności tych genów, ale raczej o skomplikowanych mechanizmach kompensacyjnych leżących u podstaw szlaków biochemicznych, do których te geny należą. Analiza tych mechanizmów kompensacyjnych pozwoliła na stworzenie map epistazy, które ujawniły kompleksowe interakcje genetyczne i poszerzyły naszą wiedzę na temat funkcjonalnych szlaków biochemicznych3,4.

Metody o wysokiej przepustowości (np. analiza syntetycznej macierzy genetycznej lub SGA) zostały opracowane w celu identyfikacji interakcji genetycznych całego genomu u pączkujących drożdży i zostały rozszerzone do użytku w drożdżach rozszczepialnych5,6. Takie podejścia często opierają się na bibliotece szczepów zawierających wszystkie zdolne do życia delecje genów kodujących pojedyncze białka (około 3300 haploidalnych mutantów delecji pokrywających ponad 92% genomu drożdży rozszczepialnych) i wymagają ramienia robotycznego do wykonania krzyżówek genetycznych między szczepem będącym przedmiotem zainteresowania a wszystkimi możliwymi szczepami w bibliotece6. Co więcej, techniki SGA zależą od zdolności szczepów bibliotecznych do prawidłowego i wydajnego kojarzenia, fenotypu, który jest nieprawidłowy dla 444 obecnie scharakteryzowanych genów w S. pombe2.

Pomimo złożoności interakcji genetycznych, porównanie fenotypu szczepu przenoszącego mutacje w dwóch genach do fenotypu dwóch szczepów niosących indywidualne mutacje każdego genu może przynieść jeden z dwóch godnych uwagi wyników: 1) Fenotyp podwójnej mutacji jest gorszy niż oczekiwany multiplikatywny fenotyp rodzicielski w postaci choroby lub, w najbardziej ekstremalnym przypadku, Śmiertelność. Jest to określane jako negatywna interakcja genetyczna i jest ogólnie znakiem, że te dwa geny działają w równoległych szlakach biologicznych. 2) Fenotyp podwójnie zmutowany jest lepszy niż oczekiwana kombinacja fenotypów rodzicielskich, znana również jako pozytywna interakcja genetyczna. Pozytywna interakcja genetyczna jest szczególnie interesująca, ponieważ wskazuje, że geny te funkcjonują w tym samym procesie. Dwa pozytywnie oddziałujące geny mają trzy potencjalne relacje: zmutowany gen może regulować ekspresję drugiego genu w górę w równoległym szlaku, dwa geny mogą działać zgodnie w ramach tego samego szlaku za sobą lub dwa geny kodują białka, które oddziałują bezpośrednio ze sobą. W związku z tym pozytywne interakcje genetyczne mogą być wykorzystywane do mapowania węzłów regulacyjnych genów i klasyfikowania niescharakteryzowanych genów w szlakach biochemicznych7,8.

Supresor to mutacja, która może złagodzić fenotyp choroby mutacji innego genu, zazwyczaj reprezentując pozytywną interakcję genetyczną między dwoma genami9,10. Mutacje supresorowe w innym locus niż mutacja, którą tłumią, są znane jako supresory ekstragenowe. Są one szczególnie cenne w badaniu nieżywotnych mutacji genetycznych poprzez syntetyczne ratowanie śmiertelnego fenotypu (znanego również jako efekt Lazarusa)11. Mają również potencjalne zastosowania terapeutyczne w leczeniu chorób dziedzicznych12,13.

Z tych wszystkich powodów, identyfikacja mutacji supresorowych w różnych organizmach modelowych jest szeroko wykorzystywana, aby ułatwić nam zrozumienie różnych szlaków biochemicznych14,15,16. Badania przesiewowe w kierunku supresorów są zwykle oparte na fenotypie danej mutacji i wymagają przeprowadzenia mutagenezy losowej w celu wyizolowania mutacji, które złagodziłyby fenotyp. Prawie wszystkie organizmy modelowe mają ustalone metody mutagenezy losowej. Na przykład N-etylo-N-nitrozomocznik (ENU) i metanosulfonian etylu (EMS), dwa mutageny, które są zdolne do indukowania mutacji punktowych w DNA, są szeroko stosowane w różnych modelach, od bakterii po myszy17,18,19. Ponadto chlorek manganu jest od dawna stosowany w drożdżach ze względu na zdolność kationu manganu do hamowania szlaków naprawy DNA20. Innym powszechnym podejściem jest mutageneza indukowana promieniowaniem UV, która generuje mutagenne dimery pirymidynowe obejmujące cały genom21,22.

Chociaż wykorzystanie mutagenezy chemicznej do identyfikacji mutacji supresorowych było popularne, metoda ta ma wiele wad, w tym użycie niebezpiecznych substancji chemicznych, bardzo zróżnicowane wskaźniki sukcesu i wprowadzenie dodatkowych zmiennych zakłócających, które są spowodowane negatywnymi skutkami ubocznymi mutagenu na wiele procesów komórkowych23,24. Ponadto mutageneza chemiczna często indukuje wiele mutacji w genomie, co zwiększa złożoność stosowania technik genetycznych i sekwencjonowania w celu zidentyfikowania dokładnej mutacji, która nadała fenotyp supresorowy w organizmie25.

Aby rozwiązać problemy obecnych metod mutagenezy, przedstawiamy metodę badania spontanicznych mutacji supresorowych u drożdży rozszczepialnych, która nie opiera się na żadnych mutagenach ani bibliotece delecji. Metoda izoluje supresory za pomocą pozytywnego testu selekcji. Zasada tej metody opiera się na przewadze wzrostu zmutowanej subpopulacji supresorów w kulturze płynnej, która może być monitorowana przez automatyczny czytnik płytek. Krycie i mejoza są stosowane tylko wtedy, gdy ktoś chciałby oczyścić tło genetyczne lub potwierdzić obecność monogenowych alleli supresorów przed sekwencjonowaniem całego genomu. Jeśli fenotyp supresji jest spowodowany pojedynczą mutacją, fenotyp supresorowy będzie segregowany w stosunku 2:2 po krzyżowaniu wstecznym ze szczepami rodzicielskimi. Mutacje supresorowe można następnie zidentyfikować za pomocą sekwencjonowania całego genomu. Proponujemy, aby ta metoda miała zastosowanie do badań przesiewowych supresorów we wszystkich mikroorganizmach, które mogą urosnąć do dużej populacji w kulturze płynnej.

Protokół

1. Budowa i przygotowanie szczepu

  1. Wygeneruj mutację lub delecję genu (yfm, twoja ulubiona mutacja) przy użyciu standardowej mutagenezy ukierunkowanej na miejsce (SDM), jak opisano wcześniej26.
  2. Przed rozpoczęciem badania przesiewowego należy (optymalnie) krzyżować wstecznie zmutowane szczepy ze szczepem typu dzikiego, aby oczyścić tło genetyczne i wygenerować nowo narodzone zmutowane komórki jako szczepy rodzicielskie. Umieść szczep rodzicielski na poszczególnych koloniach na standardowych płytkach z multimediami. Losowo wybrać od ośmiu do szesnastu niezależnych kolonii (kontrprób biologicznych) z pożądanymi mutacjami do testu czytnika płytek (patrz 3.1).
    UWAGA: Ten protokół jest skuteczny tylko wtedy, gdy szczepy rodzicielskie mają defekt wzrostu w płynnych pożywkach (minimalnych lub bogatych, z lekiem lub bez, lub ze zmianami temperatury, które powodują wadę wzrostu). Wszystkie szczepy rodzicielskie powinny być haploidalne, a tym samym możliwe do genetycznego krzyżowania z innymi szczepami haploidalnymi o uzupełniającym typie kojarzenia.

2. Test czytnika płytek

  1. Za pomocą sterylnego aplikatora pobrać niewielką ilość każdej z kolonii przygotowanych w kroku 1.1 (dokładna ilość nie jest konieczna do zaszczepienia kultury wyjściowej) i umieścić w 96-dołkowej mikropłytce polistyrenowej. Zawiesić każdą z kolonii w 200 μl odpowiedniej płynnej pożywki (bogatej lub minimalnej, z lekiem lub bez). Do każdego rzędu na płytce zawierającej 200 μl tej samej pożywki należy dołączyć ślepą próbkę dla każdego rzędu zawierającego 200 μl tej samej pożywki (bez komórek).
  2. Uruchom następujący protokół w oprogramowaniu do wykrywania czytnika płytek podłączonym do automatycznego czytnika mikropłytek: Ustaw program kinetyczny na 24 godziny i temperaturę na 30 °C, z ciągłym szybkim wytrząsaniem orbitalnym (425 cpm, amplituda 3 mm). Ustaw odczyty optyczne tak, aby mierzyły rozproszenie światła na długości fali 600 nm dla gęstości optycznej i ustaw światło na odczyt spod płytki z częstotliwością odczytu 2 minuty (łącznie 721 odczytów w ciągu 24 godzin na studzienkę).
  3. Po 24 godzinach zanotować końcowe odczyty gęstości optycznej przy ślepej próbie (OD600 przy zerowej próbie) i użyć następującego wzoru w celu określenia objętości potrzebnej do rozcieńczenia każdej z próbek do średnicy zewnętrznej = 0,1:
    figure-protocol-1
    UWAGA: Wyeksportuj dane z oprogramowania czytnika płytek i użyj oprogramowania arkusza kalkulacyjnego, aby wstawić powyższą formułę jako funkcję do przetwarzania wsadowego objętości rozcieńczenia, która ma być użyta z każdego dołka doświadczalnego.
  4. Co 24 godziny rozcieńczać każdą z próbek, używając tego samego podłoża co dzień 0 do średnicy zewnętrznej = 0,1 (około 1,5 x 106 komórek/ml) według wzoru wskazanego w kroku 2.3. Zapisz wszystkie krzywe wzrostu generowane codziennie i zanotuj każdą pojedynczą kolonię, która wykazuje zwiększone tempo wzrostu, oceniane na podstawie końcowej średnicy zewnętrznej, która jest znacznie wyższa niż reszta kohorty o tym samym tle genetycznym lub na podstawie krzywej wzrostu podobnej do krzywej kolonii typu dzikiego.
    UWAGA: Ten test trwa zwykle około 7-14 dni. Wszystkie kroki wykonuj w sterylnych warunkach.

3. Wybór kolonii supresorowych i potwierdzenie fenotypu.

  1. Od ostatniego dnia testu czytnika płytek (krok 2.4) należy zachować płynne kultury, które mają zauważalnie odzyskane tempo wzrostu, prawdopodobnie poprzez uzyskanie mutacji supresorowej, która może złagodzić fenotyp mutacji rodzicielskiej. Przenieść i wymieszać 250 μl płynnej kultury do krioprobówki zawierającej 250 μl 50% glicerolu. Błyskawiczne zamrożenie komórek w ciekłym azocie i przechowywanie szczepów w temperaturze -80oC na czas nieokreślony.
  2. Aby potwierdzić, że mutacja supresorowa jest elementem dziedzicznym genetycznie, należy zastosować standardowe metody krzyżowania genetycznego w celu skrzyżowania yfm P (dla rodzicielskiego, szczepu użytego na początku testu czytnika płytki) z yfm S (dla supresora, szczepu zapisanego na końcu testu czytnika płytki). Jeśli mutacja supresorowa jest rzeczywiście elementem dziedzicznym genetycznie, yfm P × yfm S powinny dać tetrady, w których dwie kolonie mają fenotyp choroby szczepu rodzicielskiego, a dwie kolonie mają odzyskane tempo wzrostu szczepu supresorowego.
  3. Z krzyżówki kroku 3.2 wybierz trzy kolonie z fenotypem supresorowym (szczep S) i trzy kolonie z fenotypem rodzicielskim (szczep P) z tej samej krzyżówki genetycznej (3 powtórzenia biologiczne dla każdej) i kontynuuj poniższe kroki ekstrakcji i sekwencjonowania genomowego DNA.
    UWAGA: Kroki 3.2 i 3.3 są wysoce zalecane, ale nie są wymagane. Alternatywnie, można rozprowadzić odzyskaną płynną kulturę zebraną z 3.1 na bogatej pożywce na pojedyncze kolonie, a następnie losowo wybrać trzy kolonie jako biologiczne potrójne kolonie do sekwencjonowania całego genomu bez dalszego potwierdzenia genetycznego. W takim przypadku do porównania sekwencjonowania genomu należy użyć trzech biologicznych trojatek szczepu rodzicielskiego.

4. Ekstrakcja genomowego DNA, tworzenie bibliotek i sekwencjonowanie.

  1. W celu ekstrakcji DNA, przygotowania biblioteki i sekwencjonowania, losowo wybierz trzy powtórzenia biologiczne na szczep yfm P i trzy powtórzenia biologiczne każdego indywidualnie powstałego szczepu yfm S z krzyżówek genetycznych (krok 3.2) lub z płytek, które zostały rozsiane w celu uzyskania pojedynczych kolonii szczepu S (krok 3.3 uwaga).
  2. Hoduj szczepy w kulturach o pojemności 10 ml w pożywkach bogatych do połowy fazy logarytmicznej (OD = 0,5–0,8, około 0,75–1,2 x 107 komórek/ml) i użyj inkubatora do wytrząsania do hodowli płynnych kultur w temperaturze 30 °C z ciągłym wytrząsaniem z prędkością 250 obr./min. Zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 4 °C przez 5 minut przy 1000 x g.
  3. Zawiesić granulowane komórki w 400 μl buforu do ekstrakcji DNA (2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris-Cl (pH 8,0), 1mM Na 2-EDTA), a następnie dodać 400 μl szklanych kulek i 400 μl 25:24:1 fenolu:chloroformu:alkoholu izoamylowego. Wirować energicznie przez 2 minuty w temperaturze 4 °C.
  4. Dodać dodatkowe 200 μl buforu do ekstrakcji DNA i wymieszać, kilkakrotnie odwracając. Wirować przez 5 minut w temperaturze 4 °C przy 20 000 x g.
  5. Przenieść fazę wodną do czystej probówki, dodać 20 μg mieszaniny RNazy A/T1 i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut.
  6. Dodać równą objętość alkoholu fenolo-chloroformowego w proporcji 25:24:1, wirować przez 5 minut w temperaturze 4 °C w temperaturze 20 000 x g, a następnie przenieść fazę wodną do czystej probówki.
  7. Dodać równą objętość chloroformu, kilkakrotnie wymieszać przez odwrócenie, następnie wirować przez 5 minut w temperaturze 4 °C przy 20 000 x g, a następnie przenieść fazę wodną do czystej probówki.
  8. Wytrącić DNA z dwiema objętościami 100% etanolu plus 10% objętości 3 M NaOAC (pH 4,3) w temperaturze -20 °C przez co najmniej 2 godziny, następnie wirować przez 5 minut w temperaturze 4 °C w temperaturze 20 000 x g i zebrać osad.
  9. Przepłukać osad (wytrącone DNA) dwukrotnie schłodzonym 70% etanolem (odwirować przy 20 000 x g, 5 min, 4 °C) i zawiesić osad w 50 μl 10 mM buforu Tris (pH 7,4).
  10. Użyj zestawu do przygotowania biblioteki (patrz Spis materiałów) zgodnie z zaleceniami producenta, aby przygotować bibliotekę sekwencjonowania całego genomu.
    UWAGA: Polecamy zestaw wymieniony w Tabeli Materiałów, ponieważ pozwala on na budowę biblioteki genomowej bez amplifikacji PCR, co minimalizuje mutacje błędów powstające podczas amplifikacji PCR. Ponadto podczas przygotowywania biblioteki genomowej nie należy dopuścić do całkowitego wyschnięcia kulek poprzez skrócenie czasu schnięcia kulek do 1–2 min.
  11. Aby uzyskać parametry ścinania podczas przygotowania biblioteki, użyj skoncentrowanego sonikatora (patrz Tabela Materiałów) i ustaw współczynnik wypełnienia na 20%, moc szczytową na 175 W, z 200 cyklami na serię, a tryb przemiatania częstotliwości w temperaturze od 5,5oC do 6 °C przez 45 s. Alternatywnie, użyj systemu ścinania DNA i chomatyny (patrz Tabela Materiałów) z następującymi ustawieniami: amplituda 50% przy 4 °C w trybie impulsowym, 15 s wł. i 15 s wył. przez 10 min, z całkowitym czasem przetwarzania 20 min.
  12. Z materiałami niebezpiecznymi używanymi na tym etapie należy obchodzić się ostrożnie. Zapoznaj się z odpowiednimi kartami charakterystyki substancji niebezpiecznej oraz z Biurem ds. Bezpieczeństwa i Higieny Pracy instytucji w celu obchodzenia się z NaOAC, etanolem, 25:24:1 fenol:chloroform:alkohol izoamylowy i chloroformem.
  13. Zsekwencjonuj wynikowe biblioteki genomowe. Całe odczyty sekwencjonowania powinny obejmować co najmniej trzy razy cały genom z rozdzielczością w zakresie pojedynczych nukleotydów. Zalecane jest sekwencjonowanie ze sparowanymi końcami (lub najnowsza technologia).

5. Analiza bioinformatyczna w celu identyfikacji mutacji supresorowych

  1. Wykonaj analizę bioinformatyczną, aby skupić się na zmianach genomowych, które są konsekwentnie identyfikowane między rodzicielskimi i stłumionymi szczepami yfm we wszystkich kontrpróbach biologicznych.
    UWAGA: Cały proces potoku jest opisany poniżej, ale dodatkowo dwa pliki skryptów BASH w postaci zwykłego tekstu, fastq_to_vcf.sh i vcfprocess.sh, są dołączone jako materiały uzupełniające, aby pokazać przykłady przepływu pracy od przetwarzania odczytów do plików wariantów VCF oraz odpowiednio przetwarzania i przecinania plików VCF.
  2. Przytnij krótkie odczyty za pomocą SHEAR (https://github.com/jbpease/shear) zgodnie z wierszami poleceń (wszystkie inne opcje domyślne):
    shear.py --fq1 $FASTQ 1 --fq2 $FASTQ 2 --out1 $OUTFQ 1 --out2 $OUTFQ 2 \
    --kody kreskowe1 $BARCODE --platform TruSeq --trimqual 20:20 \
    --trimpolyat 0 --trimambig --filterlength 50 --filterunspared
  3. Mapa odczytuje genom referencyjny S. pombe v2.30 uzyskany z PomBase (ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/pombase/pombe/Chromosome_Dumps/fasta/) przy użyciu BWA v0.7.1527. Użyj następującego wiersza poleceń (wszystkie inne opcje są domyślne):
    bwa mem -t 8 $GENOME $OUTFQ 1 $OUTFQ 2 > $SAM 1
  4. Umieść pliki SAM wyrównania za pomocą potoku najlepszych rozwiązań GATK 28 dla wywoływania wariantów przy użyciu GATK v3.629, PicardTools v2.5.0 (http://broadinstitute.github.io/picard) i SAMtools v1.3.130. Użyj następujących wierszy poleceń i parametrów (wszystkie inne opcje są domyślne):
    java -Xmx30g -jar picard.jar AddOrReplaceReadGroups INPUT=$SAM 1 \
    OUTPUT=$BAMMARKED RGID=1 RGLB=lib01 RGPL=illumina \
    RGPU=$BARCODE RGSM=$SAMPLENUMBER
    samtools fixmate -O bam $BAMMARKED $BAMFIXED
    samtools sort -O bam -o $BAMSORTED -T /home/peasejb/tmp $BAMFIXED
    samtools index $BAMSORTED
    java -Xmx30g -jar GenomeAnalysisTK.jar -T HaplotypeCaller \
    -R $GENOME -I $BAMSORTED --genotyping_mode ODKRYCIE \
    -stand_emit_conf 10 -stand_call_conf 30 -o $VCFRAW
  5. Kompresuj i indeksuj pliki VCF za pomocą tabix:
    bgzip $VCFRAW.vcf
    Tabix $VCFRAW.vcf.gz
  6. Porównaj pliki VCF między powtórzeniami sekwencjonowania szczepów rodzicielskich i supresorowych za pomocą BCFtools v1.3.127. Użyj następujących wierszy poleceń i parametrów (wszystkie inne opcje pozostały domyślne):
    bcftools isec -n+1 $VCFPARENTAL1.gz $VCFPARENTAL2.gz $VCFPARENTAL3.gz \
    $VCFMUTANT1.gz $VCFMUTANT2.gz $VCFMUTANT3.gz > common_variants.list
    UWAGA: To polecenie dało plik zakodowany ze wzorcami binarnymi, w którym warianty sekwencji pojawiające się tylko w pierwszym mutancie byłyby kodowane binarnie jako "000100", drugi mutant tylko jako "000010", wszystkie trzy mutanty jako "000111" itd. Pliki te zostały wygenerowane dla każdego zestawu rodzicielskich i zmutowanych replikowanych plików VCF.
  7. Skompiluj pliki listy przecięć wariantów wraz z nazwą pliku dołączoną do każdego wiersza za pomocą polecenia grep systemu UNIX:
    grep "." *.list > all.list
  8. Porównaj pełną listę wariantów z bieżącym plikiem adnotacji GFF3 (ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/pombase/pombe/Chromosome_Dumps/gff3/schizosacchar omyces_pombe.chr.gff3) za pomocą niestandardowego skryptu Pythona (variant_characterize.py), aby zidentyfikować spójne miejsca SNP w regionach kodujących białka (synonimiczne i niesynonimiczne), UTR 5′ i 3′ oraz ncRNA.
    python3 variant_characterize.py --list common_variants.list \
    --gff schizosaccharomyces_pombe.chr.gff3 \
    --fasta Schizosaccharomyces_pombe. ASM294v2.30.dna.genome.fa \
    --wzorzec 000100 --out all.list.filter.000100
    Powtórz ten skrypt, modyfikując --wzorzec i sufiks pliku wyjściowego (--out) przy użyciu binary
    Wzorce: 000010, 000001, 000110, 000011, 000101 i 000111
  9. Połącz dane wyjściowe ze wszystkich tych uruchomień skryptów w pliku rozdzielonym tabulatorami, który ma być wyświetlany jako arkusz kalkulacyjny. Tabela wariantów z adnotacjami obejmuje te, które pojawiają się w jednym lub obu zmutowanych szczepach w stosunku do tła. Pole flagi binarnej oznacza występowanie w pojedynczym zmutowanym szczepie (000100, 000010, 000001), dwóch zmutowanych szczepach (000011, 000101, 000110) lub we wszystkich trzech zmutowanych szczepach (000111).
  10. Przeanalizuj wyjściowe listy z adnotacjami wariantów, które nie zostały znalezione w próbkach rodzicielskich, ale znaleziono w jednej, dwóch lub wszystkich trzech próbkach zmutowanych. Adnotacja oznacza zarówno lokalizację genomu, jak i klasę wariantu (synonimiczny/niesynonimiczny w regionie kodującym, 3'/5' UTR, niekodujący itp.). Z tej listy mutacji kandydujących, przykładem silnie istotnych kandydatów może być niesynonimiczny wariant kodujący pojawiający się konsekwentnie we wszystkich trzech szczepach. Innym typem silnego kandydata byłaby akumulacja różnych niesynonimicznych lub przypuszczalnych mutacji regulatorowych w zmutowanych szczepach pojawiających się blisko siebie lub w obrębie tego samego genu.

Wyniki

Wolno rosnące mutanty wykazują fenotypową regenerację w płynnych kulturach
Wybraliśmy trzy mutanty zaangażowane w różne szlaki biologiczne o chorym, wolno rosnącym fenotypie: ATPaza z rodziny AAA Elf1, deacetylaza histonów Clr6 i składnik kompleksu złączy eksonowych Fal1. Szczep typu dzikiego i szczepy niosące mutacje tych trzech genów, które zostały skrzyżowane wstecznie ze szczepami typu dzikiego, zostały przeniesione do poszczególnych kolonii, a 16 pojedynczych kolonii zostało losowo wybranych do hodowli w bogatych płynnych pożywkach przy użyciu 96-dołkowej płytki, jak opisano powyżej. Krzywe wzrostu poszczególnych rodzin rejestrowano w początkowym punkcie czasowym (dzień 0) i przez 6 dni z ciągłym monitorowaniem za pomocą czytnika płytek. Zgodnie z oczekiwaniami, kolonie typu dzikiego nie wykazują zauważalnych zmian w swoich krzywych wzrostu w całym eksperymencie31 (Rysunek 1). Warto zauważyć, że cztery kolonie o pochodzeniu elf1∆ i jedna kolonia fal1∆ wykazują dramatyczną zmianę wzrostu z wolno rosnącego do pewnych różnych poziomów wzrostu podobnych lub zbliżonych do kolonii typu dzikiego. Co dramatyczne, wszystkie mutanty clr6-1 wykazują konsekwentną regenerację fenotypową, rosnąc w szybszym tempie pod koniec testu31 (Rysunek 1). Aby scharakteryzować różne fenotypy, odnosimy się do oryginalnych szczepów, które rosną powoli, jako "szczepów P" (lub szczepów rodzicielskich), a do szczepów wykazujących powrót do zdrowia fenotypowego jako "szczepów S" (lub szczepów stłumionych). Proszę zauważyć, że Rysunek 1 jest przykładem jednej rundy eksperymentu przesiewowego i nie reprezentuje całkowitej liczby niekomplementarnych supresorów zidentyfikowanych i zsekwencjonowanych w poniższych reprezentatywnych wynikach.

Regeneracja fenotypowa jest przypisywana cechom dziedzicznym
S. pombe może rosnąć jako haploidalny w bogatych podłożach, ale dwa haploidalne szczepy o uzupełniających się typach kojarzenia łączą się w pary z powodu głodu azotu. Mejoza w drożdżach rozszczepieniowych pociąga za sobą rundę duplikacji, po której następują dwie rundy podziału komórek. Cykl płciowy skutkuje powstaniem czterech haploidalnych zarodników przenoszących materiał genetyczny szczepu rodzicielskiego z segregacją cech genetycznych w stosunku 2:2 zgodnie z zasadami klasycznej genetyki mendlowskiej (Ryc. 2A). Podczas uprawy na tej samej płytce przez ten sam czas, potwierdziliśmy segregację 2:2 podczas krzyżowania wstecznego wszystkich stłumionych szczepów (szczepów S) z ich szczepami rodzicielskimi (szczepy P), co dało 2 małe (wada wzrostu) i 2 duże (fenotyp supresorowy) kolonie. Poszczególne przykłady dla stłumionych komórek elf1∆, clr6-1 i fal1∆ są pokazane w Rysunek 2B. Potwierdziliśmy, że wszystkie izolowane szczepy S zawierają monogenowy element genetyczny, który hamuje wolno rosnący fenotyp ich szczepów P (dane nie pokazane).

Sekwencjonowanie całego genomu skutecznie identyfikuje mutacje supresorowe
Jako przykład użyliśmy sekwencjonowania całego genomu z parami końców, aby zidentyfikować elementy genetyczne odpowiedzialne za odbudowę fenotypową w szczepach elf1∆ S. Bardziej szczegółowy opis analizy danych jest dostępny online31. Krótko mówiąc, zastosowaliśmy biologiczne triplikaty dwóch niezależnie wygenerowanych szczepów elf1∆ P oraz biologiczne duplikaty pięciu niekomplementarnych grup szczepów elf1∆ S, z których każda zawiera różne supresory. Po uzyskaniu listy wariantów z adnotacjami z analizy bioinformatycznej (6.1-10), nadaliśmy priorytet pewnym klasom wariantów, które były istotne dla naszej analizy. Skupiliśmy się na identyfikacji spójnych zmian genomowych, które były identyczne we wszystkich replikach biologicznych poszczególnych szczepów elf1∆ S w porównaniu z ich rodzicielskimi szczepami elf1∆ P (Rysunek 3 i tabele uzupełniające 1-4). Zidentyfikowaliśmy pięć niesynonimicznych zmian w regionach CDS we wszystkich pięciu różnych szczepach elf1∆ S, w tym rli1 +, SPBPJ4664.02, cue2 + i rpl2702 +. Zarówno S-A1, jak i S-A2 zawierają zmutowane SPBPJ4664,02, chociaż mutacje zachodzą w różnych aminokwasach. Ponieważ SPBPJ4664,02 jest długim genem (11 916 nukleotydów) z setkami powtórzeń, mutacji nie można było potwierdzić przez wykonanie PCR, a następnie sekwencjonowania. S-A3 zawiera mutanta delecyjnego w rli1, który jest spójny w obu duplikatach biologicznych. Jednak mutant nie segregował się z fenotypem S na tle elf1∆. Zidentyfikowaliśmy mutanta cue2 (cue2-1) w S-B1, w którym brakuje aminokwasów 396-400. S-B2 zawiera mutanta rpl2702 (rpl2702-1), który zmienia aminokwas w pozycji 45 z glicyny na asparaginian31. Zarówno cue2-1, jak i rpl2702-1 zostały potwierdzone jako tłumiki elf1∆, jak pokazano poniżej.

Genetyczne potwierdzenie zidentyfikowanych mutacji supresorowych weryfikuje odziedziczalność fenotypu odzyskiwania
Dwa ze zidentyfikowanych niesynonimicznych zmian, cue2-1 i rpl2702-1, zostały zrekonstruowane w laboratorium przy użyciu standardowych protokołów mutagenezy ukierunkowanej na miejsce. Podwójnie zmutowane szczepy cue2-1 elf1∆ P i rpl2702-1 elf1∆ P skrzyżowano z uzupełniającym elf1∆ P strain31 (Rysunek 4). Gdyby niesynonimiczne mutacje, zidentyfikowane za pomocą tego ekranu, były wystarczające do stłumienia elf1∆ P, wówczas powstałe tetrady wykazywałyby stosunek 2:2 mały do dużego w koloniach wynikających z 4 zarodników w każdej tetradzie. Rzeczywiście, krzyżowanie genetyczne wykazało, że zidentyfikowane mutacje supresorowe są skuteczne w tłumieniu wolno rosnącego fenotypu elf1∆ P i są dziedziczne.

figure-results-1
Rycina 1: Odzysk fenotypowy można monitorować, rejestrując krzywe wzrostu w czytniku płytek. Szesnaście pojedynczych kolonii typu dzikiego (WT), elf1∆, clr6-1 i fal1∆ umieszczono na 96-dołkowej płytce. Krzywe wzrostu rejestrowano w okresie 24 godzin, a kolonie były codziennie ponownie rozcieńczane w multimediach. Wada wzrostu jest widoczna po niskiej absorbancji (O.D.) pod koniec okresu 24 godzin w dniu 0. Fenotypowo odzyskane szczepy to te, które wykazują krzywą wzrostu podobną lub zbliżoną do krzywej typu dzikiego w okresie 24 godzin w 6 dniu. Cztery kolonie elf1∆, jedna kolonia fal1∆ i wszystkie kolonie clr6-1 wykazywały różne poziomy powrotu do zdrowia fenotypowego po 6 dniach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rycina 2: Krzyżowanie genetyczne może potwierdzić, że powrót do zdrowia fenotypowego przypisuje się pojedynczemu allelowi dziedzicznemu. (A) Kiedy rozszczepione komórki drożdży są poddawane głodowi azotu, dwie haploidalne komórki o komplementarnym typie kojarzenia mogą wytworzyć zygotę, która zarodnikuje, tworząc tetradę 4 zarodników. Rodzicielski materiał genetyczny ulegnie segregacji podczas mejozy zgodnie z zasadami genetyki mendlowskiej. (B) Fenotypowo odzyskane kolonie (oznaczone jako S, dla stłumionych) ze wskazanymi genotypami rodzicielskimi zostały skrzyżowane wstecznie z ich komplementarną kolonią rodzicielską (która wykazuje brak odbudowy fenotypowej, oznaczonej jako P, dla rodzicielskiej). Krzyżówki genetyczne wykazujące 2:2 małe (słaba sprawność) i duże (odzyskane przystosowanie) kolonie pokazują, że powrót do zdrowia fenotypowego jest dziedziczny i można go przypisać pojedynczemu elementowi genetycznemu. Czerwone pudełka to kolonie zawierające allel supresorowy, a niebieskie pudełka to kolonie zawierające allel rodzicielski. Ten rysunek został zmodyfikowany na podstawie Marayati et al., 201831. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Analiza danych sekwencjonowania całego genomu w celu zidentyfikowania elementów genetycznych odpowiedzialnych za odzysk fenotypowy. Trzy powtórzenia biologiczne dwóch rodzicielskich szczepów "P" (P-A i P-B) oraz dwie biologiczne kontrpróby pięciu fenotypowo odzyskanych przełączonych szczepów "S" (S-A1, S-A2 i S-A3 odzyskanych z P-A; S-B1 i S-B2 z P-B ), zsekwencjonowano, a mutacje zorganizowano jako listę każdej mutacji w odzyskanym szczepie w porównaniu z genomem szczepu rodzicielskiego, z którego pochodził (np. P-A vs. S-A1 itp.). Całkowita liczba wykrytych mutacji w całym genomie we wszystkich takich porównaniach parami wyniosła 660. W sumie zidentyfikowano 44 mutacje, gdy wybrano tylko mutacje występujące w obu replikach biologicznych tego samego szczepu "S". Spośród 44 mutacji, 12 mutacji było mutacjami insercji/delecji (INDEL) lub mutacjami niesynonimicznymi. Spośród 12 mutacji INDEL lub niesynonimicznych, pięć wystąpiło w sekwencji kodującej białko. Pięć mutacji potencjalnie koreluje z pojedynczym elementem genetycznym odpowiedzialnym za fenotypowo odzyskane szczepy: niesynonimiczną mutację w SPBPJ4664.02 znalezioną w S-A1 i S-A2, INDEL w rli1 znalezioną w S-A3, INDEL w cue2 znalezioną w S-B1 i niesynonimiczne mutacje w rpl2702 znalezione w S-B2. Szczegółowe informacje na temat sekwencji mutacji i przefiltrowanego tła znajdują się w tabelach uzupełniających 1-4. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rycina 4: Potwierdzenie supresorów zidentyfikowanych za pomocą sekwencjonowania całego genomu. Wyniki sekwencjonowania całego genomu zostały potwierdzone poprzez niezależne generowanie mutacji i wykonywanie krzyżówek genetycznych w celu potwierdzenia odzyskania fenotypu poprzez skrzyżowanie szczepu elf1∆ cue2-1 ze szczepem elf1∆ P i elf1∆ rpl2702-1 ze szczepem elf1∆ P. Pokazano trzy reprezentatywne tetrady pionowe. Czerwone pudełka to podwójnie zmutowane kolonie (elf1 cue2-1 lub elf1 rpl2702-1); Niebieskie pola to kolonie Elf1∆. Ten rysunek został zmodyfikowany na podstawie Marayati et al., 201831. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela uzupełniająca 1.Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela uzupełniająca 2.Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela uzupełniająca 3.Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela uzupełniająca 4.Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dodatkowe pliki kodowania.Kliknij tutaj, aby pobrać pliki.

Dyskusja

Opisany tutaj protokół stanowi nowatorskie i proste badanie przesiewowe spontanicznych mutacji supresorowych wykrywalnych poprzez fenotypowe odzyskiwanie mutacji powodujących powolny wzrost drożdży rozszczepialnych, fenotypu charakterystycznego dla ponad 400 genów u S. pombe, z których funkcja wielu pozostaje nieznana 2,32. Poprzednie metody obejmowały inne podejścia do badań przesiewowych w kierunku mutacji supresorowych w mikroorganizmach, w tym wykorzystanie mutagenów21 lub zastosowanie zmiany temperatury w zmutowanych tłach wrażliwych na temperaturę33. W przeciwieństwie do tego, protokół ten pokazuje, że odzysk fenotypowy zachodzi bez dodatkowej ingerencji środowiskowej/chemicznej i podkreśla przewagę dopasowania wynikającą z wzrostu mutacji supresyjnych, które ostatecznie przejmują zasoby dostępne w kulturze płynnej. To badanie przesiewowe umożliwia izolację zarówno supresorów obejściowych, jak i supresorów interakcji, ponieważ jest skuteczne zarówno w przypadku mutacji powodujących utratę funkcji∆ takich jak elf1 lub fal1∆ jak i mutacji punktowych, takich jak clr6-1, o ile mutanty wykazują defekty dopasowania w płynnej hodowli.

Do tej pory wszystkie odzyskane szczepy S, które badaliśmy, wykazywały różne stopnie odzysku fenotypowego. Jak wykryto w wyniku krzyżowania genetycznego, odzyskany fenotyp można przypisać pojedynczemu elementowi genetycznemu i jest dziedziczny (przykłady pokazane na rycinie 2). Jest to jedna z najważniejszych zalet tej metody w porównaniu z ekranami supresorowymi opartymi na chemikaliach lub promieniowaniu UV, które często są ukierunkowane na wiele loci genomowych. Często obserwuje się, że jedna lub dwie kolonie są odzyskiwane z 16 kolonii/szczepu (około 10%) w ciągu tygodnia. Zauważyliśmy jednak, że niektóre mutanty, takie jak utrata funkcji Rrp6, podjednostki egzosomów specyficznej dla jądra, nigdy nie powróciły do prawie dzikiego tempa wzrostu obserwowanego w elf1Δ komórki31. Jest prawdopodobne, że funkcja Rrp6 może być tylko częściowo skompensowana przez supresory, w przeciwieństwie do funkcji innych badanych mutantów, w tym fal1∆, który, jak wykazano, powoduje poważny defekt mejotyczny poprzez swoją ważną funkcję w splicingu regulatorowym34. Uważamy, że alternatywne metody badań przesiewowych supresorów byłyby narażone na ten sam problem, gdy yfg ma unikalne, niezastępowalne role we wzroście komórek.

Przed wykonaniem sekwencjonowania genomu optymalne jest krzyżowanie wsteczne fenotypowo odzyskanych kolonii, zidentyfikowanych na podstawie czytnika płytek, ze szczepami rodzicielskimi w celu oczyszczenia tła genetycznego i uzyskania replik biologicznych. Ponadto głębokie sekwencjonowanie całego genomu identyfikuje setki zmian pojedynczych nukleotydów, z których większość nie jest identyczna między powtórzeniami biologicznymi, które są mało interesujące dla badań przesiewowych. Na przykład znaleźliśmy w sumie 660 zmian genomowych we wszystkich trzech chromosomach między dwoma elf1Δ P i pięcioma różnymi szczepami S (Figura 3). Nie zaobserwowaliśmy często identycznych mutacji między zsekwencjonowanymi replikami biologicznymi każdego szczepu, co sugeruje, że albo nowe mutacje mogą powstać podczas hodowli elf1Δ komórek przed budową biblioteki genomowej, albo mogą zostać wprowadzone losowe błędy podczas budowy biblioteki i sekwencjonowania. W związku z tym izolowanie mutacji, które są spójne we wszystkich replikach biologicznych, jest ważnym aspektem skutecznej identyfikacji supresorów za pomocą sekwencjonowania całego genomu.

Zidentyfikowaliśmy i potwierdziliśmy dwa supresory w regionach CDS w pięciu sekwencjonowanych szczepach S. Chociaż mutacje w SPBPJ4664.02 wykryto zarówno w szczepach S-A1, jak i S-A2, jest mało prawdopodobne, że SPBPJ4664.02 jest ważnym supresorem, ponieważ S-A1 i S-A2 nie zawierają supresora na tym samym genie, ponieważ nie są ze sobą komplementarne (dane nie pokazane). Nie potwierdziliśmy również rli1 w S-A3, który nie uległ kosegregacji z fenotypem S po krzyżowaniu wstecznym z elf1Δ. Alternatywnie, znaleźliśmy specyficzne mutacje w regionach niekodujących w S-A1, S-A2 i S-A3. Możliwe, że te zmienione niekodujące regiony genomowe łagodzą fenotyp elf1Δ , który zostanie uwzględniony w naszych przyszłych badaniach. W porównaniu z tradycyjnymi metodami, takimi jak test sprzężeń, który może zająć lata, aby zmapować mutację genetyczną, zidentyfikowaliśmy dwa supresory w ciągu dwóch miesięcy po potwierdzeniu, że element monogenowy spowodował fenotyp S. Biorąc pod uwagę szybki rozwój technologii sekwencjonowania całego genomu, jesteśmy optymistami, że metoda ta będzie bardziej skuteczna w identyfikacji spójnych mutacji genetycznych w dającej się przewidzieć przyszłości.

Podsumowując, protokół ten zawiera wskazówki krok po kroku, jak skutecznie zidentyfikować mutacje supresorowe dla dowolnego genu będącego przedmiotem zainteresowania z wolno rosnącym defektem w płynnej kulturze. Prostota tego testu pozwala na badania przesiewowe na dużą skalę wielu interesujących środowisk genetycznych przy niewielkim przeszkoleniu praktycznym. Istnieje możliwość dalszej automatyzacji procesu poprzez wykorzystanie robota do obsługi cieczy do wykonywania codziennych rozcieńczeń. Ponieważ laboratoryjna manipulacja mikroorganizmami nieuchronnie wymaga wzrostu w płynnej kulturze, procesu, który jest z natury selektywny pod względem przydatności, proponujemy, aby protokół ten mógł być szeroko stosowany do innych organizmów modelowych o dużej populacji, takich jak bakterie i inne gatunki drożdży.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak poparcia ze strony producentów instrumentów stosowanych w tej metodzie, ani też brak konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez National Institute of General Medical Sciences, przyznaje K.Z. 1R15GM119105-01. Dziękujemy wszystkim recenzentom za wnikliwe komentarze. Dziękujemy również Jamesowi Tuckerowi, Alicii Anderson, Elizabeth Black i Glenowi Marrsowi za dyskusję i komentarze na temat tego manuskryptu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Adenina, ProszekAcros Organics147441000Stosować w dawce 75 mg/L do wytwarzania płynnych i stałych pożywek bogatych (YEA)
Bakteriologia PetriDish Corning, FalconC351029100 i razy; 15 mm, służy do hodowli szczepów do pojedynczych kolonii na stałych pożywkach bogatych D-glukoza
bezwodna, proszekFisher ChemicalD16-1Stosować w ilości 30 g/l do wytwarzania płynnych i stałych pożywek bogatych (YEA)
Difco Agar, GranuatedBecton, Dickinson and Co.214530Stosować w stężeniu 20 g/L do wytwarzania stałego buforu
do ekstrakcji DNA2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris-Cl (pH 8,0), 1mM Na2-EDTA
Skoncentrowany ultrasonografCovaris Inc.S220Alternatywnie, użyj QSonica Q800R sonicator/system ścinania DNA i chromatyny
Gen5 Oprogramowanie do zbierania i analizy danychBiotek, Inc.GEN5SECURELub równoważny, musi być kompatybilny z czytnikiem mikropłytek, służy do eksportowania odczytów danych z czytnika mikropłytek
Kwas solny 1N, płynFisher ChemicalSA48-4Służy do regulacji pH do 5,5 w płynnych i stałych podłożach bogatych
Płynne podłoża bogate (płynny YEA)30 g/L D-glukoza, 5 g/L ekstrakt drożdżowy, 75 mg/L Adenina, pH dostosowane do 5,5 za pomocą czytnika mikropłytek HCl 1 M
, hybrydowego czytnika wielomodowego Synergy H1Biotek, Inc.BTH1MGLub równoważny, musi odczytywać światło widzialne w zakresie długości fal 600 nm
Płytki agarowe Rich Media (płytki YEA)30 g / L D-glukoza, 5 g / L ekstrakt drożdżowy, 75 mg / L adenina, 20 g / L agar, pH dostosowane do 5,5 z 1 M HCl.
Mieszanka RNazy A/T1Thermo Fisher ScientificEN0551Stosować zgodnie z zaleceniami producenta
Sterylna pętla do zaszczepiania polistyrenuCorning, Inc.OS101Lub odpowiednik, służy do przenoszenia kolonii z płytek agarowych na płytkę 96-dołkową
Sterylna przestrzeń robocza i palniki
Płytka do hodowli tkankowych, 96-dołkowa optyczna płaska denna z pokrywką o niskiej parowaniuRdzeniowanie, FalconC353072Lub odpowiednik, musi mieć optyczny płaski dno do przygotowania mikropłytki
Zestaw do przygotowania biblioteki TruSeq DNA PCR-Free LT / HTIllumina, Inc.20015962Służy do przygotowania biblioteki sekwencjonowania całego genomu
Ekstrakt drożdżowy, proszekFisher ChemicalBP1422-500Stosować w stężeniu 5 g/l do wytwarzania płynnych i stałych pożywek bogatych (YEA)
z bogatymi pożywkami (YEA)DNA

Bibliografia

  1. McKay, J. K., Latta, R. G. Adaptive population divergence: Markers, QTL and traits. Trends in Ecology and Evolution. 17 (6), 285-291 (2002).
  2. Wood, V., Harris, M. A., et al. PomBase: A comprehensive online resource for fission yeast. Nucleic Acids Research. 40 (D1), (2012).
  3. de Visser, J. A. G. M., Cooper, T. F., Elena, S. F. The causes of epistasis. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 278 (1725), 3617-3624 (2011).
  4. Sailer, Z. R., Harms, M. J. Detecting high-order epistasis in nonlinear genotype-phenotype maps. Genetics. 205 (3), 107911088(2017).
  5. Kuzmin, E., Costanzo, M., Andrews, B., Boone, C. Synthetic genetic arrays: Automation of yeast genetics. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (4), 326-332 (2016).
  6. Tong, A. H. Y., Boone, C. Synthetic genetic array analysis in Saccharomyces cerevisiae. Methods in Molecular Biology. 313 (1), 171-192 (2006).
  7. Dixon, S. J., Costanzo, M., Baryshnikova, A., Andrews, B., Boone, C. Systematic Mapping of Genetic Interaction Networks. Annual Review of Genetics. 43 (1), 601-625 (2009).
  8. Boone, C., Bussey, H., Andrews, B. J. Exploring genetic interactions and networks with yeast. Nature Reviews Genetics. 8 (6), 437-449 (2007).
  9. Bai, X., Yang, Z., Jiang, H., Lin, S., Zon, L. I. Genetic suppressor screens in haploids. Methods in Cell Biology. , 129-136 (2011).
  10. Manson, M. D. Allele-specific suppression as a tool to study protein-protein interactions in bacteria. Methods. 20 (1), 18-34 (2000).
  11. Motter, A. E., Gulbahce, N., Almaas, E., Barabási, A. L. Predicting synthetic rescues in metabolic networks. Molecular Systems Biology. 4, 168(2008).
  12. Peterson, R. T., Shaw, S. Y., et al. Chemical suppression of a genetic mutation in a zebrafish model of aortic coarctation. Nature Biotechnology. 22 (5), 595-599 (2004).
  13. Giorgini, F., Guidetti, P., Nguyen, Q., Bennett, S. C., Muchowski, P. J. A genomic screen in yeast implicates kynurenine 3-monooxygenase as a therapeutic target for Huntington disease. Nature Genetics. 37 (5), 526-531 (2005).
  14. Forsburg, S. L., Patton, E., et al. The art and design of genetic screens. Nature reviews. Genetics. 2 (9), 659-668 (2001).
  15. Johnston, D. S. The art and design of genetic screens. Genetics. 3 (March), 176-188 (2002).
  16. Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: Caenorhabditis elegans. Nature Reviews Genetics. 3 (5), 356-369 (2002).
  17. Gocke, E., Müller, L. In vivo studies in the mouse to define a threshold for the genotoxicity of EMS and ENU. Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 678 (2), 101-107 (2009).
  18. Suzuki, T., Hayashi, M., et al. A comparison of the genotoxicity of ethylnitrosourea and ethyl methanesulfonate in lacZ transgenic mice (Muta(TM)Mouse). Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 395 (1), 75-82 (1997).
  19. Uttam, J., Alberico, C., De Stasio, E. ENU Mutagenesis. International C. elegans Meeting. , (1995).
  20. Putrament, A., Baranowska, H., Ejchart, A., Prazmo, W. Manganese Mutagenesis in Yeast. Methods in Cell Biology. 20, 25-34 (1978).
  21. Bose, J. L. Chemical and UV mutagenesis. Methods in Molecular Biology. 1373, 111-115 (2016).
  22. Ikehata, H., Ono, T. The Mechanisms of UV Mutagenesis. Journal of Radiation Research. 52 (2), 115-125 (2011).
  23. Shrivastav, N., Li, D., Essigmann, J. M. Chemical biology of mutagenesis and DNA repair: cellular responses to DNA alkylation. Carcinogenesis. 31 (1), 59-70 (2010).
  24. De Stasio, E. A., Dorman, S. Optimization of ENU mutagenesis of Caenorhabditis elegans. Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 495 (1-2), 81-88 (2001).
  25. Probst, F. J., Justice, M. J. Mouse mutagenesis with the chemical supermutagen ENU. Methods in Enzymology. 477 (C), 297-312 (2010).
  26. Bähler, J., Wu, J. Q., et al. Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe. Yeast. 14 (10), 943-951 (1998).
  27. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows – Wheeler transform. Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).
  28. Van der Auwera, G. A., Carneiro, M. O., et al. From fastQ data to high-confidence variant calls: The genome analysis toolkit best practices pipeline. Current Protocols in Bioinformatics. 43, 11.10.1-11.10.33 (2013).
  29. Mckenna, A., Hanna, M., et al. The Genome Analysis Toolkit: A MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data. Genome Research. 20, 1297-1303 (2010).
  30. Li, H., Handsaker, B., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  31. Marayati, B. F., Drayton, A. L., et al. Loss of Elongation-Like Factor 1 Spontaneously Induces Diverse, RNase H-Related Suppressor Mutations in Schizosaccharomyces pombe. Genetics. 209 (4), 967-981 (2018).
  32. Harris, M. A., Lock, A., Bähler, J., Oliver, S. G., Wood, V. FYPO: The fission yeast phenotype ontology. Bioinformatics. 29 (13), 1671-1678 (2013).
  33. Xu, X., Wang, L., Yanagida, M. Whole-Genome Sequencing of Suppressor DNA Mixtures Identifies Pathways That Compensate for Chromosome Segregation Defects in Schizosaccharomyces pombe. G3: Genes|Genomes|Genetics. 8 (3), 1031-1038 (2018).
  34. Marayati, B. F., Hoskins, V., et al. The fission yeast MTREC and EJC orthologs ensure the maturation of meiotic transcripts during meiosis. RNA. 22 (9), 1349-1359 (2016).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Sekwencjonowanie ca ego genomuautomatyczny czytnik p ytekkrzy owanie genetycznedefekt wzrostumutogeneza celowanakriokonserwacjagenetyka mendlowska

Powiązane artykuły