Method Article

Przygotowanie próbki do analizy proteomicznej mikronaczyń oka w oparciu o spektrometrię mas

DOI:

10.3791/59140

⸱

February 22nd, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, University Medical Centre of the Johannes Gutenberg University Mainz

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Charakterystyka proteomu łożysk mikronaczyniowych oka jest kluczowa dla dogłębnego zrozumienia wielu patologii oczu u ludzi. Badanie to demonstruje skuteczną, szybką i solidną metodę ekstrakcji białek i przygotowania próbek z małych naczyń krwionośnych, wykorzystującą krótkie tylne tętnice rzęskowe świń jako naczynia modelowe do analiz proteomicznych opartych na spektrometrii mas.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Użycie izolowanych naczyń krwionośnych oka in vitro do rozszyfrowania patofizjologicznego stanu oka przy użyciu zaawansowanych metod technologicznych znacznie poszerzyło nasze zrozumienie niektórych chorób. Proteomika oparta na spektrometrii mas (MS) stała się potężnym narzędziem do odkrywania zmian w mechanizmach molekularnych i szlakach sygnałowych białek w łożyskach naczyniowych w zdrowiu i chorobie. Jednak etapy przygotowania próbki przed analizami w kierunku stwardnienia rozsianego mają kluczowe znaczenie dla uzyskania powtarzalnych wyników i dogłębnego wyjaśnienia złożonego proteomu. Jest to szczególnie ważne w przypadku przygotowania mikronaczyń ocznych, gdzie ilość próbki dostępnej do analizy jest często ograniczona, a tym samym stanowi wyzwanie dla optymalnej ekstrakcji białka. Niniejszy artykuł ma na celu przedstawienie skutecznego, szybkiego i solidnego protokołu przygotowania próbki z przykładowego zagałkowego łożyska naczyniowego oka wykorzystującego krótkie tylne tętnice rzęskowe świni. Niniejsza metoda koncentruje się na procedurach ekstrakcji białek zarówno z supernatantu, jak i osadu próbki po homogenizacji, czyszczeniu próbki za pomocą filtrów odśrodkowych przed jednowymiarową elektroforezą żelową i etapami oczyszczania peptydów w celu bezznacznikowej kwantyfikacji w chromatografii cieczowej-jonizacji elektronatrysko-liniowej pułapce jonowej-Orbitrap MS. Chociaż metoda ta została opracowana specjalnie do analiz proteomicznych mikronaczyń oka, dostarczyliśmy również przekonujących dowodów na to, że można ją również łatwo zastosować w przypadku innych próbek tkankowych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Postęp w dziedzinie proteomiki, który pozwala na zintegrowane i niezrównane gromadzenie danych, znacznie zrewolucjonizował nasze zrozumienie mechanizmów molekularnych leżących u podstaw niektórych stanów chorobowych, jak również w odzwierciedlaniu stanu fizjologicznego określonej populacji komórek lub tkanek1,2,3,4. Proteomika okazała się również ważną platformą w badaniach okulistycznych ze względu na czułość i bezstronną analizę różnych próbek ocznych, które ułatwiły identyfikację potencjalnych markerów choroby do ostatecznej diagnozy i rokowania, czego elegancko dowodzą liczne badania z ostatnich lat, w tym niektóre z naszych1,5,6,7,8,9,10. Jednak często trudno jest uzyskać próbki ludzkie do analiz proteomicznych ze względów etycznych, zwłaszcza biorąc pod uwagę zapotrzebowanie na materiał kontrolny od zdrowych osób do wiarygodnych analiz porównawczych. Z drugiej strony wyzwaniem jest również uzyskanie wystarczającej ilości próbek do optymalnych i wiarygodnych analiz spektrometrii mas. Jest to szczególnie istotne w przypadku materiałów biologicznych o ograniczonej masie, takich jak mikronaczynia krwionośne oka. Jednym z takich głównych zagałkowych naczyń krwionośnych, które odgrywają kluczową rolę w regulacji przepływu krwi w oku, jest krótka tylna tętnica rzęskowa (sPCA). Wszelkie zaburzenia lub anomalie w tym łożysku naczyniowym mogą skutkować poważnymi reperkusjami klinicznymi, które mogą prowadzić do patogenezy kilku chorób zagrażających wzrokowi, takich jak jaskra i nietętnicza neuropatia niedokrwienna przedniego niedokrwiennika nerwu wzrokowego (NAION)11,12. Brakuje jednak badań wyjaśniających zmiany proteomu w tym łożysku tętniczym ze względu na wyżej wymienione wady. Dlatego w ostatnich latach świnia domowa (Sus scrofa domestica Linnaeus, 1758) stała się dobrym modelem zwierzęcym w badaniach okulistycznych ze względu na duże podobieństwa morfologiczne i filogenetyczne między ludźmi a świniami13,14,15. Próbki oczu świń są łatwo dostępne, a co najważniejsze, są dokładniejszym odwzorowaniem tkanek ludzkich.

Biorąc pod uwagę ważną rolę tych naczyń krwionośnych w oku, a także niedostatek metodologii umożliwiającej efektywną ekstrakcję białek i analizy z tych mikronaczyń, wcześniej scharakteryzowaliśmy proteom świńskiego sPCA za pomocą wewnętrznego protokołu, który zaowocował identyfikacją dużej liczby białek16. Na podstawie tego badania zoptymalizowaliśmy i szczegółowo opisaliśmy naszą metodologię w tym artykule, która umożliwia analizę proteomu z niewielkich ilości próbek przy użyciu sPCA świni jako tkanki modelowej. Chociaż głównym celem tego badania było ustalenie metodologii zgodnej ze stwardnieniem rozsianym dla naczyń krwionośnych oka o ograniczonej masie, dostarczyliśmy istotnych dowodów eksperymentalnych na to, że opisany przepływ pracy można również szeroko zastosować do różnych próbek tkankowych.

Przewiduje się, że ten proces pracy będzie kluczowy dla przygotowania wysokiej jakości próbek kompatybilnych z MS z małych ilości materiałów do kompleksowych analiz proteomowych.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury eksperymentalne z wykorzystaniem próbek zwierzęcych zostały przeprowadzone zgodnie z oświadczeniem Stowarzyszenia Badań nad Wzrokiem i Okulistyką (ARVO) dotyczącym wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych oraz wytycznymi instytucjonalnymi. Badanie to zostało przeprowadzone i zatwierdzone w Klinice Okulistyki Uniwersyteckiego Centrum Medycznego w Moguncji.

UWAGA: Oczy świni wraz z nerwem wzrokowym i tkankami zewnątrzgałkowymi zostały pobrane prosto z lokalnej rzeźni bezpośrednio po sekcji zwłok. Wyłuszczone oczy przetransportowano do laboratorium w lodowatym roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i natychmiast użyto. Schematyczny przegląd zastosowanego przepływu pracy jest pokazany na Rysunek 1.

1. Rozwiązania

  1. Aby przygotować bufor Krebsa-Henseleita (K-H), należy zważyć następujące substancje chemiczne (27,68 g NaCl, 8,4 g NaHCO, 3,1,4 g KCl, 1,18 gMgSO4 i 0,64 g KH2PO4) do jednej suchej i czystej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml, a następnie 1,47 g CaCl2 i 8,0 g glukozy do drugiej probówki.
    nuta: Mieszaninę tych chemikaliów w proszku należy przechowywać w chłodnym i suchym miejscu. Mieszaninę CaCl2 i glukozy w proszku najlepiej przygotować na świeżo, aby zapobiec wchłanianiu wilgoci i zbrylaniu.
  2. Aby przygotować 200 μl buforu ekstrakcyjnego 2A na próbkę osadu, należy zmieszać 100 μl buforu ekstrakcyjnego 2 i 100 μl odczynnika A z zestawu do transbłonowej ekstrakcji białek (patrz B6 w Tabeli materiałów).
    nuta: Podwielokrotność składników zestawu do transbłonowej ekstrakcji białek, składającego się z buforu ekstrakcyjnego 2, odczynnika A i koktajlu inhibitorów proteazy, podzielić na porcje robocze i przechowywać w temperaturze -20 °C do przedłużonego stosowania. Unikaj wielokrotnego zamrażania i rozmrażania. Rozmrozić odczynniki do temperatury pokojowej (RT) przed rozpoczęciem procedury ekstrakcji osadów.
  3. Aby przygotować roztwór wodorowęglanu amonu (ABC, 100 mM), rozpuść 0,39 g ABC w 50 ml wody dejonizowanej.
  4. Aby przygotować 10 mM 1, 4-ditiotreitol (DTT), należy rozpuścić 30 mg DTT w 20 ml 100 mM ABC.
  5. Aby przygotować 55 mM roztworu jodoacetamidu (IAA), rozpuścić 200 mg IAA w 20 ml 100 mM ABC.
    nuta: IAA musi być trzymana w niewiedzy. Użyj folii aluminiowej, aby owinąć probówki roztworami wrażliwymi na światło.
  6. Przygotować bufor trypsyny zawierający 10 mM ABC i 10% (obj./obj.) acetonitrylu (ACN). Dodać 1,5 ml buforu trypsyny do jednej fiolki z 20 μg trypsyny, aby rozpuścić jej zawartość i przygotować roztwór roboczy trypsyny o stężeniu 13 ng/μl.
    nuta: Zmodyfikowana trypsyna do sekwencjonowania jest dostarczana w postaci liofilizowanej i musi być przechowywana w temperaturze -20 °C do czasu użycia.
  7. Aby przygotować bufor do ekstrakcji peptydów, należy zmieszać 1:2 (v/v) 5% kwasu mrówkowego z ACN.
    nuta: Przygotuj wszystkie roztwory w krokach 1.3-1.7 świeże tuż przed użyciem i wyrzuć niewykorzystaną objętość.
  8. Aby przygotować 0,1% kwas trifluorooctowy (TFA), wymieszaj 10 μl TFA z 10 ml wody dejonizowanej.

2. Izolacja krótkich tylnych tętnic rzęskowych

UWAGA: Oko świni jest zasadniczo podzielone na przednie (Rysunek 2A) i tylne (Rysunek 2B).

  1. Umieść gałkę oczną w komorze rozwarstwiającej zawierającej lodowaty bufor K-H. Ostrożnie odetnij otaczające mięśnie i tkanki ostrymi nożyczkami Mayo.
  2. Wykonaj nacięcie skalpelem i przetnij kulę ziemską wzdłuż płaszczyzny równikowej ostrymi nożyczkami Mayo, aż oko zostanie rozdzielone na przednią i tylną połowę. Usuń jak najwięcej ciała szklistego z tylnej połowy oka za pomocą pary standardowych kleszczy.
    nuta: Rozdzielenie gałki ocznej na dwie połówki ułatwia łatwe wyizolowanie sPCA bez konieczności posiadania ruchomego oka w naczyniu separacyjnym. Ten krok nie jest jednak obowiązkowy. Naczynia można również odizolować bez otwierania gałki ocznej.
  3. Użyj szpilek preparacyjnych, aby ostrożnie przygwoździć tylną połowę oka siatkówką skierowaną w dół i nerwem wzrokowym skierowanym do góry w kierunku eksperymentatora.
  4. Delikatnie odetnij tkanki łączne otaczające nerw wzrokowy, aby odsłonić leżące pod spodem unaczynienie zagałkowe za pomocą nożyczek sprężynowych Student Vannas.
  5. sPCA może być postrzegana jako krótkie gałęzie naczyń (od 5 do 8 gałęzi), które przenikają do twardówki i obwodowo otaczają głowę nerwu wzrokowego (Ryc. 2C). Odizoluj przywzrokową i dystalną sPCA wraz z otaczającymi tkankami łącznymi za pomocą pary precyzyjnych pęset typu 5 i nożyczek do kapsulotomii Vannas (Rysunek 2D).
    nuta: Upewnij się, że bufor K-H pozostaje lodowaty przez cały czas trwania procedury izolacji. Zdecydowanie zaleca się wymianę bufora co 20-30 minut, w zależności od temperatury otoczenia.

3. Przygotowanie próbki

  1. Delikatnie usuń tkanki łączne z odcinków tętniczych za pomocą precyzyjnej pęsety typu 5 o bardzo cienkiej końcówce i nożyczek do kapsulotomii Vannas pod mikroskopem stereoskopowym i przepłucz izolowane tętnice w lodowatym PBS, aby usunąć zanieczyszczenia i pozostałości krwi.
    nuta: Jeśli próbki nie zostaną natychmiast poddane kolejnym etapom, należy je błyskawicznie zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.
  2. Pobrać tętnice z dwóch oczu, aby uzyskać jedną kontrpróbę biologiczną, przenieść je do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i zważyć próbki za pomocą wagi analitycznej.
  3. Do każdej probówki dodać mieszaninę kulek tlenku cyrkonu o średnicy 0,5 mm i 1,0 mm, a następnie odczynnik do ekstrakcji białek tkankowych (T-PER; patrz B7 w tabeli materiałów).
    nuta: Objętość T-PER zależy od masy próbek w każdej probówce, w stosunku 1 ml odczynnika na 50 mg próbki. Ogólną zasadą, której należy przestrzegać podczas ładowania probówek do homogenizacji, jest stosunek objętości 1:1:2 = próbka: kulki: T-PER (Rysunek 3A). Nie należy stosować zbyt dużej objętości bufora ekstrakcyjnego i zbyt małej ilości kulek, aby zapobiec nieefektywnej homogenizacji.
  4. Załadować probówki z próbkami do homogenizatora mieszającego (patrz D6 w tabeli materiałów). Ustaw timer na 2 min i poziom prędkości 6 i rozpocznij homogenizację. Po uruchomieniu sprawdź próbki pod kątem pełnej homogenizacji i powtarzaj cykl, aż próbki zostaną całkowicie zhomogenizowane (Rysunek 3B).
    nuta: W jednym przebiegu można homogenizować łącznie 24 probówki na próbki. Ważne jest, aby podczas procedury homogenizacji próbki były utrzymywane w niskiej temperaturze, aby zminimalizować denaturację białek. Homogenizator typu bullet blender zastosowany w tym badaniu ma nieodłączną funkcję chłodzenia, która utrzymuje próbki w niskiej temperaturze. W przypadkach, gdy homogenizator nie ma funkcji chłodzenia wewnętrznego, próbki mogą być przechowywane na lodzie pomiędzy każdym cyklem.
  5. Ostrożnie pipetować homogenację do świeżych probówek do mikrowirówek. Odwirować próbki o masie 10 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia nierozpuszczalnych białek i oddzielenia supernatantu zawierającego białka rozpuszczalne. Ostrożnie odpipetować supernatant do świeżych probówek do mikrowirówek, nie dotykając warstwy osadu (Rysunek 3C).
    nuta: Zarówno supernatant, jak i granulat można przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.

4. Trawienie granulek

  1. Dodać 200 μl buforu ekstrakcyjnego 2A i 5 μl koktajlu inhibitorów proteazy do każdej próbki osadu. Zawiesić osad kilka razy za pomocą pipety.
    nuta: Dobrze wymieszaj odczynniki ekstrakcyjne przed dodaniem do osadu. Przechowywać bufor ekstrakcyjny 2A na lodzie, a inhibitor proteazy w temperaturze pokojowej przez cały czas trwania procedury ekstrakcji.
  2. Użyj homogenizatora ultradźwiękowego, aby całkowicie zhomogenizować granulki.
    1. Ustaw amplitudę na 60 i przełącz na 1. Należy użyć sondy wykonanej z tytanu (Ø 0,5 mm, długość 80 mm), która jest odpowiednia do homogenizacji próbek o małych objętościach (10-500 μL).
    2. Zanurz sondę w mieszaninie osadu i buforu ekstrakcyjnego i naciśnij przycisk start, aby wystawić próbkę na działanie fal ultradźwiękowych.
    3. Sonikować próbkę, aż grudki osadu zostaną całkowicie zhomogenizowane. Zrób kilkusekundową przerwę między każdą sonikacją.
    4. Sprawdź wizualnie pełną homogenizację. Wymieszaj homogenat kilka razy pipetą, aby upewnić się, że nie ma grudek.
      nuta: Procedura ekstrakcji osadów powinna być przeprowadzana na lodzie, aby zapobiec denaturacji białek pod wpływem ciepła wytwarzanego podczas homogenizacji (Rysunek 4).

5. Czyszczenie próbek i wymiana bufora

  1. Do tej procedury należy użyć odśrodkowych urządzeń filtrujących z odcięciem 3 kDa (patrz D3 w tabeli materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta z modyfikacjami w razie potrzeby. Najpierw włóż jednostkę filtrującą do probówki mikrowirówki (dostarczonej w zestawie filtrów).
  2. Odpipetować 200 μl próbki homogenizować do jednego urządzenia filtrującego i dodać 200 μl wody dejonizowanej do tego samego filtra. Zakryj go bezpiecznie (Rysunek 5A).
  3. Umieścić jednostkę filtrującą w wirówce i wirować przez 14 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
  4. Wyjąć urządzenie z wirówki i oddzielić jednostkę filtrującą zawierającą koncentrat próbki od probówki mikrowirówki zawierającej filtrat. Wyrzuć filtrat (Rysunek 5B).
  5. Koncentrat należy rozpuścić, dodając 400 μl wody dejonizowanej do jednostki filtrującej. Powtórz kroki 5.3 i 5.4 trzy razy. Ostrożnie odpipetować "oczyszczoną" próbkę koncentratu do czystej mikroprobówki.
    nuta: Zazwyczaj surowa próbka o pojemności 200 μl daje ~50-70 μl koncentratu po filtracji.
  6. Powtórzyć kroki 5.1-5.5 dla pozostałych homogenatów próbki.

6. Pomiar białka

  1. Użyć zestawu do oznaczania białek kwasu bicinchoninowego (BCA) (patrz B5 w tabeli materiałów) w celu oznaczenia stężeń białka w frakcjach supernatantu i osadu w próbkach sPCA na czytniku płytek.
  2. Przygotować roztwory wzorca albuminy (BSA) (końcowe stężenia BSA wahają się od 25 do 2 000 μg/ml) z jednej ampułki o pojemności 1 ml zawierającej 2 mg/ml masy ciała, zgodnie z instrukcjami producenta.
  3. Odpipetować 10 μl każdego wzorca BSA i powtórzeń próbek (zarówno supernatantu, jak i osadu) do każdego dołka 96-dołkowej mikropłytki płaskodennej.
  4. Przygotuj odczynnik roboczy BCA, dodając 50 części odczynnika BCA A do 1 części odczynnika BCA B.
    nuta: Obliczyć całkowitą objętość odczynnika roboczego wymaganą dla każdego pomiaru przed przygotowaniem i świeżo przygotować wystarczającą objętość w oparciu o liczbę próbek i rozcieńczeń wzorcowych, które mają być oznaczone.
  5. Ostrożnie odpipetować 200 μl odczynnika roboczego BCA do każdej studzienki. Przykryć mikropłytkę i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Po schłodzeniu płytki do temperatury suchej temperatury zmierzyć absorbancję przy długości fali 562 nm na czytniku płytek (patrz D13 w Tabeli Materiałów).
  6. Na podstawie krzywej wzorcowej wygenerowanej dla każdego wzorcowego stężenia BSA (μg/ml) należy określić stężenia białek w próbkach.

7. Jednowymiarowa elektroforeza żelowa (1DE)

  1. Przygotować próbki dla 1DE, jak pokazano w tabeli 1 (dla jednej próbki). Mieszaninę próbki dobrze wymieszać pipetą. Podgrzewać próbki w temperaturze 70 °C przez 15 minut i schłodzić do temperatury regulowanej.
  2. Przygotuj 1x Running Buffer, dodając 50 ml MES SDS Running Buffer do 950 ml wody dejonizowanej. Dobrze wymieszaj.
  3. Przygotuj prefabrykowane żele białkowe Bis-Tris 4-12% (patrz B4 w Tabeli Materiałów).
    1. Rozetnij plastikową torebkę, aby wyjąć kasetę z żelem i wypłucz kasetę wodą dejonizowaną.
    2. Wyjmij grzebień z kasety na żel jednym płynnym ruchem, uważając, aby nie uszkodzić studzienek.
    3. Delikatnie przepłucz studzienki załadowcze 2-3 razy za pomocą 1x bufora bieżącego za pomocą pipety. Odwróć i delikatnie potrząśnij kasetą z żelem, aby usunąć bufor, upewniając się, że w studzienkach nie ma pęcherzyków powietrza.
    4. Usuń białą taśmę z dolnej części kaset z żelem.
  4. Włóż żele (maksymalnie dwie kasety) do zbiornika do pracy z żelem, a po całkowitym zmontowaniu zablokuj klin napinający żel.
  5. Napełnij górną (katodową) komorę buforową 200 ml buforu bieżącego, aż studzienki zostaną całkowicie pokryte. Sprawdź, czy nie ma wycieków.
  6. Dodać 500 μl przeciwutleniacza (patrz A14 w Tabeli Materiałów) do buforu do biegania.
    nuta: Przeciwutleniacz jest właściwym odczynnikiem, który musi być stosowany z próbkami zredukowanymi środkiem redukującym (patrz Tabela 1) w celu utrzymania warunków redukcji podczas elektroforezy i zapobieżenia ponownemu utlenianiu wrażliwych aminokwasów, takich jak tryptofan i metionina.
  7. Ostrożnie załadować 50 μg próbki na linię za pomocą pipety. Następnie należy załadować wstępnie wybarwiony wzorzec białka jako marker masy cząsteczkowej (patrz A18 w Tabeli Materiałów).
  8. Napełnij dolną (anodową) komorę buforową 600 ml buforu do biegania.
  9. Uruchom żele na ~60 min przy stałym napięciu 175 V. Pod koniec biegu ostrożnie usuń żel z płytki kasety za pomocą noża do żelu.
  10. Ostrożnie przenieś żele do pudełka do barwienia żelu.
    1. Roztwór utrwalający należy przygotować na świeżo w oparciu o całkowitą liczbę żeli, które należy zabarwić, zgodnie z instrukcjami producenta, jak opisano w Tabeli 2.
    2. Wstrząsaj żelem(ami) w roztworze utrwalającym przez 10 minut w temperaturze pokojowej na platformie bujanej.
  11. Wyrzuć roztwór utrwalający i zabarwiaj żele zestawem do barwienia w kolorze błękitu koloidalnego.
    1. Roztwory barwiące należy przygotować na świeżo w oparciu o całkowitą liczbę żeli, które należy zabarwić, zgodnie z instrukcjami producenta, jak opisano w tabeli 3.
    2. Najpierw odmierz odpowiednią objętość i wymieszaj bezpośrednio składniki oznaczone gwiazdką (*) w pudełku do barwienia żelu. Potrząsaj żelem(ami) w roztworze barwiącym bez barwnika B przez 10 minut w temperaturze pokojowej na bujanej platformie.
    3. Dodaj Stainer B bezpośrednio do pudełka do barwienia zawierającego *roztwór barwiący. Pamiętaj, aby dobrze wstrząsnąć Stainer B przed użyciem.
      ostrożność: Czynności przygotowawcze opisane w pkt 7.10.1 i 7.11.1 należy wykonać pod wyciągiem.
  12. Wstrząśnij żel(ami) w roztworze barwiącym przez noc, aby uzyskać najlepsze ogólne rezultaty.
    nuta: Poplamione pasma staną się widoczne w ciągu 10 minut po dodaniu Stainera B. Barwienie wymaga minimum 3 godzin, a intensywność nie zmienia się, jeśli zostanie pozostawiona na dłuższe godziny w roztworze barwiącym.
  13. Ostrożnie zdekantować roztwór barwiący i zastąp go 200 ml wody dejonizowanej. Potrząsaj żelem (żelami) przez co najmniej 7-8 godzin w wodzie, aby oczyścić tło.
    nuta: Woda dejonizowana musi być kilkakrotnie wymieniana podczas procedury odbarwiania, aby lepiej usunąć nadmierne plamy. Żel(e) można również pozostawić w wodzie do 3 dni bez uszczerbku dla intensywności pasma białkowego. Jeśli żel(e) nie zostanie natychmiast poddany kolejnym etapom, można go przechowywać w 20% roztworze siarczanu amonu w temperaturze 4 °C w celu długotrwałego przechowywania.

8. Trawienie tryptyczne w żelu

UWAGA: Ten protokół jest zgodny z metodą Shevchenko et al.17, z niewielkimi modyfikacjami. Procedurę tę należy przeprowadzić w okapie z przepływem laminarnym i użyć specjalnie do tego celu dedykowanego zestawu pipet, końcówek, probówek i szkła. Przez cały czas noś rękawice i odpowiednią odzież laboratoryjną, aby zapobiec keratynie i innym zanieczyszczeniom. Wszystkie roztwory i odczynniki używane w tej procedurze należy przygotować na krótko przed użyciem.

  1. Usuń pasma białkowe z żelu za pomocą czystych, nowych ostrzy mikrotomu. Pokrój opaskę na małe kawałki (około 1 mm x 1 mm do 2 mm x 2 mm). Ostrożnie przenieś kawałki żelu do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
    nuta: Zbyt małe kawałki mogą zatkać końcówki pipet, a większe kawałki ograniczą odzyskiwanie peptydów. Zachowaj ostrożność podczas używania ostrzy mikrotomów, które są bardzo ostre.
  2. Odbarwienie
    1. Dodać 500 μl roztworu odbarwiającego zawierającego 100 mM roztworu ABC/ACN (1:1, v/v) i inkubować próbki w temperaturze pokojowej przez 30 minut, od czasu do czasu wstrząsając lub wirując.
    2. Ostrożnie odpipetować roztwór odbarwiający. Sprawdź wzrokowo, czy nie ma rurek z resztkami plamy. Powtórz krok 8.2.1, jeśli kawałki żelu są nadal zabarwione na niebiesko.
  3. Redukcja i alkilowanie
    1. Dodać ~400 μL świeżo przygotowanego roztworu naziemnej telewizji cyfrowej i inkubować w temperaturze 56 °C przez 30 min. Upewnij się, że roztwór całkowicie pokrywa kawałki żelu. Ostrożnie odpipetować roztwór redukujący i wyrzucić.
    2. Dodać ~400 μL świeżo przygotowanego roztworu IAA i inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 30 min. Usunąć bufor alkilujący za pomocą pipety i wyrzucić.
  4. trawienie
    1. Dodaj 500 μl czystego ACN w temperaturze pokojowej przez 10-15 minut, aż kawałki żelu skurczą się i staną się nieprzezroczyste. Odpipetuj ACN i suche na powietrzu kawałki żelu przez 5-10 minut pod maską.
    2. Odpipetować 50 μl roztworu trypsyny do każdej probówki, aby całkowicie pokryć kawałki żelu. Inkubować probówki w temperaturze 4 °C przez 30 minut.
    3. Po 30 minutach sprawdź każdą probówkę, czy cały roztwór trypsyny został wchłonięty przez kawałki żelu. Dodać wystarczającą objętość buforu trypsyny (50-100 μl, w zależności od objętości w probówce), aby w razie potrzeby całkowicie pokryć kawałki żelu. Próbki należy inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
  5. Ekstrakcja peptydów
    1. Ostrożnie odpipetować wyekstrahowany roztwór peptydu z probówek i przenieść do czystych mikroprobówek. Wysuszyć supernatant w odśrodkowym parowniku próżniowym.
      nuta: Nie wyrzucaj pozostałych kawałków żelu.
    2. Dodać 100 μl buforu ekstrakcyjnego (patrz krok 1.7) do każdej probówki i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem.
    3. Pipetować supernatant do tych samych mikroprobówek zawierających wyekstrahowane peptydy zgodnie z odpowiednimi pasmami i suszyć w wirówce próżniowej.
      nuta: Suszone ekstrakty peptydowe nie zostaną natychmiast zużyte i mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C do kilku miesięcy do czasu dalszego użycia.

9. Oczyszczanie peptydów

UWAGA: Ta procedura odsalania i oczyszczania próbki peptydu odbywa się przy użyciu końcówek pipet C18 (zobacz C15 w Tabeli Materiałów). Użyj nowej końcówki dla każdej próbki.

  1. Przygotować następujące roztwory świeże w stożkowych probówkach wirówkowych i porcjować do probówek mikrowirówek o pojemności 2 ml w celu przeprowadzenia procedury oczyszczania peptydów, jak pokazano w tabeli 4. Podsumowanie probówek do oczyszczania peptydów jest następujące: Probówka A (roztwór próbki), Probówka B (Roztwór zwilżający), Probówka C (Roztwór równoważący), Probówka D (Roztwór do mycia), Probówka E (Roztwór elucyjny), Probówka F (pusta probówka do mikrowirówki o pojemności 2 ml lub 5 ml, w zależności od liczby próbek do oczyszczenia, do usuwania odpadów) i Probówka G (A czysta, pusta mikroprobówka o pojemności 0,2 ml).
  2. Rozpuść wysuszone ekstrakty peptydowe z kroku 8.6.3 w 10 μl 0,1% TFA. Ta rurka jest oznaczona jako Rura A.
  3. Sonikować probówki A w łaźni ultradźwiękowej z lodem przez 5 min.
  4. Odwirować roztwór próbki w wirówce stołowej o sile 1 000 x g przez 1 minutę.
  5. Ustaw mikropipetę P10 na maksymalną objętość 10 μl i mocno zamocuj końcówkę pipety C18.
  6. Zanurz końcówkę pipety w roztworze zwilżającym (probówka B) i ostrożnie zassaj do materiału opakowaniowego. Powoli dozuj odpady do probówki F. Powtórz ten krok co najmniej 7-8 razy.
    nuta: Wciśnij tłok pipety do martwego punktu i powoli zwalniaj lub dozuj tłok przez cały czas trwania procedury. Należy zachować ostrożność, aby nie wprowadzać pęcherzyków powietrza do końcówek podczas pipetowania, aby zapewnić maksymalne wiązanie peptydów z kolumną C18.
  7. Zrównoważyć końcówkę do wiązania peptydów, zasysając 10 μl roztworu równoważącego w probówce C. Wyrzuć roztwór i powtórz tę procedurę 3 do 4 razy.
  8. Następnie kilkakrotnie odessać i dozować roztwór próbki w probówce A (w zależności od odpowiedniej grubości opaski żelowej), aby związać peptydy z kolumną końcówki.
    ostrożność: Etapy aspiracji i dozowania podczas procedury wiązania (krok 9.8) są przeprowadzane w probówce A. Nie dozować roztworu próbki do marnotrawstwa.
  9. Umyj końcówkę pipety C18, zasysając roztwór myjący do probówki D i wyrzucając go do zmarnowania (probówka F) 4 do 5 razy.
  10. Na koniec wymyj związane peptydy, pipetując roztwór elucyjny (probówka E) i dozując eluant do probówki G.
  11. Powtórz wszystkie kroki od 2 do 3 cykli na próbkę, aby zwiększyć odzysk próbki.
  12. Wyrzuć końcówkę po jednym oczyszczeniu próbki i użyj nowej końcówki do następnej próbki.
  13. Wysuszyć oczyszczone eluatyny peptydowe w koncentratorze próżniowym.
    nuta: Oczyszczone próbki są teraz gotowe do analiz LC-MS/MS w systemie LC-ESI-LTQ-Orbitrap MS. Wysuszone próbki należy przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu dalszego użycia.

10. Chromatografia cieczowa-elektronatrysk-Jonizacja-MS/MS Analizy

UWAGA: Ilościowa analiza proteomiczna bez znaczników jest wykonywana na systemie MS do chromatografii cieczowej, jonizacji elektrorozpylania i liniowej pułapki jonowej. LC składa się z pompy czwartorzędowej Rheos Allegro wyposażonej w odgazowywacz online (sprzężony z automatycznym samplerem HTS PAL), a system składa się z kolumny wstępnej C18 o wymiarach 30 mm x 0,5 mm połączonej z kolumną C18 o wymiarach 150 mm x 0,5 mm. Użyć wodnego rozpuszczalnika A z odwróconą fazą składającego się z wody klasy LC-MS z 0,1% (v/v) kwasem mrówkowym i rozpuszczalnika organicznego B składającego się z acetonitrylu klasy LC-MS z 0,1% (v/v) kwasem mrówkowym. Użyj gradientu o czasie trwania 60 minut na opaskę żelową, jak szczegółowo opisano w naszych poprzednich badaniach6,16.

  1. Rozpuścić oczyszczone próbki peptydów w 10 μl 0,1% TFA. Sonikować próbki na lodzie przez 5 minut.
  2. Pobrać pipetę z 10 μl próbek do 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery V i zamknąć przezroczystą, samoprzylepną folią ochronną.
  3. Przenieś płytkę do automatycznego podajnika próbek.
  4. Dla każdego czasu pracy wynoszącego 60 minut należy stosować następujący gradient: 0-35 min (15-40% rozpuszczalnika B), 35-40 min (40-60% rozpuszczalnika B), 40-45 min (60-90% rozpuszczalnika B), 45-50 min (90% rozpuszczalnika B), 50-53 min (90-10% rozpuszczalnika B) i 53-60 min (10% rozpuszczalnika B).
  5. Należy zastosować następujące warunki spektrometrii mas przyrządu: tryb jonizacji elektronicznej rozpylania jonów dodatnich, napięcie rozpylania (2,15 kV), temperatura kapilary (220 °C), tryb akwizycji zależny od danych, automatyczne przełączanie akwizycji między Orbitrap-MS i LTQ MS/MS, rozdzielczość orbitrapu (30 000), zakres m/z (300 do 1 600), automatyczna kontrola wzmocnienia celu (AGC, 1,0 x 106 jonów), rekalibracja wewnętrzna (polidimethlycyclosiloxane [PCM] przy jonach m/z 445.120025 w czasie rzeczywistym), opcja blokady masy włączona w trybie MS, dane tandemowe uzyskane przez wybór pięciu najintensywniejszych jonów prekursorowych, dalsza fragmentacja przez dysocjację wywołaną zderzeniem (CID), znormalizowana energia zderzenia (NCE, 35% z czasem aktywacji 30 ms z liczbą powtórzeń 3) oraz czas trwania dynamicznego wykluczenia (600 s).
    nuta: Powstałe w ten sposób rozdrobnione jony są rejestrowane w LTQ.
  6. Przeprowadzić co najmniej trzy kontrpróby biologiczne dla każdej próbki.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ograniczona dostępność próbek jest jedną z głównych wad badań okulistycznych. W związku z tym metody ekstrakcji w celu uzyskania optymalnej wydajności białka z małych ilości próbek, takich jak naczynia krwionośne oka, są często dyskusyjne. Do tej pory istnieje niedostatek metod stosowanych w szczególności w przypadku ekstrakcji białek z naczyń krwionośnych zagałkowych. Dlatego, jako pierwszy krok w optymalizacji metody i jako dowód słuszności zasady w celu porównania skuteczności i odporn...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kompleksowe profilowanie proteomu w różnorodnych próbkach oka jest ważnym i niezbędnym pierwszym krokiem do wyjaśnienia mechanizmów molekularnych i szlaków sygnałowych związanych ze zdrowiem i chorobą. W celu uzyskania wysokiej jakości danych i zapewnienia odtwarzalności wyników uzyskanych z tych analiz, kluczowe znaczenie mają poprzednie etapy przygotowania próbki, jak podkreślono w przeglądzie przeprowadzonym przez Mandal i wsp., w którym szczegółowo omówiono procedury przetwarzania próbek dla różnych części oka z zast...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dr Manicam jest wspierany przez Wewnętrzne Finansowanie Badań Uniwersyteckich (Stufe 1) z Uniwersyteckiego Centrum Medycznego Uniwersytetu Jana Gutenberga w Moguncji oraz grant z Deutsche Forschungsgemeinschaft (MA 8006/1-1).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
A. Chemicals
1, 4-Dithiothreitol (DTT)Sigma-Aldrich1.11474
Chlorek wapnia dwuwodny (CaCl2)   Carl Roth 5239.12,5 mM 
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) firmy Dulbecco Thermo Fisher Scientific14190169
Kwas mrówkowy (CH2O2)AppliChemA0748
Acetonitryl klasy HPLC (ACN, C2H3N)AppliChemA1605
Metanol klasy HPLC (CH3OH)Fisher ScientificM/4056/17
Woda klasy HPLC AppliChemA1589
Jodoacetamid (IAA)Sigma-AldrichI6125
Chlorek Kalium (KCl)   Carl Roth 6781.14,7 mM 
Diwodorofosforan kalium (KH2PO4)  Carl Roth 3904.21,2 mM 
Kwas octowy klasy LC-MS  Carl Roth AE69.1
Siarczan magnezu (MgSO4)     Carl Roth 261,21,2 mM 
NuPAGE AntioxidantThermo Fisher Scientific (Invitrogen)NP0005
NuPAGE LDS Bufor do próbek Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)NP00074x
NuPAGE MES SDS Running Buffer Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)NP000220x
NuPAGE Środek redukujący próbki Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)NP000410x
SeeBlue Plus2 wstępnie barwione białko standardowe Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)LC5925
Zmodyfikowana trypsyna klasy sekwencjonowaniaPromegaV5111
Chlorek sodu (NaCl)  Carl Roth 9265,2118,3 mM 
Wodorowęglan sodu (NaHCO3)  Carl Roth 965.325 mM 
Kwas trifluorooctowy (TFA,  C2HF3O2)Merck Millipore108178
α-(D)-(+)- Monohydrat glukozy  Carl Roth 6780.111 mM 
B. Odczynniki i zestawy
0,5 mm kulki z tlenku cyrkonu Następny AdvanceZROB05
Koraliki z tlenku cyrkonu 1,0 mm Next AdvanceZROB10
Barwienie na niebiesko koloidalne  ZestawThermo Fisher Scientific (Invitrogen)LC6025Do barwienia 25 mini żeli w zestawie
NuPAGE 4-12 % Bis-Tri żeleThermo Fisher Scientific (Invitrogen)NP0321BOX1,0 mm, 10-dołkowy
zestaw do oznaczania białek z kwasem bicynchoninowym (BCA) Thermo Fisher Scientific23227
Zestaw do transbłonowej ekstrakcji białek ProteoExtract, TM-PEKMerck Millipore71772-320 reakcji w zestawie
Odczynnik do ekstrakcji białek tkankowych (T-PER)Thermo Scientific78510
C. Narzędzia
96-dołkowe płytki z dnem w kształcie litery VGreiner Bio-One651180
Corning 96-dołkowe płytki z płaskim dnemSigma-AldrichCLS3595-50EA
Jednorazowe ostrza mikrotomupfm Medical207500014
Skalpele jednorazowe #21pfm Medyczne200130021
Szpilki preparacyjne Carl RothPK47.1
Ekstra cienkie nożyczki do bonn  Fine Science Tools14084-08
Stożkowe probówki wirówkowe Falcon (50 ml)Fisher Scientific14-432-22
, Tough cut  Fine Science Tools14130-17
Pęseta precyzyjna  Fine Science Tools11251-10Typ 5
Pęseta precyzyjna, prosta z bardzo cienkimi końcówkamiCarl RothLH53.1Typ 5
Samoprzylepne folie uszczelniające do mikropłytekRatiolab (vWR)RATI6018412
Kleszczyki o standardowym wzorze  Fine Science Tools11000-12
Nożyczki sprężynowe Student Vannas  Fine Science Tools91501-09
Nożyczki do kapsulotomii Vannas   Geuder19760  Proste, końcówki
do pipet ZipTipC18 proste, 77 mm Końcówki do pipetMerck MilliporeZTC18S096
D. Sprzęt i urządzenia
150 × 0,5 mm Kolumna BioBasic C18Thermo Scientific, Rockford, USA72105-150565
30 &razy; 0,5 mm kolumna wstępna BioBasic C18 Thermo Scientific, Rockford, USA72105-030515
Filtry odśrodkowe Amicon Ultra-0,5 3K Merck MilliporeUFC500396opakowanie 96 szt.
Waga analitycznaSartoriusH51
Autosampler CTC Analytics AG, Zwingen, SzwajcariaHTS Pal
BBY24M Bullet Blender Storm Next AdvanceNA-BB-25
Koncentrator Eppendorf, model 5301Sigma-AldrichZ368172
Mikrowirówka Eppendorf, model 5424Fisher Scientific05-403-93Niechłodzona
wirówka Heraeus Primo RThermo Scientific75005440Chłodzony
Labsonic M Homogenizator ultradźwiękowy Pompa SartoriusBBI-8535027
LC-MS, model Rheos AllegroThermo Scientific, Rockford, USASpektrometr masowy 22080
LTQ Orbitrap XL Thermo Scientific, Brema, Niemcy
Czytnik płyt Multiskan Ascent Thermo Labsystemsv2.6
Rotator z wirem neoLab7-0045
Tytanowa sonda (Ø 0,5 mm, długość 80 mm)SartoriusBBI-8535612
Kąpiel ultradźwiękowa, typ RK 31Bandelin329
Xcell Surelock Mini CellLife TechnologiesEl0001
Nożyczki Mayo

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mandal, N., Heegaard, S., Prause, J. U., Honoré, B., Vorum, H. Ocular proteomics with emphasis on two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry. Biological Procedures Online. 12, 56-88 (2010).
  2. Gregorich, Z. R., Ge, Y. Top-down proteomics in health and disease: Challenges and opportunities. Proteomics. 14, 1195-1210 (2014).
  3. Aebersold, R., Mann, M. Mass spectrometry-based proteomics. Nature. 422, 198-207 (2003).
  4. Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537, 347-355 (2016).
  5. Cehofski, L. J., Mandal, N., Honoré, B., Vorum, H. Analytical platforms in vitreoretinal proteomics. Bioanalysis. 6, 3051-3066 (2014).
  6. Manicam, C., et al. Proteomics Unravels the Regulatory Mechanisms in Human Tears Following Acute Renouncement of Contact Lens Use: A Comparison between Hard and Soft Lenses. Scientific Reports. 8, 11526(2018).
  7. Perumal, N., Funke, S., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Characterization of lacrimal proline-rich protein 4 (PRR 4) in human tear proteome. Proteomics. 14, 1698-1709 (2014).
  8. Perumal, N., Funke, S., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Proteomics analysis of human tears from aqueous-deficient and evaporative dry eye patients. Scientific Reports. 6, 29629(2016).
  9. Perumal, N., Funke, S., Wolters, D., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Characterization of human reflex tear proteome reveals high expression of lacrimal proline-rich protein 4 (PRR4). Proteomics. 15, 3370-3381 (2015).
  10. Perumal, N., et al. Characterization of the human aqueous humour proteome: A comparison of the genders. PloS ONE. 12, 0172481(2017).
  11. Hayreh, S. S. Posterior ciliary artery circulation in health and disease the Weisenfeld lecture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45, 749-757 (2004).
  12. Zeitz, O., et al. Glaucoma progression is associated with decreased blood flow velocities in the short posterior ciliary artery. British Journal of Ophthalmology. 90, 1245-1248 (2006).
  13. Verma, N., Rettenmeier, A. W., Schmitz-Spanke, S. Recent advances in the use of Sus scrofa (pig) as a model system for proteomic studies. Proteomics. 11, 776-793 (2011).
  14. Foulds, W. S., Kek, W. K., Luu, C. D., Song, I. C., Kaur, C. A porcine model of selective retinal capillary closure induced by embolization with fluorescent microspheres. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51, 6700-6709 (2010).
  15. Sanchez, I., Martin, R., Ussa, F., Fernandez-Bueno, I. The parameters of the porcine eyeball. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 249, 475-482 (2011).
  16. Manicam, C., Perumal, N., Pfeiffer, N., Grus, F. H., Gericke, A. First insight into the proteome landscape of the porcine short posterior ciliary arteries: Key signalling pathways maintaining physiologic functions. Scientific Reports. 6, 38298(2016).
  17. Shevchenko, A., Tomas, H., Havli, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature Protocols. 1, 2856-2860 (2006).
  18. Feist, P., Hummon, A. B. Proteomic challenges: sample preparation techniques for microgram-quantity protein analysis from biological samples. International Journal of Molecular Sciences. 16, 3537-3563 (2015).
  19. Cox, B., Emili, A. Tissue subcellular fractionation and protein extraction for use in mass-spectrometry-based proteomics. Nature Protocols. 1, 1872-1878 (2006).
  20. Zhang, L., et al. Proteomic analysis of mouse liver plasma membrane: use of differential extraction to enrich hydrophobic membrane proteins. Proteomics. 5, 4510-4524 (2005).
  21. Zhou, H., et al. Improved recovery and identification of membrane proteins from rat hepatic cells using a centrifugal proteomic reactor. Molecular & Cellular Proteomics. 10, 111(2011).
  22. de la Cuesta, F., Mourino-Alvarez, L., Baldan-Martin, M., Moreno-Luna, R., Barderas, M. G. Contribution of proteomics to the management of vascular disorders. Translational Proteomics. 7, 3-14 (2015).
  23. Cottingham, K. 1DE proves its worth... again. Journal of Proteome Research. 9, 1636(2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Ocular MicrovesselsProtein ExtractionMass Spectrometry ProteomicsSample PreparationCentrifugal Filter DevicesOne Dimensional Gel ElectrophoresisPeptide PurificationLiquid Chromatography MSTissue Protein ExtractionPorcine Short Posterior Ciliary Arteries

Related Articles