Tutaj prezentujemy protokół sekwencyjnej celowanej kwantyfikacji i nieukierunkowanej analizy związków fluorowanych w wodzie za pomocą spektrometrii mas. Metodologia ta zapewnia ilościowe poziomy znanych związków fluorochemicznych i identyfikuje nieznane substancje chemiczne w powiązanych próbkach wraz z półilościowymi oszacowaniami ich obfitości.
Artykuł metodologiczny
Identyfikacja per- i polifluorowanych związków chemicznych za pomocą połączonego przepływu pracy spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości z ukierunkowanymi i nieukierunkowanymi badaniami przesiewowymi
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Historyczne i powstające substancje per- i polifluoroalkilowe (PFAS) wzbudziły znaczne zainteresowanie opinii publicznej i agencji rządowych, od poziomu lokalnego do federalnego. Ciągła ewolucja chemii PFAS stanowi wyzwanie dla monitorowania środowiska, w którym ciągły rozwój metod celowanych nieuchronnie opóźnia odkrywanie nowych związków chemicznych. W związku z tym istnieje potrzeba dysponowania perspektywicznymi metodologiami, które mogą wykrywać pojawiające się i nieoczekiwane związki, monitorować te gatunki w czasie i ustalać szczegóły ich struktury chemicznej, aby umożliwić przyszłe prace nad zdrowiem ludzkim. W tym celu nieukierunkowana analiza za pomocą spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości oferuje szerokie podejście do wykrywania baz, które można połączyć z prawie każdym schematem przygotowania próbki i zapewnia znaczące możliwości identyfikacji związku po wykryciu. W niniejszym artykule opisujemy metodę zatężania próbki opartą na ekstrakcji do fazy stałej (SPE), dostosowaną do krótszych łańcuchów i bardziej hydrofilowych substancji chemicznych PFAS, takich jak fluorowane kwasy eterowe i sulfoniany, oraz opisujemy analizę próbek przygotowanych w ten sposób zarówno w trybie ukierunkowanym, jak i niedocelowym. Metody celowane zapewniają lepszą kwantyfikację, gdy dostępne są wzorce referencyjne, ale są z natury ograniczone do oczekiwanych związków podczas przeprowadzania analizy. Z kolei podejście nieukierunkowane może zidentyfikować obecność nieoczekiwanych związków i dostarczyć pewnych informacji na temat ich struktury chemicznej. Informacje o cechach chemicznych można wykorzystać do korelacji związków w różnych lokalizacjach próbek oraz śledzenia obfitości i występowania w czasie.
Wprowadzenie
Klasa substancji per- i polifluoroalkilowych (PFAS) to trwałe zanieczyszczenia organiczne o poważnym zagrożeniu dla zdrowia publicznego. Specyficzne związki kwas perfluorooktanowy (PFOA) i perfluorooktanosulfonian (PFOS) mają zalecane poziomy zdrowotne dla wody pitnej ustalone przez EPA1,2, a ich główna produkcja w USA zakończyła się w 2000 roku3,4. Aby uzyskać znaczące zrozumienie właściwości materiałów PFAS w sferze produkcji tekstyliów i produktów konsumenckich, opracowano setki, jeśli nie tysiące, alternatywnych chemikaliów PFAS w celu wypełnienia nisz produktowych, w tym zamienników przestarzałych związków5,6,7,8. Istnieje ciągła potrzeba monitorowania poziomów środowiskowych perfluorowanych kwasów karboksylowych i sulfonianów o prostym łańcuchu, takich jak PFOS, PFOA i ich pokrewne serie homologiczne, ale pojawiające się związki chemiczne nie są objęte ustalonymi metodami, takimi jak metoda EPA 5379 i często brakuje standardów analitycznych dla tradycyjnej analizy ukierunkowanej. Cel tego protokołu jest zatem dwojaki. Zapewnia ścieżkę do ukierunkowanej analizy LC-MS/MS związków fluorochemicznych w wodzie, w której dostępne są wzorce analityczne, i szczegółowo opisuje bezproblemową integrację nieukierunkowanego podejścia opartego na spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości do analizy danych, które umożliwia wykrywanie nieznanych lub nieoczekiwanych związków w tych samych próbkach.
Ekstrakcja do fazy stałej (SPE) jest sprawdzoną techniką oczyszczania i zagęszczania próbki, z zastosowaniem do wielu analitów i matryc próbek10,11. Do analizy PFAS wiele stałych faz retencyjnych, w tym niepolarne, funkcjonalizowane kolumny polarne i jonowymienne, zostało w różnym stopniu użytych dla podklas gatunków fluorowanych w szerokiej gamie matryc9,12,13,14,15,16. Postępy w analizie próbek SPE przy użyciu konfiguracji on-line znacznie zwiększają wydajność podejścia i poprawiają odtwarzalność obsługi próbek, ale podstawowy proces pozostaje niezmienny17. Podjęto również pewne wysiłki w celu usunięcia stężenia SPE offline za pomocą wstrzyknięć o dużej objętości, ale wymagają one modyfikacji chromatografii, które umieszczają je poza sferą potocznej analizy18,19. Nasza analiza próbki wykorzystuje polimeryczną fazę retencyjną słabej wymiany anionów (WAX) w celu dokładnego oddzielenia kwaśnych materiałów PFAS od tradycyjnych zanieczyszczeń organicznych przy jednoczesnym osiągnięciu znacznych współczynników stężenia próbki. Ta faza WAX jest ważna dla wychwytywania krótkołańcuchowych kwasów perfluorowanych, takich jak sulfonian perfluorobutanu (PFBS) lub etery perfluorowane, takie jak kwas dimerowy tlenku heksafluoropropylenu (HFPO-DA), które są bardziej polarne niż starsze gatunki perfluorowane o dłuższym łańcuchu20,21. Ponieważ w ostatnich latach chemii PFAS nastąpiła znacząca zmiana w kierunku krótszych łańcuchów fluorowanych i włączenia eteru5, ten wybór faz umożliwia dokładniejsze odzyskiwanie nowych związków do analizy MS.
Ukierunkowana kwantyfikacja LC-MS/MS przy użyciu uwierzytelnionych wzorców i stabilnych wzorców wewnętrznych znakowanych izotopami zapewnia niezrównany poziom swoistości i czułości dla analizy ilościowej. Chociaż takie podejście jest pożądane w wielu sytuacjach, jest niepraktyczne w zbyt powszechnych sytuacjach w analizie. Podejścia celowane sprawdzają się tylko w przypadku gatunków, które są oczekiwane w próbce i dla których metody zostały wcześniej ustalone. W przypadku nowych i powstających związków podejście to nie jest nawet w stanie wykryć gatunków, które mogą być interesujące, niezależnie od ich składu chemicznego lub stężenia, a spektrometry mas o niskiej rozdzielczości są prawie niezdolne do dostarczenia wystarczającej ilości informacji, aby jednoznacznie przypisać chemiczne nieznane związki. W związku z tym pojawiła się dziedzina analizy nieukierunkowanej, wykorzystująca moc nowoczesnych spektrometrów masowych o wysokiej rozdzielczości do analizy próbek bez z góry założonej hipotezy i wstecznego przypisywania substancji chemicznych do wykrywalnych cech próbki. Podejście to jest szeroko stosowane w dziedzinach biologii22,23,24 i nauk o środowisku25,26,27 na wielu klasach chemikaliów. Perfluorowane chemikalia są szczególnie łatwe do zidentyfikowania w tej metodzie ze względu na ich unikalne wzorce widma masowego, a w ciągu ostatnich kilku lat opisano setki związków5,28.
Omawiany tutaj protokół ma na celu dostosowanie ukierunkowanej oceny ilościowej LC-MS/MS PFAS do potrzeby identyfikacji i półilościowego monitorowania pojawiających się interesujących związków. Techniki selekcji faz SPE i przygotowania próbek mają na celu zapewnienie wychwytywania z wody bardziej hydrofilowych powstających kwasów PFAS i mogą być mniej odpowiednie dla długołańcuchowych form polimerowych i niejonowych. Co więcej, dane generowane przez analizę nieukierunkowaną są gęste i mają dużą wymiarowość, co wymaga użycia oprogramowania do analizy danych. Takie pakiety oprogramowania są często specyficzne dla dostawcy i wymagają modyfikacji w celu działania między platformami urządzeń. Tam, gdzie to możliwe, proces analizy został opisany w sposób ogólny i odniesiono się do alternatyw open source/freeware, ale skuteczność i dokładność każdego podejścia do oprogramowania musi być oceniana indywidualnie.
Protokół
1. Pobieranie próbek wody
- Przygotowanie standardowych zapasów PFAS
- Przygotować wzorcową mieszaninę PFAS w metanolu zawierającą dowolne docelowe związki będące przedmiotem zainteresowania (np. PFOA, PFOS, HFPO-DA) w stężeniu 1 ng/μl. To jest natywna mieszanina PFAS. Dostępne są również mieszanki przygotowane na rynku (tj. PFAC Mix A i Mix B).
- Przygotować wzorcową mieszaninę zawierającą dopasowane związki PFAS znakowane stabilnymi izotopami (SIL) (np. 13C 4-PFOA, 13C8-PFOS, 13C3-HFPO-DA) w stężeniu 1 ng/μl. To jest mieszanina IS PFAS. Dostępne są również mieszanki przygotowane na rynku (tj. MPAFC Mix A i Mix B).
UWAGA: Jeśli wersja SIL docelowego PFAS jest niedostępna, można użyć substytutu o podobnej budowie i długości łańcucha (np. 13C 2-PFHxA dla HFPO-DA)
- Przygotowanie próbek ślepej próby polowej (FB), ślepej próby kolca (SB)
- Napełnij dwie czyste butelki z polipropylenu (HDPE) lub polipropylenu (PP) o dużej gęstości 1,000 ml laboratoryjnej wody dejonizowanej (DI), o której wiadomo, że nie zawiera PFAS.
UWAGA: Materiały PFAS często mają nieokreśloną toksyczność i/lub rakowalność. Należy zachować ostrożność, aby nie dopuścić do kontaktu doustnego lub skórnego z roztworami wzorcowymi lub podstawowymi. - Dodać pewną ilość mieszaniny wzorcowej PFAS do jednej z butelek o stężeniu końcowym równoważnym oczekiwanym stężeniom próbki (np. 100 ng/l). To jest Spike Blank (SB).
- Dodaj 5 ml 35% środka konserwującego kwas azotowy do Spike Blank.
- Przenieść zarówno próbkę SB, jak i ślepą próbę polową bez kolców do miejsca pobierania próbek jako kontrolę.
- Napełnij dwie czyste butelki z polipropylenu (HDPE) lub polipropylenu (PP) o dużej gęstości 1,000 ml laboratoryjnej wody dejonizowanej (DI), o której wiadomo, że nie zawiera PFAS.
- Pobieranie próbek w terenie
UWAGA: Osoba zbierająca próbki powinna nosić rękawice nitrylowe i w miarę możliwości pobierać próbki z systemów przepływowych. Próbki z kranu powinny mieć możliwość przepływu i zrównoważenia przed pobraniem próbek (2-3 min).- Zbierz 500-1,000 ml wody z terenu w czystej butelce HDPE lub PP.
- Dodaj 5 ml 35% środka konserwującego kwas azotowy do butelek na próbki i pola ślepego.
UWAGA: Kwas azotowy jest i silnie utleniający
2. Pobieranie próbek
UWAGA: PFAS są wszechobecne i trwałe. Upewnij się, że wszystkie rozpuszczalniki są najwyższej jakości i zostały przeanalizowane pod kątem niskiego poziomu zanieczyszczenia PFAS. Przed przygotowaniem ślepych prób i próbek należy dokładnie wypłukać cały sprzęt laboratoryjny używany do przygotowania wzorców.
- Obróbka wstępna próbki
- Wlać każdą próbkę do oddzielnego, wstępnie oczyszczonego cylindra z podziałką HDPE o pojemności 1 l i zanotować dokładną objętość.
- Dodaj 10 ml metanolu do opróżnionej butelki z próbką, zakręć ją i dobrze wstrząśnij, aby wypłukać zaadsorbowane PFAS z wnętrza butelki.
- Odmierzoną próbkę wody należy umieścić z powrotem w wypłukanej butelce z płukanką metanolową.
- Krzywa wzorcowa do oznaczania ilościowego
- Napełnij osiem butelek o pojemności 1 l HDPE/PP wodą DI wolną od PFAS.
- Wybierz osiem równomiernie rozłożonych stężeń obejmujących żądany zakres ilościowy. Na przykład: 10, 25, 50, 100, 250, 500, 750 i 1 000 ng/L dla zakresu 10-1 000 ng/L.
- Dodać pewną ilość natywnej mieszanki PFAS do każdej butelki, aby uzyskać końcowe stężenia PFAS w 2.2.2 (np. 100 μL PFAS Mix A na 1 l wody DI = 100 ng/L).
- Dodatek do wzorca wewnętrznego
UWAGA: Dodanie wzorca wewnętrznego znakowanego stabilnym izotopem (IS) jest konieczne tylko wtedy, gdy oprócz analizy nieukierunkowanej pożądane są wyniki ilościowe.- Dodać mieszaninę IS PFAS do każdej próbki w stężeniu zbliżonym do punktu środkowego krzywej kalibracyjnej (np. 250 μl mieszaniny IS PFAS = 250 ng/l)
- filtracja
- Przefiltrować próbki przez filtry z włókna szklanego GF/A (47 mm, wielkość porów 1,6 μm) pod delikatnym podciśnieniem do wstępnie oczyszczonej kolby próżniowej o pojemności 1 l HDPE.
- Jeśli w butelce pozostaną cząstki stałe, spłucz filtr dodatkową wodą dejonizowaną. Przefiltrowaną wodę należy umieścić z powrotem w butelce z próbką lub w nowym pojemniku do ekstrakcji do fazy stałej.
- Ekstrakcja do fazy stałej (SPE)
UWAGA: Opisane tutaj stężenie we wkładzie wykorzystuje pompę tłokową o stałym przepływie. Alternatywne metody zatężania przy użyciu kolektora próżniowego20 lub przy użyciu konfiguracji on-line SPE-LC-MS17 są możliwe, ale nie są omawiane.- Kondycjonować wkład ze słabą wymianą anionową (WAX) z 25 ml metanolu.
- Kondycjonuj wkład WAX dodatkowymi 25 ml wody dejonizowanej.
- Umieść rurki pompy w przefiltrowanych butelkach na próbki i oznacz wkłady SPE odpowiednimi nazwami próbek.
- Przepompować 500 ml próbki wody przez wkład ze stałym natężeniem przepływu 10 ml/min (łącznie 500 ml), odrzucając przepływającą ciecz do odpadów.
UWAGA: Większe lub mniejsze objętości mogą być skoncentrowane w zależności od oczekiwanych stężeń próbki. - Wyjmij wkład z pompy tłokowej w celu elucji.
UWAGA: W przypadku zagęszczania dodatkowych próbek za pomocą tej samej pompy, pompę tłokową należy przepłukać 25 ml metanolu przed zainstalowaniem następnego wkładu w celu zrównoważenia. - Przenieś wkład SPE do kolektora próżniowego i wyposaż w zewnętrzny szklany zbiornik .
- Przepłukać wkład SPE 4 ml buforu octanu sodu o pH 4,0 o pH 4,0 w delikatnym podciśnieniu. Odrzuć przepływ. Umyj wkład SPE 4 ml neutralnego metanolu.
UWAGA: Neutralną frakcję płuczącą można zebrać, jeśli spodziewane są określone niejonowe anality polarne. W przeciwnym razie wyrzuć do zmarnowania - Umieść 15 ml polipropylenowej probówki wirówkowej pod każdym wkładem SPE, aby zebrać eluent. Elutę próbki za pomocą 4 ml 0,1% wodorotlenku amonu w metanolu.
- Wyjąć rurkę elucyjną i zmniejszyć objętość eluatu do 500 - 1 000 μl poprzez odparowanie pod suchym strumieniem azotu w łaźni wodnej o nieznacznie podwyższonej temperaturze (40 °C).
- Skoncentrowane ekstrakty próbek można przechowywać przed analizą w temperaturze pokojowej.
- Ukierunkowana ocena ilościowa LC-MS/MS
- Rozcieńczyć 100 μl ekstraktu próbki w 300 μl 2 mM buforu octanu amonu do fiolki z próbką HPLC.
- Skalibruj i zrównoważ systemy HPLC i MS zgodnie z instrukcjami producenta.
UWAGA: PFAS w tle są powszechnie wykrywane ze względu na stosowanie składników fluoropolimerowych w większości systemów LC oraz w przegrodach fiolek z próbkami. Przed użyciem należy upewnić się, że wykrywalne poziomy w ślepych próbach są znikome. Tam, gdzie to możliwe, sugerowana jest modyfikacja systemu LC w celu zastąpienia elementów teflonowych. Sugerowane jest również użycie analitycznej kolumny "podtrzymującej" przylegającej do zaworu mieszającego LC29. - Przygotuj analityczną listę roboczą składającą się z krzywej standardowej, próbek i dodatkowej repliki krzywej standardowej, aby ocenić dryf instrumentalny w całym przebiegu. Przykładowa lista robocza znajduje się w tabeli 1.
- Analizować próbki przy użyciu metod LC i MS ustalonych dla docelowego związku lub docelowych związków. Przykładowy gradient LC przedstawiono w tabeli 2, a parametry metody MS przedstawiono w tabelach 3 i 4. Dalsze szczegółowe dyskusje można znaleźć w McCord et al.21.
- Wygeneruj krzywą wzorcową z próbek wzorcowych, wykorzystując stosunek powierzchni piku analitu do wzorca wewnętrznego w funkcji stężenia analitu. Wygeneruj formułę regresji kwadratowej z wagą 1/x do przewidywania stężenia9.
- Określić ilościowo docelowe anality w każdej próbce, korzystając z przygotowanych krzywych wzorcowych i stosunku powierzchni (obszar standardowy/obszar IS) dla każdego pomiaru.
- Jeśli stężenie przekracza zakres kalibracji, rozcieńczyć pierwotną próbkę wodą demineralizowaną z dodatkiem odpowiedniego stężenia IS i ponownie wyekstrahować, aby doprowadzić stężenie do odpowiedniego zakresu.
- Niedocelowe gromadzenie danych LC-MS/MS
- Rozcieńczyć 100 μl ekstraktu próbki w 300 μl 2 mM buforu octanu amonu do fiolki z próbką HPLC.
- Skalibrować i zrównoważyć HPLC i MS o wysokiej rozdzielczości zgodnie z instrukcjami producenta.
- Przygotować analityczną listę roboczą jak w ppkt 2.6.2.
- Korzystając z oprogramowania przyrządu, zbierz dane LC-MS za pomocą szerokiego skanowania MS1 w trybie zależnym od danych, aby zebrać MS/MS. Przykładowy gradient LC w tabeli 5. Więcej informacji na temat ustawień przyrządów można znaleźć w Strynar et al.30 oraz Newton et al.31.
UWAGA: W celu poprawy jakości MS/MS można przeprowadzić analizę zależną od danych z preferowaną listą jonów podzbioru cech pozostałych po przetworzeniu danych w 2.8.1-2.8.8.
- Nieukierunkowane przetwarzanie danych
UWAGA: Analizę danych można przeprowadzić za pomocą szerokiej gamy oprogramowania, a metody te nie odzwierciedlają jedynej lub najlepszej metody dla dowolnego zestawu danych. Tam, gdzie to możliwe, kroki zawierają ogólny opis, który można wykonać w alternatywnym oprogramowaniu. Przetwarzanie przykładowych danych użytych w tym manuskrypcie zostało przeprowadzone przy użyciu oprogramowania specyficznego dla dostawcy (Oprogramowanie 1 i Oprogramowanie 2), zgodnie z opisem w Newton et al.31.- Wykonaj ekstrakcję cech molekularnych cech chemicznych za pomocą jednego z kilku pakietów oprogramowania open source32,33 lub oprogramowania dostawcy, aby zidentyfikować masy monoizotopowe, czasy retencji i zintegrowane obszary pików cech chemicznych.
- W obszarze Oprogramowanie 1 wybierz opcję Dodaj/Usuń przykładowe pliki > Dodaj pliki i wybierz nieprzetworzone dane z eksperymentu niedocelowego, a następnie naciśnij przycisk OK.
- W obszarze Oprogramowanie 1 wybierz opcję Batch Recursive Feature Extraction (Wyodrębnianie funkcji cyklicznych wsadowych) > Open Method (Metoda otwarta), aby załadować wstępnie ustaloną metodę, lub ręcznie edytuj ustawienia oprogramowania. Ustawienia programu Profinder dotyczące wyodrębniania obiektów znajdują się w Tabeli 6.
- W Oprogramowaniu 1 po wyodrębnieniu funkcji wybierz opcję Plik > Eksportuj jako CSV..., Plik > Eksportuj jako CEF... lub Plik > Eksportuj jako PFA... w celu dalszego przetwarzania. Zakłada się, że pliki CEF będą używane dla pozostałej części opisu.
- W oprogramowaniu 2 (MPP) utwórz nowy eksperyment z Kreatorem importu danych typu Niezidentyfikowany i Przepływ pracy, a następnie kliknij przycisk OK.
- W MPP wybierz opcję Pliki danych i zlokalizuj wyeksportowane wyniki oprogramowania 1 (CEF lub PFA) do zaimportowania, a następnie klikaj przycisk Dalej, aż pojawią się opcje parametru wyrównania.
- W MPP ustaw wartości wyrównania złożonego na 0,0 (wyrównanie zostało już wykonane w wyodrębnianiu funkcji w kroku 2.8.1.2 oprogramowania 1), a następnie klikaj przycisk Dalej, wykonując kolejne kroki, aż dostępna będzie opcja Zakończ.
- Filtruj identyfikatory na podstawie odtwarzalności analitycznej. W przypadku gdy dostępnych jest wiele próbek, cechy powinny być obecne w >80% poszczególnych kontrprób, a ich analityczny współczynnik zmienności (CV) powinien wynosić < 30 %
- W MPP wybierz Konfiguracja eksperymentalna > Grupowanie eksperymentów i przypisz każdemu plikowi raw grupę odpowiadającą jego próbce źródłowej (tj. repliki z tego samego źródła powinny znajdować się w tej samej grupie). Można utworzyć wiele grup odpowiadających zmiennym zagnieżdżonym (np. repliki instrumentalne i techniczne).
- W MPP wybierz Ustawienia eksperymentalne > Utwórz interpretację, a następnie wybierz parametr eksperymentu (tj. grupę) i klikaj przycisk Dalej, aż będzie dostępna opcja Zakończ. Spowoduje to utworzenie kategorii, na której będzie można operować w przyszłości.
- W MPP wybierz Kontrola jakości > Filtruj według częstotliwości. Ustaw Listę encji na Wszystkie jednostki i Interpretację na przykładową grupę (nieuśrednioną) utworzoną w 2.8.2.2, a następnie naciśnij przycisk Dalej.
- W polu Parametry wejściowe ustaw przechowywanie jednostek na 80% próbkowania w co najmniej jednym warunku, a następnie klikaj przycisk Dalej, dopóki opcja Zakończ nie będzie dostępna. Nazwij listę Funkcje filtrowane częstotliwościowo
- W MPP wybierz Kontrola jakości > Filtruj według zmienności próbki. Ustaw listę encji na Funkcje filtrowane z częstotliwością z 2.8.2.4 i interpretację na Grupuj (nieuśrednione), a następnie naciśnij Dalej.
- Wybierz przycisk radiowy dla danych pierwotnych i Zakres zainteresowania do Współczynnik zmienności < 30%. Kliknij Dalej> Zakończ i zapisz listę jako Funkcje filtrowane CV.
- Usuń obiekty, w przypadku których żadna próbka nie ma znacznie większej (>3-krotnej) liczebności niż próbka ślepej próby pola (FB).
- W MPP wybierz Analiza > Zmiana składania. Ustaw Listę encji na Funkcje filtrowane CV i Interpretację na przykładową grupę, a następnie naciśnij przycisk Dalej. Wybierz opcję zmiany krotności na Wszystkie względem pojedynczego warunku i wybierz warunek FB lub dowolną nazwę grupy dla pustej przetworzonej próbki.
- Na następnym ekranie ustaw odcięcie Fold-Change na 3.0 i kliknij do końca monitów. Zapisz listę jako listę filtrowaną FC.
- Wykonaj binarne porównania poszczególnych próbek będących przedmiotem zainteresowania z odpowiednią próbką tła (np. przed i za źródłem punktowym) w celu określenia zmian fałdowania dla poszczególnych cech chemicznych.
- W MPP wybierz Analiza > Filtruj na wykresie wulkanu. Ustaw listę encji na Lista filtrowana FC i Interpretacja na Grupa.
- Dla pary warunków krotności-zmiany wybierz dwie próbki do porównania (np. sparowaną próbkę przed i za próbką) i wybierz test Mann-Whitney Unpaired.
- W przypadku analizy wstępnej nie wybieraj wartości do wielokrotnej korekty testowej Na następnym ekranie kliknij na wykres wyników.
- Na ekranie wyników wybierz wartość odcięcia zmiany zagięcia wynoszącą 3,0 i wartość odcięcia wartości p równą 0,1. Następnie zakończ i wyeksportuj listę jako wyniki wstępne.
- Dla każdej cechy pozostałej po przefiltrowaniu wygeneruj przewidywane wzory chemiczne na podstawie dokładnego widma masowego i kompozytowego.
- W MPP wybierz pozycję Interpretacja wyników > identyfikacji IDBrowser i listę jednostek Wyniki wstępne.
- W IDBrowser wybierz opcję Zidentyfikuj wszystkie związki przy użyciu generatora wzorów cząsteczkowych (MFG) jako metodę identyfikacji.
- W opcjach Generuj formułę dodaj wartość F w kolumnie Elementy i ustaw wartość Maksimum na 50, a następnie wybierz pozycję Zakończ. Po wygenerowaniu formuły wybierz pozycję Zapisz i zwróć, aby powrócić do MPP.
- W MPP kliknij prawym przyciskiem myszy przefiltrowaną i dopasowaną listę encji MFG i wybierz polecenie Eksportuj listę. Zapisz wyniki.
- Zbadaj masę monoizotopową gatunków na liście zredukowanych istotnych cech chemicznych dla tych, które zawierają defekty masy wskazujące na fluorowanie; patrz Kind i Fiehn34.
- Zwróć uwagę na serie chemiczne zawierające typowe motywy polifluorowania (CF2 (m/z 49.9968), CF2O (m/z 65.9917), CH2CF2O (m/z 80.0074) itp.) przy użyciu wykresu defektów masy lub algorytmu oprogramowania; patrz sekcja dyskusji, Liu et al.17, Loos et al.35 oraz Dimzon et al.36.
- Przeszukuj przewidywane wzory chemiczne lub neutralne masy w bazie danych EPA Chemistry Dashboard i/lub innych bazach danych, aby zwrócić potencjalne struktury chemiczne.
- Otwórz narzędzie do wyszukiwania partii EPA Comptox Chemicals Dashboard (https://comptox.epa.gov/dashboard/dsstoxdb/batch_search) i wklej listę identyfikatorów (formuł lub mas) w polu identyfikatora, po wybraniu typu identyfikatora (tj. Formuła gotowa dla MS lub Masa monoizotopowa).
- Wybierz opcję Pobierz dane chemiczne..., a także wybierz z listy rozwijanej dowolne dane fizyczne/chemiczne/toksykologiczne dotyczące potencjalnych dopasowań.
- Korzystając z intuicji chemicznej i dostępnych danych referencyjnych, usuń mało prawdopodobne dopasowania z listy potencjalnej struktury chemicznej dla każdej formuły w oparciu o wykonalność ze względu na stabilność chemiczną, właściwości fizyczne, takie jak jonizacja lub hydrofobowość, obecność chemikaliów wytwarzających z pobliskich źródeł itp. W przypadku braku dodatkowych danych, wykonalność spektralna może być uszeregowana wyłącznie na podstawie rozpowszechnienia w literaturze; zob. McEachran et al.37.
- Potwierdź struktury za pomocą dostępnych standardów i/lub ukierunkowanego dopasowania MS/MS o wysokiej rozdzielczości do widm z baz danych, widm teoretycznych in silico lub ręcznego kuratorstwa.
- Wykonaj ekstrakcję cech molekularnych cech chemicznych za pomocą jednego z kilku pakietów oprogramowania open source32,33 lub oprogramowania dostawcy, aby zidentyfikować masy monoizotopowe, czasy retencji i zintegrowane obszary pików cech chemicznych.
Wyniki
Ilościowe wyniki LC-MS/MS przedstawione są w formie chromatogramów jonowych dla całkowitego chromatogramu jonowego (TIC) oraz wyekstrahowanych chromatogramów jonowych (EIC) dla konkretnych przejść chemicznych mierzonych substancji (Rycina 1). Zintegrowana powierzchnia piku przejścia chemicznego jest powiązana z zawartością związku i może być wykorzystana do obliczenia dokładnego stężenia przy użyciu krzywej kalibracyjnej znormalizowanej względem wzorca wewnętrznego (Rycina 2). Niski lub płaski sygnał poszczególnych analitów wskazuje, że zakres kalibracji wykracza poza zakres liniowy spektrometru mas lub że instrument wymaga strojenia/kalibracji. Słaba precyzja powtórzeń wskazuje na problem z wtryskiem próbki lub niespójną chromatografią, co wymaga modyfikacji parametrów LC.
Analiza nietargetowa z wykorzystaniem pełnego skanowania MS1 generuje TIC dla próbek (Rysunek 3), co umożliwia doraźne tworzenie EIC dla poszczególnych jonów (Rysunek 4). Każdy dany punkt czasu chromatograficznego zawiera sygnały dla gatunków chemicznych, a w przypadku zastosowania spektrometru mas o wysokiej rozdzielczości – również odcisk izotopowy związku. Identyfikacja związków ze skanu MS1 jest przeprowadzana programowo przez algorytm detekcji pików (peak-picking) z wykorzystaniem jednego z kilku podejść38,39,40. Detekcja pików pozwala na wyodrębnienie cech chemicznych z pomiarem dokładnej masy i czasu retencji chromatograficznej, a także widma masowego jonu oraz pola powierzchni piku chromatograficznego. Informacje te są zazwyczaj przechowywane w formacie cyfrowej bazy danych w celu dalszego przetwarzania i filtrowania, jednak zagnieżdżony i powiązany charakter danych można zrozumieć koncepcyjnie (Rysunek 5).
Lista cech jest filtrowana pod kątem związków spełniających jedno z kilku kryteriów, aby zostały wybrane do dalszych badań. Pierwszym i najprostszym z nich jest filtrowanie według defektu masy (różnicy między masą dokładną a masą nominalną danej cechy). Związki PFAS wykazują ujemne defekty masy (Rycina 6) ze względu na przewagę atomów fluoru, natomiast związki polifluorowane mają dodatnie, lecz znacznie mniejsze defekty masy niż homologiczne materiały organiczne31,34. Drugim etapem filtrowania metodą analityczną jest identyfikacja serii homologicznych zawierających jednostki powtarzalne typowe dla gatunków PFAS, takie jak CF2 lub CF2O. Ich identyfikacja może być przeprowadzona przy użyciu wykresów defektu masy Kendricka17,36 lub pakietów oprogramowania, takich jak pakiet nontarget w języku R35 (Rycina 7).
Po filtrowaniu można rozpocząć przypisywanie tożsamości chemicznej gatunkom z krótkiej listy związków wykazujących wysoką różnicowość w obserwacjach i/lub wstępnie zidentyfikowanych jako związki per-/polifluorowane. Dokładna masa dostarcza stosunkowo krótkiej listy potencjalnych wzorów chemicznych do dopasowania, jednak jest niewystarczająca do identyfikacji bez zastosowania dopasowania widmowego do rozkładu izotopowego widma masowego41. Na podstawie danych MS1 o wysokiej rozdzielczości jeden lub więcej domniemanych wzorów chemicznych jest dopasowywanych do profilu izotopowego widma masowego i ocenianych (Rycina 8). Wzory do dopasowania mogą być generowane ab initio z wykorzystaniem określonego zestawu atomów lub pochodzić z połączenia związków opisanych w literaturze oraz zawartości jednej lub więcej baz danych. Panel chemiczny US EPA (https://comptox.epa.gov/dashboard/) zawiera stale aktualizowaną listę związków PFAS zidentyfikowanych przez agencję, a także listy opracowane przez inne organizacje, takie jak NORMAN Network42.
Wzory chemiczne można dodatkowo potwierdzić, a pewne informacje strukturalne można uzyskać ze spektra MS/MS (Rysunek 9). Potencjalne struktury są dostępne w dużych bazach danych chemicznych, takich jak EPA chemistry dashboard, Pubchem, CAS registry itp. Przewidywane spektra można wygenerować lub pozyskać za pomocą różnych programów fragmentacji i przypisać je do struktur,43 lub spektra MS/MS można interpretować ręcznie.
Przykładowa macierz danych dostępna jest w Informacjach Uzupełniających i zawiera pełną macierz cech z dziesięciu próbek (5 powyżej i 5 poniżej nurtu) pobranych powyżej i poniżej punktowego źródła zanieczyszczeń fluorochemicznych. Każdy wiersz reprezentuje cechę chemiczną z przypisanym czasem retencji, masą neutralną, widmem mas oraz surową obfitością dla każdej próbki. (Tabela uzupełniająca, Arkusz 1). Wstępne filtrowanie (Tabela uzupełniająca, Arkusz 2) pod kątem ujemnego deficytu masy oraz istotności statystycznej w nieparzystym teście t między próbkami pobranymi powyżej i poniżej nurtu redukuje liczbę „ciekawych” cech chemicznych do ok. 120. Przewidywane wzory chemiczne uzyskano z programu Agilent IDBrowser i przeszukano w bazie EPA Comptox Chemicals Dashboard, co pozwoliło na znalezienie możliwych dopasowań (Tabela uzupełniająca, Arkusz 3). Dla każdego wzoru chemicznego przypisano wynik „top-hit” na podstawie źródeł danych37 (Tabela uzupełniająca, Arkusz 4). Należy zauważyć, że ponad połowa pozostałych cech nie posiada dopasowań wysokiej jakości. Zidentyfikowane cechy bez dopasowań mogą być wynikiem fragmentacji w źródle/tworzenia adduktów, błędnego przypisania wzoru lub identyfikacji PFAS-ów niewystępujących w bazie źródłowej. Interpretacja surowych widm w celu walidacji przypisań wykracza poza zakres niniejszego opracowania, jednak więcej informacji można znaleźć w cytowanych pracach15,30,31,44,45.
| ID | Nazwa próbki | Typ próbki | Konc. std. | Fiolka | Metoda LC | Metoda MS |
| 1 | DB_001 | Ślepa próba | 1:A,1 | PFAS grad 400uL/min - 9 min run | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 2 | DB_002 | Ślepa próba | 1:A,1 | PFAS grad 400uL/min - 9 min run | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 3 | DB_003 | Ślepa próba | 1:A,1 | PFAS grad 400uL/min - 9 min run | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 4 | DB_004 | Ślepa próba | 1:A,1 | PFAS grad 400uL/min - 9 min run | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 5 | DB_005 | Ślepa próba | 1:A,1 | PFAS grad 400uL/min - 9 min run | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 6 | FB | Ślepa próba | 1:A,2 | PFAS grad 400uL/min - 9 min run | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 7 | 10 std | Standard | 10 | 1:A,3 | PFAS grad 400uL/min - 9 min run | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
| 8 | 25 std | Standard | 25 | 1:A,4 | PFAS grad 400uL/min - 9 min run | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
| 9 | 50 std | Standard | 50 | 1:A,5 | PFAS grad 400uL/min - 9 min run | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
| 10 | 100 std | Standard | 100 | 1:A,6 | PFAS grad 400uL/min - 9 min run | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
| 11 | 250 std | Standard | 250 | 1:A,7 | PFAS grad 400uL/min - 9 min run | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
| 12 | 500 std | Standard | 500 | 1:A,8 | PFAS grad 400uL/min - 9 min run | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
| 13 | 750 std | Standard | 750 | 1:B,1 | PFAS grad 400uL/min - 9 min run | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
| 14 | 1000 std | Standard | 1000 | 1:B,2 | PFAS grad 400uL/min - 9 min run | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
| 15 | DB_006 | Ślepa próba | 1:B,3 | PFAS grad 400uL/min - 9 min run | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 16 | SB_DUP1 | Analit | 1:B,4 | PFAS grad 400uL/min - 9 min run | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 17 | SB_DUP2 | Analit | 1:B,5 | PFAS grad 400uL/min - 9 min run | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 18 | SW Site 03 | Analit | 1:B,6 | PFAS grad 400uL/min - 9 min run | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 19 | SW Site 16 | Analit | 1:B,7 | PFAS grad 400uL/min - 9 min run | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 20 | SW Site 30 | Analit | 1:B,8 | PFAS grad 400uL/min - 9 min run | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 21 | DB_007 | Analit | 1:C,1 | PFAS grad 400uL/min - 9 min run | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 22 | SW Site 19 | Analit | 1:C,2 | PFAS grad 400uL/min - 9 min run | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 23 | SW Site 48 | Analit | 1:C,3 | PFAS grad 400uL/min - 9 min run | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 24 | SW Site 49 | Analit | 1:C,4 | PFAS grad 400uL/min - 9 min run | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 25 | SW Site 05 | Analit | 1:C,5 | PFAS grad 400uL/min - 9 min run | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 26 | SW Site 47 | Ślepa próba | 1:C,6 | PFAS grad 400uL/min - 9 min run | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 27 | DB_008 | Analit | 1:C,7 | PFAS grad 400uL/min - 9 min run | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 28 | SW Site 19_DUP | Analit | 1:C,8 | PFAS grad 400uL/min - 9 min run | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 29 | SW Site 20 | Analit | 1:D,1 | PFAS grad 400uL/min - 9 min run | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 30 | SW Site 21 | Analit | 1:D,2 | PFAS grad 400uL/min - 9 min run | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 31 | SW Site 46 | Analit | 1:D,3 | PFAS grad 400uL/min - 9 min run | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 32 | SW Site 47 | Analit | 1:D,4 | PFAS grad 400uL/min - 9 min run | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 33 | DB_009 | Ślepa próba | 1:D,5 | PFAS grad 400uL/min - 9 min run | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 28 | SW Site 32 | Analit | 1:D,6 | PFAS grad 400uL/min - 9 min run | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 29 | SW Site 50 | Analit | 1:D,7 | PFAS grad 400uL/min - 9 min run | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 30 | SW Site 25 | Analit | 1:D,8 | PFAS grad 400uL/min - 9 min run | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 31 | SW Site 21_DUP | Analit | 1:E,1 | PFAS grad 400uL/min - 9 min run | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 32 | SW Site 52 | Analit | 1:E,2 | PFAS grad 400uL/min - 9 min run | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 33 | DB_010 | Ślepa próba | 1:E,3 | PFAS grad 400uL/min - 9 min run | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 34 | FB | Ślepa próba | 1:A,2 | PFAS grad 400uL/min - 9 min run | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 35 | 10 std | Standard | 10 | 1:A,3 | PFAS grad 400uL/min - 9 min run | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
| 36 | 25 std | Standard | 25 | 1:A,4 | PFAS grad 400uL/min - 9 min run | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
| 37 | 50 std | Standard | 50 | 1:A,5 | PFAS grad 400uL/min - 9 min run | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
| 38 | 100 std | Standard | 100 | 1:A,6 | PFAS grad 400uL/min - 9 min run | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
| 39 | 250 std | Standard | 250 | 1:A,7 | PFAS grad 400uL/min - 9 min run | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
| 40 | 500 std | Standard | 500 | 1:A,8 | PFAS grad 400uL/min - 9 min run | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
| 41 | 750 std | Standard | 750 | 1:B,1 | PFAS grad 400uL/min - 9 min run | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
| 42 | 1000 std | Standard | 1000 | 1:B,2 | PFAS grad 400uL/min - 9 min run | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
| 43 | DB_011 | Ślepa próba | 1:B,2 | PFAS grad 400uL/min - 9 min run | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 44 | DB_012 | Ślepa próba | 1:E,4 | PFAS grad 400uL/min - 9 min run | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
Tabela 1: Przykładowa lista zadań dla ukierunkowanej analizy i oznaczania ilościowego PFAS przy użyciu LC-MS/MS
| Czas (min) 0 | % A (2,5 mM octanu amonu w 5% MeOH) 90 | % B (2,5 mM octanu amonu w 95% MeOH) 10 |
| 5 | 15 | 85 |
| 5.1 | 0 | 100 |
| 7 | 0 | 100 |
| 7.1 | 90 | 10 |
| 9 | 90 | 10 |
Tabela 2: Przykładowy gradient dla rozdziału LC w analizie celowanej
| Napięcie kapilarne (kV) | 1.97 |
| Napięcie stożka (V) | 15 |
| Napięcie ekstraktora (V) | 3 |
| Obiektyw RF (V) | 0.3 |
| Temperatura źródła | 150 |
| Temperatura desolwatacji | 40 |
| Przepływ gazu desolwatacyjnego (L/h) | 300 |
| Przepływ gazu w stożku (L/godz) | 2 |
Tabela 3: Parametry źródła jonizacji dla analizy celowanej
| Związek | Prekursor | Produkt | Czas przebywania | Napięcie stożka (V) | Energia kolizyjna (eV) |
| PFBA | 212.80 | 168.75 | 0.01 | 15 | 10 |
| 13C4-PFBA IS | 216.80 | 171.75 | 0.01 | 15 | 10 |
| PFPeA | 262.85 | 218.75 | 0.01 | 15 | 9 |
| PFBS °1 | 298.70 | 79.90 | 0.01 | 40 | 30 |
| PFBS °2 | 298.70 | 98.80 | 0.01 | 40 | 28 |
| PFHxA °1 | 312.70 | 118.70 | 0.01 | 13 | 21 |
| PFHxA °2 | 312.70 | 268.70 | 0.01 | 13 | 10 |
| 13C2-PFHxA IS | 314.75 | 269.75 | 0.01 | 13 | 9 |
| HFPO-DA 1° | 329.16 | 168.90 | 0.01 | 10 | 12 |
| HFPO-DA 2° | 329.16 | 284.90 | 0.01 | 10 | 6 |
| HFPO-DA IS 1° | 332.16 | 168.90 | 0.01 | 10 | 12 |
| HFPO-DA IS 2° | 332.16 | 286.90 | 0.01 | 10 | 6 |
| PFHpA °1 | 362.65 | 168.65 | 0.01 | 14 | 17 |
| PFHpA °2 | 362.65 | 318.70 | 0.01 | 14 | 10 |
| PFHxS °1 | 398.65 | 79.90 | 0.01 | 50 | 38 |
| PFHxS °2 | 398.65 | 98.80 | 0.01 | 50 | 32 |
| 13C4-PFHxS IS | 402.65 | 83.90 | 0.01 | 50 | 38 |
| PFOA °1 | 412.60 | 168.70 | 0.01 | 15 | 18 |
| PFOA °2 | 412.60 | 368.65 | 0.01 | 15 | 11 |
| 13C4-PFOA IS | 416.75 | 371.70 | 0.01 | 15 | 11 |
| PFNA °1 | 462.60 | 218.75 | 0.01 | 15 | 17 |
| PFNA °2 | 462.60 | 418.60 | 0.01 | 15 | 11 |
| PFNA IS | 467.60 | 422.60 | 0.01 | 15 | 11 |
| PFOS °1 | 498.65 | 79.90 | 0.01 | 60 | 48 |
| PFOS °2 | 498.65 | 98.80 | 0.01 | 60 | 38 |
| 13C4-PFOS IS | 502.60 | 79.70 | 0.01 | 60 | 48 |
| PFDA °1 | 512.60 | 218.75 | 0.01 | 16 | 18 |
| PFDA °2 | 512.60 | 468.55 | 0.01 | 16 | 12 |
| 13C2 - PFDA IS | 514.60 | 469.55 | 0.01 | 16 | 12 |
Tabela 4: Przykładowa tabela przejść i parametry MS/MS dla zawartości PFAC-MXA wraz z HFPO-DA
| Czas (min) | % A (2,5 mM octanu amonu w 5% MeOH) | % B (2,5 mM octanu amonu w 95% MeOH) |
| 0 | 90 | 10 |
| 0.5 | 90 | 10 |
| 3 | 50 | 50 |
| 3.5 | 50 | 50 |
| 5.5 | 40 | 60 |
| 6 | 40 | 60 |
| 7 | 0 | 100 |
| 11 | 0 | 100 |
Tabela 5: Przykładowy gradient dla rozdziału LC w analizie nietargetowanej
| Parametr Profinder | Ustawianie wartości |
| Filtr wysokości piku ekstrakcji | 800 odczytów |
| Dopuszczony(e) jon(y) | -H/+H |
| Model izotopowy ekstrakcji cech | Powszechne cząsteczki organiczne |
| Dopuszczalne stany naładowania | 2 stycznia |
| Próg liczby jonów złożonych | Dwa lub więcej jonów |
| Tolerancja RT wyrównania | 0,40 min + 0,0% |
| Tolerancja masy przy dopasowaniu | 20,00 ppm + 2,0 mDa |
| Filtr absolutnej wysokości w obróbce końcowej | >= 10 000 zliczeń w jednej próbce |
| Filtr wyników MFE w obróbce końcowej | >= 75 w jednej próbce |
| Algorytm całkowania piku | Agile 2 |
| Filtr wysokości integracji pików | >= 5000 zliczeń |
| Wyszukiwanie według filtra bezwzględnej wysokości jonu | >= 7500 zliczeń w jednej próbce |
| Filtrowanie według wyniku jonowego | >= 50,00 w jednej próbce |
Tabela 6: Ustawienia ekstrakcji cech molekularnych i wyrównania dla oprogramowania Profinder. Wszystkie niewymienione wartości zachowały ustawienia domyślne dla przetwarzania danych.
| Próg obfitości jonów | Progi cech | Próg powtórzeń (n = 5) | Czas trwania | Cechy | Próg akceptacji powtórzeń | Przekroczenie progu CV | Cechy dla 90% TIC |
| 1x S/N | 2000 | Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. | 8.15 | 987 | 505 | 421 | 91 |
| 2x S/N | 5000 | Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. | 5.02 | 707 | 357 | 313 | 93 |
| 3x S/N | 10000 | Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia. | 2.3 | 308 | 249 | 230 | 93 |
| 1x S/N | 2000 | 100% | 3.3 | 603 | 339 | 297 | 92 |
| 2x S/N | 35000 | 100% | 1.58 | 310 | 248 | 229 | 93 |
| 3x S/N | 10000 | 100% | 1.45 | 202 | 190 | 182 | 92 |
Tabela 7: Porównanie czasu przetwarzania próbek i identyfikacji cech chemicznych dla różnych progów ekstrakcji cech.
Rycina 1: Całkowity chromatogram jonowy i ekstrakcyjne chromatogramy jonowe dla podzbioru wzorców perfluorowanych eterów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 2: Reprezentatywne krzywe kalibracyjne dla związków wykazujące malejącą jakość konstrukcji krzywej analitycznej. Panel po lewej stronie wskazuje na kalibrację o wysokiej jakości; panel środkowy wskazuje na związek o niskiej precyzji w powtórzeniach przygotowań, szczególnie przy wyższych stężeniach; panel po prawej stronie wskazuje na krzywą o niskiej precyzji i niskim liniowym zakresie dynamicznym, co skutkuje płaską odpowiedzią w górnym zakresie kalibracji i brakiem wykrywalnego sygnału w zakresie dolnym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Rycina 3: Nałożone na siebie całkowite chromatogramy jonowe (TIC) dla ekstraktów z wód powierzchniowych pobranych powyżej i poniżej zakładu produkcji związków fluorowych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 4: Ekstrahowane chromatogramy jonowe (EIC) dla wszystkich zidentyfikowanych cech chemicznych z próbki wody powierzchniowej zawierającej wiele klas związków fluorowych. Każdy ślad chemiczny ma inny kolor w celu ich rozróżnienia. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 5: Schemat koncepcyjny surowych i przewidywanych informacji dla cechy chemicznej zidentyfikowanej jako kwas dimeru tlenku heksafluoropropylenu (HFPO-DA). Cechy chemiczne są kompilowane na podstawie programowej ekstrakcji surowych danych z pomiarów MS i zawierają informacje chromatograficzne (np. czas retencji (RT)) oraz spektrometryczne. Przewidywany wzór, struktury i tożsamość chemiczna są generowane z surowych danych pomiarowych dla każdej cechy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 6: Wykres deficytu masy dla cech chemicznych zidentyfikowanych w odpływie produkcyjnym (kolor czerwony, lewa strona) i referencyjnej wodzie powierzchniowej (kolor niebieski, prawa strona). Związki fluorowane znajdują się w pobliżu i poniżej przerywanej linii zerowej. Zwróć uwagę na trwałą serię PFOA/PFOS w próbce tła wody powierzchniowej (prawa strona). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 7: Wykres masy w funkcji deficytu masy dla niezidentyfikowanych cech chemicznych z próbki wody powierzchniowej, z zidentyfikowanymi i oznaczonymi szeregami homologicznymi za pomocą pakietu R nontarget. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 8: Widmo masowe nieznanej cechy chemicznej z przewidywanymi intensywnościami izotopowymi trzech możliwych wzorów chemicznych o tej samej masie monoizotopowej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 9: Widmo fragmentacji związku eteru perfluorowanego z opisanymi pikiemami fragmentów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 10: Graficzna reprezentacja progów filtrowania. Od lewej do prawej: próg obfitości jonów dla widm mas cech chemicznych, próg obfitości cech dla wyekstrahowanych cech chromatograficznych oraz próg powtórzeń dla częstotliwości wykrywania cech w eksperymencie z iniekcjami w trzech powtórzeniach. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Dyskusja
Postępowanie z próbkami i ich przygotowanie
Uwzględnienie wzorców referencyjnych/szczytowych ma zasadnicze znaczenie dla każdej ukierunkowanej analizy, ponieważ stanowią one zabezpieczenie dla sprawdzenia poprawności analitycznej. Brak próbek kontroli jakości uniemożliwia jakąkolwiek ocenę dokładności wyników; wszechobecność fluorochemikaliów oznacza, że przypadkowe zanieczyszczenie próbek terenowych, materiałów przetwórczych lub systemu LC-MS nie jest rzadkością i należy je uwzględnić. Co więcej, pozwala to na walidację protokołu niezależnie od zmian w codziennym przetwarzaniu próbek, ponieważ wiele etapów może być bardzo zmiennych, w szczególności etapy SPE i stężenia próbki. Na ekstrakcję zarówno starszych, jak i nowych perfluorowanych substancji chemicznych duży wpływ może mieć wybór fazy stacjonarnej do zagęszczenia oraz składników próbek źródłowych, takich jak pH i zasolenie46. Wpływ warunków pobierania próbek powinien być brany pod uwagę, jeżeli interesujące są poszczególne klasy pefluorowanych substancji chemicznych. Można zastosować alternatywne schematy przygotowania próbek do ekstrakcji wodnych, jeśli dostępna jest konfiguracja laboratoryjna, a dalsza analiza danych pozostaje podobna.
Ukierunkowana analiza danych
W przypadku związków o dostępnych wzorcach i dopasowanych, stabilnych wzorcach wewnętrznych znakowanych izotopami, główne problemy związane z analizą danych mają charakter instrumentalny, a określenie granic wykrywalności metody i odpowiednich zakresów raportowania można określić na podstawie poszczególnych laboratoriów przy użyciu standardowych podejść, takich jak stosunek sygnału do szumu z niskich skoków wzorca47. W przypadku braku dopasowanych wzorców wewnętrznych mogą wystąpić błędy wynikające z efektów niedopasowanej matrycy, a dokładne przewidywanie wsteczne próbek wzbogaconych może być wykorzystane do oszacowania dokładności pomiarów. W przypadku braku wzorców do przygotowania krzywej, ilościowe oszacowanie niewiadomej można dokonać, traktując ją identycznie z ściśle dopasowanym związkiem wzorcowym, ale błędy w oszacowaniu są rzędu 10+ krotności z ograniczoną zdolnością do ilościowego określenia niepewności, patrz McCord, Newton i Strynar21. W takich przypadkach nadal można gromadzić dane dotyczące trendów, ale szacunki dotyczące koncentracji są z natury niewiarygodne.
Nieukierunkowana analiza danych
Ustawienia pobierania wartości szczytowych mają znaczący wpływ na liczbę zidentyfikowanych cech chemicznych, ale duży wpływ ma również jakość wyboru cech. Decyzje będące przedmiotem zainteresowania w wybieraniu pików to: 1) intensywność poszczególnych mas, które mają być uwzględnione w widmach, próg obfitości jonów, 2) intensywność wyekstrahowanych pików chromatogramu, które należy uznać za cechy, próg obfitości cech, 3) częstotliwość wykrywania cech, próg kontrpróby i 4) zmienność analityczna, próg CV (rysunek 10).
Ustawienie nierealistycznie niskich progów dla szczytowej kompletacji powoduje wykładnicze wydłużenie czasu pobierania próbek w celu rozwiązania dodatkowych cech o coraz niższej liczebności (Tabela 7). Próg obfitości jonów filtruje cechy widma mas, w których wystarczająca ilość pojedynczych izotopów nie przekracza tego progu. To idealnie wybiera tylko cechy o wysokiej jakości widmach MS, zapewniając, że są to rzeczywiste cechy chemiczne, a nie szum instrumentalny, i umożliwiając przewidywanie formuły w dalszym przetwarzaniu. Odpowiedni próg opiera się na szumie instrumentalnym, najlepiej co najmniej 3-krotnie wyższym niż próg szumu dla skanów MS1. Próg liczebności cech filtruje cechy chemiczne w oparciu o intensywność lub obszar wyodrębnionej cechy chromatograficznej. Ten krok umożliwia odrzucenie pików o niskiej obfitości, które zazwyczaj mają niską jakość chromatograficzną, mają wysokie wariancje lub są wynikiem innej złej ekstrakcji oprogramowania. Odpowiedni próg musi zostać określony dla każdego eksperymentu i dla każdej matrycy w oparciu o akceptowalny poziom słabej generacji cech (np. cechy poniżej progu wykazują niedopuszczalnie słabą chromatografię). Dalsza analityczna kontrola jakości może być stosowana do odrzucania cech na poziomie chromatograficznym na podstawie niespójnej identyfikacji w kontrpróbach analitycznych i/lub przygotowawczych (próg kontrpróby) lub na podstawie słabej odtwarzalności w różnych kontrpróbach (próg CV). Odpowiednie poziomy zależą od jakości zastosowanego oprogramowania do integracji pików i badanych jednostek chemicznych. W przypadku rozpuszczalnych w wodzie związków perfluorowanych i lekko zoptymalizowanych protokołów integracji, cechy powinny być zidentyfikowane w 80+% kontrprób analitycznych, a CV oczekuje się, że spadną poniżej 30%, jak szczegółowo opisano w sekcji dotyczącej metod.
Piki wykryte w wyniku analizy nieukierunkowanej nie dają ilościowych oszacowań stężeń wykrytych materiałów. Co więcej, tożsamość prawdziwych niewiadomych może być trudna do potwierdzenia, ponieważ nowe związki nie występują w publicznie dostępnych bazach danych. Nowatorskie oznaczanie strukturalne wymaga szeroko zakrojonej analizy przy użyciu wielu metod i wymaga specjalistycznej wiedzy zarówno w zakresie spektrometrii mas, jak i chemii. Jednak normalizacja obszarów pików cech chemicznych może dostarczyć półilościowych szacunków stężeń nieznanych gatunków21. Jeżeli stosuje się spójne etapy pobierania próbek i przygotowania, można uzyskać informacje o trendach czasowych dla poszczególnych gatunków w celu monitorowania trwałości substancji chemicznej w przyszłości, ponieważ reakcja dla poszczególnych gatunków powinna być spójna, z wyjątkiem dużych różnic w matrycy21.
Główną zaletą tej metody jest możliwość rozszerzenia obróbki próbki, aby umożliwić zarówno analizę ukierunkowaną, jak i nieukierunkowaną. Podczas gdy analiza ukierunkowana dostarcza równoważnych lub lepszych informacji ilościowych, bardzo brakuje jej zakresu analizy pożądanej w przypadku nowych i powstających materiałów, a także ich związku z materiałami matrycowymi. Stosowanie ukierunkowanej metodologii, a nawet podejrzanej metody badań przesiewowych opartej wyłącznie na znanych materiałach i ograniczonych bazach danych, jest całkowicie ślepe na wcześniej nieobserwowane gatunki, nawet jeśli mogą one mieć znaczące skutki zdrowotne. Wraz z ulepszaniem oprogramowania i coraz bardziej niezawodnymi bazami danych, dokładność nieznanej identyfikacji będzie nadal rosła, przy jednoczesnym zmniejszeniu inwestycji czasowych i poziomu wiedzy specjalistycznej niezbędnej do analizy wielowymiarowych danych generowanych przez to podejście. Niemniej jednak dane generowane obecnie mają znaczącą wartość w przyszłości, ponieważ bankowanie danych pozwala na analizę post-hoc za pomocą nowo opracowanego oprogramowania i umożliwia porównanie w czasie, nawet jeśli tożsamość wykrytego związku jest obecnie nieznana.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Amerykańska Agencja Ochrony Środowiska, poprzez swoje Biuro Badań i Rozwoju, finansowała i zarządzała opisanymi tutaj badaniami. Niniejszy dokument został sprawdzony przez amerykańską Agencję Ochrony Środowiska, Biuro Badań i Rozwoju i zatwierdzony do publikacji. Poglądy wyrażone w tym artykule są poglądami autorów i niekoniecznie reprezentują poglądy lub politykę Amerykańskiej Agencji Ochrony Środowiska. Badania te były częściowo wspierane przez powołanie do Programu Badań Podoktoranckich w Narodowym Laboratorium Badań nad Ekspozycją administrowanym przez Oak Ridge Institute for Science and Education na mocy umowy międzyagencyjnej DW89992431601 między Departamentem Energii Stanów Zjednoczonych a Agencją Ochrony Środowiska Stanów Zjednoczonych.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Ultra-wysokosprawny system chromatografii cieczowej Acqity | Waters Corporation | Zmodyfikowany zestawem do analizy PFC (176001744); równoważny system UPLC jest dopuszczalny, jeśli tło PFAS jest sprawdzone i potwierdzone, że jest nisko | |
| osadzone w octanie amonu | Fluka | 17836 | Klasa spektrometrii mas >99% czysty |
| wodorotlenek amonu | Sigma-Aldrich | 338818 | |
| Balance | Mettler | AB204S | |
| Kolumna UPLC BEH C18 z odwróconą fazą, 2,1 i razy; 50 mm, 1,7 μ m | Waters Corporation | 186002350 | |
| Dwutłokowa pompa strzykawkowa | Waters Corporation | SPC10-C | |
| Lodowcowy kwas octowy | Sigma-Aldrich | ARK2183 | |
| Filtry szklane z mikrofibry | Whatman | 1820-070 | |
| Butelka na próbkę z polietylenu o wysokiej gęstości | Nalgene | 2189-0032 | |
| Spektrometr masowy o wysokiej rozdzielczości | Różne | spektrometry masowe powinny być w stanie zapewnić dokładną masę do < 10ppm i zbieranie danych MS/MS. W tej pracy użyto Agilent 6530 qTOF i Thermo Fisher Orbitrap Fusion | |
| Metanol | Sigma-Aldrich | ||
| Kwas azotowy (35% w/w) | Thermo Fisher Scientific | SVCN-5-1 | Można przygotować w domu przy użyciu stężonego kwasu azotowego i wody odczynnikowej |
| Lejek polipropylenowy Buchner | ACE Glass | 12557-09 | |
| Polipropylenowa rurka i nasadka z cylindrem | termos BD Falcon | 352096 | |
| (1 L) | Nalgene | DS4101-1000 | |
| Spektrometr masowy potrójny kwadrupolowy Quattro Premier XE | Waters Corporation | Zamiast tego można użyć równoważnego systemu z potrójnym kwadrupolem lub lepszym, który powinien zapewniać wysoką czułość i stabilność do ukierunkowanej analizy | |
| Odczynnik Woda | Dowolne źródło uznane za wolne od PFAS | ||
| Octan sodu | Parownik azotu Sigma-Aldrich | W302406 | |
| TurboVap | Caliper Life Sciences | 103198 | Zamiast tego można zastosować równoważne systemy lub obrotową wyparkę próżniową |
| Wkład SPE ze słabą wymianą anionów (Oasis WAX Plus) | Waters Corporation | 186003519 | |
| Standard Solutions | |||
| 2,3,3,3-tetrafluoro-2-(1,1,2,2,3,3,3-heptafluoropropoksy)kwas propanowy (HFPO-DA) | Wellington | HFPO-DA | |
| Dodatkowe docelowe standardy związków będących przedmiotem zainteresowania | zostaną określone na podstawie wstępnej analizy i dostępności normy | ||
| Znakowana masowo HFPO-DA | Wellington | M2HFPO-DA | |
| Natywna mieszanina PFCA/PFAS (2 ug/ml) | Wellington | PFAC-MXA | lub PFAC-MXB; lub indywidualnie przygotowana mieszanina zawierająca związki będące przedmiotem zainteresowania |
| Stabilny izotop znakowany PFCA/PFAS Mieszanina (2 ug/ml) | Wellington | MPFAC-MXA | lub MPFAC-MXB; lub indywidualnie przygotowana mieszanina zawierająca związki będące przedmiotem zainteresowania, odpowiednio do natywnych PFASs |
| Software | |||
| Mass Profiler Professional | Agilent | Lub pakiety oprogramowania open source | |
| Profinder | Agilent | Lub pakiety oprogramowania open source |
Bibliografia
- Provisional Health Advisories for Perfluorooctanoic Acid (PFOA) and Perfluorooctane Sulfonate (PFOS). United States Environmental Protection Agency. , Washington, DC. (2009).
- Lifetime Health Advisories and Health Effects Support Documents for Perfluorooctanoic Acid and Perfluorooctane Sulfonate. United States Environmental Protection Agency. , Washington DC. 33250-33251 (2016).
- Fact Sheet: 2010/2015 PFOA Stewardship Program. , Available from: https://www.epa.gov/assessing-and-managing-chemicals-under-tsca/fact-sheet-20102015-pfoa-stewardship-program (2006).
- EPA and 3M Announce phase out of PFOS. Environmental Protection Agency. , Available from: https://yosemite.epa.gov/opa/admpress.nsf/0/33aa946e6cb11f35852568e1005246b4 (2000).
- Wang, Z., Cousins, I. T., Scheringer, M., Hungerbühler, K. Fluorinated alternatives to long-chain perfluoroalkyl carboxylic acids (PFCAs), perfluoroalkane sulfonic acids (PFSAs) and their potential precursors. Environment International. 60, 242(2013).
- Scheringer, M., et al. Helsingør Statement on poly- and perfluorinated alkyl substances (PFASs). Chemosphere. 114, 337-339 (2014).
- Wang, Z., DeWitt, J. C., Higgins, C. P., Cousins, I. T. A Never-Ending Story of Per- and Polyfluoroalkyl Substances (PFASs). Environmental Science & Technology. 51 (5), 2508-2518 (2017).
- Xiao, F., Golovko, S. A., Golovko, M. Y. Identification of novel non-ionic, cationic, zwitterionic, and anionic polyfluoroalkyl substances using UPLC-TOF-MSE high-resolution parent ion search. Analytica Chimica Acta. 988, 41-49 (2017).
- Shoemaker, J., Grimmett, P., Boutin, B. Method 537. Determination of selected perfluorinated alkyl acids in drinking water by solid phase extraction and liquid chromatography/tandem mass spectrometry (LC/MS/MS). US Environmental Protection Agency. , Washington, DC. (2009).
- Poole, C. F., Gunatilleka, A. D., Sethuraman, R. Contributions of theory to method development in solid-phase extraction. Journal of Chromatography A. 885 (1), 17-39 (2000).
- Ahrens, L. Polyfluoroalkyl compounds in the aquatic environment: a review of their occurrence and fate. Journal of Environmental Monitoring. 13 (1), 20-31 (2011).
- Higgins, C. P., Field, J. A., Criddle, C. S., Luthy, R. G. Quantitative Determination of Perfluorochemicals in Sediments and Domestic Sludge. Environmental Science & Technology. 39 (11), 3946-3956 (2005).
- Szostek, B., Prickett, K. B., Buck, R. C. Determination of fluorotelomer alcohols by liquid chromatography/tandem mass spectrometry in water. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 20 (19), 2837-2844 (2006).
- Alzaga, R., Bayona, J. M. Determination of perfluorocarboxylic acids in aqueous matrices by ion-pair solid-phase microextraction-in-port derivatization-gas chromatography-negative ion chemical ionization mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1042 (1-2), 155-162 (2004).
- Schaider, L. A., et al. Fluorinated Compounds in U.S. Fast Food Packaging. Environmental Science & Technology Letters. 4 (3), 105-111 (2017).
- Lindstrom, A. B., Strynar, M. J., Libelo, E. L. Polyfluorinated Compounds: Past, Present, and Future. Environmental Science & Technology. 45 (19), 7954(2011).
- Liu, Y., Pereira, A. D. S., Martin, J. W. Discovery of C5-C17 Poly-and Perfluoroalkyl Substances in Water by In-Line SPE-HPLC-Orbitrap with In-Source Fragmentation Flagging. Analytical Chemistry. 87 (8), 4260(2015).
- Backe, W. J., Day, T. C., Field, J. A. Zwitterionic, Cationic, and Anionic Fluorinated Chemicals in Aqueous Film Forming Foam Formulations and Groundwater from U.S. Military Bases by Nonaqueous Large-Volume Injection HPLC-MS/MS. Environmental Science & Technology. 47 (10), 5226-5234 (2013).
- Mazzoni, M., Rusconi, M., Valsecchi, S., Martins, C. P. B., Polesello, S. An on-line solid phase extraction-liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for the determination of perfluoroalkyl acids in drinking and surface waters. Journal of Analytical Methods in Chemistry. 2015, 942016(2015).
- Li, F., et al. Method development for analysis of short- and long-chain perfluorinated acids in solid matrices. International Journal of Environmental Analytical Chemistry. 91 (12), 1117-1134 (2011).
- McCord, J., Newton, S., Strynar, M. Validation of quantitative measurements and semi-quantitative estimates of emerging perfluoroethercarboxylic acids (PFECAs) and hexfluoroprolyene oxide acids (HFPOAs). J Chromatoqr A. , (2018).
- Wang, Y., Liu, S., Hu, Y., Li, P., Wan, J. -B. Current state of the art of mass spectrometry-based metabolomics studies - a review focusing on wide coverage, high throughput and easy identification. RSC Advances. 5 (96), 78728-78737 (2015).
- Cajka, T., Fiehn, O. Toward Merging Untargeted and Targeted Methods in Mass Spectrometry-Based Metabolomics and Lipidomics. Analytical Chemistry. 88 (1), 524-545 (2016).
- Mann, M., Kelleher, N. L. Precision proteomics: The case for high resolution and high mass accuracy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (47), 18132-18138 (2008).
- Sobus, J. R., et al. Integrating tools for non-targeted analysis research and chemical safety evaluations at the US EPA. Journal of Exposure Science & Environmental Epidemiology. , (2017).
- Bletsou, A. A., Jeon, J., Hollender, J., Archontaki, E., Thomaidis, N. S. Targeted and non-targeted liquid chromatography-mass spectrometric workflows for identification of transformation products of emerging pollutants in the aquatic environment. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 66, 32-44 (2015).
- Viant, M. R., Sommer, U. Mass spectrometry based environmental metabolomics: a primer and review. Metabolomics. 9 (1), 144-158 (2013).
- Xiao, F. Emerging poly- and perfluoroalkyl substances in the aquatic environment: A review of current literature. Water Research. 124, 482-495 (2017).
- Nakayama, S. F., Strynar, M. J., Reiner, J. L., Delinsky, A. D., Lindstrom, A. B. Determination of perfluorinated compounds in the Upper Mississippi River Basin. Environmental Science & Technology. 44 (11), 4103(2010).
- Strynar, M., et al. Identification of novel perfluoroalkyl ether carboxylic acids (PFECAs) and sulfonic acids (PFESAs) in natural waters using accurate mass time-of-flight mass spectrometry (TOFMS). Environmental Science & Technology. 49 (19), 11622(2015).
- Newton, S., et al. Novel Polyfluorinated Compounds Identified Using High Resolution Mass Spectrometry Downstream of Manufacturing Facilities near Decatur, Alabama. Environmental Science & Technology. 51 (3), 1544-1552 (2017).
- Forsberg, E. M., et al. Data processing, multi-omic pathway mapping, and metabolite activity analysis using XCMS Online. Nature Protocols. 13, 633(2018).
- Sturm, M., et al. OpenMS - An open-source software framework for mass spectrometry. BMC Bioinformatics. 9 (1), 163(2008).
- Kind, T., Fiehn, O. Seven Golden Rules for heuristic filtering of molecular formulas obtained by accurate mass spectrometry. BMC Bioinformatics. 8, 105-105 (2007).
- Loos, M., Singer, H. Nontargeted homologue series extraction from hyphenated high resolution mass spectrometry data. Journal of Cheminformatics. 9, 12(2017).
- Dimzon, I. K., et al. High Resolution Mass Spectrometry of Polyfluorinated Polyether-Based Formulation. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27, 309(2016).
- McEachran, A. D., Sobus, J. R., Williams, A. J. Identifying known unknowns using the US EPA's CompTox Chemistry Dashboard. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (7), 1729-1735 (2017).
- French, W. R., et al. Wavelet-Based Peak Detection and a New Charge Inference Procedure for MS/MS Implemented in ProteoWizard's msConvert. Journal of Proteome Research. 14 (2), 1299-1307 (2015).
- Tautenhahn, R., Böttcher, C., Neumann, S. Highly sensitive feature detection for high resolution LC/MS. BMC Bioinformatics. 9, 504(2008).
- Rafiei, A., Sleno, L. Comparison of peak-picking workflows for untargeted liquid chromatography/high-resolution mass spectrometry metabolomics data analysis. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 29 (1), 119-127 (2015).
- Kind, T., Fiehn, O. Metabolomic database annotations via query of elemental compositions: Mass accuracy is insufficient even at less than 1 ppm. BMC Bioinformatics. 7, 234-234 (2006).
- Brack, W., Dulio, V., Slobodnik, J. The NORMAN Network and its activities on emerging environmental substances with a focus on effect-directed analysis of complex environmental contamination. Environmental Sciences Europe. 24 (1), 29(2012).
- Blaženović, I., et al. Comprehensive comparison of in silico MS/MS fragmentation tools of the CASMI contest: database boosting is needed to achieve 93% accuracy. Journal of Cheminformatics. 9, 32(2017).
- Rager, J. E., et al. Linking high resolution mass spectrometry data with exposure and toxicity forecasts to advance high-throughput environmental monitoring. Environment International. 88, Supplement C 269-280 (2016).
- Munoz, G., et al. Environmental Occurrence of Perfluoroalkyl Acids and Novel Fluorotelomer Surfactants in the Freshwater Fish Catostomus commersonii and Sediments Following Firefighting Foam Deployment at the Lac-Mégantic Railway Accident. Environmental Science & Technology. 51 (3), 1231-1240 (2017).
- Brumovský, M., Bečanová, J., Karásková, P., Nizzetto, L. Retention performance of three widely used SPE sorbents for the extraction of perfluoroalkyl substances from seawater. Chemosphere. 193, 259-269 (2018).
- Definition, Definition and Procedure for the Determination of the Method Detection Limit (Revision 2). Environmental Protection Agency. , Federal Regester (2016).
Przedruki i uprawnienia
