Artykuł metodologiczny

Uniwersalna metoda montażu liści Arabidopsis do przyżyciowego obrazowania poklatkowego

9.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59147

⸱

11 lutego 2019

 ,  , 
1Japan Science and Technology Agency (JST), PRESTO, 2Department of Biological Sciences, Graduate School of Science, The University of Tokyo, 3Faculty of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba, 4Microbiology Research Center for Sustainability, University of Tsukuba

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiamy prostą i wszechstronną metodę wykonywania fluorescencyjnego obrazowania na żywo liści Arabidopsis thaliana przez dłuższy okres czasu. Używamy transgenicznej rośliny Arabidopsis wykazującej ekspresję fluorescencyjnego genu reporterowego pod kontrolą promotora związanego z odpornością jako przykładu uzyskania czasoprzestrzennego zrozumienia odpowiedzi immunologicznych roślin.

Streszczenie

Odpowiedź immunologiczna roślin związana z przeprogramowaniem transkrypcji całego genomu jest inicjowana w miejscu infekcji. W ten sposób odpowiedź immunologiczna jest regulowana przestrzennie i czasowo. Zastosowanie genu fluorescencyjnego pod kontrolą promotora związanego z odpornością w połączeniu z automatyczną mikroskopią fluorescencyjną jest prostym sposobem na zrozumienie czasoprzestrzennej regulacji odporności roślin. W przeciwieństwie do tkanek korzeniowych, które zostały wykorzystane w wielu różnych eksperymentach obrazowania fluorescencyjnego w trybie przyżyciowym, istnieje niewiele przykładów obrazowania fluorescencyjnego na żywo dla tkanek liści, które napotykają szereg infekcji bakteryjnych przenoszonych drogą powietrzną. W związku z tym opracowaliśmy prostą metodę montowania liści roślin Arabidopsis thaliana w celu obrazowania żywych komórek przez dłuższy czas. Użyliśmy transgenicznych roślin Arabidopsis z ekspresją genu żółtego białka fluorescencyjnego (YFP) do sygnału lokalizacji jądrowej (NLS) pod kontrolą promotora genu markerowego związanego z obroną, związanego z patogenezą 1 (PR1). Naciekaliśmy transgeniczny liść Pseudomonas syringae pv. pomidor DC3000 (avrRpt2) (Pst_a2) i wykonywane in vivo obrazowanie poklatkowe sygnału YFP przez łącznie 40 godzin przy użyciu automatycznego stereomikroskopu fluorescencyjnego. Metoda ta może być wykorzystana nie tylko do badań nad odpowiedziami immunologicznymi roślin, ale także do analiz różnych zdarzeń rozwojowych i reakcji środowiskowych zachodzących w tkankach liści.

Wprowadzenie

Odpowiedź immunologiczna roślin obejmuje dynamiczne przeprogramowanie transkrypcji regulowane przez wiele czynników transkrypcyjnych, a także fitohormony1. Gromadzenie danych transkryptomu daje możliwość zbierania informacji o układzie odpornościowym roślin: na przykład struktura sieci kaskad sygnałowych2. Jednak nasza wiedza na temat przestrzennej i czasowej dynamiki odporności roślin nadal pozostaje ograniczona3,4,5.

W poprzednich badaniach, czasoprzestrzenna regulacja ekspresji genów związanych z obroną była głównie analizowana przy użyciu hybrydyzacji in situ i testu reporterowego β-glukuronidazy (GUS)6,7,8. Metody te pozwalają nam zwizualizować transkrypcyjną aktywację różnych genów będących przedmiotem zainteresowania in situ. Procedury te wymagają jednak chemicznego utrwalenia próbek, a tym samym skutkują utratą wszystkich informacji czasowych. Zdarzenia biologiczne, takie jak odporność, postępują w czasie. Użycie lucyferazy jako reportera umożliwiło uchwycenie dynamiki czasowej promotora zainteresowania3. Jednak test oparty na lucyferazie wymaga drogiego substratu i bardzo czułych detektorów. Aby pogłębić naszą wiedzę na temat czasoprzestrzennych aspektów odpowiedzi immunologicznej roślin za pomocą prostej procedury, wygenerowaliśmy transgeniczne rośliny Arabidopsis thaliana wykazujące ekspresję genu żółtego białka fluorescencyjnego (YFP) połączonego z sygnałem lokalizacji jądrowej (YFP-NLS) pod kontrolą promotora genu markera związanego z obroną, Pathogenesis-Related 1 (PR1)9. Użyliśmy autofluorescencji chlorofilu, markera żywych komórek, aby uchwycić proces programowanej śmierci komórki (PCD), który często występuje podczas odporności aktywowanej efektorem (ETI), formy odporności roślin indukowanej przez infekcję specyficznym patogenem9,10. Monitorowanie temporalnej dynamiki intensywności sygnału fluorescencji w swobodnie poruszających się obiektach, takich jak żywe liście rzodkiewnika, wymaga złożonego oprogramowania do przetwarzania obrazu, które jest wbudowane we własne firmy lub dostępne na rynku. Alternatywnie, zapobieganie przemieszczaniu się próbek jest prostą metodą rozwiązania problemu. W tym miejscu opracowaliśmy wszechstronną i prostą metodę montażu żywych liści transgenicznej rośliny Arabidopsis do długotrwałej obserwacji pod automatycznym stereomikroskopem fluorescencyjnym. Metoda ta pozwala nam uchwycić dynamikę promotora w nienaruszonych liściach roślin uprawianych w glebie w ciągu kilku dni.

Protokół

UWAGA: Ważne jest, aby zapobiec ruchom sennym żywych próbek liści podczas obrazowania poklatkowego. Aby zminimalizować naprężenia mechaniczne liści, konieczne jest delikatne utrwalenie liści. Tylko odpowiednio przygotowane próbki liści dają obrazy poklatkowe nadające się do różnych analiz obrazu. Protokół wykorzystujący transgeniczne rośliny Arabidopsis wykazujące ekspresję fuzji YFP-NLS pod kontrolą promotora genu PR1 (rośliny pPR1-YFP-NLS) i Pseudomonas syringae pv. pomidor Szczep DC3000 (avrRpt2) (Pst_a2) jest opisany poniżej jako przykład.

1. Przygotowanie roślin i patogenów

  1. Napełnij plastikową tackę na zatyczki do komórek (tabela materiałów) autoklawowaną glebą.
  2. Zasiej jedno transgeniczne nasiono Arabidopsis na komórkę (Rysunek 1A).
  3. Przenieś tacę do pomieszczenia do uprawy w temperaturze 23 °C i hoduj rośliny w ciągłym białym świetle przez 2-3 tygodnie.
  4. Dwa dni przed inokulacją patogenu smuga Pseudomonas syringae pv. pomidor DC3000 avrRpt2 (Pst_a2) z glicerolu podstawowego na pożywkę NYG (5 g/l peptonu, 3 g/l ekstraktu drożdżowego, 20 ml/l glicerolu, 15 g/l agaru bakteriologicznego, pH 7,0) zawierający 100 mg/l ryfampicyny i 50 mg/l kanamycyny i inkubować w temperaturze 28 °C przez 48 godzin.
  5. Zbierz komórki bakteryjne, które pojawiają się na powierzchni podłoża za pomocą plastikowych końcówek, przenieś je do plastikowej probówki zawierającej 10 mM MgCl2 i ponownie zawieś. Zmierzyć gęstość optyczną (OD) roztworu przy 600 nm (OD600). Dostosuj końcowe stężenie komórek bakteryjnych do 108 jednostek tworzenia kolonii (CFU)/ml, co normalnie odpowiada OD600 = 0,211.

2. Inokulacja patogenów

  1. Ostrożnie wytnij zatyczkę komórkową zawierającą 2-3-tygodniową roślinę, nie uszkadzając rośliny. Umieść komórkę w pustej tacce na wtyczkę (wystarczą 2 x 2 komórki), aby utrzymać dobrą równowagę (Rysunek 1B).
  2. Wybierz widocznie zdrowy liść do zaszczepienia. Ogólnie rzecz biorąc, trzeci, czwarty i piąty liść (odpowiednio #3, #4 i #5 w Rysunek 1C) od spodu rośliny są łatwe w obsłudze. Używaj liści w tej samej pozycji w zestawie eksperymentów, aby uzyskać lepszą odtwarzalność. Podlej glebę, w której znajduje się roślina przed inokulacją, w celu długoterminowego obrazowania poklatkowego.
  3. Opcjonalnie, w przypadku analizy promotorów reagujących na stres, takich jak pPR1, aby upewnić się, że rośliny nie są naturalnie zestresowane, należy zbadać liście pod stereomikroskopem fluorescencyjnym przed inokulacją patogenu, aby zweryfikować brak sygnału YFP. Wyklucz z eksperymentu liście pokazujące sygnał YFP.
  4. Przed infiltracją należy założyć jednorazowe rękawiczki lateksowe, aby uniknąć bezpośredniego kontaktu z patogenem. Używając plastikowej strzykawki bezigłowej o pojemności 1 ml, ostrożnie naciekaj zawiesinę bakteryjną (10 8 CFU/ml) po stronie abakcyjnej liścia (108 CFU/ml)11 (Rysunek 1D). Zaszczepienie niewielkiej porcji na jednej połowie liścia umożliwia dobrą wizualizację aktywności pPR1; Naciekany obszar staje się widoczny jako ciemniejszy zielony kolor w porównaniu z pozostałym liściem. Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie spowodować żadnych uszkodzeń mechanicznych skrzydła podczas infiltracji.
    UWAGA: Upewnij się, że wszystkie przestrzenie międzykomórkowe w infiltrowanym obszarze są całkowicie (pionowo) wypełnione zawiesiną patogenu; w przeciwnym razie domena PCD będzie trudna do uwidocznienia pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym. Można to po prostu potwierdzić poprzez zakończenie ciemnego zazielenienia w infiltrowanym obszarze.
  5. Nadmiar zawiesiny bakteryjnej z obszaru otaczającego naciekany odcinek naciekanego liścia należy wchłonąć miękkim ręcznikiem papierowym.

3. Montaż zaszczepionego liścia

  1. Natychmiast po zaszczepieniu przymocuj szklane szkiełko do plastikowej tacki za pomocą taśmy chirurgicznej (Tabela materiałów) tak, aby naciekany liść znajdował się na środku szkiełka podstawowego. Upewnij się, że zaszczepiona blaszka liściowa jest całkowicie dopasowana do szkiełka (Rysunek 2A).
  2. Przygotuj dwuwarstwową taśmę z tworzywa sztucznego (w przypadku taśmy o grubości 0,2 mm, patrz Tabela Materiałów) i pokrój ją na dwie części (Rysunek 2B; kawałki 1 i 2), aby dopasować się do przestrzeni wzdłuż ogonka naciekanego liścia. Ułóż długość tych dwóch elementów, oznaczoną strzałką z podwójnym grotem w Rysunek 2B, tak, aby pasowała do długości strzałki z podwójnym grotem pokazanej w Rysunek 2A.
    UWAGA: Wycięcie narożnika z każdego z dwóch elementów pomaga uniknąć uszkodzenia blaszki liściowej (Rysunek 2B, groty strzałek; patrz również krok 3.4 poniżej). Każdy rodzaj taśmy plastikowej o podobnej grubości nadaje się do wykonania mostu nad ogonkiem. Sztywność taśmy z tworzywa sztucznego jest ważna dla łatwej obsługi podczas procedury opisanej poniżej.
  3. Za pomocą cienkiej pęsety przyklej kawałki 1 i 2 po obu stronach ogonka liściowego tak, aby ścięte rogi każdego kawałka pokrywały się z podstawą blaszki liściowej (Rysunek 2C). Upewnij się, że kawałki taśmy nie dotykają ogonka liściowego lub blaszki liściowej.
    UWAGA: Te dwuwarstwowe kawałki taśmy z tworzywa sztucznego u podstawy blaszki liściowej działają jak przekładki i zapobiegają fizycznemu obciążeniu ogonka liściowego podczas montażu.
  4. Przygotuj dodatkowy kawałek dwuwarstwowej plastikowej taśmy (Rysunek 2B, kawałek 3), aby dopasować rozmiar strzałki z podwójnym grotem w Rysunek 2B i przyklej go na wierzchu kawałków taśmy 1 i 2, aby utworzyć most nad ogonkiem liściowym (Rysunek 2D,E). Zachowaj szczególną ostrożność, aby nie zahaczyć o ogonek liściowy i blaszkę liściową bezpośrednio między kawałkami taśmy w miejscach oznaczonych strzałkami w Rysunek 2D,E.
  5. Delikatnie przyklej mały kawałek taśmy chirurgicznej (Rysunek 2F, kawałek 4) na szkiełku podstawowym nad końcówką blaszki liściowej, tak aby blaszka liściowa była bardzo miękko przymocowana do szkiełka. Mocno dociśnij tylko tę część taśmy chirurgicznej, która bezpośrednio dotyka szkiełka (Rysunek 2F, obszar obrysowany przerywaną czerwoną linią), a nie drugą część leżącą nad liśćmi.
  6. Delikatnie przyklej kolejny mały kawałek taśmy chirurgicznej (Rysunek 2G, kawałek 5) na granicy ogonka liściowego i kawałków taśmy z tworzywa sztucznego (1, 2 i 3), tak aby ogonek był bardzo miękko przymocowany zarówno do szkiełka podstawowego, jak i kawałków taśmy z tworzywa sztucznego. Tylko mocno przymocuj część taśmy chirurgicznej bezpośrednio stykającą się ze szkiełkiem do szkiełka i kawałków taśmy z tworzywa sztucznego (Rysunek 2G, obszar obrysowany przerywaną czerwoną linią), a nie drugą część leżącą nad ogonkiem.
  7. Zapobiegaj przesuwaniu się sąsiednich liści w pole widzenia mikroskopu za pomocą końcówek do pipet o pojemności 200 μl (Rysunek 2H). Włóż końcówki pipet do gleby, aby delikatnie trzymać sąsiednie liście z dala od infiltrowanego liścia. Uważaj, aby nie wkładać końcówek zbyt głęboko w glebę, aby uniknąć możliwego uszkodzenia korzeni.
    UWAGA: Przygotowana roślina jest teraz gotowa do obrazowania fluorescencyjnego stereoskopem.

4. Mikroskopowa obserwacja poklatkowa

  1. Włącz stereoskopowy mikroskop fluorescencyjny.
    UWAGA: W tym przypadku używany jest automatyczny mikroskop stereoskopowy wyposażony w bardzo czułą monochromatyczną kamerę cyfrową o rozdzielczości 1,4 megapiksela w trybie 12-bitowym (tabela materiałów). Mikroskop powinien być umieszczony w ciemnym pomieszczeniu wyposażonym w klimatyzator lub w ciemnej szafie z odpowiednią wentylacją, aby utrzymać temperaturę w pomieszczeniu na poziomie 23 °C podczas obrazowania poklatkowego.
  2. Ustaw roślinę w przestrzeni powyżej pod soczewką obiektywu mikroskopu stereoskopowego w celu obrazowania.
  3. Ustaw parametry obrazowania poklatkowego (patrz przykłady w Tabeli 1). Upewnij się, że zaprogramowałeś kroki ekspozycji na światło w okresie interwałowym obrazowania poklatkowego, ponieważ światło ma duży wpływ na odporność roślin12.
    1. Użyj konwencjonalnego filtra YFP (wzbudzenie 500-520 nm; emisja 540-580 nm), aby zobrazować sygnał YFP.
    2. Użyj filtra Texas Red (TXR) (wzbudzenie 540-580 nm; emisja 610 nm długości przepustowej), aby zobrazować autofluorescencję chlorofilu tak, aby domena PCD była widoczna jako ciemny obszar (bez autofluorescencji) otoczony warstwami komórek YFP-dodatnimi9 (Rysunek 3A).
    3. Użyj konwencjonalnej konfiguracji epi-bright field, aby uzyskać dodatkowe kroki ekspozycji na światło.
      UWAGA: Przed eksperymentem zmierz moc źródła światła epi-bright i dostosuj je do poziomu warunków wzrostu własnej rośliny.
  4. Uruchom program do obrazowania poklatkowego. W przypadku długotrwałej obserwacji przez kilka dni rozważ odpowiednie podlewanie rośliny, na przykład podczas etapów ekspozycji na światło.
  5. Po pozyskaniu obrazu należy pominąć w zbiorze danych dodatkowe kanały używane do ekspozycji na światło w przedziałach (odpowiadających kanałom 3-8 w tabeli 1). Analizuj dane różnymi metodami, takimi jak analiza regionu zainteresowania (ROI), przy użyciu różnych programów do analizy obrazów, takich jak Fiji9.

Wyniki

W niniejszej pracy wykorzystano ETI indukowane przez Pst_a2 jako przykład obrazowania w trybie poklatkowym (time-lapse). Dane poklatkowe uzyskano w postaci serii obrazów, z których kilka przedstawiono na Rysunku 3B, oraz w formie filmu poklatkowego (Supplemental Movie 1)9. W udanych eksperymentach z użyciem pPR1-YFP-NLS podczas ETI indukowanego przez Pst_a2 obserwowano przejściową aktywację pPR1, co objawiało się w postaci ognisk ekspresji YFP w kilku warstwach komórek otaczających domenę PCD (Rysunku 3B)9. Aktywacja pPR1 w komórkach otaczających domenę PCD zwykle rozpoczyna się około 5 godzin po inokulacji (hpi), osiąga szczyt około 12 hpi i trwa do 40 hpi (Rysunku 3B)9. Ponieważ obrazy pozyskano przy użyciu układu epifluorescencyjnego, sygnały YFP uzyskane w tym badaniu pochodziły z kilku adaksjalnych warstw komórek, w tym z komórek epidermy oraz górnych komórek mezofilu.

Eksperyment wzrostu roślin z doniczkami dla siewek, opisanym schematem liścia oraz procesem iniekcji strzykawką.
Rysunek 1: Metoda stosowana do infiltracji patogenu bakteryjnego do liścia Arabidopsis thaliana. (A) Dwu- do trzytygodniowe rośliny Arabidopsis hodowano w tacy z otworami do siewek. (B) Pojedynczy otwór zawierający wybraną roślinę do inokulacji i obserwacji został wycięty i umieszczony w pustej tacy, aby zachować równowagę. (C) Trzeci, czwarty i piąty liść (odpowiednio #3, #4 i #5) nadają się do analizy obrazu. (D) Infiltracja zawiesiny patogenu do wybranego liścia przy użyciu strzykawki bez igły. Obszar zinfiltrowany można rozpoznać po ciemniejszej zielonej barwie w porównaniu do reszty liścia. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Eksperyment wzrostu roślin; schemat przedstawia metodę pomiaru liścia, zestaw obejmuje komorę wzrostową i linijkę.
Rycina 2: Metoda stosowana do montażu infiltrowanego liścia Arabidopsis do obrazowania poklatkowego. (A) Fotografia rośliny Arabidopsis z podstawką szklaną przymocowaną pod zaszczepionym liściem. Infiltrowany liść został umieszczony w centrum podstawki szklanej. Strzałka dwustronna wskazuje długość dystansów z taśmy plastikowej. (B) Przygotowanie dystansów i mostka z taśmy plastikowej. Dwuwarstwowa taśma plastikowa została pocięta na dwa kawałki (1 i 2) pełniące rolę dystansów, a kolejny kawałek (3, obrysowany czerwoną przerywaną linią) został wycięty w celu przygotowania mostka. Długości strzałek dwustronnych są niemal identyczne z długością strzałki dwustronnej w punkcie (A). Jeden z czterech narożników kawałków 1 i 2, wskazany strzałkami, został odcięty. (C) Dwa kawałki dwuwarstwowej taśmy plastikowej (oznaczone jako 1 i 2) zostały ostrożnie przyklejone do szkła podstawki wzdłuż ogonka liściowego za pomocą precyzyjnej pęsety, bez bezpośredniego kontaktu z ogonkiem i blaszką liściową. (D) Dodatkowy kawałek dwuwarstwowej taśmy plastikowej (oznaczony jako 3), przygotowany w punkcie (B), został umieszczony na obu podstawowych dystansach (1 i 2), aby utworzyć mostek nad ogonkiem, dbając o to, by nie uwięzić ogonka między taśmami 1 i 2 w miejscach wskazanych strzałkami. (E) Fotografia przedstawiająca zaklejony ogonek. Ważne jest, aby nie uwięzić tkanek roślinnych bezpośrednio między kawałkami taśmy plastikowej w miejscach wskazanych strzałkami. (F) Mały kawałek taśmy chirurgicznej (oznaczony jako 4) został delikatnie przyklejony do podstawki szklanej wokół wierzchołka blaszki liściowej. Tylko obszar obrysowany czerwoną przerywaną linią został mocno dociśnięty do podstawki szklanej. (G) Kolejny mały kawałek taśmy chirurgicznej (oznaczony jako 5) został delikatnie przyklejony na granicy ogonka i kawałków taśmy plastikowej. Tylko obszar obrysowany czerwoną przerywaną linią został dociśnięty, aby miękko przymocować ogonek do szkła podstawki i kawałków taśmy plastikowej. (H) Dwa jednorazowe końcówki do pipet zostały wykorzystane, aby zapobiec przesunięciu sąsiednich liści w pole widzenia stereomikroskopu. Końcówki pipet zostały włożone bezpośrednio do gleby w odpowiednich miejscach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Mikroskopia fluorescencyjna YFP, autofluorescencja chlorofilu, żywotność komórek, wyniki obrazowania time-lapse.
Rysunek 3: Reprezentatywne wyniki z zastosowaniem metody montażu liści Arabidopsis. (A) Fluorescencyjne obrazy stereomikroskopowe liścia transgenicznej Arabidopsis (roślina pPR1-YFP-NLS). Część liścia została infiltrowana Pst_a2 (108 CFU/mL) na jego stronie abaksjalnej, a obrazy zarejestrowano 22 godziny po inokulacji (hpi). Jądra komórkowe, w których aktywowany był promotor pPR1, wykryto za pomocą filtra YFP, a programowaną śmierć komórki (PCD) zidentyfikowano na podstawie utraty autofluorescencji chlorofilu przy użyciu filtra Texas Red (TXR). Pasek skali = 2,5 mm. (B) Wybrane obrazy time-lapse z zestawu 800 obrazów uzyskanych zgodnie z opisanym tutaj protokołem. Dane te zapewniają przegląd in vivo dynamiki czasowo-przestrzennej aktywności pPR1 do 40 hpi. Przedstawiono nałożone na siebie obrazy YFP i TXR. Pasek skali = 2,5 mm. (C) Infiltracja kontrolna (mock) liścia transgenicznego (roślina pPR1-YFP-NLS). W infiltracji kontrolnej na stronę abaksjalną liścia wprowadzono 10 mM MgCl2, a następnie wykonano obrazowanie time-lapse. Zabieg kontrolny nie wywołał ektopowej aktywności pPR1 ani nie zakłócił autofluorescencji chlorofilu w 13 hpi. Strzałka wskazuje miejsce infiltracji kontrolnej. Pasek skali = 2,5 mm. Obrazy te zostały zmodyfikowane z wcześniejszego badania9. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat konfiguracji obrazowania time-lapse; kanały YFP, TXR i Bright Field; czasy ekspozycji; analiza żywych komórek.
Tabela 1:Program obrazowania time-lapse zastosowany w niniejszym badaniu.

Podział komórki, obraz z mikroskopii fluorescencyjnej, przedstawiający proces mitozy, kontrast zielono-fioletowy.
Dodatkowy Film 1: Film time-lapse pokazujący dynamikę spatiotemporalną aktywacji pPR1 w transgenicznej liściu Arabidopsis po odporności wywołanej efektorem (ETI) indukowanej inokulacją Pst_a2 . Fragment strony abaksjalnej transgenicznego liścia zawierającego konstrukt pPR1-YFP-NLS został infiltrowany Pst_a2 (108 CFU/mL). Obrazy pozyskiwano w odstępach 3-minutowych przez łącznie 40 h. Wyświetlany znacznik czasu jest w formacie dd:hh:mm:ss.sss. Film ten został zmodyfikowany na podstawie wcześniejszej pracy9. Kliknij tutaj, aby obejrzeć ten film. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać.)

Dyskusja

W tym miejscu przedstawiamy prostą metodę montowania żywego liścia Arabidopsis z ekspresją fluorescencyjnego genu reporterowego pod kontrolą promotora zainteresowania do długotrwałej obserwacji za pomocą automatycznego fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego. Obrazowanie poklatkowe reportera fluorescencyjnego było często wykonywane w tkankach korzeniowych; Jednak tylko kilka podobnych badań przeprowadzono na tkankach liści. Dzieje się tak najprawdopodobniej dlatego, że liście są w stanie swobodnie poruszać się w przestrzeni, podczas gdy korzenie są często zakopane i utrwalone w stałym podłożu agarowym.

W niniejszym raporcie skupiliśmy się na czasoprzestrzennej dynamice aktywności pPR1 podczas ETI indukowanej przez Pst_a2. Oprócz delikatnego utrwalenia liścia opisanego powyżej, ważne jest, aby wyraźnie zobrazować czasoprzestrzenną dynamikę zdarzeń komórkowych, takich jak aktywacja promotora i PCD. Jeśli rozróżnienie między komórkami wykazującymi aktywność pPR1 a PCD nie jest ostre, upewnij się, że wszystkie przestrzenie międzykomórkowe w obszarze naciekanym są całkowicie wypełnione zawiesiną patogenu (patrz krok 2.4). Ma to kluczowe znaczenie w przypadku korzystania ze stereoskopów fluorescencyjnych o szerokim polu, ponieważ mikroskopy te rejestrują wszystkie wykrywalne sygnały wzdłuż tej samej pozycji pionowej próbki. Autofluorescencja chlorofilu z komórek, które przeżyły, powyżej lub poniżej komórek w domenie PCD łatwo maskuje martwe komórki, które nie wykazują autofluorescencji. Dotyczy to również sygnału YFP.

Warunki do obrazowania poklatkowego muszą być starannie ustalone poprzez kilka wstępnych eksperymentów w różnych warunkach eksperymentalnych. Parametry obrazowania poklatkowego zależą od kilku czynników, takich jak układ mikroskopowy, rośliny transgeniczne i patogeny. Aby uzyskać te parametry, najpierw przeanalizowaliśmy różne czasy ekspozycji na intensywność sygnału YFP w naciekanym liściu przy 7 hpi, co prawie zbiega się z początkową aktywacją pPR1. Określono 5-sekundową ekspozycję jako odpowiednią do uchwycenia sygnału YFP za pomocą stereomikroskopu użytego w tym badaniu. Podobny test przeprowadzono do obrazowania autofluorescencji chlorofilu. Ekspozycja próbki na światło w odstępach 3-minutowych została zaprogramowana w programie obrazowania poklatkowego jako normalne obrazowanie w jasnym polu z maksymalnym czasem naświetlania. Nasz system (Tabela Materiałów) pozwolił nam na 2,5 minuty oprócz obrazowania YFP, TXR i jasnego pola. To ograniczenie było głównym powodem wyboru 3-minutowego interwału. Następnie potwierdziliśmy, że ten stan poklatkowy nie spowodował widocznych uszkodzeń próbek roślin i nie wywołał ektopowej aktywacji pPR1 związanej z ektopowym stresem świetlnym (Figura 3B, C). Doprowadziło to do opracowania programu wykorzystanego w tym badaniu. W związku z tym 3-minutowe interwały obrazowania fluorescencyjnego uznano za wystarczające do uchwycenia dynamiki pPR1 podczas ETI9 za pośrednictwem Pst_a2.

Konstrukty promotor-reporter, zwłaszcza z fluorescencyjnym reporterem połączonym z NLS, były wykorzystywane przez wiele grup i są łatwo dostępne dla społeczności naukowej; posłużyliśmy się konstruktem opublikowanym przez Kubo i wsp.13. W związku z tym opisany tutaj protokół może być stosowany w każdym badaniu biologii roślin badającym tkanki liści, jeśli dostępne są odpowiednie rośliny transgeniczne. Nasz prosty i łatwy w obsłudze protokół stanowi doskonałą okazję dla badaczy, którzy chcą przeanalizować czasoprzestrzenną dynamikę dowolnego zdarzenia biologicznego zachodzącego w liściach, takiego jak odpowiedź immunologiczna. Jest prawdopodobne, że nasza metoda wykorzystująca kawałki taśmy wywołuje lekkie naprężenia fizyczne na próbkach. Kwestię tę można jednak kontrolować, włączając do eksperymentów odpowiednie kontrole pozytywne i negatywne, takie jak pozorowane leczenie (ryc. 3C). Warunki eksperymentalne mogą być dalej modyfikowane i optymalizowane, analizując te kontrole w różnych warunkach.

W ostatnich latach szybki rozwój instrumentów i technik obrazowania pobudził zainteresowanie badaczy złożonymi czasoprzestrzennymi aspektami zdarzeń biologicznych. W każdej analizie obrazowej do najważniejszych kwestii należy odpowiednie mocowanie i mocowanie próbek. Prosta i wszechstronna metoda montowania żywych liści rzodkiewnika opracowana w tym badaniu może być stosowana i optymalizowana do różnych eksperymentów obrazowych.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Japońską Agencję Nauki i Technologii [PRESTO117665 do S.B., ERATOJPMJER1502 do N.N.] oraz przez Japońskie Towarzystwo Promocji Nauki (Grants-in-Aid for Research Activity Start-up [22880008 do S.B.] oraz dla Młodych Naukowców (B) [23780040 do S.B.]). Dziękujemy A. Senzaki, Y. Suzuki, Y. Sugisawa i E. Betsuyaku za doskonałą pomoc techniczną, J. Parkerowi za dostarczenie szczepu Pst_a2 oraz T. Demurze za dostarczenie wektora pBGYN.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Bacto AgarBD biosciences214010
Pepton proteazy baktonowej nr 3BD nauki biologiczne211693
Ekstrakt z drożdży baktoBD biosciences212750
BM2 glebaBerger
Glycerolnacalai tesque17017-35
Siarczan kanamycynyWako113-00343
Leica M205FA z DFC365FX, LED_MCI i Leica EL6000 (regulowany programowo Las X) LeicaMicrosystemsZainstalowane filtry żółtej fluorescencji białkowej (YFP) i Texas Red (TXR)
Sześciowodny chlorek magnezuWako135-00165
Slide Glass (Rozmiar: 76 mm i razy 26 mm, Grubość: 1.0– 1,2 mm)MATSUNAMIS1112
Taśma chirurgiczna Micropore (1,25 cm i razy 9 m)3M1530-0
Bezigłowa plastikowa strzykawka 1 mlTerumoSS-01T
Plastikowa tacka na zatyczkę do komórek (rozmiar komórki: 44 mm  × 44mm × 44 mm)Tanaka sangyo, Japoniahtray-bk72Można użyć dowolnej  tacki z komórkami o podobnej wielkości
RyfampicynaNacalai tesque30259-81
Taśma plastikowa (grubość 0,2 mm i czasy; 19 mm szerokości i razy 10 m długości)YamatoNo0200-19-1Można użyć dowolnej taśmy plastikowej/winylowej o podobnej grubości
Micro

Bibliografia

  1. Tsuda, K., Somssich, I. E. Transcriptional networks in plant immunity. New Phytologist. 206 (3), 932-947 (2015).
  2. Mine, A., Sato, M., Tsuda, K. Toward a systems understanding of plant-microbe interactions. Frontiers in Plant Science. 5, (2014).
  3. Murray, S. L., Thomson, C., Chini, A., Read, N. D., Loake, G. J. Characterization of a novel, defense-related Arabidopsis mutant, cir1, isolated by luciferase imaging. Molecular Plant-Microbe Interactions. 15 (6), 557-566 (2002).
  4. Spoel, S. H., Johnson, J. S., Dong, X. Regulation of tradeoffs between plant defenses against pathogens with different lifestyles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (47), 18842-18847 (2007).
  5. Asai, S., Shirasu, K. Plant cells under siege: plant immune system versus pathogen effectors. Current Opinion in Plant Biology. 28, 1-8 (2015).
  6. Schmelzer, E., Kruger-Lebus, S., Hahlbrock, K. Temporal and Spatial Patterns of Gene Expression around Sites of Attempted Fungal Infection in Parsley Leaves. The Plant Cell. 1 (10), 993-1001 (1989).
  7. Ohshima, M., Itoh, H., Matsuoka, M., Murakami, T., Ohashi, Y. Analysis of stress-induced or salicylic acid-induced expression of the pathogenesis-related 1a protein gene in transgenic tobacco. The Plant Cell. 2 (2), 95-106 (1990).
  8. Rushton, P. J., Reinstädler, A., Lipka, V., Lippok, B., Somssich, I. E. Synthetic plant promoters containing defined regulatory elements provide novel insights into pathogen- and wound-induced signaling. The Plant Cell. 14 (4), 749-762 (2002).
  9. Betsuyaku, S., et al. Salicylic Acid and Jasmonic Acid Pathways are Activated in Spatially Different Domains Around the Infection Site During Effector-Triggered Immunity in Arabidopsis thaliana. Plant & Cell Physiology. 59 (1), 8-16 (2018).
  10. Dodds, P. N., Rathjen, J. P. Plant immunity: towards an integrated view of plant-pathogen interactions. Nature Reviews Genetics. 11 (8), 539-548 (2010).
  11. Katagiri, F., Thilmony, R. The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction. Arabidopsis Book. , (2002).
  12. Zeier, J., Pink, B., Mueller, M. J., Berger, S. Light conditions influence specific defence responses in incompatible plant-pathogen interactions: uncoupling systemic resistance from salicylic acid and PR-1 accumulation. Planta. 219 (4), 673-683 (2004).
  13. Kubo, M., et al. Transcription switches for protoxylem and metaxylem vessel formation. Genes & Development. 19 (16), 1855-1860 (2005).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mikroskopia fluorescencyjnaodporno ro linpromotor PR1ekspresja YFP NLSinokulacja patogenemmontowanie li cianaliza czasowo przestrzennaekspresja gen w
Uniwersalna metoda montażu liści Arabidopsis do przyżyciowego obrazowania poklatkowego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.