Uniwersalna metoda montażu liści Arabidopsis do przyżyciowego obrazowania poklatkowego

Odpowiedź immunologiczna roślin obejmuje dynamiczne przeprogramowanie transkrypcji regulowane przez wiele czynników transkrypcyjnych, a także fitohormony¹. Gromadzenie danych transkryptomu daje możliwość zbierania informacji o układzie odpornościowym roślin: na przykład struktura sieci kaskad sygnałowych². Jednak nasza wiedza na temat przestrzennej i czasowej dynamiki odporności roślin nadal pozostaje ograniczona^3,4,5.

W poprzednich badaniach, czasoprzestrzenna regulacja ekspresji genów związanych z obroną była głównie analizowana przy użyciu hybrydyzacji in situ i testu reporterowego β-glukuronidazy (GUS)^6,7,8. Metody te pozwalają nam zwizualizować transkrypcyjną aktywację różnych genów będących przedmiotem zainteresowania in situ. Procedury te wymagają jednak chemicznego utrwalenia próbek, a tym samym skutkują utratą wszystkich informacji czasowych. Zdarzenia biologiczne, takie jak odporność, postępują w czasie. Użycie lucyferazy jako reportera umożliwiło uchwycenie dynamiki czasowej promotora zainteresowania³. Jednak test oparty na lucyferazie wymaga drogiego substratu i bardzo czułych detektorów. Aby pogłębić naszą wiedzę na temat czasoprzestrzennych aspektów odpowiedzi immunologicznej roślin za pomocą prostej procedury, wygenerowaliśmy transgeniczne rośliny Arabidopsis thaliana wykazujące ekspresję genu żółtego białka fluorescencyjnego (YFP) połączonego z sygnałem lokalizacji jądrowej (YFP-NLS) pod kontrolą promotora genu markera związanego z obroną, Pathogenesis-Related 1 (PR1)⁹. Użyliśmy autofluorescencji chlorofilu, markera żywych komórek, aby uchwycić proces programowanej śmierci komórki (PCD), który często występuje podczas odporności aktywowanej efektorem (ETI), formy odporności roślin indukowanej przez infekcję specyficznym patogenem^9,10. Monitorowanie temporalnej dynamiki intensywności sygnału fluorescencji w swobodnie poruszających się obiektach, takich jak żywe liście rzodkiewnika, wymaga złożonego oprogramowania do przetwarzania obrazu, które jest wbudowane we własne firmy lub dostępne na rynku. Alternatywnie, zapobieganie przemieszczaniu się próbek jest prostą metodą rozwiązania problemu. W tym miejscu opracowaliśmy wszechstronną i prostą metodę montażu żywych liści transgenicznej rośliny Arabidopsis do długotrwałej obserwacji pod automatycznym stereomikroskopem fluorescencyjnym. Metoda ta pozwala nam uchwycić dynamikę promotora w nienaruszonych liściach roślin uprawianych w glebie w ciągu kilku dni.

UWAGA: Ważne jest, aby zapobiec ruchom sennym żywych próbek liści podczas obrazowania poklatkowego. Aby zminimalizować naprężenia mechaniczne liści, konieczne jest delikatne utrwalenie liści. Tylko odpowiednio przygotowane próbki liści dają obrazy poklatkowe nadające się do różnych analiz obrazu. Protokół wykorzystujący transgeniczne rośliny Arabidopsis wykazujące ekspresję fuzji YFP-NLS pod kontrolą promotora genu PR1 (rośliny pPR1-YFP-NLS) i Pseudomonas syringae pv. pomidor Szczep DC3000 (avrRpt2) (Pst_a2) jest opisany poniżej jako przykład.

1. Przygotowanie roślin i patogenów

1. Napełnij plastikową tackę na zatyczki do komórek (tabela materiałów) autoklawowaną glebą.
2. Zasiej jedno transgeniczne nasiono Arabidopsis na komórkę (Rysunek 1A).
3. Przenieś tacę do pomieszczenia do uprawy w temperaturze 23 °C i hoduj rośliny w ciągłym białym świetle przez 2-3 tygodnie.
4. Dwa dni przed inokulacją patogenu smuga Pseudomonas syringae pv. pomidor DC3000 avrRpt2 (Pst_a2) z glicerolu podstawowego na pożywkę NYG (5 g/l peptonu, 3 g/l ekstraktu drożdżowego, 20 ml/l glicerolu, 15 g/l agaru bakteriologicznego, pH 7,0) zawierający 100 mg/l ryfampicyny i 50 mg/l kanamycyny i inkubować w temperaturze 28 °C przez 48 godzin.
5. Zbierz komórki bakteryjne, które pojawiają się na powierzchni podłoża za pomocą plastikowych końcówek, przenieś je do plastikowej probówki zawierającej 10 mM MgCl₂ i ponownie zawieś. Zmierzyć gęstość optyczną (OD) roztworu przy 600 nm (OD₆₀₀). Dostosuj końcowe stężenie komórek bakteryjnych do 10⁸ jednostek tworzenia kolonii (CFU)/ml, co normalnie odpowiada OD₆₀₀ = 0,2¹¹.

2. Inokulacja patogenów

1. Ostrożnie wytnij zatyczkę komórkową zawierającą 2-3-tygodniową roślinę, nie uszkadzając rośliny. Umieść komórkę w pustej tacce na wtyczkę (wystarczą 2 x 2 komórki), aby utrzymać dobrą równowagę (Rysunek 1B).
2. Wybierz widocznie zdrowy liść do zaszczepienia. Ogólnie rzecz biorąc, trzeci, czwarty i piąty liść (odpowiednio #3, #4 i #5 w Rysunek 1C) od spodu rośliny są łatwe w obsłudze. Używaj liści w tej samej pozycji w zestawie eksperymentów, aby uzyskać lepszą odtwarzalność. Podlej glebę, w której znajduje się roślina przed inokulacją, w celu długoterminowego obrazowania poklatkowego.
3. Opcjonalnie, w przypadku analizy promotorów reagujących na stres, takich jak pPR1, aby upewnić się, że rośliny nie są naturalnie zestresowane, należy zbadać liście pod stereomikroskopem fluorescencyjnym przed inokulacją patogenu, aby zweryfikować brak sygnału YFP. Wyklucz z eksperymentu liście pokazujące sygnał YFP.
4. Przed infiltracją należy założyć jednorazowe rękawiczki lateksowe, aby uniknąć bezpośredniego kontaktu z patogenem. Używając plastikowej strzykawki bezigłowej o pojemności 1 ml, ostrożnie naciekaj zawiesinę bakteryjną (10 8 CFU/ml) po stronie abakcyjnej liścia (10⁸ CFU/ml)¹¹ (Rysunek 1D). Zaszczepienie niewielkiej porcji na jednej połowie liścia umożliwia dobrą wizualizację aktywności pPR1; Naciekany obszar staje się widoczny jako ciemniejszy zielony kolor w porównaniu z pozostałym liściem. Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie spowodować żadnych uszkodzeń mechanicznych skrzydła podczas infiltracji.
   UWAGA: Upewnij się, że wszystkie przestrzenie międzykomórkowe w infiltrowanym obszarze są całkowicie (pionowo) wypełnione zawiesiną patogenu; w przeciwnym razie domena PCD będzie trudna do uwidocznienia pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym. Można to po prostu potwierdzić poprzez zakończenie ciemnego zazielenienia w infiltrowanym obszarze.
5. Nadmiar zawiesiny bakteryjnej z obszaru otaczającego naciekany odcinek naciekanego liścia należy wchłonąć miękkim ręcznikiem papierowym.

3. Montaż zaszczepionego liścia

1. Natychmiast po zaszczepieniu przymocuj szklane szkiełko do plastikowej tacki za pomocą taśmy chirurgicznej (Tabela materiałów) tak, aby naciekany liść znajdował się na środku szkiełka podstawowego. Upewnij się, że zaszczepiona blaszka liściowa jest całkowicie dopasowana do szkiełka (Rysunek 2A).
2. Przygotuj dwuwarstwową taśmę z tworzywa sztucznego (w przypadku taśmy o grubości 0,2 mm, patrz Tabela Materiałów) i pokrój ją na dwie części (Rysunek 2B; kawałki 1 i 2), aby dopasować się do przestrzeni wzdłuż ogonka naciekanego liścia. Ułóż długość tych dwóch elementów, oznaczoną strzałką z podwójnym grotem w Rysunek 2B, tak, aby pasowała do długości strzałki z podwójnym grotem pokazanej w Rysunek 2A.
   UWAGA: Wycięcie narożnika z każdego z dwóch elementów pomaga uniknąć uszkodzenia blaszki liściowej (Rysunek 2B, groty strzałek; patrz również krok 3.4 poniżej). Każdy rodzaj taśmy plastikowej o podobnej grubości nadaje się do wykonania mostu nad ogonkiem. Sztywność taśmy z tworzywa sztucznego jest ważna dla łatwej obsługi podczas procedury opisanej poniżej.
3. Za pomocą cienkiej pęsety przyklej kawałki 1 i 2 po obu stronach ogonka liściowego tak, aby ścięte rogi każdego kawałka pokrywały się z podstawą blaszki liściowej (Rysunek 2C). Upewnij się, że kawałki taśmy nie dotykają ogonka liściowego lub blaszki liściowej.
   UWAGA: Te dwuwarstwowe kawałki taśmy z tworzywa sztucznego u podstawy blaszki liściowej działają jak przekładki i zapobiegają fizycznemu obciążeniu ogonka liściowego podczas montażu.
4. Przygotuj dodatkowy kawałek dwuwarstwowej plastikowej taśmy (Rysunek 2B, kawałek 3), aby dopasować rozmiar strzałki z podwójnym grotem w Rysunek 2B i przyklej go na wierzchu kawałków taśmy 1 i 2, aby utworzyć most nad ogonkiem liściowym (Rysunek 2D,E). Zachowaj szczególną ostrożność, aby nie zahaczyć o ogonek liściowy i blaszkę liściową bezpośrednio między kawałkami taśmy w miejscach oznaczonych strzałkami w Rysunek 2D,E.
5. Delikatnie przyklej mały kawałek taśmy chirurgicznej (Rysunek 2F, kawałek 4) na szkiełku podstawowym nad końcówką blaszki liściowej, tak aby blaszka liściowa była bardzo miękko przymocowana do szkiełka. Mocno dociśnij tylko tę część taśmy chirurgicznej, która bezpośrednio dotyka szkiełka (Rysunek 2F, obszar obrysowany przerywaną czerwoną linią), a nie drugą część leżącą nad liśćmi.
6. Delikatnie przyklej kolejny mały kawałek taśmy chirurgicznej (Rysunek 2G, kawałek 5) na granicy ogonka liściowego i kawałków taśmy z tworzywa sztucznego (1, 2 i 3), tak aby ogonek był bardzo miękko przymocowany zarówno do szkiełka podstawowego, jak i kawałków taśmy z tworzywa sztucznego. Tylko mocno przymocuj część taśmy chirurgicznej bezpośrednio stykającą się ze szkiełkiem do szkiełka i kawałków taśmy z tworzywa sztucznego (Rysunek 2G, obszar obrysowany przerywaną czerwoną linią), a nie drugą część leżącą nad ogonkiem.
7. Zapobiegaj przesuwaniu się sąsiednich liści w pole widzenia mikroskopu za pomocą końcówek do pipet o pojemności 200 μl (Rysunek 2H). Włóż końcówki pipet do gleby, aby delikatnie trzymać sąsiednie liście z dala od infiltrowanego liścia. Uważaj, aby nie wkładać końcówek zbyt głęboko w glebę, aby uniknąć możliwego uszkodzenia korzeni.
   UWAGA: Przygotowana roślina jest teraz gotowa do obrazowania fluorescencyjnego stereoskopem.

4. Mikroskopowa obserwacja poklatkowa

1. Włącz stereoskopowy mikroskop fluorescencyjny.
   UWAGA: W tym przypadku używany jest automatyczny mikroskop stereoskopowy wyposażony w bardzo czułą monochromatyczną kamerę cyfrową o rozdzielczości 1,4 megapiksela w trybie 12-bitowym (tabela materiałów). Mikroskop powinien być umieszczony w ciemnym pomieszczeniu wyposażonym w klimatyzator lub w ciemnej szafie z odpowiednią wentylacją, aby utrzymać temperaturę w pomieszczeniu na poziomie 23 °C podczas obrazowania poklatkowego.
2. Ustaw roślinę w przestrzeni powyżej pod soczewką obiektywu mikroskopu stereoskopowego w celu obrazowania.
3. Ustaw parametry obrazowania poklatkowego (patrz przykłady w Tabeli 1). Upewnij się, że zaprogramowałeś kroki ekspozycji na światło w okresie interwałowym obrazowania poklatkowego, ponieważ światło ma duży wpływ na odporność roślin¹².
   1. Użyj konwencjonalnego filtra YFP (wzbudzenie 500-520 nm; emisja 540-580 nm), aby zobrazować sygnał YFP.
   2. Użyj filtra Texas Red (TXR) (wzbudzenie 540-580 nm; emisja 610 nm długości przepustowej), aby zobrazować autofluorescencję chlorofilu tak, aby domena PCD była widoczna jako ciemny obszar (bez autofluorescencji) otoczony warstwami komórek YFP-dodatnimi⁹ (Rysunek 3A).
   3. Użyj konwencjonalnej konfiguracji epi-bright field, aby uzyskać dodatkowe kroki ekspozycji na światło.
      UWAGA: Przed eksperymentem zmierz moc źródła światła epi-bright i dostosuj je do poziomu warunków wzrostu własnej rośliny.
4. Uruchom program do obrazowania poklatkowego. W przypadku długotrwałej obserwacji przez kilka dni rozważ odpowiednie podlewanie rośliny, na przykład podczas etapów ekspozycji na światło.
5. Po pozyskaniu obrazu należy pominąć w zbiorze danych dodatkowe kanały używane do ekspozycji na światło w przedziałach (odpowiadających kanałom 3-8 w tabeli 1). Analizuj dane różnymi metodami, takimi jak analiza regionu zainteresowania (ROI), przy użyciu różnych programów do analizy obrazów, takich jak Fiji⁹.

Tutaj użyliśmy ETI wywołanego przez Pst_a2 jako przykładu dla obrazowania poklatkowego. Dane poklatkowe uzyskano jako serię obrazów, z których kilka jest pokazanych w Rysunek 3B) oraz jako film poklatkowy (Film uzupełniający 1)9. W udanych eksperymentach z użyciem pPR1-YFP-NLS podczas ETI indukowanego przez Pst_a2, zaobserwowano przejściową aktywację pPR1, jak wynika z ognisk ekspresji YFP, w kilku warstwach komórek otaczających domenę PCD (Rysunek 3B)9. Aktywacja pPR1 w komórkach otaczających domenę PCD zwykle rozpoczyna się po około 5 godzinach od inokulacji (hpi), osiąga szczyt przy około 12 hpi i trwa do 40 hpi (Rysunek 3B) 9. Ponieważ obrazy uzyskano za pomocą systemu epifluorescencyjnego, uzyskane tutaj sygnały YFP zostały wygenerowane z kilku warstw komórek adaksjalnych, w tym komórek naskórka i górnych komórek mezofilu.

Rysunek 1: Metoda używana do infiltracji patogenu bakteryjnego do liścia Arabidopsis thaliana. (A) Dwu- lub trzytygodniowe rośliny Arabidopsis były hodowane w tacy z zatyczkami komórkowymi. (B) Zatyczka jednokomórkowa zawierająca wybraną roślinę, która miała być użyta do zaszczepienia i obserwacji, została wycięta i umieszczona w pustej tacce na zatyczki komórkowe w celu utrzymania równowagi. orazTrzecia, czwarta i piąta karta (odpowiednio #3, #4 i #5) nadają się do analizy obrazu. (D) Infiltracja zawiesiny patogenu do wybranego liścia za pomocą strzykawki bezigłowej. Infiltrowany obszar można rozpoznać po ciemniejszym zielonym kolorze niż pozostały liść. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Metoda używana do montażu naciekanego liścia Arabidopsis do obrazowania poklatkowego. (A) Fotografia rośliny Arabidopsis ze szkiełkiem podstawowym umocowanym pod zaszczepionym liściem. Skrzydło infiltracyjne umieszczono pośrodku szkiełka. Strzałka z podwójnym grotem wskazuje długość przekładek z plastikowej taśmy. (B) Przygotowanie przekładek z taśmy z tworzywa sztucznego i mostka. Dwuwarstwowa taśma z tworzywa sztucznego została pocięta na dwie części (1 i 2) na przekładki, a kolejny kawałek (3, obrysowany przerywaną czerwoną linią) został przecięty w celu przygotowania mostu. Długości strzał dwugrotowych są niemal identyczne do długości strzały z dwoma grotami w (A). Jeden z czterech rogów elementów 1 i 2, oznaczonych strzałkami, został przecięty. (C) Dwa kawałki dwuwarstwowej taśmy z tworzywa sztucznego (ponumerowane jako 1 i 2) zostały ostrożnie przyklejone do szkiełka szkiełkowego wzdłuż ogonka liściowego za pomocą pary cienkich pęset, bez bezpośredniego kontaktu z ogonkiem liściowym i blaszką liściową. (D) Dodatkowy kawałek dwuwarstwowej taśmy z tworzywa sztucznego (o numerze 3), który został przygotowany z (B), został umieszczony na obu podstawowych przekładkach (1 i 2) w celu utworzenia mostka nad ogonkiem, przy jednoczesnym upewnieniu się, że ogonek liściowy między taśmami 1 i 2 nie zostanie złapany w miejscach oznaczonych strzałkami. (E) Fotografia przedstawiająca zaklejony taśmą ogonek liściowy. Ważne jest, aby nie zaczepiać tkanki roślinnej bezpośrednio między kawałkami plastikowej taśmy w miejscach wskazanych strzałkami. (F) Mały kawałek taśmy chirurgicznej (ponumerowany jako 4) delikatnie przyklejony był do szkiełka naokoło czubka blaszki liściowej. Tylko obszar zaznaczony przerywaną czerwoną linią został mocno dociśnięty do szkiełka podstawowego. (G) Kolejny mały kawałek taśmy chirurgicznej (ponumerowany jako 5) został delikatnie przyklejony na granicy ogonka liściowego i kawałków taśmy plastikowej. Tylko obszar wyznaczony przerywaną czerwoną linią został naciśnięty w celu miękkiego zamocowania ogonka liściowego na szkiełku szkiełkowym i kawałkach plastikowej taśmy. (H) Użyto dwóch jednorazowych końcówek do pipet, aby zapobiec przesuwaniu się sąsiednich liści w pole widzenia mikroskopu stereoskopowego. Końcówki pipet zostały włożone bezpośrednio do gleby w odpowiednich pozycjach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Reprezentatywne wyniki przy użyciu metody montażu liści Arabidopsis. (A) Fluorescencyjne stereomikroskopowe obrazy transgenicznego liścia Arabidopsis (roślina pPR1-YFP-NLS). Część liścia naciekowano Pst_a2 (108 CFU/ml) na jego powierzchni aosiowej, a obrazy zostały wykonane po 22 godzinach od inokulacji (hpi). Jądra, w których aktywowany był promotor pPR1, wykrywano za pomocą filtra YFP, a programowaną śmierć komórki (PCD) wykrywano na podstawie utraty autofluorescencji chlorofilu przy użyciu filtra Texas Red (TXR). Podziałka liniowa = 2,5 mm. (B) Kilka zdjęć poklatkowych wybranych z kolekcji 800 obrazów uzyskanych przy użyciu opisanego tutaj protokołu. Dane te stanowią przegląd in vivo czasoprzestrzennej dynamiki aktywności pPR1 dla 40 hpi. Wyświetlane są scalone obrazy obrazów YFP i TXR. Podziałka = 2,5 mm. (C) Udawana infiltracja liścia transgenicznego (roślina pPR1-YFP-NLS). W pozorowanej infiltracji 10 mM MgCl2 naciekano do aosialnej strony liścia, a następnie wykonywano obrazowanie poklatkowe. Pozorowane leczenie nie powodowało ektopowej aktywności pPR1 i nie wpływało na autofluorescencję chlorofilu przy 13 hpi. Strzałka wskazuje pozycję pozorowanej infiltracji. Podziałka = 2,5 mm. Te obrazy zostały zmodyfikowane na podstawie poprzedniego badania9. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Program do obrazowania poklatkowego wykorzystany w tym badaniu.

Film uzupełniający 1: Film poklatkowy pokazujący czasoprzestrzenną dynamikę aktywacji pPR1 w transgenicznym liściu Arabidopsis po odporności wyzwalanej efektorowo (ETI) indukowanej przez szczepienie Pst_a2. Część abaksjalnej strony transgenicznego liścia przenoszącego konstrukt pPR1-YFP-NLS infiltrowano Pst_a2 (10,8 CFU/ml). Zdjęcia były rejestrowane w odstępach 3-minutowych przez łącznie 40 godzin. Wyświetlany znacznik czasu jest w formacie dd:hh:mm:ss.sss. Ten film został zmodyfikowany na podstawie poprzedniego badania9. Kliknij tutaj, aby obejrzeć ten film. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać.)

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.