Artykuł metodologiczny

Przygotowanie próbki biologicznej poprzez zamrażanie pod wysokim ciśnieniem, wspomagane mikrofalami wzmocnienie kontrastu i minimalne zatapianie żywicy w celu obrazowania objętościowego

12K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59156

⸱

19 marca 2019

 ,  , 
1Electron Microscopy Core Unit, Max Planck Institute of Experimental Medicine, 2Center Nanoscale Microscopy and Molecular Physiology of the Brain (CNMPB)

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół łączenia dwóch technik przetwarzania próbek, zamrażania wysokociśnieniowego i przetwarzania próbek wspomaganego mikrofalami, a następnie minimalnego zatapiania żywicy w celu pozyskiwania danych za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego z skupioną wiązką jonów (FIB-SEM). Wykazano to przy użyciu próbki nerwu piszczelowego myszy i Caenorhabditis elegans.

Streszczenie

Opisana technika przygotowania próbki została zaprojektowana tak, aby połączyć najlepszą jakość zachowania ultrastrukturalnego z najbardziej odpowiednim kontrastem dla metody obrazowania w skaningowym mikroskopie elektronowym ze skupioną wiązką jonów (FIB-SEM), który jest używany do uzyskiwania stosów sekwencyjnych obrazów do rekonstrukcji i modelowania 3D. Zamrażanie wysokociśnieniowe (HPF) pozwala na zachowanie struktury zbliżonej do natywnej, ale późniejsza substytucja przez zamrożenie często nie zapewnia wystarczającego kontrastu, szczególnie w przypadku większego próbki, który jest potrzebny do wysokiej jakości obrazowania w SEM wymaganego do rekonstrukcji 3D. Dlatego w tym protokole, po podstawieniu przez zamrożenie, przeprowadza się dodatkowe kontrastujące etapy w temperaturze pokojowej. Chociaż czynności te są wykonywane w kuchence mikrofalowej, możliwe jest również zastosowanie tradycyjnej obróbki stołowej, która wymaga dłuższego czasu inkubacji. Późniejsze zatopienie w minimalnej ilości żywicy pozwala na szybsze i bardziej precyzyjne celowanie i przygotowanie wewnątrz FIB-SEM. Protokół ten jest szczególnie przydatny w przypadku próbek, które wymagają przygotowania przez zamrażanie pod wysokim ciśnieniem w celu niezawodnej konserwacji ultrastrukturalnej, ale nie uzyskują wystarczającego kontrastu podczas substytucji przez zamrożenie do obrazowania objętościowego przy użyciu FIB-SEM. W połączeniu z minimalnym zatopieniem żywicy, protokół ten zapewnia wydajny przepływ pracy w celu pozyskiwania wysokiej jakości danych objętościowych.

Wprowadzenie

Zamrażanie wysokociśnieniowe to metoda przygotowania próbki z wyboru w celu uzyskania wysokiej jakości ultrastrukturalnej konserwacji, która znacznie lepiej reprezentuje natywny stan próbki niż konwencjonalne metody przygotowania przy użyciu chemicznego utrwalania1. Ta metoda krioprzygotowania jest przydatna w przypadku próbek takich jak mielinizowana tkanka myszy2 i ścisłe wymagania dotyczące stosowania organizmu modelowego Caenorhabditis elegans3. Po podstawieniu przez zamrożenie i zatopieniu w żywicy, próbki te są zwykle analizowane za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) lub tomografii elektronowej (ET). Jeśli większe objętości muszą być obrazowane za pomocą FIB-SEM lub szeregowego obrazowania blokowego w celu rekonstrukcji 3D o wysokiej rozdzielczości na dużą skalę, z naszego doświadczenia wynika, że prawidłowe obrazowanie za pomocą SEM jest często utrudnione przez brak kontrastu. W FIB-SEM obraz jest zwykle rejestrowany przez detekcję elektronów wstecznie rozproszonych z pierwotnej wiązki elektronów. Wydajność elektronów wstecznie rozproszonych jest proporcjonalna do zawartości metali ciężkich w próbce. W związku z tym protokoły zostały specjalnie zaprojektowane do obrazowania objętościowego, aby zwiększyć kontrast poprzez dodatkową impregnację metalami ciężkimi. Takie metody opierają się na chemicznie utrwalonych próbkach i stosują kombinację tetrtlenku osmu-tiokarbohydrazydu-tetratlenku osmu4, zgodnie z opisem Knott et al.5, do seryjnej skaningowej mikroskopii elektronowej z blokową powierzchnią i skupioną wiązką jonów. Modyfikacje, w tym zastosowanie formamidu i pirogalolu6 lub asparaginianu ołowiu7 zostały z powodzeniem zastosowane w różnych technikach obrazowania.

Dostarczony tutaj protokół łączy krioprzygotowanie próbek za pomocą HPF i substytucję przez zamrażanie z późniejszym przetwarzaniem wspomaganym mikrofalami w celu zwiększenia kontrastu przy użyciu tiokarbohydrazydu/tetratlenku osmu w acetonie w temperaturze pokojowej. Wykazujemy to na mielinizowanym nerwie piszczelowym myszy oraz na Caenorhabditis elegans, które reprezentują próbki wymagające zamrażania pod wysokim ciśnieniem w celu uzyskania wysokiej jakości konserwacji ultrastrukturalnej. Ponadto pokazano, w jaki sposób, po odwodnieniu i infiltracji, próbki są zatapiane z jak najmniejszą ilością żywicy. To minimalne osadzanie żywicy8 pozwala na szybsze ukierunkowanie interesującej struktury i skraca czas poświęcony na przetwarzanie próbki, w tym mniej czasu potrzebnego na naświetlenie obszaru zainteresowania wiązką jonów. Po wykonaniu dalszych etapów przygotowania próbki wewnątrz mikroskopu, obrazowanie i mielenie próbki odbywa się w sposób ciągły w celu uzyskania stosu obrazów. W przypadku wizualizacji 3D oprogramowanie do przetwarzania obrazu (IMOD) służy do rekonstrukcji części zestawu danych.

Nasz przepływ pracy opisuje, jak najbardziej odpowiednie kontrastowanie próbek do obrazowania objętościowego może być połączone z najlepszym zachowaniem ultrastrukturalnym przez HPF i podstawienie przez zamrożenie. Jest to przydatne w przypadku próbek, które ściśle wymagają kriopreparacji. Zastosowania są ograniczone do małych próbek, które można przygotować za pomocą HPF. W próbkach o różnym charakterze, takich jak materiał roślinny lub mikroorganizmy, protokół ten wymaga adaptacji.

Protokół

Wszystkie eksperymenty, w tym próbki od zwierząt opisane tutaj, zostały zatwierdzone przez Instytucję Opieki nad Zwierzętami oraz Krajowy Urząd Ochrony Klienta i Bezpieczeństwa Żywności Dolnej Saksonii (LAVES).

1. Zamrażanie wysokociśnieniowe i substytucja zamrażania

  1. Wypreparuj nerw piszczelowy myszy (np. C57Bl6N, 12 tygodni, samica)9.
  2. Zanurz nerw piszczelowy w kropli 20% poliwinylopirolidonu (1 g PVP w 5 ml) w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) i pokrój na kawałki o długości 2 mm. Następnie umieść go w metalowym nośniku próbki (typ A, głębokość 0,2 mm) za pomocą drobnych kleszczyków. Dodaj kolejny płaski nośnik (typ B) pokryty cienką warstwą heksadekanu jako pokrywkę i włóż ten zespół do wkładu z próbką.
  3. Przenieść kilka C. elegan zawieszonych w kropli 20% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w M9 (patrz Tabela Materiałów) za pomocą jednorazowej plastikowej pipety do metalowego nośnika (Typ A). Następnie dodaj drugi nośnik jako pokrywę na górze (typ B) i zmontuj wkład.
  4. W przypadku obu próbek należy postępować zgodnie z poniższymi krokami: zamrozić pod wysokim ciśnieniem zespoły nośników próbek jeden po drugim, ładując je do trzyczęściowego wkładu w stacji załadowczej zamrażarki wysokociśnieniowej. Naciśnij przycisk procesu zgodnie z instrukcją obsługi producenta.
    UWAGA: Oba rodzaje próbek mogą być przetwarzane razem w późniejszym podmienianiu przez zamrożenie.
  5. Umieścić próbki w kriowialach zawierających 2 ml zamrożonego 0,1% kwasu garbnikowego w acetonie. Przeprowadzić transfer w kąpieli ciekłego azotu bez rozlewania ciekłego azotu do fiolek. Przenieś kriowiale do automatycznego urządzenia do podstawiania zamrażania10 ustawionego na -90 °C i uruchom program.
    UWAGA: Próbki przechowuje się w temperaturze -90 °C przez 100 godzin. Kwas garbnikowy przed osmyfikacjami jest stosowany jako zaprawa w celu zwiększenia absorpcji tetratlenku osmu11.
  6. Ręcznie przemyć próbki 3 razy przez 30 minut 2 ml acetonu w temperaturze -90 °C w jednostce substytucji przez zamrożenie.
  7. Pozostawić próbki w 2 ml 2% tetratlenku osmu, 0,1% octanu uranylu w acetonie do dalszego barwienia w automatycznej jednostce substytucji przez zamrażanie przez 7 godzin w temperaturze -90 °C.
    UWAGA: Tetratlenek osmu jest toksyczny i należy go obchodzić pod wyciągiem, a także nosić sprzęt ochronny.
    UWAGA: Jednostka zamianowa zamrażania automatycznie podnosi temperaturę do -20 °C przy 5 °C/h. Próbki przechowuje się w temperaturze -20 °C przez 16 godzin w jednostce substytucyjnej zamrażania. Temperatura zostanie automatycznie podniesiona do 4 °C przy 10 °C/h.
  8. Roztwór tetratlenku osmu należy wymienić na czysty aceton, gdy temperatura osiągnie 4 °C. Wyjąć kriowiale z urządzenia do substytucji przez zamrożenie.

2. Przetwarzanie wspomagane mikrofalami

UWAGA: Wykonaj wszystkie poniższe kroki w temperaturze pokojowej12 używając jednostki sterującej temperaturą, aby utrzymać stabilną temperaturę (patrz Tabela Materiałów).

  1. Pozostaw nasadki probówek reakcyjnych otwarte podczas przetwarzania w kuchence mikrofalowej.
  2. Wyjąć metalowe nośniki próbek z kriowialów i usunąć próbki z metalowego nośnika za pomocą cienkich kleszczy lub igły, trzymając próbki zanurzone w acetonie w szklanym naczyniu zegarkowym (150 mm).
  3. Przenieść próbki do probówek reakcyjnych o pojemności 2 ml za pomocą drobnych kleszczy lub pipety i przemyć 1 ml acetonu czterokrotnie przez 40 s przy 250 W.
    UWAGA: Tiokarbohydrazyd jest toksyczny i należy go obchodzić pod wyciągiem, należy nosić sprzęt ochronny.
  4. Próbki należy zabarwić 1 ml 1% tiokarbohydrazydu w acetonie przez 14 minut przy 150 W w celu zwiększenia kontrastu. Aby przeprowadzić barwienie, należy odpipetować roztwór tiokarbohydrazydu do probówki reakcyjnej, umieścić probówkę w kuchence mikrofalowej i ustawić program na poziom mocy 150 W (przy włączonej funkcji próżni) na 2 minuty włączenia/2 minuty wyłączenia, iterując łącznie przez 14 minut. Uruchom kuchenkę mikrofalową.
    UWAGA: Tiokarbohydrazyd reaguje z tetratlenkiem osmu, który został zastosowany podczas substytucji przez wymrażanie. Tworzy most, który pozwala na osadzenie większej ilości tetratlenku osmu na oryginalnych miejscach tetratlenku osmu13.
  5. Umyć próbki 4x 1 ml acetonu przez 40 s przy 250 W. Odpipetować aceton do probówki reakcyjnej, umieścić probówkę w kuchence mikrofalowej i wybrać 250 W na 40 s. Uruchom kuchenkę mikrofalową.
  6. Zabarwić w 1 ml 2% tetratlenku osmu w acetonie przez 14 minut przy 150 W. Odpipetować roztwór tetratlenku osmu do probówki reakcyjnej, umieścić probówkę w kuchence mikrofalowej i ustawić program na poziom mocy 150 W (przy włączonej funkcji próżni) na 2 minuty włączenia/2 minuty wyłączenia, iterując łącznie przez 14 minut. Uruchom kuchenkę mikrofalową.
  7. Przemyć próbki 4x 1 ml acetonu przez 40 s przy 250 W (jak to opisano w kroku 2.5).
  8. Naciekać 1 ml zwiększającym stężenie żywicy w acetonie (patrz tabela materiałów) 25%, 50%, 75%, 90%, 100% i 100% przez 3 minuty przy 250 W. Odpipetować żywicę do probówki reakcyjnej, umieścić probówkę w kuchence mikrofalowej i ustawić program na poziom mocy 250 W (przy włączonej funkcji próżni) na 3 minuty. Uruchom kuchenkę mikrofalową.

3. Minimalne osadzanie żywicy8

  1. Wyjąć nervus piszczelowo i C. elegans z probówki reakcyjnej za pomocą wykałaczki i umieścić je na kawałku folii z tworzywa sztucznego (patrz Tabela Materiałów).
  2. Użyj wykałaczki, aby delikatnie przesunąć próbkę po folii z tworzywa sztucznego, aż nie zostanie wykryta pozostała żywica. Do ogrzewania należy używać lampy halogenowej (patrz tabela materiałów), aby żywica stała się mniej lepka i można ją było łatwiej usunąć. Umieść halogen lamp wystarczająco blisko, aby podgrzać żywicę (uważając, aby nie poparzyć rąk).
  3. Próbki należy polimeryzować przez co najmniej 48 godzin w temperaturze 60 °C na wierzchu folii z tworzywa sztucznego w piecu.

4. Przygotowanie do FIB-SEM

  1. Wyciąć spolimeryzowane próbki wraz z folią z tworzywa sztucznego za pomocą żyletki o rozmiarze pasującym do króćca SEM i przymocować je do króćców SEM za pomocą przewodzącej żywicy srebrnej (patrz tabela materiałów). Ponownie polimeryzować w temperaturze 60 °C przez co najmniej 4 godziny lub przez noc.
  2. Próbki na króćcu SEM należy pokryć złotem przez 1 minutę przy natężeniu 35 mA za pomocą napylarki (można również użyć platyny/palladu; wystarczy powłoka o grubości 10 nm) i umieścić je w FIB-SEM.

5. Akwizycja danych wewnątrz FIB-SEM

  1. Zobrazuj próbki za pomocą wtórnego detektora elektronów za pomocą podstawowego oprogramowania sterującego mikroskopem (patrz Tabela materiałów). Próbka powinna być zorientowana w taki sposób, aby obszar zainteresowania (np. środkowa część nerwu piszczelowego lub C. elegans) znajdował się w polu widzenia.
    UWAGA: Aby przeprowadzić akwizycję danych, należy przechylić stolik do pozycji tak, aby próbka była skierowana w stronę wiązki jonów pod kątem 90° w odpowiedniej odległości roboczej (5 mm) w tzw. punkcie koincydencji wiązki jonów i elektronów. Za pomocą naszego przyrządu osiąga się to przy nachyleniu stopnia 54° i odległości roboczej 5 mm.
  2. Aby ustawić prawidłową pozycję próbki, wyśrodkuj wspólną cechę pod kątem 0° podczas obrazowania za pomocą wtórnego detektora elektronów. Powoli przechylaj do 54° (5°, 20°, 54°), cofając ten sam obiekt, przesuwając oś M.
  3. Znajdź punkt zbieżności, centrując cechę podczas obrazowania za pomocą wtórnego detektora elektronów pod kątem 54°, a następnie przesuwając cechę do pozycji środkowej w trybie FIB. Wykonaj to, wyświetlając krzyżyk w oprogramowaniu SEM, aby wskazać środek. Następnie najpierw przesuń wybrany przykładowy element na środek obszaru obrazu za pomocą funkcji punktu środkowego w oprogramowaniu SEM. Następnie wyśrodkuj element wzdłuż osi y, przesuwając stół montażowy w osi z. Każde końcowe przesunięcie między FIB i SEM jest korygowane za pomocą przesunięcia belki SEM.
  4. Otwórz zaawansowane oprogramowanie (patrz Spis materiałów) do nagrywania zestawów danych 3D i postępuj zgodnie z instrukcjami kreatora oprogramowania krok po kroku.
  5. W obszarze zainteresowania umieść węgiel lub platynę (400 nm) na szczycie ROI za pomocą prądu 3 nA, aby umożliwić równomierne mielenie i zmniejszyć artefakty wywołane ładowaniem.
    UWAGA: Rysując obszar zainteresowania do frezowania na powierzchni próbki zobrazowanej za pomocą FIB (szerokość, wysokość, głębokość), oprogramowanie oblicza i nakłada rozmiary różnych cech przygotowania próbki, takich jak rowy do frezowania lub obszar osadzania platyny/węgla. Należy również zachować ostrożność podczas obrazowania powierzchni próbki za pomocą zbyt wysokich prądów FIB, ponieważ może to spowodować uszkodzenie powierzchni próbki. Do obrazowania wystarczy prąd o natężeniu 50 pA.
  6. Użyj skupionej wiązki jonów do frezowania rowu, aby odsłonić obszar zainteresowania (ROI) za pomocą prądu 15/30 nA.
  7. Użyj skupionej wiązki jonów, aby wypolerować przekrój prądem 7 nA.
  8. Po zakończeniu przygotowania próbki należy ustawić następujące parametry obrazowania: parametry mielenia FIB w zakładce Ustawienia FIB (prąd frezowania FIB); Parametry obrazowania SEM w zakładce setup oraz parametry strojenia obrazu w zakładce SEM AutoTune (wykonuj autofokus i autostygmatyzację co 60 min, rozmiar piksela 50 nm, czas przebywania 3, średnia liniowa 3). Zoptymalizuj to dla każdej próbki.
  9. Aby zapobiec dryfowaniu termicznemu powodującemu dryft bloku podczas biegu, należy pozostawić pomieszczenie na co najmniej 2 godziny przed rozpoczęciem akwizycji.
  10. Uzyskaj zestaw danych w trybie młyna ciągłego i akwizycji z prądem FIB 700 pA. Użyj detektora ESB 1,5 kV (tryb analityczny, 900 V) o napięciu siatki 400 V, aby uzyskać obrazy o rozmiarze piksela 5 nm za pomocą zaawansowanego oprogramowania (patrz tabela materiałów) i grubości warstwy 50 nm. Jedna akwizycja obrazu trwa około 1,5 minuty przy czasie przebywania 6 μs.
  11. Rozpocznij pobieranie danych. Uzyskuje się obraz FIB przy prądzie mielenia, aby upewnić się, że próbka się nie poruszyła i wybrano właściwy obszar zainteresowania. W razie potrzeby dostosuj.

6. Wizualizacja danych

  1. Otwórz obrazy na Fidżi, przeciągając folder zawierający wszystkie obrazy na Fidżi i wybierz Wirtualny stos.
  2. Przytnij obszar zainteresowania za pomocą narzędzia prostokąt (Obraz > Przytnij).
  3. Odwróć dane, aby pokazać kontrast tradycyjnej transmisyjnej mikroskopii elektronowej z membranami widocznymi w ciemności (Edytuj > Odwróć).
  4. Użyj TrackEM214 (Fiji15) do wyrównania. Załaduj dane do TrackEM2 (File > New > TrackEM2), klikając warstwę. Po załadowaniu wszystkich obrazów wyrównaj je za pomocą funkcji mozaiki wielowarstwowej (kliknij prawym przyciskiem myszy Obraz > Wyrównaj > Wyrównaj mozaikę wielowarstwową). Po wyrównaniu obrazy są eksportowane jako pojedyncze pliki tiff (kliknij prawym przyciskiem myszy na obrazie > Eksportuj > Utwórz płaski obraz). Zaznacz wszystkie obrazy, które mają zostać wyeksportowane, i wybierz opcję Zapisz do pliku.
  5. Do przetwarzania końcowego użyj rozmycia gaussowskiego (Filtry procesowe > > Rozmycie gaussowskie; sigma 2) i lokalnego wzmocnienia kontrastu (Procesuj > Zwiększ kontrast lokalny; CLAHE: rozmiar bloku 127, przedziały histogramu 256, maksymalne nachylenie 1,5), które są stosowane na Fidżi w celu wygładzenia obrazu i uzyskania lepszego stosunku sygnału do szumu.
  6. IMOD16 służy do ręcznej segmentacji i wizualizacji interesującej nas struktury w 3D. Otwórz zestaw danych w IMOD i wybierz Narzędzia do rysowania (Special > Drawing Tools), aby przeprowadzić ręczną segmentację. Do śledzenia interesującej nas struktury w całym tomie można używać różnych narzędzi ręcznych (na przykład Połącz, Rzeźbię). Użyj przeglądarki obrazów mikroskopowych (MIB17) do półautomatycznej segmentacji.

Wyniki

Przepływ pracy rozpoczyna się od umieszczenia próbki (w tym przypadku świeżo wypreparowanego nerwu piszczelowego myszy) w metalowych nośnikach do zamrażania pod wysokim ciśnieniem (Rysunek 1a). Nośniki są odzyskiwane z ciekłego azotu ( Rysunek 1b) i umieszczane w jednostce do substytucji przez zamrażanie na wierzchu zamrożonego pierwszego koktajlu chemicznego (Rysunek 1c). Po długim protokole substytucji przez zamrożenie, w tym 2% tetratlenku osmu i 0,1% octanu uranylu, próbki są usuwane z nośników w temperaturze pokojowej (Rysunek 1d). Aby jeszcze bardziej zwiększyć kontrast, próbki są przenoszone do plastikowych probówek w celu przetworzenia w kuchence mikrofalowej (Rysunek 1e). Komora próżniowa i jednostka kontrolująca temperaturę służą do optymalizacji procesu (Rysunek 1f).

Aby móc wykonać minimalne zatapianie żywicy, potrzebne są wykałaczki i arkusze folii z tworzywa sztucznego (Rysunek 2a). Po infiltracji próbek żywicą za pomocą kuchenki mikrofalowej, umieszcza się je na kawałkach folii z tworzywa sztucznego i przesuwa tak długo, aż na powierzchni próbki nie pozostanie żywica. Lampa halogenowa jest używana do odsączania pozostałej żywicy i pozostawiania próbki minimalnie osadzonej (Rysunek 2b) na folii z tworzywa sztucznego. Należy zauważyć, że więcej żywicy usuniętej z górnej części próbki jest dobre. Pod próbką powinna pozostać jeszcze niewielka ilość, aby była przymocowana do podłoża. Próbka polimeryzowana na folii z tworzywa sztucznego jest cięta i montowana na króćcu SEM za pomocą srebrnej żywicy przewodzącej ( Rysunek 2c). Kikut jest polimeryzowany przez co najmniej 4 godziny w temperaturze 60 °C ( Rysunek 2d). Składniki należy dokładnie wymieszać, w przeciwnym razie mieszanina może nie polimeryzować prawidłowo. Aby uniknąć ładowania wewnątrz skaningowego mikroskopu elektronowego, króciec jest napylany złotem lub platyną/palladem (Rysunek 2e).

Próbki są umieszczane w FIB-SEM i obrazowane za pomocą wtórnego detektora elektronów, aby celować w obszar zainteresowania (Rysunek 3a,e). Wiązka jonów służy do usuwania materiału bezpośrednio przed obszarem zainteresowania w celu odsłonięcia przekroju poprzecznego (Rysunek 3b-d, 3f-h). Standardowe protokoły często cierpią z powodu braku kontrastu membranowego ( Rysunek 3b,f), podczas gdy rozszerzony protokół zapewnia silny kontrast membranowy (Rysunek 3c-d, 3g-h).

Dane EM (po przetworzeniu) są wizualizowane za pomocą IMOD, programu do przetwarzania i modelowania obrazów. Aby uzyskać lepsze zrozumienie informacji 3D, stosuje się wirtualne dzielenie danych na części (Rysunek 4a). Różne struktury zbioru danych są segmentowane ręcznie (Rysunek 4b-d).

figure-results-1
Rysunek 1: Zamrażanie wysokociśnieniowe, substytucja przez zamrażanie i przetwarzanie wspomagane mikrofalami. a) Nośnik próbki zawierający nerw piszczelowy myszy, podziałka 3 mm. b) Nośnik próbki zawierający nerw piszczelowy myszy po zamrożeniu pod wysokim ciśnieniem, podziałka 3 mm. c) Jednostka automatycznego substytucji przez zamrożenie (AFS) z próbkami. Wkładka: wykonany na zamówienie metalowy pojemnik na maksymalnie 23 fiolki na próbki i dwie duże fiolki zawierające chemikalia w AFS. d) Próbki pobierane z nośników w szklanym naczyniu z acetonu, podziałka 3 mm. e) Próbki w probówkach reakcyjnych, które należy umieścić w kuchence mikrofalowej w celu przetworzenia. f) Komora próżniowa i jednostka kontrolująca temperaturę kuchenki mikrofalowej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Minimalne osadzanie żywicy i przygotowanie do FIB-SEM. (a) Folia z tworzywa sztucznego i wykałaczki, które są używane do minimalnego zatapiania żywicy, podziałka 4 cm. (b) Nervus piszczelowy odsączony z żywicy na wierzchu folii z tworzywa sztucznego, podziałka 250 μm. (c) Nervus piszczelowy polimeryzowany na folii z tworzywa sztucznego, a następnie cięty i montowany na górze króćca SEM za pomocą srebrnej żywicy przewodzącej, podziałka 250 μm. (d) Próbki polimeryzowane na górze króćca SEM, podziałka 3 mm. (e) Próbki pokryte złotem na króćcu SEM, podziałka 3 mm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Przygotowanie próbki wewnątrz FIB-SEM. lit. a) oraz e) Obraz elektronów wtórnych wewnątrz FIB-SEM powierzchni próbki (a) Nervus tibialis, podziałka 100 μm. (e) C. elegans, podziałka 2 μm. (b-d) i (f-h) Przekrój przez próbkę przy użyciu detektora ESB do obrazowania. lit. b oraz c) Nervus tibialis, podziałka 2 μm. (f i g) C. elegans, podziałka 1 μm i 200 nm. (b i f) Pokazano wyniki zamrażania pod wysokim ciśnieniem i substytucji przez zamrażanie bez poprawy, podczas gdy wszystkie inne obrazy pokazują wyniki ulepszonego substytucji przez zamrażanie. lit. d oraz h) Szczegółowy obraz próbki z wykorzystaniem detektora ESB. d) Nervus tibialis, podziałka 200 nm. h) C. elegans, podziałka liniowa 200 nm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Akwizycja i wizualizacja obrazu. (a) Dane EM pokazane w IMOD z wirtualnie przeciętymi płaszczyznami x/z i y/z, podziałka 2 μm. (b) Segmentowane aksony na danych EM (niebieskie), wiązki Remak (czerwone), osłonki mielinowe (żółte i pomarańczowe) i mitochondria (turkusowe), podziałka 2 μm. (c i d) Model 3D, podziałka 2 μm i 500 nm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Protokół został opracowany w celu zilustrowania optymalnego zachowania i kontrastu w celu wykonania seryjnego obrazowania blokowego za pomocą FIB-SEM. Dlatego zdecydowaliśmy się na zastosowanie kriounieruchomania, a następnie barwienia końcowego przy użyciu substytucji przez zamrożenie i przetwarzania wspomaganego mikrofalami. Dlatego protokół ten jest ograniczony do próbek, które są wystarczająco małe, aby można je było zamrażać pod wysokim ciśnieniem. Ograniczenia wielkości od 3 do 6 mm szerokości i grubości ~200 μm są ustalane przez rozmiar nośnika próbki, który odpowiada wielkości próbki, którą można prawidłowo zamrozić za pomocą tej techniki. Jest to istotne w przypadku próbki nerwu myszy, ponieważ nerw kulszowy ma zbyt dużą średnicę, aby zmieścić się w nośnikach 0,2 mm, które są wymagane do zapewnienia prawidłowego zamrożenia. Dlatego zaleca się staranne wypreparowanie mniejszego nerwu, takiego jak nerw piszczelowy lub innego cienkiego nerwu, takiego jak nerw udowy. Ponieważ osłonka mielinowa jest wrażliwa na rozciąganie, należy zachować szczególną ostrożność podczas preparowania świeżego i żywego nerwu, aby uniknąć obchodzenia się z artefaktami. Ogólnie rzecz biorąc, do badań mikroskopu elektronowego należy używać tylko żywych próbek.

Przetwarzanie wspomagane mikrofalami i minimalne zatapianie żywicy mają na celu przyspieszenie procesu przygotowania i celowania. Przetwarzanie wspomagane mikrofalami z zastosowaniem zmodyfikowanego protokołu OTO4 służy do utrwalania chemicznego w temperaturze pokojowej. Domowa kuchenka mikrofalowa nie przyniesie takich samych rezultatów, ponieważ nie ma jednorodnego rozkładu mikrofal, jej temperatura nie jest kontrolowana i nie ma próżni, którą można zastosować. Im mniejsza próbka, tym lepsza penetracja substancji chemicznych; Dlatego najlepsze wyniki osiąga się na mniejszych próbach. Aby uniknąć uszkodzenia próbki w wyniku przegrzania, kluczowe znaczenie ma kontrola temperatury i zastosowanie minimalnie wymaganej mocy mikrofalowej. Etapy przetwarzania wspomaganego mikrofalami można wykonać na stole, jeśli nie ma dostępnej kuchenki mikrofalowej, co doprowadzi do wydłużenia czasu przetwarzania. Aby bezpośrednio celować w struktury w SEM, ważne jest, aby usunąć jak najwięcej żywicy z górnej części próbki. Po zarejestrowaniu zestawu danych konieczne jest przetwarzanie końcowe surowych danych w celu zmniejszenia rozmiaru pliku i poprawy stosunku sygnału do szumu. Nowoczesne techniki obrazowania objętościowego generują duże ilości danych. Dlatego, aby przetwarzanie danych przebiegało w sposób szybki i wystarczający, potrzebna jest wystarczająca ilość pamięci RAM na stacji roboczej. W przypadku operacji wyrównywania wymagane jest co najmniej dwa razy więcej pamięci RAM niż rozmiar zestawu danych.

Protokół ten został przetestowany na nerwie piszczelowym myszy, a także na C. elegans. Hall i wsp.12 osób zastosowało podobny etap wzmacniania po zamianie ich przez zamrożenie na ławce rezerwowych w celu przygotowania C. elegans. W przypadku każdego innego organizmu modelowego, takiego jak danio pręgowany, prawdopodobnie konieczne są zmiany w protokole. Jedną z możliwych modyfikacji jest zmiana składu koktajlu substytucji zamrażania, na przykład poprzez dodanie wody, która jest używana do wzmocnienia kontrastu18. Ponadto czas trwania substytucji przez wymrażanie musi być dostosowany do próbki i może zostać znacznie skrócony zgodnie z protokołem szybkiej substytucji przez zamrożenie19. Jedną z możliwości jest zastosowanie agitacji w celu przyspieszenia procesu substytucji przez zamrożenie20. Po podstawieniu przez zamrożenie możliwe są dalsze modyfikacje, takie jak wielokrotne stosowanie wzmacniających chemikaliów i tetratlenku osmu21. Podczas przetwarzania mikrofalowego temperatura, czas inkubacji i ustawienia mocy mogą być zmieniane w celu optymalizacji wyników dla danej próbki.

Protokół ten pokazuje, że takie ulepszenie można połączyć z innymi protokołami substytucji przez zamrożenie i różnymi typami próbek, jak opisano w Hali12 , które są obrazowane w FIB-SEM lub za pomocą seryjnej skaningowej mikroskopii elektronowej. Te techniki obrazowania wymagają zwiększonego kontrastu, który jest mniej ważny w transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Oświadczenia

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

FIB-SEM i A.S. (stanowisko operatora FIB-SEM) są finansowane przez Klaster Doskonałości i Centrum Badawcze Mikroskopii Nanoskalowej i Fizjologii Molekularnej Mózgu (CNMPB) oraz Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). Dziękujemy laboratorium Thomasa Müllera-Reicherta za dostarczenie próbek C. elegans. Dziękujemy Ulrichowi Weikertowi za udział w filmie.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Instrumentation
Leica HPM100Leica
Laboratoryjna kuchenka mikrofalowa z regulatorem temperaturyTed Pella
EM ACE600 ze złotą tarcząLeica
Crossbeam 540Zeiss
Żarówka halogenowa 12 V/ 20 WPiekarnik Osram
VWR
strong>freezezing
Surowica bydlęca AlbuminaSigma-AldrichA2153
M9Domowa wedługC. Elegans- Praktyczne podejście I.A.Hope
HexadeceneSigma-Aldrich52276
PoliwinylopirolidonSigma-AldrichP2307
Nośnik typu AWohlwend GmbH#241
Nośnik typu BWohlwend GmbH#242
Nośnik szczelinyWohlwend GmbH#446
Plastikowe pipety PasteuraVWR612-1684
KleszczeFST11200-10
Freeze substytucja
Acetonusługi naukowe10015
Kwas garbnikowySigma-Aldrich403040
Tetroxide osmuEMS19100
Octan uranyluSPI-Chem02624-AB
AcetonEMS10015
TiokarbohydrazydSigma-Aldrich223220
Nunc CryoTubesSigma-AldrichV7884-450EA
Szklane czasze zegarka, 150 mmVWR216-2189H
Dętki EppendorfEppendorf0030 120.094
Żywica DurcupanSigma-Aldrich44610
Montaż
SEM odgałęzieniaScience ServicesE75200
AclarScience Services50425-10
Wykałaczki bibuła
filtracyjnaVWR512-3618
przewodząca żywica srebrnaEMS12670-EEEPO-TEK EE 129-4
Oprogramowanie
Image acquisitionZeissSmartSEM
Akwizycja obrazuZeissAtlas5 A3D
Przetwarzanie obrazuOpen sourceFijihttp://fiji.sc/#download
Wizualizacja obrazuOpen sourceIMODhttp://bio3d.colorado.edu/imod/
Automatyczne zastępowanie przez zamrożenie Leica <

Bibliografia

  1. Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples: bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochemistry and Cell Biology. 130 (5), 877-889 (2008).
  2. Möbius, W., Nave, K. -A., Werner, H. B. Electron microscopy of myelin: Structure preservation by high-pressure freezing. Brain Research. 1641, 92-100 (2016).
  3. Mancuso, J., Lich, B., McDonald, K. Three-Dimensional Reconstruction Methods for Caenorhabditis elegans Ultrastructure. Methods in Cell Biology. 96, 331-361 (2010).
  4. Deerinck, T. J., Bushong, E. A., Thor, A., Ellisman, M. H. NCMIR methods for 3D EM: A new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. , Available from: https://www.ncmir.ucsd.edu/sbem-protocol (2010).
  5. Knott, G., Rosset, S., Cantoni, M. Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue. Journal of Visualized Experiments. (53), e2588(2011).
  6. Eberle, A. L., et al. High-resolution, high-throughput imaging with a multibeam scanning electron microscope. Journal of Microscopy. 259 (2), 114-120 (2015).
  7. Hua, Y., Laserstein, P., Helmstaedter, M. Large-volume en-bloc staining for electron microscopy-based connectomics. Nature Communications. 6, 1-7 (2015).
  8. Schieber, N. L., et al. Minimal resin embedding of multicellular specimens for targeted FIB-SEM imaging. Methods in Cell Biology. 140, (2017).
  9. Batt, J. A. E., Bain, J. R. Tibial nerve transection - a standardized model for denervation-induced skeletal muscle atrophy in mice. Journal of Visualized Experiments. (81), e50657(2013).
  10. Möbius, W., et al. Electron Microscopy of the Mouse Central Nervous System. Methods in Cell Biology. 96, 475-512 (2010).
  11. Hayat, M. A. Stains and Cytochemical Methods. , Plenum Press. New York and London. (1993).
  12. Hall, T. J., Hartweig, E., Nguyen, K. C. Q. OTO Fixation for SEM and Blockface Imaging. , Available from: http://www.wormatlas.org/EMmethods/OTOFix.htm (2018).
  13. Tapia, J. C., et al. High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy. Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).
  14. Cardona, A., et al. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLoS ONE. 7 (6), (2012).
  15. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  16. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
  17. Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. Microscopy Image Browser: A Platform for Segmentation and Analysis of Multidimensional Datasets. PLoS Biology. 14 (1), 1-13 (2016).
  18. Walther, P., Ziegler, A. Freeze substitution of high-pressure frozen samples: The visibility of biological membranes is improved when the substitution medium contains water. Journal of Microscopy. 208 (1), 3-10 (2002).
  19. Mcdonald, K. L., Webb, R. I. Freeze substitution in 3 hours or less. Journal of Microscopy. 243 (3), 227-233 (2011).
  20. Reipert, S., et al. Agitation Modules: Flexible Means to Accelerate Automated Freeze Substitution. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. , (2018).
  21. Lešer, V., Drobne, D., Pipan, Ž, Milani, M., Tatti, F. Comparison of different preparation methods of biological samples for FIB milling and SEM investigation. Journal of Microscopy. 233 (2), 309-319 (2009).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Skaningowy mikroskop elektronowy z ukierunkowan wi zk jon wsubstytucja mro cabarwienie tetrotlenkiem osmutraktowanie tiokarbohydrazydpolimeryzacja ywicycelowanie w pr bce

Powiązane artykuły