Ten protokół demonstruje wstrzyknięcie wstecznie transportowalnego wektora wirusowego do tkanki rdzenia kręgowego szczura. Wektor jest wychwytywany w synapsie i transportowany do ciała komórkowego docelowych neuronów. Model ten nadaje się do wstecznego śledzenia ważnych ścieżek rdzeniowych lub celowania w komórki do zastosowań w terapii genowej.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Bezpośrednie wstrzyknięcie wektora lentiwirusowego uwydatnia wiele ścieżek motorycznych w rdzeniu kręgowym szczura
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wprowadzanie interesujących białek do komórek w układzie nerwowym jest wyzwaniem ze względu na wrodzone bariery biologiczne, które ograniczają dostęp do większości molekuł. Wstrzyknięcie bezpośrednio do tkanki rdzenia kręgowego omija te bariery, zapewniając dostęp do ciał komórkowych lub synaps, w których mogą być włączane cząsteczki. Połączenie technologii wektorów wirusowych z tą metodą pozwala na wprowadzenie docelowych genów do tkanki nerwowej w celu terapii genowej lub śledzenia dróg oddechowych. W tym przypadku wirus zaprojektowany do wysoce wydajnego transportu wstecznego (HiRet) jest wprowadzany do synaps interneuronów propriordzeniowych (PN), aby stymulować specyficzny transport do neuronów w rdzeniu kręgowym i jądrach pnia mózgu. Celowanie w PN wykorzystuje liczne połączenia, które otrzymują ze ścieżek motorycznych, takich jak drogi rubrordzeniowe i siateczkowo-rdzeniowe, a także ich wzajemne połączenia w różnych segmentach rdzenia kręgowego. Reprezentatywne śledzenie przy użyciu wektora HiRet z konstytutywnie aktywnym białkiem zielonej fluorescencji (GFP) wykazało wysoką wierność szczegółów ciał komórkowych, aksonów i trzpieni dendrytycznych w PN klatki piersiowej oraz w neuronach siateczkowo-rdzeniowych w formacji siatkowatej mostu. HiRet dobrze integruje się ze szlakami pnia mózgu i PN, ale wykazuje zależną od wieku integrację z neuronami dróg korowo-rdzeniowych. Podsumowując, iniekcja do rdzenia kręgowego za pomocą wektorów wirusowych jest odpowiednią metodą wprowadzania interesujących białek do neuronów docelowych szlaków.
Wprowadzenie
Wektory wirusowe są ważnymi narzędziami biologicznymi, które mogą wprowadzać materiał genetyczny do komórek w celu kompensacji wadliwych genów, zwiększania poziomu ważnych białek wzrostu lub wytwarzania białek markerowych, które podkreślają strukturę i połączenia synaptyczne swoich celów. Ten artykuł koncentruje się na bezpośrednim wstrzyknięciu wysoce wydajnego, transportowalnego wstecznie wektora lentiwirusowego do rdzenia kręgowego szczura w celu uwidocznienia głównych szlaków motorycznych za pomocą śledzenia fluorescencyjnego. Metoda ta jest również wysoce odpowiednia do badań nad regeneracją i odrastaniem aksonów w celu wprowadzenia białek będących przedmiotem zainteresowania do różnych populacji neuronów i została wykorzystana do wyciszenia neuronów w badaniach mapowania funkcjonalnego1, 2.
Wiele szczegółów anatomicznych ścieżek motorycznych kręgosłupa zostało wyjaśnionych dzięki bezpośrednim badaniom iniekcji z klasycznymi znacznikami, takimi jak BDA i fluoro-gold3,4,5,6,7,8. Te znaczniki są uważane za złoty standard, ale mogą mieć pewne wady, takie jak wychwyt przez uszkodzone aksony lub aksony w przejściu w istocie białej otaczającej miejsce wstrzyknięcia9,10,11. Może to prowadzić do nieprawidłowych interpretacji połączeń szlaków i może być wadą w badaniach regeneracji, w których absorpcja barwnika przez uszkodzone lub odcięte aksony może zostać pomylona z regeneracją włókien podczas późniejszej analizy12.
wektory lentiwirusowe są popularne w badaniach nad terapią genową, ponieważ zapewniają stabilną, długoterminową ekspresję w populacjach neuronów13,14,15,16,17,18,19. Jednak tradycyjnie pakowane wektory lentiwirusowe mogą mieć ograniczony transport wsteczny i mogą wywoływać odpowiedź układu odpornościowego, gdy są stosowane in vivo4,20,21. Wysoce wydajny wektor transportu wstecznego, określany jako HiRet, został opracowany przez Kato i wsp. poprzez modyfikację otoczki wirusa za pomocą glikoproteiny wirusa wścieklizny w celu stworzenia wektora hybrydowego, który poprawia transport wsteczny22,23.
Śledzenie wsteczne wprowadza wektor do przestrzeni synaptycznej docelowego neuronu, umożliwiając jego przejęcie przez akson komórki i przetransportowanie do ciała komórki. Wykazano skuteczny transport HiRet z synaps neuronalnych do mózgów myszy i naczelnych23,24 oraz z mięśni do neuronów ruchowych22. Protokół ten demonstruje wstrzyknięcie do lędźwiowego rdzenia kręgowego, w szczególności ukierunkowanego na zakończenia synaptyczne interneuronów propriordzeniowych i neuronów pnia mózgu. PN otrzymują połączenia z wielu różnych ścieżek rdzeniowych i dlatego mogą być wykorzystywane do celowania w różnorodną populację neuronów w rdzeniu kręgowym i pniu mózgu. Oznaczone neurony w tym badaniu reprezentują obwody unerwiające pule neuronów ruchowych związane z funkcją motoryczną kończyn tylnych. Solidne oznakowanie jest widoczne w rdzeniu kręgowym i pniu mózgu, w tym szczegóły o wysokiej wierności trzpieni dendrytycznych i zakończeń aksonów. Zastosowaliśmy również tę metodę w poprzednich badaniach w obrębie rdzenia kręgowego szyjnego do oznaczania ścieżek siateczkowo-rdzeniowych propriordzeniowych i pnia mózgu25.
Ten protokół demonstruje wstrzyknięcie wektora wirusowego do rdzenia kręgowego odcinka lędźwiowego szczura. Jak widać na filmie 1, nacięcie jest celem poprzez identyfikację kręgu L1 znajdującego się na ostatnim żebrze. Jest to używany jako punkt orientacyjny ogona dla 3-4 cm nacięcia, które odsłania mięśnie nad rdzeniem kręgowym L1-L4. Wykonuje się laminektomię grzbietowych aspektów kręgów T11-T13, a ściętą szklaną igłę kieruje się 0,8 mm w bok od linii środkowej i opuszcza na głębokość 1,5 mm w głąb istoty szarej w celu wstrzyknięcia wirusa.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie poniższe procedury chirurgiczne i opieki nad zwierzętami zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Temple.
1. Przygotowania przedoperacyjne
- Na kilka dni przed zabiegiem należy przygotować wyciągnięte szklane igły do wstrzyknięcia wirusa za pomocą szklanych pipet kapilarnych o pojemności 3,5 nanolitra przeznaczonych do wstrzykiwaczy nanolitrowych. Pociągnij każdą pipetę za pomocą dwustopniowego ściągacza igieł zgodnie z instrukcjami producenta, aby utworzyć dwa szablony igieł.
- Udoskonal końcówkę szablonów igieł, odcinając około 1-2 mm nadmiaru szkła mikronożyczkami. Zmierz przybliżoną wielkość apertury pod mikroskopem za pomocą szkiełka kalibracyjnego mikroskopu, aby wyizolować igły o aperturze 30-40 μm.
- Ustawiając igłę pod kątem 30°, użyj ukosowarki do mikropipet, aby utworzyć końcówkę o aperturze 30-40 μm i kącie ukosu 45°. Sprawdź szerokość przysłony za pomocą skali noniusza na szkiełku kalibracyjnym. Przepuścić wodę i etanol przez szklaną igłę za pomocą strzykawki z elastyczną nasadką do igły, aby zmyć zanieczyszczenia i oznaczyć igłę w regularnych odstępach czarnym markerem.
- Umieść igły na przykrytej szalce Petriego, uprzednio oczyszczonej 70% etanolem i sterylizuj przez 30 minut w kapturze bezpieczeństwa biologicznego pod światłem UV.
- Przygotować lentiwirusa HiRet, wyjmując odpowiednią objętość z zamrażarki bezpośrednio przed zabiegiem.
UWAGA: Odpowiednia objętość obejmuje ilość potrzebną do wstrzyknięcia (1 μl na wstrzyknięcie x liczba wstrzyknięć) plus niewielką ilość dodatkowej objętości uwzględniającą straty związane z pipetowaniem i obciążeniem. Wirus należy transportować i przechowywać na lodzie, gdy nie jest używany. - Przygotuj wtryskiwacz, podłączając go do mikropompy i umieszczając w mikromanipulatorze ze skalą noniuszową.
- Aby przygotować szklaną igłę, ostrożnie załaduj kolorowy barwnik, taki jak czerwony olej, za pomocą strzykawki wyposażonej w elastyczną igłę. Upewnij się, że w igle nie pozostały żadne pęcherzyki powietrza. Podczas obchodzenia się z igłą należy stosować technikę aseptyczną i powstrzymać się od dotykania końcówki.
- Włóż szklaną igłę do wtryskiwacza, upewniając się, że igła jest prawidłowo osadzona w podkładkach, nasadka wtryskiwacza jest mocno dokręcona, a stalowa igła wtryskiwacza jest przedłużona o około 3/4 długości szklanej igły. Wirus może zostać załadowany do igły w późniejszym kroku.
2. Znieczulenie i przygotowanie pola operacyjnego
- Zważ zwierzę na wadze cyfrowej. Zapisz masę ciała przed operacją, aby określić wymaganą objętość środka znieczulającego i umożliwić monitorowanie masy ciała po operacji. W tym protokole użyto samic szczurów Sprague-Dawley o wadze około 200–250 g.
- Znieczulić szczura za pomocą inhalacji izofluranu lub wstrzykniętego roztworu ketaminy/ksylazyny (k/x). W tym przypadku ketamina jest wstrzykiwana dootrzewnowo w dawce 67 mg/kg, a ksylazyna w dawce 6,7 mg/kg.
- Potwierdź odpowiednią płaszczyznę znieczulenia, mocno ściskając stopę. Jeśli dojdzie do odruchowego wycofania, odczekaj kilka dodatkowych minut przed kontynuowaniem.
UWAGA: Obserwuj również wąsy, oczy i częstość oddechów pod kątem oznak świadomości. Jeśli wąsy drgają, oko mruga przy delikatnym dotyku lub oddech jest szybki i płytki, poczekaj, aż płaszczyzna znieczulenia znajdzie się głębiej, aby kontynuować protokół. Należy również monitorować te objawy przez cały czas trwania laminektomii i operacji iniekcji. Jeśli zwierzę wykazuje płytką płaszczyznę znieczulania, podaj zastrzyk przypominający z ketaminy równej 1/2 pierwotnej dawki k/x. - Ogol szczura wzdłuż grzbietowej linii środkowej od bioder do dolnego kąta łopatek. Napnij skórę zwierzęcia, aby uzyskać łatwiejsze i bardziej precyzyjne golenie.
- Nałóż maść okulistyczną na oba oczy.
- Zastosuj środek antyseptyczny na ogolony obszar, aby wysterylizować miejsce. Do pierwszego peelingu nasącz sterylną gazę 5% roztworem jodu i zetrzyj wszystkie włosy i zanieczyszczenia. Następnie przesuń jednokierunkowo sterylną gazą nasączoną 70% etanolem, tak aby żaden obszar nie stykał się dwukrotnie. Użyj tej samej techniki z naprzemiennym jodem i gazą nasączoną etanolem jeszcze dwa razy.
3. Pole operacyjne i przygotowanie narzędzi
- Przygotuj zestaw autoklawowanych narzędzi chirurgicznych, który zawiera skalpel, rongeurs, kleszczyki do zębów szczura, nożyczki sprężynowe, hemostatyki, kleszcze i retraktory o średnim czubku zakrzywionym lub obciążone haczyki, rozwijając sterylną folię, aby stworzyć sterylne pole.
- Otwórz opakowanie sterylnych rękawic chirurgicznych i połóż sterylną folię na rękawiczki na stole. Użyj tego jako dodatkowego sterylnego pola dla używanych narzędzi, aby zapobiec zanieczyszczeniu sterylnej folii.
- Upuść ostrze skalpela #10 na sterylne pole. Przymocuj ostrze do uchwytu za pomocą hemostatów. W dostępnym miejscu umieść sterylną sól fizjologiczną, chromowy szew katgutowy 4.0 oraz materiały do tamowania krwawienia, takie jak kauteryzator, sterylna gaza, sterylne aplikatory z bawełnianą końcówką (w przypadku krwawień mięśniowych) lub pianka żelowa lub wosk kostny (w przypadku krwawień kostnych).
- Weź zwierzę i połóż je na sterylnej szmatce. Umieść gazę pod pęcherzem, aby zebrać mocz. Podeprzyj obszar docelowy zwiniętym ręcznikiem pod brzuchem. Jeśli to możliwe, umieść chirurgiczną poduszkę grzewczą pod sterylną szmatką, szczególnie w przypadku dłuższych zabiegów.
UWAGA: Sterylność jest ważna podczas operacji przeżycia. Miej pod ręką butelkę z rozpylaczem zawierającą 70% etanol, aby utrzymać sterylność rąk w rękawiczkach, oraz sterylizator kulkowy, jeśli sterylność narzędzi jest zagrożona lub między poszczególnymi operacjami.
4. Odsłonięcie kręgosłupa i identyfikacja miejsca laminektomii
- Zidentyfikuj obszar, w którym zostanie wykonane nacięcie skóry, delikatnie naciskając palce na ostatnie żebro, aby zlokalizować kręg L1. Używając tego jako punktu orientacyjnego, wykonaj 3-4 cm nacięcie skóry za pomocą skalpela chirurgicznego #10 kończącego się nieco poniżej L1, aby odsłonić mięsień. Przytrzymaj skórę napiętą, delikatnie rozprowadzając i mocno dociśnij ostrzem skalpela, aby zapewnić czyste nacięcie.
- W razie potrzeby wytnij i rozprowadź powierzchowny tłuszcz za pomocą kleszczy i nożyczek. (W zależności od kręgu docelowego może istnieć duża poduszeczka tłuszczowa przylegająca do mięśnia).
- Wyczuj wyrostki kolczyste płaską częścią ostrza skalpela lub palcem. Często obszar linii środkowej będzie obrysowany literą "V" białej powięzi po obu stronach. Wykonaj małe nacięcie rostralne, aby zapewnić miejsce na bezpieczne uchwycenie górnego wyrostka za pomocą kleszczy do zębów szczura, a następnie wykonaj 2 długie, głębokie nacięcia jak najbliżej wyrostków. W najgłębszym miejscu nacięcia można wyczuć ostrzem skalpela grzbietową powierzchnię kręgów.
- Trzymaj mięśnie boczne na bok za pomocą zwijaczy lub obciążonych haków, aby poprawić widoczność. Oczyść mięśnie wokół procesów za pomocą skalpela, nożyczek sprężynowych lub rongeurów, aby określić kształt ich głów.
UWAGA: Pamiętaj, że rdzeń kręgowy nie rozciąga się na całej długości kręgosłupa, ponieważ tkanka rdzenia kręgowego przestaje rosnąć wcześniej w rozwoju niż kość. Oznacza to, że docelowy poziom kręgosłupa może znajdować się pod inaczej nazwanym kręgiem. - Zlokalizuj T11 i sąsiednie procesy T12 i T13.
UWAGA: Pomoc w celowaniu w prawidłowe poziomy kręgów można znaleźć w atlasie rdzenia kręgowego szczura i wcześniejszych badaniach przedstawiających punkty orientacyjne u myszy, która ma bardzo podobną strukturę kręgów6,33. Pozostaw niezakłócony wyrostek kolczysty rostralny, taki jak T9, aby uzyskać punkt orientacyjny w linii środkowej.
5. Wykonywanie laminektomii
- Po prawidłowym zidentyfikowaniu obszaru docelowego należy wykonać laminektomię grzbietowych aspektów T11-T13. Delikatnie rozłóż kręgi, aby odsłonić więzadła międzykręgowe, które są dobrymi miejscami do wprowadzenia rongeurs do początkowego ugryzienia kości. Trzymaj rongeurs w pozycji półzamkniętej, aby zwiększyć precyzyjną kontrolę.
- Usuń wyrostki kolczyste i grzbietową część kręgów, biorąc małe kęsy rongeurs. Uważaj, aby nie uszkodzić rdzenia kręgowego ani nie naruszyć opony twardej. Lekko podnieś kleszcze do zębów szczura, aby pomóc odciągnąć rdzeń kręgowy od kręgów i zmniejszyć skłonność do uderzania w tkankę rdzenia kręgowego.
- Oczyść kość z dala od linii środkowej, aby można było zaobserwować naczynie krwionośne w linii środkowej. Zostaw okno, które wyraźnie pokazuje tkankę rdzenia kręgowego i jest wolne od zanieczyszczeń.
- Delikatnie dotknij rdzenia kręgowego kleszczami. Niektóre zwierzęta mogą odruchowo skakać, nawet jeśli ich płaszczyzna znieczulenia jest głęboka. Nałóż kilka kropli środka znieczulającego, takiego jak lidokaina, bezpośrednio na rdzeń kręgowy, aby zapobiec skakaniu podczas zabiegu wstrzykiwania.
- Zabezpiecz zwierzę w uchwycie kręgosłupa, mocując kleszcze stabilizujące do wyrostków kolczystych, rostralnych i ogonowych do okna laminektomii. Podnieś brzuch zwierzęcia za pomocą uchwytu kręgosłupa, aby zniwelować efekt ruchów oddechowych. Zwiększy to stabilność igły i zapewni odpowiednią głębokość wstrzyknięcia.
6. Wczytywanie wirusa i ustawianie wtryskiwacza
- Załadować wirusa do wstrzykiwacza, pipetując około 5 μl na kawałek parafilmu i ustawiając igłę tak, aby końcówka znajdowała się wewnątrz kropli.
- Za pomocą mikropompy należy pobrać do 4 μl wirusa z szybkością 20–100 nL/s.
- Ustawić kontroler tak, aby wstrzykiwał i uwalniał niewielką ilość wirusa z igły, aby upewnić się, że końcówka igły nie jest zablokowana. Zetrzyj nadmiar wirusa za pomocą laboratoryjnej chusteczki do ścierania.
UWAGA: Strzykawka Hamilton ze stalową igłą może być używana jako alternatywa dla pipet z wyciąganego szkła. - Ustawić mikromanipulator tak, aby łuska noniusza była widoczna i umieścić igłę na linii środkowej rdzenia kręgowego.
UWAGA: Linia środkowa może być czasami zlokalizowana przez duże naczynie krwionośne biegnące po przedniej powierzchni rdzenia kręgowego. Może się to jednak różnić u poszczególnych szczurów, a celowanie w linię środkową powinno być potwierdzone przez porównanie z nienaruszonym wyrostkiem kolczystym. - Skierować igłę w bok na 0,8 mm za pomocą skali noniusza na mikromanipulatorze.
- Opuść igłę do rdzenia kręgowego, aż wbije się, ale nie przebije opony twardej. Szybkim ruchem skręcającym nakłuj oponę twardą igłą, aż zapadnie się na głębokość 1,5 mm.
7. Wstrzykiwanie wirusa do rdzenia kręgowego
- Po umieszczeniu igły na miejscu zaprogramuj wstrzykiwacz tak, aby wstrzykiwał z szybkością 400 nL/min. Upewnij się, że wirus dostaje się do rdzenia kręgowego, obserwując postęp frontu barwnika. Nie powinno być widocznego wycieku ani wybrzuszenia tkanki rdzenia kręgowego. W przypadku zaobserwowania nieszczelności można ją czasami złagodzić, zmniejszając prędkość wtrysku do 200 nL/min.
- Po zakończeniu wstrzyknięcia należy pozostawić igłę w rdzeniu kręgowym na 2–5 minut (w zależności od wstrzykniętej objętości), aby ułatwić dyfuzję wirusa.
- Powoli wyjąć igłę i przejść do następnego miejsca wstrzyknięcia. Wstrzyknąć 1 μl wirusa do każdego z 6 równomiernie rozmieszczonych miejsc oddalonych od siebie o około 1 mm wzdłuż długości tkanki rdzeniowej L1-L4. Ta sama igła może być używana do każdego wstrzyknięcia, o ile działa prawidłowo.
8. Zamykanie ran i opieka pooperacyjna
- Wyjmij zwierzę z uchwytu kręgosłupa i wyjmij zwijacze lub haki używane do rozciągania mięśni bocznych. Przed zamknięciem upewnij się, że rana jest wolna od wszelkich zanieczyszczeń.
- Zszyj mięsień za pomocą chromowego szwu katgutowego 4,0. Przetnij nici szwu blisko węzła, aby zmniejszyć prawdopodobieństwo wewnętrznego podrażnienia skóry.
- Zszyj skórę za pomocą spinek do ran o średnicy 9 mm. Aby umożliwić optymalne gojenie, wyrównaj krawędzie skóry przed zszyciem.
- Umieść zwierzę na podkładce do podgrzewania konwekcyjnego wody i monitoruj, aż się obudzi.
- Wstrzyknij podskórnie 5-10 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej, aby uzupełnić płyny i antybiotyk, taki jak cefazolina, aby zapobiec infekcji. Kiedy zwierzę jest w stanie chodzić, umieść je z powrotem w klatce domowej i podaj początkowe środki przeciwbólowe. Monitoruj szczury pod kątem wszelkich oznak bólu i niepokoju i lecz zgodnie z zatwierdzoną przez IACUC procedurą łagodzenia bólu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Prawidłowe wstrzyknięcie i transport wektora wirusowego powinno prowadzić do transdukcji znacznej populacji neuronów jednostronnych w rdzeniu kręgowym oraz w niektórych jądrach pnia mózgu. Rysunek 1 przedstawia stereotypowe znakowanie neuronów i aksonów w piersiowym odcinku rdzenia kręgowego oraz w formacji siateczkowej mostu w pniu mózgu w czwartym tygodniu po wstrzyknięciu. Wyraźna ekspresja GFP jest widoczna w neuronach istoty szarej piersiowego odcinka rdzenia kręgowe...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Manipulacja genetyczna neuronów w mózgu i rdzeniu kręgowym posłużyła do uwidocznienia szlaków czuciowych, motorycznych i autonomicznych za pomocą śledzenia fluorescencyjnego oraz do zbadania potencjału odrastania dróg neuronalnych po urazie 27,28,29,30,31,32,33. Bezpośrednie wstrzyknięcie ws...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca została sfinansowana z grantu z National Institute of Neurological Disorders and Stroke R01 R01NS103481 oraz grantów Shriners Hospital for Pediatric Research SHC 84051 i SHC 86000 oraz Departamentu Obrony (SC140089).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| #10 Ostrza skalpela | Roboz | RS-9801-10 | Do użytku ze skalpelem. |
| Strzykawki 1 ml | Becton, Dickinson and Company | 309659 | Do znieczulającego wstrzykiwania IP, potencjalnych zastrzyków przypominających znieczulanie i zastrzyków z antybiotykiem. |
| Strzykawki 10 ml | Becton, Dickinson and Company | 309604 | Do wstrzykiwania soli fizjologicznej zwierzęciu, po operacji. |
| 4.0 Chromowy szew katgutowy | DemeTECH | NN374-16 | Do ponownego wiązania mięśni podczas zamykania. |
| 48000 Beveler do mikropipet | World Precision Instruments | 32416 | Służy do ukosowania końcówek ciągniętych szklanych rurek kapilarnych w celu utworzenia funkcjonalnych szklanych igieł. |
| 5% roztwór jodu Purdue | Products L.P. | L01020-08 | Do stosowania w sterylizacji pola operacyjnego. |
| 70% Etanol | N/A | N/A | Do sterylizacji nowo przygotowanych igieł szklanych, modeli zwierzęcych podczas przygotowania chirurgicznego i rąk chirurga podczas operacji, a także wszystkich innych drobnych czynności związanych z utrzymaniem sterylności. |
| Środek znieczulający (roztwór ketaminy/ksylazyny) | Zoetis | 240048 | Do utrzymywania zwierzęcia w prawidłowej płaszczyźnie świadomości podczas operacji. |
| Antybiotyk (Cefazolin) | West-Ward Pharmaceuticals | NPC 0143-9924-90 | Do wstrzykiwania podskórnego w celu zapobiegania infekcji po operacji. |
| Sterylizator koralików | CellPoint | 5-1450 | Do sterylizacji na gorąco narzędzi chirurgicznych. |
| Bonewax | Fine Science Tools | 19009-00 | Do uszczelniania kości w przypadku krwawienia z kości. |
| Cauterizer | Fine Science Tools | 18010-00 | Do uszczelniania wszelkich tętnic lub żył przerwanych podczas operacji, aby zapobiec nadmiernej utracie krwi. |
| Waga cyfrowa | Okaus | REV.005 | Do ważenia zwierzęcia podczas przygotowania chirurgicznego. |
| Elastyczna nasadka do igieł | World Precision Instruments | MF34G-5 | Do czyszczenia szklanych igieł i ładowania czerwonego oleju do szklanych igieł. |
| Gelfoam | Pfizer | H68079 | Do uszczelniania kości w przypadku krwawienia z kości. |
| Szklane rurki kapilarne | World Precision Instruments | 4878 | Do ciągniętych szklanych igieł - powinny być przeznaczone do wtryskiwaczy nanolitrowych. |
| Maszynka do strzyżenia włosów | Oster | 111038-060-000 | Do oczyszczania miejsca operowanego z włosów. |
| Hemostats | Roboz | RS-7231 | Do ogólnego użytku w chirurgii. |
| Chusteczki | Kimtech Kimtech | 34155 | Do ogólnego stosowania w chirurgii. |
| Kleszczyki zakrzywione średniego punktu | Roboz | RS-5136 | Do ogólnego użytku w chirurgii. |
| Mikromanipulator ze skalą noniuszową | Kanetec | N/A | Do precyzyjnego celowania podczas operacji. |
| Mikronożyczki | Roboz | RS-5621 | Do wycinania szklanych szeptów ze świeżo wyciągniętych szklanych rurek kapilarnych. |
| Mikroskop ze skalą światła i noniusza Ocular | Leitz Wetzlar | N/A | Służy do wizualizacji i pomiaru ukosowania ciągniętych szklanych rurek kapilarnych w funkcjonalne szklane igły. |
| Sterownik pompy mikrostrzykawkowej | World Precision Instruments | 62403 | Do kontrolowania szybkości wtrysku. |
| Nanolitr 2000 Pompa Head Injector | World Precision Instruments | 500150 | Do ładowania i wstrzykiwania wirusa w kontrolowany sposób. |
| Ściągacz igieł | Narishige | PC-100 | Do podgrzewania i rozsuwania szklanych kapilar w celu uformowania szklanych igieł. |
| Maść oftalamowa | Dechra Veterinary Products | RAC 0119 | W celu ochrony oczu zwierzęcia podczas operacji. |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | Aby pomóc w ładowaniu wirusa do nanowtryskiwacza. |
| Igły PrecisionGlide (25G x 5/8) | Becton, Dickinson and Company | 305122 | Do stosowania ze strzykawkami 1 ml i 10 ml, aby umożliwić wstrzyknięcie modelu zwierzęcego. |
| Kleszczyki do zębów szczurów | Roboz | RS-5152 | Do chwytania wyrostków kolczystych. |
| Red Oil | N/A | N/A | Aby zapewnić front do wizualizacji wirusa wnikającego do tkanki podczas wstrzyknięcia. |
| Retraktory | Roboz | RS-6510 | Do utrzymywania otwartej rany pooperacyjnej. |
| Rimadyl Tablets | Bio Serv | MP275-050 | Do leczenia bólu po operacji. |
| Rongeurs | Roboz | RS-8300 | Do usuwania mięśni z kręgosłupa podczas operacji. |
| Rękojeść ostrza skalpela | Roboz | RS-9843 | Do rozcinania skóry i poduszeczki tłuszczowej modelu zwierzęcego podczas operacji. |
| Nożyczki | Roboz | RS-5980 | Do ogólnego użytku w chirurgii. |
| Klipsy do ran ze stali nierdzewnej | CellPoint | 201-1000 | Do wiązania skóry rany chirurgicznej podczas zamykania. |
| Kleszcze do usuwania zszywek | Kent Scientific INS750347 | Aby usunąć zszywki, jeśli zostały nałożone nieprawidłowo. | |
| Sterylna tkanina | Phenix Research Products | BP-989 | Aby zapewnić sterylną powierzchnię do operacji. |
| Sterylne aplikatory z bawełnianą końcówką | Puritan | 806-WC | Do wchłaniania krwi w ranie pooperacyjnej przy jednoczesnym zachowaniu sterylności. |
| Sterylna gaza | Covidien | 2146 | Do czyszczenia obszaru operacyjnego i narzędzi chirurgicznych przy zachowaniu sterylności. |
| Sterylna sól fizjologiczna | Baxter Healthcare Corporation | 281324 | Do stosowania w oczyszczaniu krwi i do uzupełniania płynów po operacji. |
| Rękawice chirurgiczne | N/A | N/A | Do użytku przez chirurga w celu utrzymania sterylnego pola podczas operacji. |
| Chirurgiczna poduszka grzewcza | N/A | N/A | Do utrzymywania temperatury ciała modelu zwierzęcego podczas operacji. |
| Mikroskop chirurgiczny | N/A | N/A | Dla lepszej wizualizacji rany pooperacyjnej. |
| Zszywacz chirurgiczny | Kent Scientific | INS750546 | Do nakładania zszywek. |
| T / Pump Pompa wodna do terapii cieplnej | Gaymar | TP500C | Do pompowania ciepłej wody do konwekcyjnej podkładki grzewczej. |
| Podkładka do podgrzewania konwekcji wodnej | Baxter Healthcare Corporation | L1K018 | Do stosowania w obszarze rekonwalescencji pooperacyjnej w celu utrzymania temperatury ciała nieprzytomnego zwierzęcia. |
| Haki obciążeniowe | N/A | N/A | Do utrzymywania otwartej rany pooperacyjnej. |
Bibliografia
- Wang, X., et al. Deconstruction of corticospinal circuits for goal-directed motor skills. Cell. 171 (2), 440-455 (2017).
- Kinoshita, M., et al. Genetic dissection of the circuit for hand dexterity in primates. Nature. 487 (7406), 235-238 (2012).
- Brichta, A. M., Grant, G. Cytoarchitectural organization of the spinal cord. The rat nervous system. Vol. 2, hindbrain and spinal cord. , Academic Press. (1985).
- Liang, H., Paxinos, G., Watson, C. Projections from the brain to the spinal cord in the mouse. Brain Structure & Function. 215 (3-4), 159-186 (2011).
- Rexed, B. The cytoarchitectonic organization of the spinal cord in the cat. The Journal of Comparative Neurology. 96 (3), 414-495 (1952).
- Schmued, L. C., Fallon, J. H. Fluoro-gold: A new fluorescent retrograde axonal tracer with numerous unique properties. Brain Research. 377 (1), 147-154 (1986).
- Veenman, C. L., Reiner, A., Honig, M. G. Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single- and double-labeling studies. Journal of Neuroscience Methods. 41 (3), 239-254 (1992).
- Watson, C., Paxinos, G., Kayalioglu, G., Heise, C. Atlas of the rat spinal cord. The spinal cord. , 238-306 (2009).
- Brandt, H. M., Apkarian, A. V. Biotin-dextran: A sensitive anterograde tracer for neuroanatomic studies in rat and monkey. Journal of Neuroscience Methods. 45 (1-2), 35-40 (1992).
- Geed, S., van Kan, P. L. E. Grasp-based functional coupling between reach- and grasp-related components of forelimb muscle activity. Journal of Motor Behavior. 49 (3), 312-328 (2017).
- Reiner, A., Veenman, C. L., Medina, L., Jiao, Y., Del Mar, N., Honig, M. G. Pathway tracing using biotinylated dextran amines. Journal of Neuroscience Methods. 103 (1), 23-37 (2000).
- Steward, O., Zheng, B., Banos, K., Yee, K. M., et al. Response to: Kim et al., "axon regeneration in young adult mice lacking nogo-A/B." neuron 38, 187-199. Neuron. 54 (2), 191-195 (2007).
- Brown, B. D., et al. A microRNA-regulated lentiviral vector mediates stable correction of hemophilia B mice. Blood. 110 (13), 4144-4152 (2007).
- Lo Bianco, C., et al. Lentiviral vector delivery of parkin prevents dopaminergic degeneration in an alpha-synuclein rat model of parkinson's disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (50), 17510-17515 (2004).
- Malik, P., Arumugam, P. I., Yee, J. K., Puthenveetil, G. Successful correction of the human cooley's anemia beta-thalassemia major phenotype using a lentiviral vector flanked by the chicken hypersensitive site 4 chromatin insulator. Annals of the New York Academy of Sciences. 1054, 238-249 (2005).
- Pawliuk, R., et al. Correction of sickle cell disease in transgenic mouse models by gene therapy. Science. 294 (5550), 2368-2371 (2001).
- Wang, G., et al. Feline immunodeficiency virus vectors persistently transduce nondividing airway epithelia and correct the cystic fibrosis defect. The Journal of Clinical Investigation. 104 (11), R55-R62 (1999).
- Liang, H., Paxinos, G., Watson, C. The red nucleus and the rubrospinal projection in the mouse. Brain Structure & Function. 217 (2), 221-232 (2012).
- Abdellatif, A. A., et al. delivery to the spinal cord: comparison between lentiviral, adenoviral, and retroviral vector delivery systems. Journal of Neuroscience Research. 84 (3), 553-567 (2010).
- DePolo, N. J., et al. VSV-G pseudotyped lentiviral vector particles produced in human cells are inactivated by human serum. Molecular Therapy. 2 (3), 218-222 (2000).
- Higashikawa, F., Chang, L. Kinetic analyses of stability of simple and complex retroviral vectors. Virology. 280 (1), 124-131 (2001).
- Hirano, M., Kato, S., Kobayashi, K., Okada, T., Yaginuma, H., Kobayashi, K. Highly efficient retrograde gene transfer into motor neurons by a lentiviral vector pseudotyped with fusion glycoprotein. PLoS One. 8 (9), e75896(2013).
- Kato, S., et al. A lentiviral strategy for highly efficient retrograde gene transfer by pseudotyping with fusion envelope glycoprotein. Human Gene Therapy. 22 (2), 197-206 (2011).
- Kato, S., et al. Selective neural pathway targeting reveals key roles of thalamostriatal projection in the control of visual discrimination. The Journal of Neuroscience. 31 (47), 17169-17179 (2011).
- Sheikh, I. S., Keefe, K. M., et al. Retrogradely transportable lentivirus tracers for mapping spinal cord locomotor circuits. Frontiers in Neural Circuits. 12, 60(2018).
- Harrison, M., et al. Vertebral landmarks for the identification of spinal cord segments in the mouse. NeuroImage. 68, 22-29 (2013).
- Tang, X. Q., Heron, P., Mashburn, C., Smith, G. M. Targeting sensory axon regeneration in adult spinal cord. The Journal of Neuroscience. 27 (22), 6068-6078 (2007).
- Cameron, A. A., Smith, G. M., Randall, D. C., Brown, D. R., Rabchevsky, A. G. Genetic manipulation of intraspinal plasticity after spinal cord injury alters the severity of autonomic dysreflexia. The Journal of Neuroscience. 26 (11), 2923-2932 (2006).
- Liu, Y., Keefe, K., Tang, X., Lin, S., Smith, G. M. Use of self-complementary adeno-associated virus serotype 2 as a tracer for labeling axons: Implications for axon regeneration. PLoS One. 9 (2), e87447(2014).
- Chamberlin, N. L., Du, B., de Lacalle, S., Saper, C. B. Recombinant adeno-associated virus vector: Use for transgene expression and anterograde tract tracing in the CNS. Brain Research. 793 (1-2), 169-175 (1998).
- Filli, L., et al. Bridging the gap: A reticulo-propriospinal detour bypassing an incomplete spinal cord injury. The Journal of Neuroscience. 34 (40), 13399-13410 (2014).
- Williams, R. R., Pearse, D. D., Tresco, P. A., Bunge, M. B. The assessment of adeno-associated vectors as potential intrinsic treatments for brainstem axon regeneration. The Journal of Gene Medicine. 14 (1), 20-34 (2012).
- Smith, G. M., Onifer, S. M. Construction of pathways to promote axon growth within the adult central nervous system. Brain Research Bulletin. 84 (4-5), 300-305 (2011).
- Morcuende, S., Delgado-Garcia, J. M., Ugolini, G. Neuronal premotor networks involved in eyelid responses: Retrograde transneuronal tracing with rabies virus from the orbicularis oculi muscle in the rat. The Journal of Neuroscience. 22 (20), 8808-8818 (2002).
- Ugolini, G. Specificity of rabies virus as a transneuronal tracer of motor networks: Transfer from hypoglossal motoneurons to connected second-order and higher order central nervous system cell groups. The Journal of Comparative Neurology. 356 (3), 457-480 (1995).
- Gelderd, J. B., Chopin, S. F. The vertebral level of origin of spinal nerves in the rat. The Anatomical Record. 188 (1), 45-47 (1977).
- Inquimbert, P., Moll, M., Kohno, T., Scholz, J. Stereotaxic injection of a viral vector for conditional gene manipulation in the mouse spinal cord. Journal of Visualized Experiments. 73, e50313(2013).
- Carbajal, K. S., Weinger, J. G., Whitman, L. M., Schaumburg, C. S., Lane, T. E. Surgical transplantation of mouse neural stem cells into the spinal cords of mice infected with neurotropic mouse hepatitis virus. Journal of Visualized Experiments. 53, e2834(2011).
- Snyder, B. R., et al. Comparison of adeno-associated viral vector serotypes for spinal cord and motor neuron gene delivery. Human Gene Therapy. 22 (9), 1129-1135 (2011).
- Cronin, J., Zhang, X. Y., Reiser, J. Altering the tropism of lentiviral vectors through pseudotyping. Current Gene Therapy. 5 (4), 387-398 (2005).
- Reed, W. R., Shum-Siu, A., Onifer, S. M., Magnuson, D. S. Inter-enlargement pathways in the ventrolateral funiculus of the adult rat spinal cord. Neuroscience. 142 (4), 1195-1207 (2006).
- Mao, X., Schwend, T., Conrad, G. W. Expression and localization of neural cell adhesion molecule and polysialic acid during chick corneal development. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (3), 1234-1243 (2012).
- Charles, P., et al. Negative regulation of central nervous system myelination by polysialylated-neural cell adhesion molecule. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (13), 7585-7590 (2000).
- Tervo, D. G., et al. A designer AAV variant permits efficient retrograde access to projection neurons. Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).
- Tohyama, T., et al. Contribution of propriospinal neurons to recovery of hand dexterity after corticospinal tract lesions in monkeys. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (3), 604-609 (2017).
- Liu, Y., et al. A sensitized IGF1 treatment restores corticospinal axon-dependent functions. Neuron. 95 (4), 817-833 (2017).
- Kinoshita, M., et al. Genetic dissection of the circuit for hand dexterity in primates. Nature. 487 (7406), 235-238 (2012).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
