Ekspresja, solubilizacja i oczyszczanie eukariotycznych transporterów boranu

Trudność w uzyskaniu wystarczającej ilości oczyszczonego białka błonowego pozostaje krytycznym wąskim gardłem w dążeniu do badań strukturalnych i funkcjonalnych receptorów, kanałów jonowych i transporterów. Istnieje wiele protokołów dla umiarkowanie wysokich przepustowości potoków do badań przesiewowych i znajdowania potencjalnych białek błonowych, które ulegają ekspresji wystarczająco dobrej, aby umożliwić późniejsze badania in vitro^1,2,3,4. Zazwyczaj białka są znakowane N- lub C-końcowym zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP), a poziomy ekspresji są monitorowane albo za pomocą fluorescencji w żelu, albo za pomocą chromatografii wykluczającej rozmiar wykrywania fluorescencji (FSEC)⁵. Takie podejścia umożliwiają klasyfikację kandydatów na białka błonowe na białka o wysokiej ekspresji, białka o umiarkowanej lub niskiej ekspresji lub białka, które wyrażają się słabo lub wcale. Podejście to sprawdza się, gdy projekt eksperymentalny polega na badaniu dużej liczby genów kandydujących z zamiarem wybrania białka, które wykazuje najlepszą ekspresję. Jednak w niektórych przypadkach podejście eksperymentalne opiera się na badaniu określonego białka błonowego, co może być trudne, gdy poziomy ekspresji tego białka są w umiarkowanym lub niskim zakresie. Dodatkowo, czasami w takich przypadkach, poziomy ekspresji mogą być tylko minimalnie zwiększone przez zmianę konstruktu poprzez skrócenie, mutacje termostabilizujące lub optymalizację kodonów. Dlatego czasami konieczna jest optymalizacja ekspresji białek błonowych i protokołów oczyszczania dla białek błonowych, które wyrażają się tylko umiarkowanie dobrze.

Rodzina transporterów SLC4 obejmuje transporter wodorowęglanowy Anion Exchanger 1 (znany również jako Band 3), najobficiej występujące białko błonowe w czerwonych krwinkach⁶, oraz kluczowy czynnik oddychania komórkowego. Rodzina SLC4 jest homologiczna z transporterami boranu, które mają kluczowe znaczenie w roślinach i wykazano, że wykazują podobną strukturę do wymieniacza anionowego 1, a także do transporterów SLC4 sprzężonych z sodem^7,8,9,10. W tym miejscu przedstawiamy zoptymalizowane protokoły ekspresji i oczyszczania białek przy użyciu S. cerevisiae do oczyszczania trzech różnych transporterów boranu znajdujących się w drożdżach i roślinach. Szczegółowo przedstawiamy kluczowe kroki, które podjęliśmy, aby zoptymalizować wydajność i skuteczność oczyszczania do jednorodności. Dodatkowo informujemy o chemicznym teście sieciowania przy użyciu aldehydu glutarowego w celu monitorowania multimerycznego składania tych transporterów w kontekście oczyszczonego kompleksu białkowo-detergentowo-lipidowego. Eksperyment sieciowania może pomóc w ocenie przydatności homologu i detergentu poprzez ocenę stanu multimerycznego transporterów oligomerycznych po oczyszczeniu.

Ten protokół zakłada, że pożądany transporter został sklonowany do plazmidu pochodzącego z 2 μ pod indukowalną kontrolą promotora GAL1 do ekspresji w S. cerevisiae. Do tych procedur wykorzystano DNA kodujące pełnowymiarowe transportery boranu typu dzikiego Saccharomyces cerevisiae Bor1 (ScBor1)¹¹, Arabidopsis thaliana Bor1 (AtBor1)¹² i Oryza sativa Bor3 (OsBor3)¹³. Do końca C w każdym konstrukcie dołączony jest znacznik 10-His i miejsce rozszczepienia trombiny umieszczone między transporterem a znacznikiem 10-His, aby umożliwić jego usunięcie w razie potrzeby. Protokół zakłada również, że plazmid został już przekształcony w szczep ekspresyjny DSY-5 S. cerevisiae na kompletnych uzupełniających pożywkach selektywnych (CSM) pozbawionych histydyny.

1. Przygotowanie pożywek i ważnych

1. Przygotuj 500 ml 40% galaktozy, dodając 200 g galaktozy i wody dejonizowanej do całkowitej objętości 500 ml. Użyj płyty grzejnej lub kuchenki mikrofalowej, aby zwiększyć szybkość przedostawania się galaktozy do roztworu. Sterylny filtr z próżniowym aparatem filtracyjnym składającym się z pokrywy filtra 0,2 μm przymocowanej do sterylnej szklanej butelki.
   UWAGA: Wszystkie roztwory pożywek są przygotowywane przy użyciu wody dejonizowanej.
2. Przygotuj 500 ml 40% glukozy, dodając 200 g glukozy i wody do całkowitej objętości 500 ml. Autoklaw do sterylizacji.
3. Do każdej z czterech kolb o pojemności 2 litrów dodać 0,4 g kompletnej mieszanki suplementu bez histydyny (CSM-His), 3,35 g drożdżowej zasady azotowej z siarczanem amonu (YNB + azot) i 475 ml wody. Autoklaw. Dodaj 25 ml 40% glukozy, aby uzyskać końcowe stężenie glukozy 2%.
4. Dodaj do szklanej butelki 50 g peptonu i 25 g ekstraktu drożdżowego oraz wodę do 375 ml. Autoklaw. Dodaj 125 ml 40% galaktozy, aby uzyskać 5x roztwór peptonu drożdżowego (YP) zawierający 10% galaktozy.
5. Dodać do kolby o pojemności 250 ml 0,04 g CSM-His, 0,335 g YNB + azot i wodę do 47,5 ml. Autoklaw. Dodaj 2,5 ml 40% glukozy, aby uzyskać 50 ml CSM-His + YNB + 2% glukozy.
6. Przygotuj 1 l 1M Tris pH 7,0, mieszając 121,14 g zasady Tris z 800 ml wody. Dodawać stężony kwas solny, aż pH osiągnie 7,0. Dodać wodę do końcowej objętości 1 l i przepuścić przez filtr 0,2 μm.
7. Przygotować 500 ml 0,5 M kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) o pH 8,0, mieszając 73,06 g EDTA z 400 ml wody. Dodawać granulki wodorotlenku sodu, aż EDTA się rozpuści, a pH osiągnie 8,0. Dodać wodę do końcowej objętości 500 ml i przepuścić przez filtr 0,2 μm.
8. Przygotować 100 ml 100 mM fluorku fenylometanosulfonylu (PMSF), mieszając 1,74 g PMSF z 200-procentowym etanolem. Przechowywać w temperaturze -20 °C.
9. Przygotuj 225 ml 2x buforu do płukania kulek składającego się z 50 mM Tris pH 7,0, 1,4 M NaCl, 20% glicerolu i 1 mM EDTA pH 8,0.
10. Przygotować 100 ml buforu do chromatografii wykluczającej wielkość (bufor S200) składającego się z 20 mM hydratu kwasu 4-morfolinoetanosulfonowego (MES) o pH 6,5, 100 mM NaCl, 2% glicerolu i 0,03% n-dodecylo-beta-D-maltopiranozydu (DDM).
11. Przygotuj 100 ml membranowego buforu do reprodukcji składającego się z 50 mM Tris pH 7,0, 500 mM NaCl i 10% glicerolu.
12. Przygotuj 10 ml 3x barwnika ładującego SDS-PAGE, mieszając 3 ml 20% dodecylosiarczanu sodu (SDS), 3 ml glicerolu, 2,4 ml 1M Tris pH 6,8, 0,03 g błękitu bromofenolowego i 1,6 ml 2-merkaptoetanolu.

2. Nadekspresja transportera boranów u S. cerevisiae

1. Zaszczepić trzy przekształcone kolonie drożdży w 50 ml pożywki CSM-His + YNB + 2% glukozy i wstrząsnąć przez noc z prędkością 190 obr./min w temperaturze 30 °C.
2. Następnego dnia użyć spektrofotometru, aby określić gęstość optyczną przy długości fali 600 nm (OD₆₀₀) i zaszczepić do OD₆₀₀ 0,01 każda z czterech kolb 2-litrowych, z których każda zawiera 500 ml pożywki CSM-His + YNB + 2% glukozy.
3. Wstrząsać z prędkością 190 obr./min w temperaturze 30 °C przez 30 godzin, aby komórki mogły skonsumować całą glukozę i osiągnąć wysoką gęstość.
   UWAGA: Dłuższy czas wzrostu skutkuje większą wydajnością komórek, większą wydajnością zebranych błon i ostatecznie większą wydajnością oczyszczonego białka.
4. Indukuj ekspresję, dodając 125 ml 5x pożywki YP uzupełnionej 10% galaktozą, aby uzyskać końcowe stężenie indukcyjne 2% galaktozy. Wytrząsać przy 190 obr./min w temperaturze 30 °C przez 16 godzin.
5. Zbieraj komórki, wirując w temperaturze 4 000 x g przez 15 minut. Ponownie zawiesić komórki w 100 ml zimnej wody.
   UWAGA: W tym momencie komórki mogą być zamrażane w temperaturze -80 °C na czas nieokreślony lub przygotowanie może być kontynuowane do lizy komórek i zbierania błony. Zazwyczaj pobieramy 40-45 g komórek.

3. Zbieranie błon drożdżowych

1. Dodaj do reprodukcji komórek 11,25 ml 1M Tris pH 7,0, 0,45 ml 0,5 M EDTA i 2,25 ml 100 mM PMSF, z których dwa ostatnie działają jako inhibitory proteazy. Dodać wodę do końcowej objętości 225 ml, co spowoduje powstanie buforu do reprodukcji komórek o wartości 50 mM Tris pH 7,0, 1 mM EDTA i 1 mM PMSF.
   UWAGA: Jeśli używasz zamrożonych komórek, pozwól im dokładnie się rozmrozić, około 1 godziny w temperaturze pokojowej, ponieważ jeśli pozostaną częściowo zamrożone, będą odporne na lizę przez ubijanie kulek.
2. Dodaj zawiesinę komórek do metalowego kanistra o pojemności 450 ml w celu ubijania kulek. Uzupełnij pozostałą objętość zimnymi szklanymi koralikami o średnicy 0,5 mm.
3. Zamontuj komorę do ubijania koralików z wirnikiem i zanurz się w łaźni lodowej. Wykonaj sześć 1-minutowych impulsów, oddzielonych 2-minutowymi okresami odpoczynku, aby zapobiec przegrzaniu lizatu.
4. Zamontuj próżniowe urządzenie filtracyjne za pomocą plastikowego jednorazowego filtra górnego do butelki wkręconego w szklaną butelkę. Usuń membranę filtracyjną, ponieważ pozostałe plastikowe urządzenie może wychwycić kulki, przepuszczając lizat. Oddziel kulki od lizatu, wylewając zawartość komory ubijania kulek na zespół, jednocześnie stosując próżnię.
5. Umyj komorę ubijania kulek 225 ml 2x buforu do płukania, który zawiera 50 mM Tris pH 7,0, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1,4 M NaCl i 20% glicerolu. Wylej zawartość komory na koraliki, aby je umyć.
   UWAGA: Przemywanie daje końcową objętość ~ 450 ml zlizowanych komórek i znacznie zwiększa wydajność zebranej błony. Końcowe stężenia to 50 mM Tris pH 7,0, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 10% glicerolu i 700 mM NaCl, a głównym celem podniesienia stężenia soli jest pomoc w dysocjacji białek błony obwodowej.
6. Odwiruj lizat komórkowy przez 15 minut przy 15 000 x g. Wlać supernatant do butelek z poliwęglanu i wirować przez 1 godzinę przy 135 000 x g w ultrawirówce w celu zebrania membran.
   UWAGA: Jeśli ultrawirówka nie jest dostępna, membrany można zbierać, wirując przez 3 godziny przy 53 000 x g, przy sile osiągalnej w wirówkach podłogowych.
7. Odrzucić sklarowany osad i zważyć butelki z granulkami membrany. Zawiesić granulki membrany w około 35 ml buforze do zawieszania membrany zawierającym 50 mM Tris pH 7,0, 500 mM NaCl i 10% glicerolu i dodać do szklanego dodajnika. Zważyć puste probówki wirówkowe, aby określić masę zebranych membran.
   UWAGA: W przypadku wydajnego zbioru membran masa membran będzie równa około 20% masy komórek użytych do tego zbioru membranowego. Protokół ten daje typową wydajność komórek na poziomie 40-45 g, a zatem spodziewamy się również wydajności 8-9 g błon.
8. Odbić homogenizować membrany i podzielić na stożkowe probówki o pojemności 50 ml, które mogą być teraz przechowywane przez czas nieokreślony w temperaturze -80 °C.
   UWAGA: W tym eksperymencie zazwyczaj wykonuje się dwie podwielokrotności, aby umożliwić przeprowadzenie dwóch oddzielnych oczyszczań białka z jednego oryginalnego preparatu komórkowego.

4. Solubilizacja i oczyszczanie białka

1. Do zlewki dodać mieszadło i 150 mg n-dodecylo-β-D-d-maltopyranozydu (DDM) na g używanej błony. Utrzymuj białko na lodzie lub w temperaturze 4 °C przez cały czas.
   UWAGA: DDM jest higroskopijny i powinien być przechowywany w szklanym słoiku ze środkiem osuszającym w temperaturze -20 °C, gdy nie jest używany. Typowe jest również stosowanie od 4 do 5 g błon w oczyszczaniu, aby uzyskać znaczną ilość czystego białka.
2. Rozmrozić membrany i doprowadzić do końcowej objętości 15 ml na g błony w membranowym buforze do rezawieszania uzupełnionym 1 mM PMSF i 20 mM imidazolem o pH 8,0. Dodać błony do zlewki z DDM i mieszać przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
   UWAGA: Stężenie DDM wyniesie 1% w/v, ale w przypadku solubilizacji białek błonowych bardziej krytyczne jest zwracanie uwagi na masę detergentu dodanego na g błony.
3. Wirować przez 25 minut w temperaturze 135 000 x g w temperaturze 4 °C, aby uzyskać nierozpuszczony materiał. Przefiltrować supernatant przez filtr strzykawkowy 5 μm.
4. Załadować próbkę za pomocą pompy perystaltycznej ustawionej na natężenie przepływu 1 ml/min na 1 ml unieruchomionej kolumny powinowactwa do niklu o zrównoważonym 20 mM Tris pH 7,0, 500 mM NaCl, 10% glicerolu, 20 mM imidazolu pH 8,0 i 0,05% DDM,
   UWAGA: W przypadku białek o niższej ekspresji zaobserwowano poprawę czystości i wydajności przy użyciu 1 ml zamiast 5 ml kolumny oraz niklu zamiast jonów kobaltu do chromatografii powinowactwa.
5. Przepłukać kolumnę 10 objętościami buforu płuczącego zawierającego 20 mM Tris pH 7,0, 500 mM NaCl, 10% glicerolu, 80 mM imidazolu o pH 8,0 i 0,05% DDM.
   UWAGA: Stężenie imidazolu, które można stosować podczas prania dla białka znakowanego 10-His, jest wyższe niż się powszechnie uważa i skutkuje poprawą czystości.
6. Eluować białko w buforze zawierającym 20 mM Tris pH 7,0, 200 mM NaCl, 10% glicerolu, 300 mM imidazol o pH 8,0 i 0,05% DDM. Zebrać eluat w dziesięciu frakcjach o pojemności 1 ml i uruchomić na 4-20% żelu Tris-glycine SDS-PAGE wraz z rozpuszczonym lizatem i frakcjami płuczącymi.
7. Puluj frakcje szczytowe, zwykle około 5-6 ml, i zagęszczaj do objętości 500 μl lub mniejszej w koncentratorze odciętym 50 kDa w wirówce stołowej schłodzonej w temperaturze 4 °C.
   UWAGA: 500 μL to typowa maksymalna objętość wstrzykiwana do kolumn chromatografii wykluczającej wielkość (SEC). W tym momencie białko może być przechowywane przez czas nieokreślony w temperaturze -80 °C lub kontynuowane do SEC.
8. Przefiltrować białko przez filtr kolumny wirowej 0,2 μm i wstrzyknąć do kolumny wykluczającej wielkość (np. Superdex-200) zrównoważonej w buforze S200: 20 mM Mes pH 6,5, 100 mM NaCl, 2% glicerolu i 0,03% DDM,
   UWAGA: W kolejnym teście sieciowania aldehydu glutarowego środek buforujący nie może zawierać pierwszorzędowej aminy. SEC to okazja do wymiany w razie potrzeby, tak jak ma to miejsce w przypadku wymiany Tris na Mes.
9. Uruchom frakcje szczytowe na 4-20% żelu Tris-glycine SDS-PAGE. Zabarwić żel, zebrać czyste frakcje pikowe i skoncentrować w koncentratorze odcinającym 50 kDa w temperaturze 4 °C.
10. Oznaczyć stężenie białka, mierząc absorbancję przy długości fali 280 nm i przechowywać przez czas nieokreślony w temperaturze -80 °C.

5. Test sieciowania aldehydu glutarowego

1. Przygotuj 10 μl reakcji, mieszając 3 μl 0,5 mg/ml białka w buforze S200, 5 μl buforu S200, 1 μl wody lub 20% dodecylosiarczanu sodu (SDS), a następnie 1 μl 1,5% aldehydu glutarowego.
   UWAGA: Da to 1x reakcję 0,15 mg / ml białka i 0,15% aldehydu glutarowego. Próbki zawierające poddanie analizie wstępnej SDS są ważnymi kontrolami ujemnymi i powinny być mieszane i inkubowane w temperaturze pokojowej przez 5 minut przed dodaniem aldehydu glutarowego.
2. Inkubować reakcję przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Zakończ reakcję, dodając 5 μl 3x barwnika ładującego żel SDS-PAGE, który zawiera nadmiar buforu Tris, który wygasza aldehyd glutarowy.
3. Załaduj wszystkie 15 μl na 4-20% żel Tris-glycine SDS-PAGE, który załaduje 1,5 μg białka na linię. Uruchom żel pod napięciem 200 V przez 30 minut. Zabarwić i określić zakres sieciowania dimerów na podstawie dowodów na pasmo, które biegnie dwa razy większe niż zdenaturowany monomer.
   UWAGA: Najpierw można przeprowadzić miareczkowanie aldehydu glutarowego i przebieg czasowy, aby znaleźć najlepsze warunki dla transportera homomerycznego.

Typowe żele dla eluowanych frakcji z przeprowadzenia chromatografii powinowactwa niklu pokazują, że wszystkie trzy białka są częściowo oczyszczone (Rysunek 1A). Po prawej stronie drabiny znajduje się lizat, który w każdym przypadku nie wykazuje znaczącego prążka odpowiadającego transporterowi boranu, co jest typowe dla białek, które nie ulegają dobrej nadekspresji. Tor myjący o długości 80 mM wykazuje minimalną utratę białka znakowanego 10-Him pomimo stosunkowo wysokiego stężenia imidazolu. Pasma odpowiadające transporterom boranu są łatwo widoczne we frakcjach eluowanych, a frakcje uważane za zawierające większość eluowanego białka są zagęszczane przed wstrzyknięciem do kolumny filtracyjnej żelu S200. Na tym etapie białka nie są wystarczająco oczyszczone do wielu dalszych zastosowań, na co wskazują dodatkowe prążki w zagęszczonej próbce przed wstrzyknięciem do kolumny S200 (Rysunek 1B). Jednak wstrzyknięcie próbki do kolumny wykluczającej wielkość ujawnia eluowane frakcje o wysokiej czystości (Rysunek 1BC). Przedstawiono chromatogramy i odpowiadające im żele dla każdego z transporterów boranu. Pomimo umiarkowanej czystości próbek po elucji z chromatografii powinowactwa, białko jest wysoce czyste po elucji z żelowej kolumny filtracyjnej. Co najważniejsze, chromatogramy ujawniają, że każde białko migruje głównie jako pojedynczy pik monodyspersyjny z niewielką ilością białka zatrzymaną w pustej objętości. Stabilne i pofałdowane białko na ogół daje monodyspersyjny i symetryczny pik, podczas gdy niestabilne, nieprawidłowo sfałdowane lub zagregowane białko na ogół daje albo wiele asymetrycznych pików, albo duży pik w objętości pustki. Typowe jest uzyskanie końcowej wydajności około 2 mg oczyszczonego białka na l kultury drożdży dla ScBor1 i około 1 mg oczyszczonego AtBor1 i OsBor3 na L kultury. Liczby te to ilość białka oczyszczonego z jednej podwielokrotności 4-5 g błon, która pochodzi z połowy naszego oryginalnego preparatu komórkowego.

Eksperyment z sieciowaniem pokazuje, że oczyszczone transportery homomeryczne mogą mieć łatwo oceniane złożenie w roztworze (Rysunek 2). Celem próbek zawierających obróbkę wstępną SDS jest wykazanie, że sieciowanie jest zależne od stanu zagięcia w roztworze i że w związku z tym sieciowanie nie zachodzi, gdy multimeryzacja jest zakłócana przez ostry detergent. Pokazane wyniki rozróżniają, że jeden z trzech transporterów boranów, ScBor1, nie jest dimeryzowany po oczyszczeniu w DDM w tych warunkach, podczas gdy pozostałe dwa, AtBor1 i OsBor3, sieciują się i wykazują dimeryzację. Można zauważyć, że nie wszystkie białka mogą być sieciowane. W tym przykładzie widoczne są śladowe ilości monomeru OsBor3, podczas gdy AtBor1 łączy się z zakończeniem. Zakres sieciowania będzie zależał od liczby reszt lizyny znajdujących się blisko siebie i możliwe jest, że inne odczynniki sieciujące mogą skutecznie sieciować różne białka błonowe.

Rysunek 1. Oczyszczanie chromatograficzne z powinowactwem i wielkością niklu dla trzech transporterów boranu. Każdy panel pionowy (A), (B) i (C) zawiera dane dla ScBor1, AtBor1 i OsBor3. (A) Kolumna powinowactwa do niklu. M jest drabiną markerów masy cząsteczkowej o masach w kDa określonych po lewej stronie. L to surowy lizat, a W to płukanie imidazolem o stężeniu 80 mM. Wszystkie inne ponumerowane pasy odpowiadają 1 ml frakcjom eluowanym 300 mM imidazolem. Słupki powyżej frakcji wskazują, które z nich zostały wybrane do połączenia i zagęszczenia do iniekcji na kolumnę. (B) P oznacza skoncentrowane białko przed wstrzyknięciem do kolumny S200. Elucjowane frakcje SEC znajdują się po prawej stronie, z nawiasami służącymi do dopasowania pasów żelu do ich frakcji chromatogramu w (C). Objętość pustki wynosi zaledwie 8 ml. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Test sieciowania ocenia oczyszczone transportery do składania multimerycznego. Drabina z masami cząsteczkowymi jest wskazana po lewej stronie. Przede wszystkim pokazano, jakie białko jest obecne i czy w próbce dodano aldehyd glutarowy lub poddano wstępnej obróbce SDS przed dodaniem aldehydu glutarowego. Strzałki wskazują pozycje monomeru i dimeru dla AtBor1 i OsBor3. ScBor1 jest mniejszym białkiem niż AtBor1 i OsBor3 i działa zgodnie z oczekiwaniami. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.