Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Indukcja indukowanego przez leki, autoimmunologicznego zapalenia wątroby u myszy BALB/c w celu zbadania jego mechanizmów patogennych

2.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59174

⸱

29 maja 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Anesthesiology and Critical Care Medicine, Johns Hopkins University, 2Department of Pediatrics and Pathology, Johns Hopkins University

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy model immunizacji in vivo, translacyjnego zapalenia wątroby u myszy BALB/c, który może być wykorzystany do badania patogenezy indukowanego lekami autoimmunologicznego zapalenia wątroby, w tym różnic płci obserwowanych w tej chorobie. Opiszemy, w jaki sposób model ten demonstruje powtarzalne analizy przy użyciu technik eksperymentalnych in vivo i in vitro.

Streszczenie

Indukowane lekami autoimmunologiczne zapalenie wątroby (DIH) jest najczęstszym procesem nadwrażliwości wywołanym lekami wątrobowymi obserwowanym u około 9 do 12% pacjentów z autoimmunologicznym zapaleniem wątroby. Zdecydowana większość pacjentów z DIH to kobiety. Mechanizmy leżące u podstaw tych różnic w rozpowszechnieniu płci są niejasne ze względu na niedostatek modeli zwierzęcych, które naśladują ludzkie choroby. Mimo to powszechnie uważa się, że mechanizmy leżące u podstaw są związane z haplotypami ludzkiego antygenu leukocytów i hormonami płciowymi. W przeciwieństwie do tego, używając mysiego modelu DIH, odkryliśmy, że IL-4 inicjuje limfocyty T CD4 + skierowane przeciwko epitopowi cytochromu P450 2E1 indukują napływ neutrofili, makrofagów i komórek tucznych do wątroby samic myszy BALB / c. Korzystając z tego modelu, wykazaliśmy również, że indukowane przez IL-33 limfocyty T FoxP3 + regulatorowe zapewniają ochronę przed DIH u samic i samców myszy. Ten model DIH jest indukowany przez uodparnienie myszy epitopem CYP2E1, który został kowalencyjnie zmieniony metabolitem leku, który był związany z DIH. Ten epitop jest rozpoznawany przez pacjentów z DIH. Nasza metoda indukuje silne i powtarzalne zapalenie wątroby i autoprzeciwciała, które można wykorzystać do badania patogenezy DIH. Podczas gdy badania in vivo mogą powodować nadmierny ból i niepokój u myszy, jeśli są wykonywane nieprawidłowo, zaletą modelu in vivo jest możliwość oceny patogenezy choroby u dużej liczby myszy. Dodatkowo, biologiczne skutki zmienionych białek wątroby mogą być badane za pomocą inwazyjnych procedur. Dodanie badań in vitro do projektu eksperymentalnego pozwala na szybkie powtórzenie i analizę mechanistyczną na poziomie komórkowym. W ten sposób zademonstrujemy nasz protokół modelowy i sposób, w jaki można go wykorzystać do badania mechanizmów DIH in vivo i in vitro.

Wprowadzenie

Celem tej metody jest opisanie mysiego modelu autoimmunologicznego zapalenia wątroby wywołanego przez leki, które rozwija się in vivo i pokazanie, jak można go wykorzystać do zbadania molekularnych, immunologicznych i genetycznych podstaw tej choroby. Długoterminowym celem naszych badań jest odkrycie mechanizmów odpowiedzialnych za rozwój przewlekłego zapalenia i uszkodzenia wątroby poprzez badanie DIH u podatnych pacjentów. Choroby wątroby i marskość wątroby stanowią szóstą najczęstszą przyczynę zgonów u dorosłych w wieku od 25 do 64 lat. Idiosynkratyczne DILI, czasami określane jako autoimmunologiczne zapalenie wątroby wywołane lekami (DIH), jest trzecią najczęstszą przyczyną ostrej niewydolności wątroby w Stanach Zjednoczonych. DIH jest najczęstszym procesem nadwrażliwości wywołanym lekami wątrobowymi obserwowanym u około 9 do 12% pacjentów z autoimmunologicznym zapaleniem wątroby1. Zdecydowana większość pacjentów z DIH to kobiety2,3,4. Rodzaj DIH rozwija się u osób podatnych po podaniu fluorowcowanych lotnych środków znieczulających, takich jak izofluran, sewofluran, desfluran lub halotan. Te środki znieczulające kowalencyjnie wiążą się z białkami wątroby z reaktywnymi produktami ich metabolizmu, tworząc w ten sposób nowe autoantygeny zdolne do wywoływania reakcji alergicznych lub autoimmunologicznych5.

Badanie mechanizmów patogennych związanych z rozwojem znieczulenia i jakiejkolwiek formy DIH było wcześniej utrudnione przez brak modelu zwierzęcego, który ściśle naśladowałby indukcję ludzkiej choroby. Opracowaliśmy eksperymentalny mysi model DIH o cechach przypominających DILI o podłożu immunologicznym u pacjentów. Zapalenie wątroby jest wywoływane przez immunizację jednym z dwóch autoantygenów, które zostały kowalencyjnie zmodyfikowane przez metabolit chlorku trifluoroacetylu (TFA), który powstaje w wyniku metabolizmu oksydacyjnego środka znieczulającego przez enzym cytochrom P450 2E1 (CYP2E1)5. Jednym autoantygenem jest cytozolowa frakcja wątrobowa S100 wątroby, która jest mieszaniną kilku białek 6, a drugi autoantygen to epitop CYP2E1, który jest rozpoznawany przez surowice od pacjentów ze znieczulającym DILI7. Używając myszy BALB/c, które są stosunkowo odporne na eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie wątroby, odróżniamy nasz model od modelu immunizacji autoimmunologicznego zapalenia wątroby indukowanego przez S100 u myszy C57Bl/6J8.

Ze względu na różnorodność prezentacji klinicznych, DIH jest trudny do zbadania u pacjentów. Translacyjne modele eksperymentalne dają możliwość oceny patogenezy choroby in vivo i in vitro. Obecnie nie ma innych alternatywnych metod indukowania DIH, które w pełni badałyby in vivo lub in vitro adaptacyjne lub wrodzone odpowiedzi immunologiczne bez użycia zwierząt. Co więcej, ponieważ trifluoroacetylacja S-100 lub epitopu CYP2E1 nie wydaje się wytwarzać drażniącego immunogenu, a my indukujemy DIH poprzez immunizację białkami zmienionymi przez TFA, zwierzęta te nie otrzymają eteru, żadnego halogenowego środka znieczulającego, barbituranów lub alkoholu przed immunizacją lub innymi procedurami, biorąc pod uwagę, że te czynniki mogą zmienić badane przez nas parametry. Mimo to zmniejszyliśmy użycie myszy, wykorzystując symulację komputerową, aby potwierdzić preferencje wiązania naszego odkrytego epitop9 i odzwierciedliliśmy ludzki DIH sugerujący płeć żeńską, wykazując, że samice myszy BALB/c rozwijają cięższy DIH10.

Pomimo różnorodnych prezentacji DIH u pacjentów i wyzwań w badaniu klinicznym choroby, potranslacyjna modyfikacja natywnych białek przez reaktywne metabolity leków jest akceptowanym kluczowym mechanizmem w patogenezie DIH, która następuje po halogenowanych środkach znieczulających11. Badacze zgadzają się również, że CYP2E1 jest głównym autoantygenem w tym procesie12,13. Rola interleukiny (IL)-4-podwyższonej limfocytów T CD4+, które rozpoznają zmodyfikowany potranslacyjnie CYP2E1 i inne białka wątroby, jest akceptowanym inicjatorem znieczulającego DIH poprzez przyciąganie neutrofili, eozynofili i komórek tucznych do wątroby14, a mechanizm ten został potwierdzony w wielu formach DIH15,16. Indukowane limfocyty T CD4 + CD25 + T z ekspresją FoxP3 (Treg) zmniejszają nasilenie DIH, a względne niedobory tych komórek w śledzionie pogarszają DIH 10,7. W związku z tym większość postępów w zrozumieniu DIH była możliwa dzięki wykorzystaniu mysich modeli in vivo do oceny genetycznych, metabolicznych i immunologicznych mechanizmów DIH zarówno in vivo, jak i in vitro.

Ponieważ my i inni badacze odkryliśmy role IL-4, neutrofili i eozynofili w inicjacji DIH przy użyciu różnych modeli mysich, wierzymy, że ta obserwacja potwierdza nasze twierdzenie, że niezależnie od używanego modelu DIH, zapalenie wątroby i uszkodzenia są wywoływane przez IL-4. Siła naszego protokołu polega na wykorzystaniu metodologii in vivo, zarówno samców, jak i samic myszy, oraz powtórzeniu histologii, testów proliferacji limfocytów T CD4 + i cytokin. Mocną stroną naszych badań in vitro jest to, że zmniejszają one liczbę potrzebnych myszy, zapewniając jednocześnie metodologię izolowania interakcji komórkowych, które napędzają DIH. Zalecamy użycie samców i samic myszy, ponieważ zmniejsza to możliwość nieświadomej stronniczości w interpretacji wyników i wzmacnia potencjał translacyjny naszych badań, ponieważ częstość, rozpowszechnienie i nasilenie DIH jest wyższe u kobiet17. Zalecamy, aby myszy były uzyskiwane od jednego dostawcy; Jeśli jednak nie jest to możliwe, należy zaopatrzyć się w kontrole współmałżonków z miotu lub myszy typu dzikiego od tego samego dostawcy, co myszy zmienione genetycznie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez komisję ds. opieki i wykorzystania zwierząt.

1. Trifluoroacetylacja wątrobowych białek cytozolowych S-100 lub epitopu CYP2E1

UWAGA: Najpierw należy przygotować trifluoroacetylowane białko S100 (TFA-S100) oraz trifluoroacetylowany epitop CYP2E1 (TFA-JHDN5). Jest to konieczne, ponieważ do immunizacji potrzebne są syngeneiczne białka S100, a do produkcji immunogenu wymagane są myszy BALB/c. Proces przygotowania daje dużą ilość immunogenu, dlatego należy przewidzieć wykonywanie tej części procedury około czterech razy w roku. Identyczną metodę zastosuje się do otrzymania TFA-JHDN5. Epitop CYP2E1 (JHDN5), GII/ FNN/ GPT/ WKD/ IRR/ FSL/ TTL, można zsekwencjonować lub zakupić.

  1. Izolacja frakcji S100 wątroby.
    1. Po sedacji 5 – 10 myszy BALB/c za pomocą 40-60 mg/kg ketaminy zmieszanej z 4 - 6 mg/kg ksylazyny, potwierdzić odpowiednią głębokość anestezji poprzez obserwację zmniejszenia napięcia mięśniowego i braku reakcji na bodźce bólowe, takie jak uciśnięcie palca u nogi (odruch cofania), oprócz utraty odruchów prostowania oraz utraty odruchów powiekowych.
    2. Za pomocą nożyczek mikrochirurgicznych odsłonić zawartość jamy brzusznej, wykonując nacięcie w linii środkowej, a następnie wykonać niewielkie nacięcie w żyłach głównych dolnych w celu usunięcia krwi.
    3. Wprowadzić kaniulę do żyły wrotnej i perfundować wątrobę z przepływem 10 mL/min za pomocą 40 mL roztworu soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) o pH 7.4 w kąpieli wodnej w temperaturze 4 °C. Wyjąć i zważyć połączone wątroby, a następnie pociąć je na małe kawałki (10 – 15 mm).
      UWAGA: Eutanazję indukuje się poprzez dokaleczenie dootrzewnowe dodatkowej dawki ketaminy/ksylazyny (80 mg/kg: 8 mg/kg), a następnie dyslokację szyjną i otwarcie klatki piersiowej w celu zapadnięcia płuc. Metoda ta zapewnia najmniejszy ból i dyskomfort zwierzętom. Metoda ta jest zgodna z zaleceniami Panelu ds. Eutanazji Amerykańskiego Stowarzyszenia Medycyny Weterynaryjnej (AVMA).
    4. Dodać 4-krotność masy tkanki buforu do homogenizacji sacharoza (250 mM) -TRIS (10 mM)- EDTA (1 mM) (pH 7.4) uzupełnionego tabletkami Complete Protease inhibitor Cocktail (patrz Tabela materiałów) zgodnie z zaleceniami producenta. Homogenizować w polipropylenowej probówce 15 mL, używając ogólnego laboratoryjnego homogenizatora do tkanek na średniej prędkości w lodzie, aż do uzyskania gładkiej zawiesiny. Homogenizować w lodzie, aby zapobiec nagrzaniu się tkanki podczas procesu.
    5. Wirować homogenaty wątrobowe przy 1500 x g przez 10 min, a następnie odlać nadsącz. Wirować nadsącz przez 1 h przy 100 000 x g. Szybko zamrozić nadsącz i przechowywać w temperaturze -80 °C. Nadsącz stanowi cytozolową frakcję S-100.
  2. Trifluoroacetylacja S100 i JHDN5
    UWAGA: Trifluoroacetylację grup ε-aminowych reszt lizyny S-100 przeprowadza się zgodnie z procedurą Satoh18. Wszystkie etapy tego eksperymentu, z wyjątkiem ostatnich dni dializy, są wykonywane w dygestorium.
    1. Oznaczyć całkowite stężenie białka w cytozolowej frakcji S-100 przy użyciu testu kwasu bicinchoniniowego (test BCA)7. Rozcieńczyć 20 mg S100 myszy BALB/c lub JHDN5 do objętości 10 mL wodą dH2O w kolbie Erlenmeyera o pojemności 50 mL. Dostosować pH do 10 za pomocą 1N KOH.
    2. Do roztworu dodać 4,7 mmol S-etylo-trifluorotioacetanu (S-ETFA). Utrzymywać pH w zakresie 9,9 – 10,0 za pomocą 1N KOH, dodając KOH kroplowo przez około 1 h. Zapisz całkowitą objętość KOH dla każdej reakcji.
    3. Przenieść roztwory do oddzielnych kaset dializacyjnych (nie napełniać nadmiernie). Dializować kasety przez 72 h przeciwko 4 L dH2O z trzykrotną wymianą roztworu na dobę. Po dializie zapisać końcową objętość TFA-S100 lub TFA-JHDN5, a następnie rozdzielić na alikwoty do oznakowanych probówek. Szybko zamrozić i przechowywać w temperaturze –80 °C.
    4. Szacunkowe stężenie określa się, dzieląc początkową ilość S100 lub JHDN5 (w mg) przez końcową objętość po dializie (mL). Aby określić procent modyfikacji natywnego białka19, rozcieńczyć 1,0 mg każdego z białek natywnych i zmodyfikowanych przez TFA (jeśli stężenie końcowe jest większe niż 1,0 mg) do 1,0 mL wodą dH2O w oddzielnych probówkach typu bullet i przygotować próbę ślepą, używając 1,0 mL dH2O. Jeśli stężenie białka zmodyfikowanego przez TFA jest mniejsze niż 1,0 mg, nie rozcieńczać.
      1. Do oddzielnych dołków płytki 96-dołkowej dodać 50 µL próby ślepej, białek natywnych i zmodyfikowanych. Do każdego dołka dodać 50 µL 4% NaHCO3, a następnie 50 µL 0,1% kwasu 2,4,6-trinitrobenzenosulfonowego.
      2. Inkubować płytkę w temperaturze 40 °C przez 2 h. Po inkubacji dodać do każdego dołka 50 µL 10% SDS, a następnie 25 µL 1N HCl.
      3. Odczytać gęstość optyczną (OD) przy 334 nm, a następnie zapisać absorbancję każdego związku w zakresie 200 – 600 nm, aby potwierdzić charakterystyczny spadek absorbancji przy 334 nm. Obliczyć procent modyfikacji reszt lizyny przez TFA, korzystając z następującego wzoru:
        Wzór obliczania modyfikacji białka; stosunek OD dla białek zmodyfikowanych i natywnych.

2. Immunizacja myszy w celu wywołania zapalenia wątroby

UWAGA: DIH jest modelowane u myszy BALB/c poprzez immunizację białkami cytozolu wątrobowego, które zostały kowalencyjnie zmodyfikowane przez chlorek trifluoroacetylu (TFA), modelowy metabolit leku, TFA-S1006 lub epitop CYP2E1 kowalencyjnie zmodyfikowany przez TFA9, TFA-JHDN5, który indukuje zapalenie wątroby, autoreaktywne limfocyty T oraz autoprzeciwciała przeciwko CYP2E1. U myszy występuje faza aktywacji śledziony 2 tygodnie po wstępnej immunizacji oraz faza wątrobowa do 3 tygodnia, charakteryzująca się zapaleniem granulocytowym. Samice myszy BALB/c są bardziej podatne na zapalenie wątroby w tym modelu niż samce.

  1. W dniu 0 myszy BALB/c w wieku 6–8 tygodni immunizuje się podskórnie u podstawy karku za pomocą 200 μg TFA-S100 lub 100 µg TFA-JHDN5 zemulgowanego w równych objętościach kompletnego adiuwantu Freunda (CFA). W dniu 0 zimmunizuj myszy, podając domięśniowo w jedną z tylnych kończyn 50 ng toksyny krztuśca. W dniu 7 zimmunizuj myszy podskórnie u nasady ogona, podając albo 200 μg TFA-S100 lub 100 µg TFA-JHDN5 zemulgowanego w równych objętościach CFA, aby zapewnić, że każda mysz otrzyma dwa wstrzyknięcia tego samego immunogenu.
    UWAGA: Myszom poddaje się monitorowaniu co godzinę przez pierwsze 6 godzin po immunizacji, a następnie co najmniej dwa razy dziennie przez tydzień. Jeśli u myszy wystąpią oznaki bólu lub stresu, takie jak skulona postawa lub zjeżona sierść, należy podać leki przeciwbólowe zgodnie z wytycznymi lokalnej komisji ACUC. W przypadku stwierdzenia znacznego bólu lub stresu, stan myszy powinien zostać oceniony przez lekarza weterynarii w celu ustalenia, czy konieczna jest eutanazja.
  2. Oznaczanie odpowiedzi immunologicznej limfocytów T CD4+ na pełne autoproteiny, epitopy autoprotein lub hapten TFA z wykorzystaniem cytometrii przepływowej
    1. Po sedacji myszy za pomocą ketaminy w dawce 40–60 mg/kg zmieszanej z ksylazyną w dawce 4–6 mg/kg podanej dootrzewnowo, należy potwierdzić odpowiednią głębokość znieczulenia zgodnie z opisem w kroku 1.1.1, a następnie zidentyfikować śledzionę po odsłonięciu jamy brzusznej za pomocą nożyczek mikrosurgicalnych. Śledzionę należy odciąć w miejscu szypuły i umieścić w szalce Petriego z PBS/2% płodową surowicą cielęcą (FCS).
      UWAGA: Eutanazję myszy zostanie przeprowadzona poprzez dożylne wstrzyknięcie dodatkowej dawki ketaminy/ksylazyny (80 mg/kg: 8 mg/kg), a następnie zwichnięcie stawów obręczy szyjnej i otwarcie klatki piersiowej w celu zapadnięcia płuc. Metoda ta zapewnia zwierzętom najmniejszy poziom bólu i dyskomfortu. Sposób ten jest zgodny z zaleceniami Panelu ds. Eutanazji American Veterinary Medical Association.
    2. Uwolnić komórki, używając matowych szkiełek przedmiotowych, a następnie przenieść je do stożkowej probówki z polipropylenu o pojemności 50 ml. Przemyć w roztworze PBS/2% FCS, uzupełniając objętość do 50 ml i wirując przy 335 x g przy użyciu wirówki chłodzącej nakładkowej. Odlać nadsącz i powtórzyć ten krok.
    3. Usuń krwinki czerwone, stosując 1 ml buforu lizującego ACK przez 1 min, a następnie uzupełnij objętość do 50 ml za pomocą PBS/2% FCS. Wiruj przy 335 x g i odlać nadsącz.
    4. Należy policzyć komórki. Komórki należy znakować CFSE przez 30 min w ciemności w temperaturze 0°C (na lodzie), zgodnie z instrukcjami producenta. Zawiesiny pojedynczych komórek należy nanieść na płytki 6-dołkowe w zagęszczeniu 3x106 komórek/ml na dołek w PBS/2% FCS.
    5. Stymulować znakowane komórki za pomocą CYP2E1, JHDN5 lub TFA-OVA (10 µg/mL) przez 72 h w temperaturze 37 °C w 5% CO2, 95% powietrza (nawilżonego). Po inkubacji komórki barwi się przeciwciałem CD4-APC (1:100) przez 30 min w temperaturze 4°C, a następnie analizuje metodą cytometrii przepływowej w ciągu 3 dni.
    6. Zastosuj następującą strategię bramkowania w celu identyfikacji komórek CD4+CFSE+: komórki CD4+CFSE+ zostaną wyłonione z bramkowanej populacji komórek żywych i przedstawione w formie histogramów komórek proliferujących.
  3. Izolacja naciekających komórek odpornościowych od myszy uodpornionych.
    1. Aby wyizolować infiltrujące komórki odpornościowe z wątroby w 14. lub 21. dniu, znieczuli myszy poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowe ketaminy w dawce 40–60 mg/kg zmieszanej z ksylazyną w dawce 4–6 mg/kg, a następnie potwierdź odpowiednią głębokość znieczulenia zgodnie z opisem w kroku 1.1.1. Po wykonaniu laparotomii poprzez nacięcie pośrodkowe za pomocą mikrosurgicalnych nożyczek, jak opisano w punkcie 1.1.2, przeprowadź kaniulację żyły wrotnej za pomocą igły 25 G, a następnie przetnij żyłę główną dolną poniżej żył nerkowych.
    2. Każdą wątrobę należy perfundować 40 ml PBS z przepływem 10 ml/min w kąpieli wodnej 37 °CPo perfuzji, używając mikronóżek chirurgicznych, należy odciąć wątrobę w miejscu pień wątrobowy, usunąć pęcherzyk żółciowy, a następnie odciąć wątrobę w obrębie wnęki.
    3. Rozetrzeć wątrobę na stalowym sicie z siatką, używając sterylnego tłoka z sytryki 20 ml oraz zimnego buforu PBS. Powstałą zawiesinę komórkową przefiltrować do wstępnie wysterylizowanych probówek do wirowania o pojemności 50 ml, używając sita o gęstości 300 mesh. Objętość każdej zawiesiny uzupełnić zimnym buforem PBS do 50 ml, a następnie przemyć zawiesinę poprzez wirowanie przez 10 min przy 370 x g.
    4. Odlej nadsącz, a następnie połącz osady z każdej grupy badawczej w nowych probówkach o pojemności 50 ml (zaleca się stosowanie jednej probówki na mysz; w przypadku łączenia próbek zaleca się umieszczenie od 2 do 4 osadów w jednej probówce). Zawieś połączone osady w 45 ml 35% Percolu (w PBS) z dodatkiem heparyny w stężeniu 100 IU/ml.
    5. Wiruj każdą probówkę z prędkością 500 x g przez 10 min w temperaturze 20 °COdciąć nadsącz, a osad zawiesić w 5 ml PBS, następnie do każdego osadu dodać 1 ml buforu lizującego ACK i inkubować przez 10 min w lodzie.
    6. Dopełnić objętość w każdej probówce do 50 ml za pomocą PBS i przemyć poprzez wirowanie przez 10 min przy 370 x g. Odlać nadsącz, a następnie przemyć komórki w roztworze PBS/2% FCS poprzez wirowanie przez 10 min przy 370 x g. Policzyć komórki.
    7. Analiza typu komórek z wykorzystaniem cytometrii przepływowej
      UWAGA: Poniżej przedstawiono przykład wykrywania indukowanych limfocytów Treg Foxp3+.
      1. Inkubować 1x106 inkubować komórki z odczynnikiem blokującym FcR, a następnie barwić rozcieńczeniami 1:100 przeciwciał CD4-FITC, CD25-PE i CD45-PerCP przez 30 min w temperaturze 4°C. Następnie przeprowadzić barwienie wewnątrzkomórkowe komórek przeciwciałem FoxP3-APC.
      2. Utrwal komórki za pomocą 250 µL buforu utrwalającego (patrz Tabela materiałów), a następnie przechowywać w 4 °C do czasu analizy metodą cytometrii przepływowej w ciągu 3 dni.
      3. W celu wykrycia indukowanych limfocytów Treg Foxp3+ w zawiesinach pojedynczych komórek z wątroby, śledziony lub węzłów chłonnych przy użyciu cytometrii przepływowej zaleca się następującą strategię bramkowania: zidentyfikować żywe komórki, wykorzystując zestaw barwiący Live/Dead Fixable Aqua Dead Cell. Następnie wyznaczyć bramkę dla komórek wątroby CD45+ (PerCP, klon RA3-6B2), a z bramki CD45+ wyznaczyć bramkę dla komórek CD4+ (FITC, klon GK1.5). Wśród komórek CD4+ określić procentowy udział komórek CD25+ (PE, klon 7D4) oraz FoxP3+ (APC, klon 3G3).
  4. Analiza histologiczna tkanek wątroby w kierunku zapalenia wątroby
    1. W 21. dniu utrwalone należy przekroje wątroby (5 µm (grubych) w 10% neutralnie buforowanym formalinie i barwić hematoksyliną &Eozyna.
    2. Najpierw określ stopnie histologiczne przy małym powiększeniu (40X), wyciągając średnią z 2 pól widzenia, a następnie potwierdź wynik przy powiększeniu 64X. Oceń skrawki tkanek w następujący sposób: stopień 0 = brak stanu zapalnego lub martwicy; stopień 1 = niewielki zapalenie zrazikowe bez martwicy; stopień 2 = zapalenie zrazikowe obejmujące <50% przekroju; stopień 3 = zapalenie lobularne obejmujące ≥ 50% przekroju; oraz stopień 4 = zapalenie z martwicą.
  5. Oznaczanie poziomów cytokin tkankowych w śledzionach i wątrobach.
    1. W 14. lub 21. dniu homogenizować próbki wątroby lub śledziony (1 g) od każdej myszy w 1 ml pożywki RPMI z 2% FCS do uzyskania jednolitej konsystencji, używając ogólnego homogenizatora laboratoryjnego na średnim ustawieniu. Próbkę należy przechowywać w niskiej temperaturze na lodzie.
    2. Wirować homogenat przez 15 min przy 1455 x g w temperaturze 4 °C przy użyciu wirówki nakładkowej z chłodzeniem. Następnie supernatant należy szybko zamrozić i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia. Poziomy cytokin i chemokin można zmierzyć przy użyciu komercyjnych zestawów ELISA, zgodnie z instrukcją dołączoną do zestawu. Należy znormalizować poziomy cytokin poprzez przeliczenie wartości (w ml lub µL) do pg/g tkanki.
  6. Wykrywanie przeciwciał w surowicy przeciwko CYP2E1, epitopowi CYP2E1 JHDN5 oraz metabolitowi leku TFA.
    1. W 14. lub 21. dniu podaj myszom środek uspokajający w postaci ketaminy w dawce 40–60 mg/kg zmieszanej z ksylazyną w dawce 4–6 mg/kg. Potwierdź odpowiednią głębokość znieczulenia, obserwując zmniejszenie napięcia mięśniowego oraz brak reakcji na bodźce bólowe, takie jak uciśnięcie palca u nogi (odruch wycofania), a także utratę odruchów prostowania i odruchów powiekowych. Używając igły 25 G przymocowanej do strzykawki tuberkulinowej, wprowadź igłę do serca, powoli przesuwając ją do jamy klatki piersiowej pod żebra, bezpośrednio bocznie od wyrostka mieczowatego. Pobierz krew za pomocą punkcji wewnątrzsercowej.
    2. Po pobraniu krwi należy pozostawić ją do skrzepnięcia w temperaturze pokojowej. Próbki krwi należy odwirować przy 295 x g przez 20 min w temperaturze pokojowej. Ostrożnie zebrać sera, podzielić je na aliquoty i zamrozić gwałtownie w temperaturze -20 °C.
    3. Zastosuj 100 µL antygenów testowych CYP2E1, JHDN5 lub TFA-ovalbuminy (OVA) (5 µg/mL w PBS) do płytek 96-dołkowych na co najmniej 18 h w temperaturze 4 °C przez noc. Następnego dnia wypłukać płytki buforem do płukania (PBS/2% FCS), wykonując 2 cykle (po 4 płukania w każdym).
    4. Zastosuj 100 µL surowic mysich (1:100) w PBS/2% FCS w trzech powtórzeniach na płytkach i inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 h. Po 2 h wypłukać płytki buforem do płukania zgodnie z opisem w punkcie 2.6.2.
    5. Dodaj 100 µL przeciwciał wtórnych: fosfatazy alkalicznej (AKP)-koziego anty-mysiego IgG, AKP-szczurzego anty-mysiego IgG1 lub AKP-szczurzego anty-mysiego IgG2a (1:1000) przez 2 h, a następnie przeprowadzić etap płukania: jeden cykl buforem do płukania i jeden cykl PBS. Przeciwciała należy wykryć przy użyciu zestawu do wykrywania AKP i mierzyć gęstość optyczną (OD) przy 405 nm co 15 min za pomocą spektrofotometru. Sygnał TFA zazwyczaj w pełni rozwija się w ciągu 15 min, podczas gdy w przypadku CYP2E1 i epitopu CYP2E1 czas ten może wynosić od 30 do 60 min.7.
  7. Badania nad rozwojem stresu oksydacyjnego indukowanego przez IgG JHDN5 in vitro.
    1. W płytkach 12-dołkowych inkubować 106 terminalnie zróżnicowane komórki wątroby na studzienkę na szkiełkach nakrywkowych pokrytych fibronektyną w 1000 µL pożywki Williams E uzupełnionej o glutaminę i dodatek ogólny (patrz Tabela materiałów) przy 37 °C, 5% CO22, przy 95% wilgotności przez 7 dni, zgodnie z zaleceniami w celu maksymalizacji aktywności CYP2E1.
    2. Do oddzielnych dołków dodać JHDN5 IgG (1:40) lub IgG mysie (1:1000) i inkubować przez 2 h w 37 °C, 5% CO22, 95% wilgotności. Sera hybridom były bardzo rozcieńczone. Dodać detektor przeciwciał z głębokim czerwonym fluorescencyjnym znacznikiem (patrz Tabela materiałów) przez dodatkowe 30 min do wszystkich studzienek.
    3. Dołek należy przemyć 3 razy 1 ml PBS w ciemności. Następnie utrwalić komórki w 3,7% formaldehydzie przez 10 min. Analizę mikroskopią konfokalną należy przeprowadzić w ciągu 24 h.
  8. Badania kolokalizacji IgG JHDN5 z organellami wewnątrzkomórkowymi, takimi jak mitochondria, in vitro.
    1. Aby wykazać ko-lokalizację IgG JHDN5 z mitochondriami, należy przeprowadzić rzadką hodowlę (~30% konfluencji) w pełni zróżnicowanych komórek wątroby na szkiełkach podstawkowych pokrytych fibronektyną przez 7 dni w pożywce Williams’s E bez barwników, uzupełnionej zgodnie z opisem w kroku 2.7.
    2. Po ustaleniu prawidłowych długości fal absorpcji, należy dodać zieloną fluorescencyjną przeciwciało IgG mysie sprzężone z fluorophorem 488 nm lub JHDN-5 (1:100) oraz czerwony fluorescencyjny Mito-tracker Red sprzężony z fluorophorem 594 (1:100) na 2 h (37 °C), 5% CO22, 95% wilgotności.
    3. Zamoczyć okładki pokrywowe pokryte fibronektyną z naniesionymi znacznikami, stosując odczynnik Anti-fade z DAPI, a następnie poddać analizie przy użyciu mikroskopii konfokalnej.

3. Ogólne uwagi do protokołu

  1. W przypadku braku związków w formulacjach do użytku klinicznego należy stosować narzędzia o czystości niefarmaceutycznej. Należy jednak pozyskiwać wszystkie takie materiały od wiarygodnych dostawców komercyjnych wskazanych w tej metodzie. Należy zawsze używać chemikaliów spełniających specyfikacje określone przez Komitet Odczynników Analitycznych Amerykańskiego Towarzystwa Chemicznego (American Chemical Society), o czystości co najmniej poziomu odczynnika. W naszych metodach, whenever possible, należy stosować odczynniki o czystości analitycznej.
  2. Podczas przygotowywania białek modyfikowanych TFA należy ściśle przestrzegać zasad aseptyki, aby zapobiec kontaminacji, która mogłaby negatywnie wpłynąć na dobrostan zwierząt lub interpretację danych.
  3. Formulacje o czystości niefarmaceutycznej należy przechowywać i wykorzystywać w czasie, w którym zachowają one swoją aktywność, zgodnie z dostępnymi informacjami technicznymi. CFA należy przechowywać w temperaturze pokojowej, a CYP2E1 oraz jego epitopy w temperaturze -20 lub -80 °C. Białka modyfikowane TFA należy przechowywać w temperaturze -80 °C i doprowadzić do temperatury 4 °C przed emulgowaniem z CFA. Białka modyfikowane TFA należy przechowywać w temperaturze -80 °C w alikwotach, aby zapobiec wielokrotnym cyklom zamrażania i rozmrażania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Harmonogram immunizacji wykorzystany do indukcji DIH, przedstawiony na Ryc. 1, obrazuje dwa wymagane immunizacje przeprowadzone u podstawy szyi (dzień 0) oraz u podstawy ogona (dzień 7). Ryc. 2 przedstawia reprezentatywne dane dotyczące proliferacji uzyskane w dniu 14 z wykorzystaniem CFSE w odpowiedzi na CYP2E1, JHDN5, epitop CYP2E1 oraz metabolit trifluoroacetylowy (TFA) środków znieczulających. Ryc. 3 przedstawia strategię bramko...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Siła tego protokołu polega na jego odtwarzalności; Dlatego bardzo ważne jest, aby przestrzegać sugerowanych kroków. Opracowanie immunogenu może być dla niektórych barierą; jednak odtworzyliśmy nasz model przy użyciu epitopu opisanego w naszym dokumencie, który eliminuje potrzebę izolowania frakcji S100 wątroby. Jest prawdopodobne, że dodatkowe epitopy lub białka mogą zostać zmienione i wywołać zapalenie wątroby po szczepieniach; Opisujemy jednak te białka, których używaliśmy, z wiarygodnymi wynikami. Wykazano, że kilka b...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dr Njoku chciałby podziękować dr Noelowi R. Rose'owi, doktorowi medycyny, za jego wskazówki i wnikliwe dyskusje, które doprowadziły do sformułowania tego modelu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,1% Kwas 2,4,6-trinitrobenzenosulfonowy (TNBS)ThermoFisher28997
AKP Zestaw substratówBioRad172-1063
BALB/c myszyJackson
CellTrace™ Zestaw do proliferacji komórek CFSEThermoFisherC34554
CFA H37RaBecton Dickinson (Difco Bacto)231131
Odczynnik blokujący FcRMilteyi130-092-575
Suplement ogólnyThermoFisherHPRG770
HepaRG™ komórki kriokonserwowaneThermoFisherHPR GC10
Żywy/Martwy Naprawialny Zestaw barwników Aqua Dead Cell ThermoFisherL34965
NaHC03Millipore SigmaS5761
Percoll®Millipore SigmaP1644-1L
Lista toksyn krztuścaBiologiczne180
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami pH 7,4Różne
Pierce™ Inhibitor proteazy Mini tabletki, bez EDTAThermoFisher88666
Wodorotlenek potasuJT Baker3140-01
S-etylotrifluorotiooctan (S-ETFA)Millipore Sigma
10 K, 12 ml)ThermoFisher66810
UltraPure&handel; Roztwór SDS, 10%ThermoFisher24730020
Williams Media E, bez czerwieni fenolowejThermoFisherA1217601
Kasety dializacyjne Slide-a-lyzer 177474 (

Bibliografia

  1. Castiella, A., Zapata, E., Lucena, M. I., Andrade, R. J. Drug-induced autoimmune liver disease: A diagnostic dilemma of an increasingly reported disease. World J. Hepatology. 6 (4), 160-168 (2014).
  2. Bjornsson, E. S., Bergmann, O. M., Bjornsson, H. K., Kvaran, R. B., Olafsson, S. Incidence, presentation, and outcomes in patients with drug-induced liver injury in the general population of Iceland. Gastroenterology. 144 (7), 1419-1425 (2013).
  3. Castiella, A., Lucena, M. I., Zapata, E. M., Otazua, P., Andrade, R. J. Drug-induced autoimmune-like hepatitis: a diagnostic challenge. Digestive Diseases and Sciences. 56 (8), 2501-2502 (2011).
  4. Czaja, A. J. Drug-induced autoimmune-like hepatitis. Digestive Diseases and Sciences. 56 (4), 958-976 (2011).
  5. Pohl, L. R., Thomassen, D., Pumford, N. R., Butler, L. E., Satoh, H., Ferrans, V. J., Perrone, A., et al. Hapten carrier conjugates associated with halothane hepatitis. Advances in Experimental Medicine and Biology. 283, 111-120 (1991).
  6. Njoku, D. B., Talor, M. V., Fairweather, D., Frisancho-Kiss, S., Odumade, O. A., Rose, N. R. A novel model of drug hapten-induced hepatitis with increased mast cells in the BALB/c mouse. Experimental and Molecular Pathology. 78 (2), 87-100 (2005).
  7. Cottagiri, M., Nyandjo, M., Stephens, M., Mantilla, J., Saito, H., Mackay, I. R., et al. In drug-induced, immune-mediated hepatitis, interleukin-33 reduces hepatitis and improves survival independently and as a consequence of FoxP3+ T-cell activity. Cellular and Molecular Immunology. , (2018).
  8. Lohse, A. W., Manns, M., Dienes, H. P., Meyer zum Buschenfelde, K. H., Cohen, I. R. Experimental autoimmune hepatitis: disease induction, time course and T-cell reactivity. Hepatology. 11 (1), 24-30 (1991).
  9. McCarthy, E. K., Vakos, A., Cottagiri, M., Mantilla, J. J., Santhanam, L., Thomas, D. L., et al. Identification of a Shared Cytochrome p4502E1 Epitope Found in Anesthetic Drug-Induced and Viral Hepatitis. mSphere. 3 (5), (2018).
  10. Cho, J., Kim, L., Li, Z., Rose, N. R., Talor, M. V., Njoku, D. B. Sex bias in experimental immune-mediated, drug-induced liver injury in BALB/c mice: suggested roles for Tregs, estrogen, and IL-6. PLoS. One. 8 (4), 61186(2013).
  11. Satoh, H., Gillette, J. R., Takemura, T., Ferrans, V. J., Jelenich, S. E., Kenna, J. G., et al. Investigation of the immunological basis of halothane-induced hepatotoxicity. Advances in Experimental Medicine and Biology. 197, 657-673 (1986).
  12. Eliasson, E., Kenna, J. G. Cytochrome P450 2E1 is a cell surface autoantigen in halothane hepatitis. Molecular Pharmacology. 50 (3), 573-582 (1996).
  13. Bourdi, M., Chen, W., Peter, R. M., Martin, J. L., Buters, J. T., Nelson, S. D., et al. Human cytochrome P450 2E1 is a major autoantigen associated with halothane hepatitis. Chemical Research in Toxicology. 9 (7), 1159-1166 (1996).
  14. Njoku, D. B., Li, Z., Washington, N. D., Mellerson, J. L., Talor, M. V., Sharma, R., et al. Suppressive and pro-inflammatory roles for IL-4 in the pathogenesis of experimental drug-induced liver injury. European Journal of Immunology. 39 (6), 1652-1663 (2009).
  15. Aithal, G. P., Ramsay, L., Daly, A. K., Sonchit, N., Leathart, J. B., Alexander, G., et al. Hepatic adducts, circulating antibodies, and cytokine polymorphisms in patients with diclofenac hepatotoxicity. Hepatology. 39 (5), 1430-1440 (2004).
  16. Higuchi, S., Kobayashi, M., Yoshikawa, Y., Tsuneyama, K., Fukami, T., Nakajima, M., et al. IL-4 mediates dicloxacillin-induced liver injury in mice. Toxicology Letters. 200 (3), 139-145 (2011).
  17. Rubtsova, K., Marrack, P., Rubtsov, A. V. Sexual dimorphism in autoimmunity. Journal of Clinical Investigation. 125 (6), 2187-2193 (2015).
  18. Satoh, H., Fukuda, Y., Anderson, D. K., Ferrans, V. J., Gillette, J. R., Pohl, L. R. Immunological studies on the mechanism of halothane-induced hepatotoxicity: immunohistochemical evidence of trifluoroacetylated hepatocytes. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 233 (3), 857-862 (1985).
  19. Habeeb, A. F. Determination of free amino groups in proteins by trinitrobenzenesulfonic acid. Analytical Biochemistry. 14 (3), 328-336 (1966).
  20. Christen, U., Burgin, M., Gut, J. Halothane metabolism: immunochemical evidence for molecular mimicry of trifluoroacetylated liver protein adducts by constitutive polypeptides. Molecular Pharmacology. 40 (3), 390-400 (1991).
  21. Christen, U., Quinn, J., Yeaman, S. J., Kenna, J. G., Clarke, J. B., Gandolfi, A. J., et al. Identification of the dihydrolipoamide acetyltransferase subunit of the human pyruvate dehydrogenase complex as an autoantigen in halothane hepatitis. Molecular mimicry of trifluoroacetyl-lysine by lipoic acid. European Journal of Biochemistry. 223 (3), 1035-1047 (1994).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Cytochrom P450 2E1cytometria przep ywowaperfuzja w trobyizolacja kom rek ledzionytrifluoroacetylacjaprotok immunizacjianaliza zapalenia w trobyr nice mi dzy p ciami
Indukcja indukowanego przez leki, autoimmunologicznego zapalenia wątroby u myszy BALB/c w celu zbadania jego mechanizmów patogennych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.