Artykuł metodologiczny

Użycie Sniper-Cas9 w celu zminimalizowania niecelnych skutków CRISPR-Cas9 bez utraty aktywności na celu poprzez ukierunkowaną ewolucję

DOI:

10.3791/59202

⸱

26 lutego 2019

 ,  ,  , 
1ToolGen

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół optymalizujący CRISPR-Cas9 w celu osiągnięcia wyższej specyficzności bez utraty aktywności na miejscu. Używamy podejścia ukierunkowanej ewolucji zwanego Sniper-screen, aby znaleźć zmutowanego Cas9 o pożądanych cechach. Sniper-Cas9 jest kompatybilny ze skróconymi pojedynczymi przewodnikami RNA i dostarczaniem w formacie rybonukleoproteiny, dobrze znanymi strategiami osiągania wyższej specyficzności.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozwój zgrupowanego, regularnie rozmieszczonego białka 9 (Cas9) związanego z krótkimi powtórzeniami palindromicznymi (CRISPR) w modalności terapeutyczne wymaga unikania jego potencjalnie szkodliwych skutków poza celem. Opracowano kilka metod mających na celu zmniejszenie takich efektów. W tym miejscu przedstawiamy metodę ukierunkowanej ewolucji opartą na Escherichia coli o nazwie Sniper-screen w celu uzyskania wariantu Cas9 o zoptymalizowanej specyficzności i zachowanej aktywności na celu, o nazwie Sniper-Cas9. Korzystając z ekranu snajpera, można jednocześnie dokonać selekcji pozytywnej i negatywnej. Badanie przesiewowe można również powtórzyć z innymi sekwencjami RNA z pojedynczym przewodnikiem (sgRNA) w celu wzbogacenia o prawdziwie dodatnie trafienia. Dzięki zastosowaniu podwójnego promotora CMV-PltetO1 do ekspresji wariantów Cas9, można szybko sprawdzić wydajność biblioteki pulowej w komórkach ssaków. Opisano również metody zwiększające specyficzność Sniper-Cas9. Po pierwsze, wcześniej wykazano, że stosowanie skróconych sgRNA zwiększa swoistość Cas9. W przeciwieństwie do innych zaprojektowanych Cas9, Sniper-Cas9 zachowuje poziom aktywności typu dzikiego (WT) na celu w połączeniu z obciętymi sgRNA. Po drugie, dostarczenie Sniper-Cas9 w formacie rybonukleoproteiny (RNP) zamiast w formacie plazmidu jest możliwe bez wpływu na jego aktywność na miejscu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym artykule staramy się poprawić specyfikę Cas9 poprzez połączenie różnych strategii. Opracowano różne metody unikania niezamierzonych skutków CRISPR-Cas9. Na przykład, skrócone sgRNA mogą być użyte do osiągnięcia wyższej swoistości1. Dodatkowo, metoda dostarczania Cas9 może zostać zmieniona z formatu plazmidu na format RNP w celu uzyskania wyższej specyficzności2. Specyficzne reszty aminokwasowe białka Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) zostały zmodyfikowane zgodnie z racjonalnym projektem opisanym wcześniej3,4,5. Alternatywnie, reszty aminokwasowe zostały zmienione w sposób losowy, a warianty Cas9 o najwyższej specyficzności zostały zidentyfikowane za pomocą systemu badań przesiewowych drożdży6 lub E. coli7,8 system przesiewowy.

Jednak wiele grup zgłosiło, że warianty Cas9 zaprojektowane przy użyciu projektu w celu osłabienia niespecyficznej interakcji między Cas9 a substratem wykazują niską aktywność na celu7,8,9,10,11,12. Opracowaliśmy oparty na E. coli system ukierunkowanej ewolucji, Sniper-screen, do badania losowo zmutagenizowanych wariantów Cas9. System badań przesiewowych E. coli ma przewagę nad systemem drożdżowym ze względu na szybszy czas podwajania i wyższą wydajność przemiany E. coli.

Zarówno selekcja negatywna, jak i pozytywna, oparta na trzech różnych plazmidach i genie zainteresowania (GOI) zintegrowanym z genomem E. coli, jest używana w Sniper-screen. Warianty Cas9 ulegają ekspresji w systemie podwójnego promotora plazmidu o niskiej liczbie kopii CMV-PltetO1, dzięki czemu kandydaci zidentyfikowani w E. coli mogą być testowani w komórkach ssaków bez konieczności subklonowania. Rząd Indii wprowadza się do genomu E. coli za pomocą systemu transpozonów Tn7. Plazmid sgRNA, który zawiera wrażliwy na temperaturę początek replikacji, wyraża sgRNA ukierunkowany na GOI; jednak sekwencje sgRNA i GOI nie są idealnie dopasowane. Idealnie dopasowane miejsce docelowe sgRNA znajduje się na trzecim plazmidzie zawierającym gen ccdB, który koduje śmiertelny produkt zatruwający gyrazę. W tym systemie komórki wyrażające warianty Cas9 o wysokiej aktywności poza celem są usuwane, ponieważ pęknięcia dwuniciowe (DSB) są wprowadzane do niedopasowanego miejsca znajdującego się w genomowym DNA. Z drugiej strony, komórki wykazujące ekspresję wariantów Cas9 o niskiej aktywności docelowej są również usuwane z powodu śmiertelnej ekspresji genu ccdB. Poziom ekspresji wariantów Cas9 można zmienić poprzez zmianę stężenia anhydrotetracykliny (ATC), która dostosowuje siłę selekcyjną.

Doszliśmy do wniosku, że zlokalizowanie niedopasowanego miejsca docelowego sgRNA w genomowym DNA, a nie na plazmidzie, zwiększy czułość systemu. Zaletą tego podejścia jest to, że istnieje tylko jedno miejsce genomowe, podczas gdy w jednej komórce E. coli znajduje się wiele plazmidów, z których każdy zawiera miejsce docelowe.

Korzystając z tego systemu, zidentyfikowaliśmy wariant Cas9, Sniper-Cas9, który pokazuje działania na poziomie WT na celu i zmniejsza aktywność poza celem w porównaniu do WT Cas9. Sniper-Cas9 może osiągnąć jeszcze wyższe współczynniki specyficzności dzięki zastosowaniu skróconych sgRNA lub dostarczania opartego na RNP, a nie dostarczania opartego na plazmidzie.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Integracja ludzkiego GOI ze szczepem BW25141 E. coli

  1. Klonowanie rządu Indii
    1. Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) wzmacnia długość 500 pz ludzkiego GOI zawierającego różne kandydujące miejsca docelowe za pomocą standardowych metod PCR ze starterami zawierającymi miejsca enzymów restrykcyjnych NotI i XhoI.
      UWAGA: W tym eksperymencie GOI był ludzkim genem EMX1.
    2. Przetraw zarówno produkt PCR, jak i wektor pgrg3613 z enzymami restrykcyjnymi NotI i XhoI.
    3. Żel oczyszcza pożądane fragmenty (500 pz i 12 kb).
    4. Liguj fragmenty razem za pomocą ligazy T4. Aby to zrobić, wymieszaj 50 ng strawionego pgrg36 i 6 ng wstawki PCR w objętości reakcyjnej 20 μl zawierającej 1x bufor ligazy i enzym ligazy 0,5 U. Inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez noc.
    5. Przekształć podwiązany plazmid w kompetentne komórki DH5-α. Powstałe transformanty hodować na płytkach agarowych bulionu Luria (LB) zawierających ampicylinę (100 μg/ml) w temperaturze 32 °C i inkubować przez noc. Podnieś kolonię i hoduj ją przez noc na pożywce LB zawierającej ampicylinę. Wyizoluj plazmidowe DNA z E. coli za pomocą dostępnego w handlu zestawu miniprep. Potwierdź wprowadzenie fragmentu GOI przez sekwencjonowanie plazmidu Sangera uzyskanego z preparatu mini-plazmidu (mini-prep)13.
  2. Przygotowanie BW25141-rząd Indii
    1. Otrzymany plazmid pgrg36-GOI przekształcić w BW25141 szczep E. coli. Konieczne jest użycie szczepu BW25141, aby zminimalizować liczbę fałszywie dodatnich kolonii.
    2. Hodować przekształcone komórki w buforze LB w temperaturze 32 °C przez noc. Rząd Indii wprowadza się do genomowego DNA szczepu BW25141 (BW25141-GOI). Usuń plazmid pgrg36-GOI ze szczepu BW25141-GOI za pomocą standardowego protokołu pgrg3613. Krótko rozcieńczyć kolonię (około 10 7-krotnie) i hodować ją na płytce LB w temperaturze 42 °C przez noc. Umieść kolonie na płytce LB i hoduj je w temperaturze 42 °C przez noc.
    3. Potwierdź poprawną insercję GOI metodą PCR kolonii, używając starterów sugerowanych w protokole pgrg36: 5'-GATGCTGGTGGCGAAGCTGT-3' i 5'-GATGACGGTTTGTCACATGGA-3'. Starter amplifikuje miejsce insercji genomowego DNA, a wielkość otrzymanego produktu PCR wyniesie 904 pz plus rozmiar insertu (w tym przypadku 500 pz).
    4. Przygotuj elektrokompetentne ogniwa BW25141-GOI (szczegółowy protokół opisano w krokach 3.2.6–3.2.10).

2. Przygotowanie biblioteki wariantów Cas9

  1. Przygotowanie biblioteki
    1. Przekształć Cas9 vector7 w komercyjny szczep mutatora E. coli (Tabela materiałów) i postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, aby uzyskać bibliotekę wariantów (bibliotekę Mutator).
    2. Wykonaj podatny na błędy PCR na całej sekwencji WT Cas9 w wektorze Cas9, używając zestawu do PCR podatnego na błędy (tabela materiałów).
      UWAGA: Protokół niskiego poziomu błędów został przyjęty w przypadku Sniper-Cas9, aby uniknąć zakłócenia pierwotnej funkcji białka.
    3. Trawić wektor Cas9 za pomocą odpowiednich enzymów restrykcyjnych. Żel oczyszcza produkt PCR (z kroku 2.1.2) i strawiony kręgosłup.
      UWAGA: Rozmiar genu SpCas9 wynosi około 4,3 kb. XhoI i KpnI zostały wybrane do przetrawienia wektora pBLC-SpCas9, który został użyty w przypadku Sniper-Cas9.
    4. Połączyć fragment szkieletu (z kroku 2.1.3) i wkładkę amplifikowaną za pomocą podatnego na błędy PCR (od kroku 2.1.3) za pomocą izotermicznej rekombinacji in vitro.
      UWAGA: Do uzyskania wysokiego stężenia biblioteki potrzeba ponad 500 ng szkieletu (biblioteka PCR podatna na błędy [EP]). Do przygotowania bibliotek EP w przypadku Sniper-Cas9 (EP library I i II) użyto dwóch różnych podatnych na błędy zestawów PCR.
    5. Oczyścić produkty z zespołu (od kroku 2.1.4) za pomocą zestawu do oczyszczania DNA, który umożliwia elucję o małej objętości (tabela materiałów). Eluować 6 μl wody wolnej od nukleaz (NFW) i zmierzyć stężenie DNA.
    6. Przekształć ponad 500 ng wektora biblioteki Cas9 (dla każdej z trzech bibliotek) w 50 μl elektrokompetentnych komórek E. coli (tabela materiałów). Patrz protokół elektroporacji w krokach 3.2.1-3.2.4. Do tego przygotowania biblioteki należy użyć 1 ml pożywki SOC zamiast 250 μl na 50 μl kompetentnych komórek.
    7. Roztwory zawierające odzyskane komórki rozcieńczyć w stosunku 1:100, 1:1 000 i 1:10 000 roztworem SOC. Rozcieńczone komórki umieścić na płytkach agarowych LB o średnicy 100 mm z dodatkiem chloramfenikolu (12,5 μg/ml). Pozostałe komórki ułóż na płytce o średnicy 245 mm2. Inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.
  2. Obliczanie złożoności biblioteki
    1. Sfotografować płytki rozcieńczające za pomocą systemu dokumentacji żelu lub zwykłego aparatu cyfrowego. Uruchom OpenCFU software14 i prześlij zdjęcia płytek rozcieńczających. Ustaw obszar liczenia wewnątrz płytki i usuń fałszywe kolonie.
    2. Ręcznie pomnóż liczbę kolonii przez współczynnik rozcieńczenia, aby uzyskać pierwotną liczbę transformantów. Zamień te liczby na postać logarytmiczną (podstawa 10). Oblicz średnią, aby określić złożoność biblioteki.
    3. Po uzyskaniu pożądanej wartości złożoności zebrać wszystkie kolonie na kwadratowej płytce o średnicy 245 mm (z kroku 2.1.7) za pomocą rozsiewacza i 20 ml LB uzupełnionego chloramfenikolem. Nie hoduj zebranych kolonii i nie oczyść biblioteki plazmidów za pomocą komercyjnego zestawu midiprep.
      UWAGA: Im większa złożoność biblioteki, tym lepiej. Kiedy zidentyfikowano Sniper-Cas9, osiągnięto różnorodność 3 x 106 dla każdej biblioteki.

3. Pozytywne i negatywne oceny dla ewoluującego Cas9

  1. Wybór celu i budowa plazmidu
    1. Wybierz docelową sekwencję dystansową sgRNA w GOI. Zastąp jedną lub dwie reszty w losowym nukleotydzie, aby uzyskać niedopasowaną sekwencję.
      UWAGA: Ludzki punkt docelowy EMX1 3 (GAGTCCGAGCAGAAGAAGAA z GGG PAM) został użyty w przypadku Sniper-Cas9. Poniżej przedstawiono użyte niezgodne sekwencje: GAGTCCGAGCAGAAagAGAA, GAacCCGAGCAGAAGAAGAA, GAGTCCGAGCAGAgGAAGAA i GAGcCCGAGCAGAAGAAGAA.
    2. Wstaw niedopasowaną sekwencję (patrz krok 3.1.1) do plazmidu sgRNA, stosując standardowe procedury klonowania oligonukleotydów (oligo)7.
    3. Wstaw niedopasowaną sekwencję z PAM na końcu 3' do p11-lacY-wtx1 (Tabela materiałów), aby skonstruować plazmid ccdB przy użyciu standardowych procedur klonowania oligo15.
  2. Przygotowanie kompetentnych komórek E. coli do badań przesiewowych snajperów
    1. Rozmrozić elektrokompetentne ogniwa BW25141-GOI na lodzie.
    2. Dodaj po 1 ng każdego z plazmidów ccdB i plazmidu sgRNA z podwójnymi niezgodnościami do 50 μl rozmrożonych komórek BW25141-GOI. Delikatnie wymieszaj ogniwa przez pipetowanie i przenieś je do wstępnie schłodzonej kuwety do elektroporacji o średnicy 0,1 cm.
    3. Przekształć E. coli z dwoma plazmidami za pomocą elektroporacji. Dodać 250 μl pożywki SOC natychmiast po elektroporacji. Delikatnie odpipetować roztwór, aby wymieszać komórki i pożywkę. Przenieść mieszaninę do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.
      UWAGA: Aby uzyskać maksymalną wydajność, ustaw napięcie na 1.80 kV, a czas pracy powinien wynosić od 4.8 ms do 5.0 ms.
    4. Odzyskać przekształcone komórki i inkubować je w temperaturze 32 °C przez 1 godzinę, delikatnie wstrząsając.
    5. Płytka 125 μl odzyskanych komórek na płytce agarowej LB ampicyliny (50 μg/ml)/kanamycyny (25 μg/ml) (warunki hodowli). Umieść pozostałe komórki na płytce agarowej LB ampicyliny/kanamycyny/arabinozy (1,5 mg/ml) (warunek ekspresji ccdB). Inkubować w temperaturze 32 °C przez noc.
    6. Sprawdź, czy na płytce z ekspresją ccdB nie ma kolonii, które przeżyły. Zebrać kolonie z płytki do hodowli za pomocą rozsiewacza i wyhodować je w 250 ml super optymalnego podłoża bulionowego (SOB) uzupełnionego 50 μg/ml ampicyliny i 25 μg/ml kanamycyny w temperaturze 32 °C, delikatnie wstrząsając.
    7. Gdy gęstość optyczna przy 600 nm (OD600) osiągnie 0,4, schłodzić kolbę na lodzie. Przygotuj wstępnie schłodzoną wodę dejonizowaną i wstępnie schłodzony 10% roztwór glicerolu (sterylizuj przed użyciem).
    8. Odwirować (przy 4 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C) komórki i odrzucić supernatant. Dodaj 200 ml wstępnie schłodzonej wody dejonizowanej. Zawiesić komórki za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml. Powtórz ten krok 3 razy.
    9. Umyj komórki 50 ml wstępnie schłodzonego 10% roztworu glicerolu. Odwirować je jak poprzednio (przy 4 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C).
    10. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 300 μl 10% roztworu glicerolu. Przygotuj 50 μl porcji i zamroź je w ciekłym azocie. Przechowywać ogniwa (komory osłaniające snajperów) w temperaturze -80 °C.
  3. Osłona snajpera
    1. Przekształć komórki przesiewowe Snajpera (z kroku 3.2.10) za pomocą 100 ng plazmidów wariantu Cas9 z każdej biblioteki (od kroku 2.2.3.Zobacz kroki 2.1.1 i 2.1.4). Postępuj zgodnie z krokami elektroporacji opisanymi w krokach 3.2.1–3.2.3.
    2. Przenieś 250 μl komórek do świeżej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Dodać 250 pg ATC, aby uzyskać końcowe stężenie 10 ng / ml. Odzyskaj zarówno ogniwa zawierające ATC, jak i wolne od ATC (patrz krok 3.2.4, aby zapoznać się z krokiem odzyskiwania).
    3. Płytka 25 μl odzyskanych komórek wolnych od ATC na płytce agarowej z chloramfenikolem/kanamycyną LB (stan nieselektywny). Dodać ATC do odzyskanych komórek zawierających ATC, aby uzyskać końcowe stężenie 100 ng/ml na płytce LB o średnicy 245 mm. Natychmiast umieść komórki na płytce agarowej z chloramfenikolem/kanamycyną/arabinozą LB (stan selektywny). Inkubować przez noc w temperaturze 32 °C.
      UWAGA: Rozmiar i numer płytki LB są określone przez wielkość różnorodności pokryw ekranu. W przypadku płytki Petriego o średnicy 100 mm z 20 ml LB dodać 2 μg ATC.
    4. Sfotografuj płyty. Policz liczbę żywotnych kolonii za pomocą oprogramowania OpenCFU14. (Patrz krok 2.2.1) Upewnij się, że liczba kolonii na nieselektywnej płytce jest co najmniej 10 razy większa niż różnorodność biblioteki, aby objąć wszystkie warianty.
    5. Obliczyć częstość przeżycia w następujący sposób.
      Częstotliwość przeżycia = liczba kolonii na selektywnej płytce / (liczba kolonii na nieselektywnej płytce x 10)
    6. Zbierz kolonie, które przetrwały na wybranych płytach ze wszystkich trzech bibliotek. Inkubować ocalałe kolonie w 250 ml pożywki LB uzupełnionej 12,5 μg/ml chloramfenikolu w temperaturze 42 °C przez noc. Wyizoluj przesiewane DNA biblioteki Cas9 za pomocą zestawu midiprep.
      UWAGA: Ten krok usuwa plazmid sgRNA.
    7. Powtarzać proces przesiewowy od kroków 3.3.1–3.3.6, aż częstotliwość przeżycia osiągnie plateau. Użyj 10 ng wybranego plazmidu Cas9 do transformacji i 10 ng/ml ATC podczas rekonwalescencji. Utrzymać stężenie ATC na poziomie 100 ng/ml dla stanu selektywnego.
  4. Tasowanie i drugi seans
    1. Przetasuj wybrane warianty w puli przy użyciu następującego protokołu tasowania DNA. PCR amplifikuje wstawkę Cas9 w plazmidzie Cas9 za pomocą starterów flankujących, 150 nukleotydów od granic wkłucia. Trawić 2 μg amplifikowanego produktu PCR z DNazą I przez 1 minutę w temperaturze 37 °C.
    2. Oczyść fragmenty o długości 70–200 pz za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym 2%. PCR amplifikuje oczyszczone fragmenty. Użyj produktu jako szablonu do PCR, amplifikuj wkładkę Cas9 odpowiednimi starterami po bokach Cas9. Użyj końcowego produktu PCR, aby skonstruować bibliotekę Cas9 zgodnie z opisem w kroku 2.1.4.
    3. Przygotuj nowe komórki przesiewowe Snipera (patrz sekcja 3.2) z innym niedopasowanym plazmidem sgRNA (patrz krok 3.1.1). Powtórz proces przesiewowy (sekcje 3.2–3.3), aż wskaźnik przeżycia osiągnie plateau. Użyj 10 ng wybranego plazmidu Cas9 do transformacji i 10 ng / ml ATC podczas odzyskiwania. Utrzymać stężenie ATC na poziomie 10 ng/ml dla stanu selektywnego.
  5. Selekcja wyewoluowanych zmutowanych plazmidów Cas9
    1. Po ostatnim etapie badania przesiewowego losowo wybrać sto kolonii z płytki selekcyjnej i wyhodować je w pożywce LB zawierającej chloramfenikol w temperaturze 42 °C przez noc.
    2. Wyizoluj plazmidy za pomocą procedury miniprep i sekwencjonuj wstawki Sangera za pomocą starterów sekwencjonowania w Cas9.
    3. Wybierz trzy najczęściej występujące warianty, aby przetestować je na ludzkich liniach komórkowych.

4. Dostarczanie Cas9 jako RNP z obciętym sgRNA

  1. Docelowa selekcja genów za pomocą Cas-OFFinder
    1. Wybierz witryny docelowe za pomocą Cas-OFFinder (http://www.rgenome.net/cas-offinder/). Wybierz typ PAM odpowiedni dla konkretnego typu Cas9 i genomu docelowego (człowiek, mysz, danio pręgowany itp.). Wypełnij kartę Sekwencje zapytań, wybierz numer niezgodności i kliknij przycisk Prześlij.
    2. Po kilku sekundach pojawią się witryny docelowe (z numerem niezgodności "0") i niedocelowe. Ogólnie rzecz biorąc, wybieraj witryny niedocelowe z jedną lub trzema niezgodnościami.
  2. Przygotowanie matrycy sgRNA
    1. Uporządkować oligonukleotydy crRNA i tracrRNA za pomocą następujących sekwencji matrycowych, a mianowicie sekwencji crRNA: 5'-TAATACGACTCACTATAGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAA-3'; sekwencja tracrRNA: 5'-AGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC-3'. Wypełnić N20 w sekwencji crRNA sekwencją docelową uzyskaną w kroku 4.1.2. Aby zaprojektować skrócone sgRNA, usuń zasady z końca 5', aby uzyskać sekwencje sgRNA N19, N18 lub N17.
    2. Przygotować mieszaninę PCR do amplifikacji sekwencji kodującej sgRNA w następujący sposób: połączyć 10 μl buforu 5x, 0,5 μl oligo crRNA (100 pmol/μL), 0,5 μl oligo tracrRNA (100 pmol/μL), 2,5 μl dNTP (po 10 mM każdy), 0,5 μl polimerazy DNA i 36 μl NFW (tabela materiałów).
    3. Wzmocnić matrycę, stosując następujące warunki, a mianowicie dla początkowej denaturacji: 1 min w temperaturze 98 °C; dla denaturacji, wyżarzania i przedłużania: 10 s w temperaturze 98 °C, 15 s w temperaturze 54 °C, 20 s w temperaturze 72 °C, przez 25 cykli; dla końcowego przedłużenia: 5 minut w temperaturze 72 °C.
    4. Przeanalizować 2 μl amplifikowanego matrycowego DNA (z kroku 4.2.3) na 2% żelu agarozowym. Oczyść matrycę za pomocą zestawu do oczyszczania PCR.
      UWAGA: Wielkość matrycowego DNA wynosi 125 pz.
  3. Synteza sgRNA
    1. Przygotować mieszaninę reakcyjną do syntezy sgRNA w następujący sposób: połączyć 8,5 μl matrycowego DNA (z kroku 4.2.3), 1 μL UTP (25 mM), 1 μL CTP (25 mM), 1 μL GTP (25 mM), 1 μL ATP (25 mM), 4,2 μL MgCl2 (100 mM), 4,5 μL polimerazy T7 RNA (50 U/μL), 3 μl 10x buforu polimerazy RNA T7, 1,2 μl pirofosfatazy (0,5 U/μL), 0,75 μl inhibitora RNazy (40 U/μL) i 4,2 μL NFW.
    2. Mieszaninę reakcyjną inkubować w temperaturze 37 °C przez noc (co najmniej przez 10 godzin). Dodać 0,5 μl DNazy (2 U/μL) do mieszaniny reakcyjnej i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15–30 min. Oczyść sgRNA za pomocą zestawu do oczyszczania RNA.
    3. Aby zmniejszyć toksyczność spowodowaną wrodzoną odpowiedzią immunologiczną wywołaną przez 5'-trifosforan na sgRNA16, usuń 5'-trifosforan z przewodnika RNA za pomocą fosfatazy alkalicznej jelita cielęcego () w następujący sposób: potraktuj 10 μg RNA transkrybowanego in vitro 250 U przez 3 godziny w temperaturze 37 °C w obecności 100 U inhibitora RNazy. Oczyść sgRNA poddane działaniu za pomocą zestawu do oczyszczania RNA.

5. Ekspresja i oczyszczanie białek WT i Sniper-Cas9

  1. Ekspresja białka w E. coli
    1. Przekształć plazmidy pET 18 kodując oznaczone przez Niego WT- i Sniper-Cas9 w BL21 (DE3) szczep E. coli.
    2. Zaszczepić 50 ml pożywki LB zawierającej 50 μg/ml kanamycyny świeżą kolonią zawierającą plazmid ekspresji pET-Cas9 i wstrząsnąć nim przez noc (200 obr./min) w temperaturze 37 °C (hodowla wstępna).
    3. Przenieś 10 ml kultury przez noc do 500 ml świeżej pożywki LB zawierającej 50 μg/ml kanamycyny. Inkubować kulturę, wytrząsając (200 obr./min) w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.
    4. Monitoruj OD600, aż kultura osiągnie środkową logarytmiczną fazę wzrostu (OD600 ≈ 0,6–0,7).
    5. Indukować ekspresję białka WT lub Sniper-Cas9 za pomocą izopropylo β-D-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG, w końcowym stężeniu 0,25 nM). Inkubować kulturę w temperaturze 18 °C przez noc.
  2. Oczyszczanie białek
    1. Zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 5 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    2. Zawiesić osad w buforze do lizy (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol, 4 mM ditiotreitol [DTT], 5 mM benzamidyna, 100 mM fluorek fenylometylosulfonylu [PMSF], pH 8) w stężeniu 20 ml na gram mokrej masy.
    3. Dodać PMSF, DTT i lizozym do końcowego stężenia 1 mg/ml każdy i inkubować mieszaninę na lodzie przez 30 minut.
    4. Sonikuj komórki na lodzie. Pulsuj wielokrotnie przez 10 s przy 200–300 W z 10-sekundowym okresem chłodzenia między każdym impulsem, przez łączny czas 20 minut.
    5. Odwirować lizat przy 6 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
    6. Usunąć supernatant do świeżej probówki. Dodać 1 ml żywicy agarozowej His-Bind do 5 ml oczyszczonego lizatu i delikatnie wstrząsać przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
    7. Załaduj mieszaninę lizatu i żywicy agarozowej His-Bind na kolumnę z zaślepionym dolnym wylotem.
    8. Zdejmij dolną nasadkę i zbierz przepływ kolumny.
    9. Przepłukać kolumnę 2x buforem do przemywania (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 20 mM imidazolu, pH 8); zebrać frakcję płuczącą do analizy za pomocą elektroforezy w żelu dodecylosiarczanowo-poliakrylamidowym dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE).
    10. Eluować białko 10x za pomocą 1 ml buforu elucyjnego (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazolu, pH 8), pobierając próbki do SDS-PAGE.
    11. Zagęścić eluowane białko WT lub Sniper-Cas9 za pomocą filtra kolumnowego o mocy 100 kDa. Próbki należy przechowywać w roztworze 10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl i 50% glicerolu w temperaturze -80 °C.

6. Dostawa RNP

  1. Transfekcja i przygotowanie komórek do podania RNP
    1. Utrzymuj HEK293T komórek w zmodyfikowanym pożywce Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco, uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% antybiotykami w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
    2. Wymieszaj białko WT- lub Sniper-Cas9 (2 μg) z sgRNA (2 μg) i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej, aby uzyskać kompleksy RNP.
    3. Trypsynizuj i policz komórki. Przygotuj 2 x 104 komórki na jedną reakcję. Przemyć komórki solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i odwirować. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad za pomocą buforu do elektroporacji.
    4. Elektroportuj kompleksy RNP do ogniw przy użyciu następujących ustawień, a mianowicie 1,300 V, 30 ms i jeden impuls. Umieść komórki na 48-dołkowej płytce wypełnionej 500 μl DMEM uzupełnionego FBS i antybiotykami (jak opisano w kroku 6.1.1) zaraz po elektroporacji. Inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
    5. Wyizolować genomowe DNA za pomocą zestawu do przygotowania gDNA, 48 godzin po transfekcji.

7. Transfekcja plazmidów kodujących Sniper-Cas9 i sgRNA

  1. Budowa plazmidu sgRNA
    1. Kolejność oligonukleotydów do przodu i do tyłu za pomocą następujących sekwencji szablonów, a mianowicie do przodu: 5'-CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'; odwrócony: 5'-AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNC-3'. Zastąp N20 sekwencją docelową uzyskaną w kroku 4.1.2. Skróć sekwencję docelową do długości N19, N18 lub N17, aby zsyntetyzować skrócone sgRNA.
    2. Wyżarzaj oba oligonukleotydy w 1x buforze ligazy DNA T4.
    3. Trawić wektor pRG2 za pomocą enzymu restrykcyjnego BsaI.
    4. Żel oczyszcza strawiony wektor (3 300 pz) za pomocą 0,8% żelu agarozowego.
    5. Związać wyżarzony oligo i oczyszczony fragment przy użyciu ligazy T4 w temperaturze 37 °C: zmieszać 50 ng przefermentowanego pRG2 i 1 ng wyżarzonego oligo w objętości reakcyjnej 20 μl. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
    6. Przekształć mieszaninę ligacji w szczep alfa DH5 i hodować transformanty na płytkach agarowych LB zawierających ampicylinę (100 μg/ml) w temperaturze 37 °C. Potwierdzić wprowadzenie oligonukleotydy do wektora za pomocą standardowego sekwencjonowania.
  2. Transfekcja plazmidów kodujących Sniper-Cas9 i sgRNA
    1. Utrzymuj HEK293T komórki w DMEM uzupełnione 10% FBS i 1% antybiotykami w temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Dzień przed transfekcją trypsynizuj i policz komórki. Podczas pracy w skali 48-dołkowej, płytka 1 x 105 komórek na studzienkę w 250 μl kompletnej pożywki wzrostowej. Komórki powinny zlewać się w 50%–80% w dniu transfekcji.
    2. W skali 48-dołkowej przygotuj 250 ng plazmidu p3s-Cas9 i 250 ng plazmidu sgRNA do transfekcji, używając odczynnika do transfekcji na bazie lipidów. Wymieszać plazmidy w 25 μl surowicy free-MEM.
    3. Rozcieńczyć 1 μl odczynnika do transfekcji 25 μl surowicy wolnej od MEM. Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Połączyć dwie mieszaniny i inkubować otrzymany roztwór w temperaturze pokojowej przez 20 minut, aby utworzyć kompleksy plazmid-lipofektamina.
    4. Po 20 minutach inkubacji dodać 50 μl roztworu zawierającego kompleksy odczynnika do transfekcji plazmidu bezpośrednio do każdej studzienki zawierającej komórki i delikatnie wymieszać, kołysząc płytką w przód iw tył. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO2 przez 48–72 godzin po transfekcji przed oznaczeniem ekspresji transgenu.

8. Obliczanie częstotliwości indel w celu określenia działań na celu i poza celem

  1. Ukierunkowane głębokie sekwencjonowanie w celu analizy miejsc docelowych i potencjalnych lokalizacji poza celem
    1. Wyizoluj genomowe DNA z kroku 6.1.5 lub 7.2.4 za pomocą zestawu do przygotowania gDNA. Generuj biblioteki głębokiego sekwencjonowania poprzez amplifikację gDNA metodą PCR za pomocą starterów ukierunkowanych na cel i poza nim.
    2. Użyj starterów indeksowych, aby oznaczyć każdą próbkę. Poddaj pule bibliotek sekwencjonowaniu sparowanym końcami przy użyciu maszyny sekwencjonującej nowej generacji.
  2. Głęboka analiza sekwencjonowania za pomocą Cas-Analyzer
    1. Analizowanie danych z głębokiego sekwencjonowania za pomocą narzędzia do oceny Cas-Analyzer17.
    2. Wybierz pliki Fastq w zakładkach Odczyt 1 i Odczyt 2 (Odczyt 1 = XX_SXX_L001_R1_001.fastq, Odczyt 2 = XX_SXX_L001_R2_001.fastq).
    3. Wypełnij zakładki Informacje podstawowe oraz zakładkę Parametry analizy. Kliknij przycisk Prześlij.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Po przeprowadzeniu badania snajperskiego, procent kolonii przetrwania można obliczyć, dzieląc liczbę kolonii na płytce LB zawierających chloramfenikol, kanamycynę, arabinozę i ATC (CKAA) przez liczbę kolonii na płytce LB zawierających tylko chloramfenikol i kanamycynę (CK). Odsetek ten był zwykle bardzo niski, gdy Sniper-screen był wykonywany z bibliotekami SpCas9. Trafienia true-positive można wzbogacić, powtarzając ekran z pulą ocalałych. Na przykład na tym reprezentatywnym ekranie snajperskim uzyskano 100% wskaźnik przeżycia po trzecim ekranie (Rysunek 1). Transfekcje za pomocą RNP lub kodowanego plazmidem Sniper-Cas9 mogą być wykonywane dla różnych celów, a wynikające z nich działania na celu i poza nim mierzone są za pomocą ukierunkowanego sekwencjonowania amplikonów (Rysunek 2). W przypadku większości celów Sniper-Cas9 wykazuje ten sam poziom aktywności na celu i wyższe współczynniki swoistości w porównaniu z WT. Skrócone sgRNA mogą być również używane do dalszej poprawy swoistości (Rysunek 3). Jednak ich zastosowanie jest ograniczone tylko do kilku celów, ponieważ w większości przypadków skutkują one niską aktywnością na miejscu w porównaniu z pełnowymiarowymi sgRNA. Dlatego należy testować sgRNA o różnych długościach (od 17 do 20 merów) i mierzyć zarówno aktywność na celu, jak i poza nim, aby zoptymalizować swoistość.

figure-results-1
Rysunek 1: Reprezentatywne ekrany snajperskie wykonane z różnymi bibliotekami losowych wariantów Cas9. Biblioteka modyfikatorów, biblioteka EP I i biblioteka EP II wskazują biblioteki wykonane przy użyciu różnych zestawów komercyjnych. Pierwszy, drugi i ostatni wskazują, ile razy ekran wzbogacania został wykonany7. Ten rysunek został zmodyfikowany z Lee et al.7. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Działania na celu i poza celem WT-Cas9 lub Sniper-Cas9 w połączeniu z 20-merową sekwencją prowadzącą dostarczaną przez plazmid lub RNP. Współczynniki swoistości określono poprzez podzielenie aktywności celowej przez aktywność pozacelową. Słupki błędów wskazują SEM (n = 3)7. Ten rysunek został zmodyfikowany z Lee et al.7. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Działania Sniper-Cas9 na celu i poza nim w porównaniu z WT-Cas9 uzyskane przy użyciu sgRNA o różnych długościach skierowanych na miejsca FANCF01 i AAVS. Współczynniki swoistości określono poprzez podzielenie częstości występowania indel w miejscach docelowych przez częstości występowania w odpowiednich miejscach poza celem. Wskazane są sgRNA z dopasowaną guaniną na końcu 5' (GX18 lub GX19) oraz te z niedopasowaną guaniną (gX17, gX18, gX19 lub gX20). Współczynniki swoistości nie zostały obliczone, gdy znormalizowane działania docelowe wynosiły <70%7. Ten rysunek został zmodyfikowany z Lee et al.7. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dla tych, którzy chcą uniknąć kłopotliwych procedur przesiewowych w celu uzyskania Sniper-Cas9, dostępne jest białko Sniper-Cas9 i plazmid kodujący. Za pomocą tych materiałów należy określić optymalną długość sgRNA, zapewniającą najwyższy współczynnik swoistości. Ponadto zaleca się dostarczanie Sniper-Cas9 i sgRNA w formacie RNP, ponieważ zwykle skutkuje to wyższym współczynnikiem swoistości niż dostarczanie w formacie plazmidu. W przeciwieństwie do Sniper-Cas9, inne zmodyfikowane warianty Cas9 nie są kompatybilne ze skróconymi sgRNA 6,7 lub dostarczaniem w formie RNP8 (z wyjątkiem HiFi-Cas9).

W przypadku ekranu snajperskiego wybór niedopasowanej sekwencji jest najważniejszym krokiem. Należy unikać wyboru niedopasowanego sgRNA, który jest związany z niską aktywnością rozszczepienia w kierunku sekwencji GOI . Jeśli nie, warianty Cas9 o poziomie swoistości WT nie rozszczepią genomowego DNA E. coli z niedopasowanym miejscem docelowym. Efekt ten spowoduje powstanie dużej liczby kolonii tła, co zagrozi całej procedurze przesiewowej.

Ponieważ E. coli ma szybki czas podwajania i wysoką wydajność przemiany w porównaniu z drożdżami, Sniper-screen jest korzystny w porównaniu z metodami przesiewowymi opartymi na drożdżach. Dodatkowo, Sniper-screen powinien być bardziej czuły niż inne systemy oparte na E. coli, w których niedopasowane miejsce jest przenoszone na plazmidzie: w naszym systemie jest jedna kopia genomowego DNA, a zatem tylko jedna kopia niedopasowanego miejsca, ale duża liczba plazmidów w jednej komórce E. coli .

Specyfika innych endonukleaz DNA, które indukują DSB, takich jak SaCas9 lub Cpf1s, można również poprawić, stosując Sniper-screen. Niestety, Sniper-screen nie może być używany do bezpośredniego zwiększania specyficzności edytorów bazowych, ponieważ edytory bazowe nie indukują DSB w genomowym DNA E. coli. Jako, że edytorzy bazowi używają nickase lub martwej wersji Cas9 w rdzeniu swojego systemu, specyfika edytorów bazowych może zostać zwiększona poprzez wykorzystanie trafień uzyskanych z Sniper-screen.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Firma ToolGen złożyła wniosek patentowy (PCT/KR2017/006212) obejmujący ekran Sniper-screen (status: w toku, wynalazca: Jungjoon K. Lee). Jungjoon K. Lee, Joonsun Lee, Minhee Jung i Euihwan Jeong są pracownikami ToolGen, Inc.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Te badania były wspierane przez granty Ministerstwa Nauki i ICT Korei (2017M3A9B4061406) oraz Narodowej Fundacji Badawczej Korei (NRF) finansowane przez rząd koreański (MSIT) (numery grantów 2017M3A9B4061404 i 2018M3A9H3020844) dla Jungjoon K. Lee. Plazmid kodujący pGRG36 był prezentem od Nancy Craig (plazmid Addgene #16666), a p11-LacY-wtx1 był prezentem od Huimin Zhao.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Fosfataza alkaliczna, jelito cielęcia ()NEBM0290L
Ampicylina Sól sodowaFisher ChemicalBP1760-25
Chlorowodorek anhydrotetracyklinySigma Aldrich37919 lub 94664
Antybiotyk Roztwór przeciwgrzybiczyWelgeneLS203-01Składnik medialny
BamHIEnzynomicsR003L
ChloramfenikolSigma AldrichR4408
Diversify PCR Losowa mutagenezaClontech630703Podatny na błędy zestaw do
PCR Zestaw do tasowania DNA JenaBiosciencePP-103
Zmodyfikowane podłoże orła firmy Dulbecco (DMEM)WelgeneLM001-17Pożywka hodowlana
Endura Elektrokompetentne komórki (DUO)Lucigen60242-2E. coli elektrokompetentne komórki do przygotowania biblioteki
Surowica bydlęca płodu (FBS)WelgeneS101-01Składnik pożywki
Gene Pulser IIBio-RadE. Sprzęt do elektroporacji coli
GeneMorph II Zestaw do mutagenezy losowejAgilent200550Podatny na błędy zestaw do PCR
Przygotowanie genomowego DNA zestawGenAll106-152gDNA-prep
GlycerolBioShopGLY001.1
GP/MP Kuweta, 0,1 cmBio-RadBR165-2089E. sprzęt do elektroporacji
HEK293T komórkaATCCCRL-11268Ludzka linia
komórkowa Siarczan kanamycynyAcros Organics450810500
L-(+)- ArabinozaSigma AldrichA3256-25G
Zestaw do oczyszczania LaboPass PCRCosmogenetechCMR0112
LaboPass Plasmid MiniCosmogenetechCMP0112Zestaw do mini-przygotowania
LB Agar MillerFormediumLMM0202
LB Bulion MillerFormediumLMM0102
LipofectamineInvitrogen11668019Odczynnik do transfekcji
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master MixNEBE2621LMieszanina montażowa Gibsona (izotermiczna in vitro rekombinacja)
System transfekcji NeonThermoMPK5000RNP Sprzęt do elektroporacji
System transfekcji Neon 10 µ L KitThermoMPK1096RNP Sprzęt do elektroporacji
NucleoBond Xtra Midi EFMacherey-Nagel740420.50Zestaw do przygotowania środka
Oligo Clean & KoncentratorZymo ResearchD4061Zestaw do oczyszczania DNA, który umożliwia elucję o małej objętości
Opti-MEMGibcoLS31985070Media transfekcyjne
p11-lacY-wtx1Addgene#123945
pgrg36Addgene#16666E. Szczep mutatora coli
Phusion Polimeraza DNA o wysokiej wiernościNEBM0530L
PirofofatazaNEBM2403L
Zestaw roztworów rybonukleotydów NEBN0450L
Inhibitor RNazyNEBM0314L
T7 Polimeraza RNANEBM0251L
Turbo DnaseAmbionAM2238
XbaIEnzynomicsR013L
XL1-Red Kompetentny KomórkiAgilent200129
kit

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fu, Y., Sander, J. D., Reyon, D., Cascio, V. M., Joung, J. K. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. Nature Biotechnology. 32 (3), 279-284 (2014).
  2. Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
  3. Chen, J. S., et al. Enhanced proofreading governs CRISPR-Cas9 targeting accuracy. Nature. 550 (7676), 407-410 (2017).
  4. Kleinstiver, B. P., et al. High-fidelity CRISPR-Cas9 nucleases with no detectable genome-wide off-target effects. Nature. 529 (7587), 490-495 (2016).
  5. Slaymaker, I. M., et al. Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity. Science. 351 (6268), 84-88 (2016).
  6. Casini, A., et al. A highly specific SpCas9 variant is identified by in vivo screening in yeast. Nature Biotechnology. 36 (3), 265-271 (2018).
  7. Lee, J. K., et al. Directed evolution of CRISPR-Cas9 to increase its specificity. Nature Communications. 9 (1), 3048(2018).
  8. Vakulskas, C. A., et al. A high-fidelity Cas9 mutant delivered as a ribonucleoprotein complex enables efficient gene editing in human hematopoietic stem and progenitor cells. Nature Medicine. 24 (8), 1216-1224 (2018).
  9. Anderson, K. R., et al. CRISPR off-target analysis in genetically engineered rats and mice. Nature Methods. 15, 512-514 (2018).
  10. Kim, S., Bae, T., Hwang, J., Kim, J. S. Rescue of high-specificity Cas9 variants using sgRNAs with matched 5' nucleotides. Genome Biology. 18 (1), 218(2017).
  11. Kulcsar, P. I., et al. Crossing enhanced and high fidelity SpCas9 nucleases to optimize specificity and cleavage. Genome Biology. 18 (1), 190(2017).
  12. Zhang, D., et al. Perfectly matched 20-nucleotide guide RNA sequences enable robust genome editing using high-fidelity SpCas9 nucleases. Genome Biology. 18 (1), 191(2017).
  13. McKenzie, G. J., Craig, N. L. Fast, easy and efficient: site-specific insertion of transgenes into enterobacterial chromosomes using Tn7 without need for selection of the insertion event. BMC Microbiology. 6, 39(2006).
  14. Geissmann, Q. OpenCFU, a new free and open-source software to count cell colonies and other circular objects. PLoS One. 8 (2), e54072(2013).
  15. Chen, Z., Zhao, H. A highly sensitive selection method for directed evolution of homing endonucleases. Nucleic Acids Research. 33 (18), e154(2005).
  16. Kim, S., et al. CRISPR RNAs trigger innate immune responses in human cells. Genome Research. 28 (3), 367-373 (2018).
  17. Park, J., et al. Cas-Analyzer: an online tool for assessing genome editing results using NGS data. Bioinformatics. 33, 286-288 (2017).
  18. Studier, F. W., et al. Use of T7 RNA Polymerase to Direct Expression of Cloned Genes. Methods in Enzymology. 185, 60-89 (1990).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Specyficzno CRISPR Cas9system Sniper screenskr cone sgRNAformat rybonukleoproteinowyredukcja efekt w off targetprzesiewanie wariant w Cas9kom rki HEK293 T

Powiązane artykuły