Ten protokół opisuje prostą metodę pobierania próbek oddechu od dzieci. Krótko mówiąc, próbki zmieszanego powietrza są wstępnie zagęszczane w probówkach sorbentowych przed analizą metodą chromatografii gazowej i spektrometrii mas. Biomarkery oddechowe chorób zakaźnych i niezakaźnych można zidentyfikować za pomocą tej metody zbierania wydychanego powietrza.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Pobieranie próbek oddechu od dzieci w celu odkrycia biomarkerów choroby
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zbieranie i analiza oddechu mogą być używane do odkrywania lotnych biomarkerów w wielu chorobach zakaźnych i niezakaźnych, takich jak malaria, gruźlica, rak płuc i choroby wątroby. Protokół ten opisuje powtarzalną metodę pobierania próbek wydychanego powietrza u dzieci, a następnie stabilizacji próbek wydychanego powietrza do dalszej analizy za pomocą chromatografii gazowej ze spektrometrią mas (GC-MS). Celem tej metody jest ustalenie ustandaryzowanego protokołu pobierania próbek wydychanego powietrza do dalszej analizy chemicznej od dzieci w wieku 4-15 lat. Najpierw próbka oddechu jest pobierana za pomocą tekturowego ustnika przymocowanego do zaworu 2-drogowego, który jest podłączony do worka o pojemności 3 litrów. Anality oddechowe są następnie przenoszone do rurki do desorpcji termicznej i przechowywane w temperaturze 4-5 °C do czasu analizy. Technika ta była wcześniej stosowana do rejestrowania oddechu dzieci z malarią w celu skutecznej identyfikacji biomarkerów oddechu. Następnie z powodzeniem zastosowaliśmy tę technikę do dodatkowych kohort pediatrycznych. Zaletą tej metody jest to, że wymaga minimalnej współpracy ze strony pacjenta (co ma szczególną wartość w populacjach pediatrycznych), ma krótki okres pobierania, nie wymaga przeszkolonego personelu i może być wykonywana przy użyciu przenośnego sprzętu w warunkach terenowych o ograniczonych zasobach.
Wprowadzenie
Biomarkery mogą dostarczyć cennych informacji o normalnych i patologicznych procesach biologicznych, które mogą przyczynić się do klinicznie zidentyfikowanej choroby. Ostatnio wzrosło zainteresowanie oceną substancji lotnych w oddechu jako biomarkerów różnych stanów chorobowych, w tym infekcji, zaburzeń metabolicznych i raka 1. Wydychany oddech zawiera mierzalne poziomy lotnych związków organicznych (LZO), półlotnych związków organicznych i materiału pochodzenia mikrobiologicznego (np. kwasów nukleinowych bakterii i wirusów). Głównym celem analizy wydychanego powietrza jest uzyskanie wglądu w stan chorobowy i/lub narażenie środowiskowe w sposób nieinwazyjny. Istnieją różne metody zbierania i analizowania wydychanego powietrza, w zależności od składników będących przedmiotem zainteresowania. Obecnie nie ma ustandaryzowanej metody zbierania wydychanego powietrza, co komplikuje analizę porównawczą wyników między badaniami. Standaryzacja procedur pobierania wydychanego powietrza ma zasadnicze znaczenie, ponieważ sama procedura pobierania próbek ma znaczący wpływ na późniejsze wyniki analiz wydychanego powietrza.
W wielu badaniach stosuje się pobieranie próbek z późnego oddechu oddechowego2,3. Pobieranie próbek polega na odrzuceniu początkowej części wydychanego powietrza ("martwa przestrzeń") w celu preferencyjnego wychwycenia powietrza pod koniec cyklu oddechowego. Zaletą tej strategii jest to, że minimalizuje ona poziomy egzogennych LZO (np. LZO w środowisku), jednocześnie wzbogacając o endogenne, specyficzne dla pacjenta LZO. Metoda ta wyklucza pierwsze kilka sekund wydechu od osoby przed pobraniem próbki wydychanego powietrza. Inni badacze zastosowali czujnik ciśnienia do aktywacji pobierania próbek podczas predefiniowanej fazy wydechu4,5. Ponieważ czujniki ciśnienia wymagają skomplikowanej inżynierii, ta alternatywna metoda wymaga dedykowanego i stosunkowo kosztownego urządzenia do pobierania próbek.
Pobieranie próbek oddechu u dzieci może być szczególnie trudne. Kluczowym problemem jest to, że małe dzieci mogą nie być w stanie współpracować zgodnie z protokołami dobrowolnego wydychania powietrza z "martwej przestrzeni". Z tego powodu łatwiej jest uzyskać mieszany oddech u dzieci. Jednak głównym zastrzeżeniem dotyczącym mieszanych próbek oddechowych jest ryzyko skażenia środowiska i materiału. Dlatego wykonalność pobierania danych przez dzieci jest głównym problemem w tej dziedzinie.
Ponadto, oprócz metod pobierania, przechowywanie próbek wydychanego powietrza może również wpływać na jakość próbki. Wysoka wilgotność wydychanego powietrza i bardzo niskie stężenia (części na bilion) lotnych organicznych związków oddechowych sprawiają, że próbki wydychanego powietrza są szczególnie podatne na problemy związane z przechowywaniem6,7. Pomimo ogromnego potencjału technik czasu rzeczywistego, takich jak spektrometria mas reakcji transferu protonów (PTR-MS), GC-MS pozostaje złotym standardem w analizie próbek wydychanego powietrza. Ponieważ analiza GC-MS próbek wydychanego powietrza jest techniką offline, jest ona sprzężona z metodami wstępnego zatężania, takimi jak probówki do desorpcji termicznej (TD), mikroekstrakcja do fazy stałej i urządzenia do łapania igieł. Przed wstępnym zatężeniem próbki wydychanego powietrza muszą być tymczasowo przechowywane w workach polimerowych8. Torby polimerowe są popularne ze względu na ich umiarkowaną cenę, stosunkowo dobrą trwałość i możliwość wielokrotnego użytku. Chociaż worki mogą być ponownie użyte, potrzeba czasu i wysiłku, aby zapewnić skuteczne czyszczenie7,8. Każdy konkretny typ worka wymaga również empirycznie określonych i ustandaryzowanych procedur kontroli jakości, możliwości ponownego użycia i odzysku.
TD są powszechnie używane do wstępnego zagęszczania oddechu, ponieważ wychwytują dużą liczbę substancji lotnych i mogą być dostosowywane. Materiały absorpcyjne stosowane do pakowania tub TD mogą być dostosowane do szczególnych zastosowań i szczególnych docelowych substancji lotnych będących przedmiotem zainteresowania. Probówki TD znacznie poprawiają wygodę badań biomarkerów oddechowych, szczególnie w odległych lokalizacjach terenowych, ponieważ probówki TD bezpiecznie przechowują lotne substancje lotne w wydychanym powietrzu przez co najmniej dwa tygodnie i są łatwe w transporcie3.
W celu standaryzacji pobierania oddechu u dzieci w celu odkrycia biomarkerów, opisujemy tutaj prostą metodę zbierania oddechu od małych dzieci. Aby zilustrować reprezentatywne wyniki wdrożonych protokołów, przedstawiono zanonimizowane dane z trwającej kohorty dzieci (w wieku 8-17 lat) poddawanych ocenie pod kątem niealkoholowej choroby wątroby kwasów tłuszczowych (NAFLD). Pełne wyniki i analiza tego badania zostaną przedstawione w późniejszej publikacji. W tej pracy raportujemy podzbiór danych, aby zademonstrować zastosowanie naszego protokołu. Krótko mówiąc, dzieci są instruowane, aby normalnie wydychać powietrze przez ustnik do polimerowej torby, tak jakby "balon". Proces powtarza się 2-4 razy, aż do zebrania 1 litra oddechu. Próbka jest następnie przenoszona do probówki TD i przechowywana w temperaturze 5 °C przed analizą GC-MS.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Badanie zostało zatwierdzone przez Institutional Review Board of Washington University School of Medicine (#201709030). Świadoma zgoda została uzyskana od rodzica lub opiekuna prawnego przed włączeniem do badania. Fotografie w Rysunek 2 reprodukowane za pisemną świadomą zgodą rodziców.
1. Zespół próbnika oddechu
- Używając jednorazowych rękawiczek, przymocuj kartonowy ustnik do próbnika oddechu, jak pokazano w Uzupełnieniu Rysunek 1. Przymocować krótki odcinek rurki o dużej średnicy do drugiego końca próbnika wydychanego powietrza, jak pokazano na rysunku uzupełniającym 1. Dla każdego pacjenta należy używać nowych przewodów.
- Podłącz złącze oddechowe do zaworu worka za pomocą rurki. Zobacz Rysunek 1 dla zdjęcia połączonego próbnika oddechu i torby.
- Przekręć radełkowaną skrzydełkową z boku złączki wlotowej w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, aby odblokować zawór i popchnij trzpień zaworu workowego w dół, aby otworzyć złączkę wlotową do pobierania próbek.
- Zablokuj zawór otwarty, obracając radełkowaną skrzydełkową z boku złączki wlotowej zgodnie z ruchem wskazówek zegara.
- Upewnij się, że niebieski zawór na próbniku oddechu jest otwarty (równolegle do złącza).
- Napisz identyfikator pacjenta, datę i godzinę na etykiecie worka polimerowego.
- Stan rurki sorbentowej TD przed pobraniem wydychanego powietrza przy użyciu zalecanych procedur (dostępnych u poszczególnych producentów). Zakryj i przechowuj probówki desorpcji termicznej w temperaturze 4–5 °C przed pobraniem próbek oddechowych, aby zminimalizować artefakty.
2. Zbieranie oddechów
- Wykonaj pokaz wydechu oddechowego dla dziecka za pomocą próbnika oddechu (bez worka). Wyjaśnij dziecku, że powinno wydychać powietrze tak, jak robiłoby to podczas "nadmuchiwania balonu" i kontynuować wydychanie tak daleko, jak to możliwe. Włóż kartonowy ustnik między usta i wydychaj powietrze tak daleko, jak to możliwe.
- Daj dziecku nowy próbnik oddechu przymocowany do torby i poproś o wydech, tak jak w demonstracji, jak pokazano na Rysunek 2.
- Zamknij niebieski zawór na próbniku oddechu, gdy tylko dziecko zakończy wydech. W razie potrzeby ponownie otwórz zawór przed dodatkowymi wydechami.
- Powtarzać kroki 2.2 i 2.3 aż do uzyskania co najmniej 1 l wydychanego powietrza. U zdrowego dziecka mogą to być 2 wydechy, a u dziecka chorego lub młodszego 2-4 wydechy. 1 l wydychanego powietrza to minimalne wymaganie analityczne. Na etykiecie worka zanotuj, ile oddechów pobrano od pacjenta. Rysunek uzupełniający 2 zawiera zdjęcie worka zawierającego różne objętości wydychanego powietrza.
- Przed odłączeniem worka od próbnika oddechu należy poluzować radełkowaną skrzydełkową z boku złączki wlotowej, obracając ją w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara i popchnąć trzpień zaworu do góry, aby zamknąć złączkę wlotową. Patrz rysunek uzupełniający 3, aby uzyskać zdjęcie zaworu workowego w pozycji otwartej i zamkniętej.
- Zablokuj zawór workowy w pozycji zamkniętej, obracając radełkowaną skrzydełkową z boku złączki wlotowej zgodnie z ruchem wskazówek zegara.
- Odłączyć worek od próbnika wydychanego powietrza.
- Wyrzuć ustnik i odłóż próbnik oddechu do czyszczenia przed użyciem u innego pacjenta.
3. Transfer oddechu do probówek desorpcji termicznej
- Wyjmij rurkę TD z lodówki. Zdjąć nasadki do długotrwałego przechowywania rurki sorbentu za pomocą dostarczonego przez producenta narzędzia do zamykania/odkręcania probówki.
- Przymocować rowkowany koniec rurki sorbentu TD do worka do pobierania próbek za pomocą wężyka. Należy pamiętać, że orientacja rury jest ważna, ponieważ rurki TD są zaprojektowane tak, aby powietrze przepływało tylko w jednym kierunku, zaczynając od rowkowanego końca. Należy pamiętać, że przeniesienie oddechu z worka do TD powinno nastąpić w ciągu 1 godziny od pobrania oddechu.
- Włóż drugi koniec rurki TD do rurki, która jest podłączona do pompy.
- Włącz pompę i ustaw ją tak, aby pracowała z prędkością 100 ml/min przez 10 minut.
- Otwórz zawór na torbie, obracając w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara radełkowaną radełkowaną z boku złączki wlotowej i popchnij trzpień zaworu w dół, aby otworzyć złączkę wlotową. Zostało to zilustrowane na rysunku uzupełniającym 4, który przedstawia przenoszenie oddechu do rurki sorbentu TD za pomocą pompy.
- Uruchom pompę, która zatrzyma się po 10 minutach zbierania.
- Wyjmij rurkę sorbentu TD i dokręć nakrętki na obu końcach za pomocą narzędzia do zamykania/odkręcania rurki. Nasadki do długotrwałego przechowywania muszą być mocno dokręcone, aby zapewnić szczelne uszczelnienie.
- Umieść naklejkę na końcu jednej nakrętki, aby wskazać, że tubka została użyta. Na naklejce należy wskazać numer identyfikacyjny badania (ID) pacjenta i datę.
- Umieść probówkę w małej zamykanej plastikowej torbie. Rurkę sorbentową przechowywać w temperaturze 4–5 °C. Wyciśnij resztę oddechu z worka i wyrzuć worek. Zapisz identyfikator badania pacjenta, numer seryjny rurki TD, dzień pobrania, czas pobrania wydychanego powietrza, czas przeniesienia oddechu i przyjęcie pokarmu (czas przyjęcia pokarmu przed pobraniem wydychanego powietrza i spożytych posiłków).
4. Odbiór powietrza atmosferycznego
- Próbki powietrza otoczenia należy pobrać w otoczeniu pacjenta natychmiast po pobraniu wydychanego powietrza.
- Przymocuj worek do portu wylotowego pompy za pomocą rurki, jak pokazano na rysunku uzupełniającym 5.
- Popchnąć trzpień zaworu workowego w dół, aby otworzyć złączkę wlotową w celu pobrania próbki.
- Zablokuj zawór otwarty, obracając zgodnie z ruchem wskazówek zegara radełkowaną skrzydełkową z boku złączki wlotowej.
- Włącz pompę i ustaw ją tak, aby pracowała z prędkością 100 ml/min przez 12 minut. Pompa będzie zbierać 1 200 ml powietrza otoczenia.
- Po zebraniu żądanej objętości poluzuj radełkowaną skrzydełkową z boku złączki wlotowej, obracając ją w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara i popchnij trzpień zaworu do góry, aby zamknąć złączkę wlotową.
- Zablokuj zawór workowy w pozycji zamkniętej, obracając zgodnie z ruchem wskazówek zegara radełkowaną skrzydełkową z boku złączki wlotowej.
- Odłącz worek od pompy.
- Wykonaj te same czynności, co w sekcji 3. Jedyna różnica polega na tym, że lotne związki organiczne z powietrza z otoczenia będą przenoszone, a nie te z oddechu.
5. Analiza próbek i danych
UWAGA: Warunki analizy próbek oddechu i powietrza zostały opisane wcześniej9.
- Analizuj zebrane dane i wykrywaj związki w chromatogramach. Użyj typowych programów, aby znaleźć i zidentyfikować wszystkie związki wykryte przez instrument (Rysunek 3A). Na przykład użyj funkcji dekonwolucji, aby zidentyfikować związki. Filtruj dane przy użyciu współczynnika rozmiaru okna przechowywania wynoszącego 80, filtrów wysokości masy ≥100 zliczeń i złożonego filtru obszaru bezwzględnego ≥500 zliczeń.
- Stosowanie wzorców chemicznych do identyfikacji związków w próbkach powietrza i oddechu. Wyodrębnij obszar piku jonów podstawowych interesujących związków, takich jak izopren i β-pinen (Rysunek 4), i porównaj poziomy substancji lotnych w oddechu i powietrzu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W naszym badaniu pobrano próbki wydychanego powietrza od 10 dzieci (w wieku 8–17 lat) poddawanych ocenie w St. Louis Children's Hospital. Próbki wydychanego powietrza oraz próbki powietrza otoczenia (n = 10) pobrano zgodnie z powyższym opisem. Próbki analizowano przy użyciu chromatografii gazowej sprzężonej z kwadrupolowym spektrometrem mas czasu przelotu (GC-QToF-MS) oraz desorpcji termicznej, zgodnie z wcześniejszym opisem9. Po usunięciu zanieczyszczeń t...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Pomimo znacznego postępu w badaniach nad oddechem w ciągu ostatniej dekady, ustandaryzowane praktyki pobierania próbek i analizy substancji lotnych w wydychanym powietrzu pozostają niezdefiniowane10. Głównym powodem tego braku standaryzacji jest różnorodność metod pobierania wydychanego powietrza, które mają bezpośredni wpływ na wynikającą z tego różnorodność chemiczną obecną w każdej próbce wydychanego powietrza. Wydychanie oddechem zawiera szeroką gamę lotnych związków organicznych w bardzo zróż...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Wyrażamy naszą wdzięczność dzieciom i rodzinom ze Szpitala Dziecięcego St Louis, które wzięły udział w tym badaniu. Doceniamy wyjątkowe wysiłki Pani Stacy Postma i Pani Janet Sokolich podczas zbierania oddechu. Praca ta jest wspierana przez St. Louis Children's Hospital Foundation.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Worek oddechowy | SKC | 237-03 | Są to worki 3 L |
| Ustnik kartonowy | Systemy AM | 161902 | 0,86" OD, 2,00" L |
| Rurka o dużej średnicy Cole | Parmer | 95802-11 | Rurka silikonowa, 1/4"ID x 5/16"OD, |
| Nasadki do przechowywania długoterminowego | Markes International | C-CF010 | Mosiężna nasadka do przechowywania ¼ " & Tuleja PTFE, pk 10 |
| Adapter męski | Charlotte Pipe | 2109 | Część 1/3 złącza oddechowego (1/2" Część uniwersalna nr 436-005) |
| Adapter męski (wykonany z teflonu) | Zbudowana | część 3/3 złącza oddechowego (1/4" ID x 1/2" MIP). Ta część została specjalnie obrobiona z prętów wykonanych z dziewiczej pompy teflonowej | |
| SKC | 220-1000TC-C | Pompa kieszonkowaTouch z ładowarką | |
| Rurka o małej średnicy | Supelco | 20533 | Rurki teflonowe L i razy; O.D. & czasy; ID 25 stóp i razy; 1/4 cala (6,35 mm) i czasy; 0,228 cala (5,8 mm) |
| Rurki do desorpcji termicznej | Markes International | C2-CAXX-5314 | Rurka, obojętna, TnxTA/Sulficarb, kond/nakrętka, pk 10 |
| Narzędzie do zamykania/odkręcania rur | Markes International | C-CPLOK | |
| Dwukierunkowy zawór kulowy złącze | Homewerks Worldwide | VBV-P40-E3B | Część 2/3 złącza oddechowego (1/2") |
Bibliografia
- Ahmed, W. M., Lawal, O., Nilsen, T. M., Goodacre, R., Fowler, S. J. Exhaled volatile organic compounds of infection: a systematic review. ACS Infectious Diseases. 3 (10), 695-710 (2017).
- Berna, A. Z., et al. Analysis of breath specimens for biomarkers of Plasmodium falciparum infection. Journal of Infectious Diseases. 212 (7), 1120-1128 (2015).
- Lawal, O., Ahmed, W. M., Nijsen, T. M. E., Goodacre, R., Fowler, S. J. Exhaled breath analysis: a review of 'breath-taking' methods for off-line analysis. Metabolomics. 13 (10), (2017).
- Kang, S., Thomas, C. L. P. How long may a breath sample be stored for at-80 degrees C? A study of the stability of volatile organic compounds trapped onto a mixed Tenax:Carbograph trap adsorbent bed from exhaled breath. Journal of Breath Research. 10 (2), (2016).
- Basanta, M., et al. Non-invasive metabolomic analysis of breath using differential mobility spectrometry in patients with chronic obstructive pulmonary disease and healthy smokers. Analyst. 135 (2), 315-320 (2010).
- Mochalski, P., et al. Blood and breath levels of selected volatile organic compounds in healthy volunteers. Analyst. 138 (7), 2134-2145 (2013).
- Mochalski, P., Wzorek, B., Sliwka, I., Amann, A. Suitability of different polymer bags for storage of volatile sulphur compounds relevant to breath analysis. Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 877 (3), 189-196 (2009).
- Mochalski, P., King, J., Unterkofler, K., Amann, A. Stability of selected volatile breath constituents in Tedlar, Kynar and Flexfilm sampling bags. Analyst. 138 (5), 1405-1418 (2013).
- Schaber, C., et al. Breathprinting reveals malaria-associated biomarkers and mosquito attractants. Journal of Infectious Diseases. 217 (10), 1553-1560 (2018).
- Herbig, J., Beauchamp, J. Towards standardization in the analysis of breath gas volatiles. Journal of Breath Research. 8 (3), (2014).
- Phillips, M., et al. Variation in volatile organic compounds in the breath of normal humans. Journal of Chromatography B. 729 (1-2), 75-88 (1999).
- Eckel, S. P., Baumbach, J., Hauschild, A. C. On the importance of statistics in breath analysis-hope or curse? Journal of Breath Research. 8 (1), (2014).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Przeglądaj więcej artykułów
