Wykorzystanie potoku IDBac MALDI TOF-MS o otwartym kodzie źródłowym do analizy białek mikrobiologicznych i specjalistycznych danych metabolitowych

Summary

IDBac to open-source'owy potok bioinformatyczny oparty na spektrometrii mas, który integruje dane zarówno z nienaruszonych białek, jak i wyspecjalizowanych widm metabolitów, zebrane na materiale komórkowym zeskrobanym z kolonii bakteryjnych. Procedura ta pozwala naukowcom szybko zorganizować setki lub tysiące kolonii bakteryjnych w przypuszczalne grupy taksonomiczne i dalej je różnicować w oparciu o wyspecjalizowaną produkcję metabolitów.

Abstract

Aby zobrazować związek między filogenezą bakteryjną a wyspecjalizowaną produkcją metabolitów kolonii bakteryjnych rosnących na agarze odżywczym, opracowaliśmy IDBac - tanią i wysokoprzepustową metodę laserowej desorpcji/jonizacji spektrometrii mas czasu przelotu wspomaganej matrycą (MALDI-TOF MS). Oprogramowanie IDBac jest przeznaczone dla osób niebędących ekspertami, jest ogólnodostępne i jest w stanie analizować od kilku do tysięcy kolonii bakteryjnych. W tym miejscu przedstawiamy procedury przygotowania kolonii bakteryjnych do analizy MS MALDI-TOF, obsługi instrumentu MS oraz przetwarzania i wizualizacji danych w IDBac. W szczególności instruujemy użytkowników, jak grupować bakterie w dendrogramach na podstawie odcisków palców białek MS i interaktywnie tworzyć sieci asocjacji metabolitów (MAN) na podstawie specjalistycznych danych metabolitowych.

Introduction

Główną przeszkodą dla badaczy zajmujących się badaniem funkcji bakterii jest możliwość szybkiej i jednoczesnej oceny tożsamości taksonomicznej mikroorganizmu i jego zdolności do produkcji wyspecjalizowanych metabolitów. Uniemożliwiło to znaczne postępy w zrozumieniu związku między filogenezą bakteryjną a wyspecjalizowaną produkcją metabolitów u większości bakterii wyizolowanych ze środowiska. Chociaż metody oparte na stwardnieniu rozsianym, które wykorzystują odciski palców białek do grupowania i identyfikacji bakterii, są dobrze opisane^1,2,3,4, badania te były na ogół przeprowadzane na małych grupach izolatów, w sposób specyficzny dla gatunku. Co ważne, informacje na temat wyspecjalizowanej produkcji metabolitów, głównego czynnika wpływającego na funkcjonowanie mikroorganizmów w środowisku, pozostały nieuwzględnione w tych badaniach. Silva et al.⁵ niedawno dostarczyli obszerną historię szczegółowo opisującą niedostateczne wykorzystanie MALDI-TOF MS do analizy wyspecjalizowanych metabolitów i niedobór oprogramowania, które mogłoby złagodzić obecne wąskie gardła w bioinformatyce. Aby zaradzić tym niedociągnięciom, stworzyliśmy IDBac, potok bioinformatyczny, który integruje zarówno tryby liniowe, jak i reflektronowe MALDI-TOF MS⁶. Pozwala to użytkownikom na szybką wizualizację i różnicowanie izolatów bakteryjnych na podstawie odcisków palców zarówno białek, jak i wyspecjalizowanych metabolitów MS.

IDBac jest opłacalny, wysokoprzepustowy i przeznaczony dla laików. Jest ogólnodostępny (chasemc.github.io/IDBac) i wymaga jedynie dostępu do spektrometru mas MALDI-TOF (tryb reflektronowy będzie wymagany do specjalistycznej analizy metabolitów). Przygotowanie próbki opiera się na prostej metodzie "rozszerzonego transferu bezpośredniego"^7,8, a dane są zbierane za pomocą kolejnych akwizycji liniowych i reflektronowych w jednym miejscu docelowym MALDI. Dzięki IDBac możliwa jest analiza przypuszczalnej filogenezy i wyspecjalizowanej produkcji metabolitów setek kolonii w czasie krótszym niż cztery godziny, w tym przygotowanie próbki, akwizycja danych i wizualizacja danych. Daje to znaczną przewagę czasową i kosztową w porównaniu z tradycyjnymi metodami identyfikacji bakterii (takimi jak sekwencjonowanie genów) i analizą wyników metabolicznych (chromatografia cieczowa ze spektrometrią mas [LCMS] i podobne metody chromatograficzne).

Korzystając z danych uzyskanych w analizie liniowej, IDBac wykorzystuje hierarchiczne grupowanie do przedstawienia pokrewieństwa widm białek. Ponieważ widma reprezentują głównie zjonizowane białka rybosomalne, zapewniają one reprezentację różnorodności filogenetycznej obecnej w próbce. Ponadto IDBac wykorzystuje dane w trybie reflektronu do wyświetlania wyspecjalizowanych odcisków palców metabolitów jako sieci asocjacyjnych metabolitów (MAN). MAN to dwuczęściowe sieci, które pozwalają na łatwą wizualizację wspólnej i unikalnej produkcji metabolitów między izolatami bakteryjnymi. Platforma IDBac umożliwia naukowcom analizowanie zarówno danych dotyczących białek, jak i wyspecjalizowanych metabolitów w tandemie, ale także indywidualnie, jeśli pozyskiwany jest tylko jeden typ danych. Co ważne, IDBac przetwarza surowe dane z instrumentów Bruker i Xiamen, a także txt, tab, csv, mzXML i mzML. Eliminuje to konieczność ręcznej konwersji i formatowania zestawów danych oraz znacznie zmniejsza ryzyko błędu użytkownika lub niewłaściwej obsługi danych MS.

Protocol

1. Przygotowanie macierzy MALDI

1. Przygotować 10 mg/ml kwasu klasy MALDI i/lub rekrystalizowanego kwasu α-cyjano-4-hydroksycynamonowego (CHCA) w rozpuszczalnikach klasy MS: 50% acetonitrylu (ACN), 47,5% wody (_H2O), 2,5% kwasu trifluorooctowego (TFA). Przykład: 100 μl roztworu = 50 μl ACN + 47,5 μl H₂O + 2,5 μl TFA + 1 mg CHCA
   1. Przygotować co najmniej 1 μl roztworu matrycowego na plamkę płytki MALDI i wirować lub sonikować aż do uzyskania roztworu (około 5 minut sonikacji lub brak widocznych ciał stałych).
      UWAGA: TFA jest silnym kwasem, z którym należy obchodzić się pod wyciągiem chemicznym podczas noszenia odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej, ponieważ może uszkodzić skórę, oczy i drogi oddechowe w kontakcie lub wdychaniu .
      UWAGA: CHCA jest higroskopijny i wrażliwy na światło i powinien być przechowywany w bursztynowych fiolkach w eksykatorze. Dostępnych jest wiele opcji macierzy MALDI. CHCA jest najczęściej stosowany do profilowania białek bakterii, ale sprawdza się również w specjalistycznej analizie metabolitów. Wybór matrycy zależy od indywidualnych potrzeb użytkownika/eksperymentu.

2. Przygotowanie tarcz MALDI

UWAGA: Zobacz Sauer et al.⁷, aby uzyskać więcej szczegółów.

1. Opłucz płytkę MALDI metanolem (klasy HPLC lub wyższej) i wytrzyj do sucha miękkimi chusteczkami papierowymi. Nie używaj szczotek ściernych do czyszczenia tarcz docelowych, ponieważ może to trwale uszkodzić powierzchnię tarczy docelowej.
2. Przypisz miejsca kalibru białka i wyspecjalizowanych metabolitów. Uporządkuj miejsca kalibracji równomiernie w całej populacji próbki, aby uwzględnić nieregularności płytek MALDI i dryf przyrządu w czasie. Przypisz odpowiednią liczbę miejsc na pożywce/matrycę ślepą do badania; Te plamy będą zawierały tylko pożywkę i matrycę lub tylko matrycę.
3. Za pomocą sterylnej wykałaczki przenieś niewielką porcję kolonii bakteryjnej w odpowiednie miejsce na płytce MALDI. Rozprowadź kolonię bakteryjną równomiernie na miejscu. Plamka powinna wydawać się tak płaska, jak to tylko możliwe.
   UWAGA: Łatwiej będzie spłaszczyć kolonie bakteryjne, które są bardziej śluzowate/amorficzne. W przypadku bardziej sztywnych/stałych kolonii należy unikać pozostawiania widocznych skupisk masy komórkowej w miejscu MALDI (Rysunek 1).

Rycina 1: Tabliczka docelowa MALDI przedstawiająca dwa różne izolaty przed dodaniem kwasu mrówkowego i matrycy MALDI (3 górne plamki - Bacillus sp.; dolne 3 plamki - Streptomyces sp.). W obu przypadkach kolumna 3 oznacza nadmiarową próbkę; kolumna 2 przedstawia odpowiednią ilość próbki; kolumna 1 oznacza niewystarczającą próbkę do analizy MALDI. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Przygotować matrycę/pożywkę kontrolną za pomocą sterylnej wykałaczki do przeniesienia minimalnej ilości agaru/pożywki na odpowiednie miejsce (miejsca) na płytce MALDI.
5. Nałóż 1 μl 70% kwasu mrówkowego klasy spektrometrii mas na każdą plamkę próbki, w tym na plamki kontrolne matrycy. Pozostaw kwas do całkowitego wyschnięcia na powietrzu w dygestoriach chemicznych (około 5 min).
   UWAGA: Kwas mrówkowy jest substancją chemiczną i należy z nim obchodzić się w wyciągach chemicznych. Wdychanie może uszkodzić drogi oddechowe.
6. Dodać 1 μl przygotowanego roztworu matrycy MALDI do każdego miejsca próbki, jak również do plamek kontrolnych matrycy/pożywki. Pozostawić roztwór matrycy do całkowitego wyschnięcia na powietrzu (około 5 minut).
   UWAGA: Możliwe jest przechowywanie płytki w eksykatorze, w ciemności, do czasu, gdy będzie można ją przeanalizować na spektrometrze masowym MALDI-TOF. Dopuszczalny czas przechowywania może się różnić w zależności od stabilności próbki.
7. Dodać kaliber 0,5–1,0 μl do wyznaczonych miejsc kalibracji, a następnie 1 μl roztworu matrycowego MALDI. Odpipetuj powstały roztwór w górę iw dół, aby wymieszać. Poczekaj, aż wszystkie plamki całkowicie wyschną na powietrzu przed wprowadzeniem do spektrometru mas MALDI-TOF.
   UWAGA: Białko i wyspecjalizowane kalibryty metabolitów należy dodać w ciągu 30 minut od analizy MALDI, ponieważ oba są podatne na degradację.

3. Akwizycja danych

UWAGA: Ogólne parametry pozyskiwania danych są wymienione w Tabeli 1.

Rozdział szt. szt. Rozdział szt. szt. szt.

parametr	białko	Wyspecjalizowany metabolit
Start masowy (Da)	Rok 1920	60
Koniec masy (da)	21000	2700
Ugięcie masy (Da)	Rok 1900	50
Zdjęć	500	1000
Częstotliwość (Hz)	Rok 2000	Rok 2000
Rozmiar lasera	duży	Średni
MaxStdDev (ppm)	300	Rozdział 30

Tabela 1.

1. Postępując zgodnie z protokołami specyficznymi dla używanego instrumentu, należy skonfigurować kalibracje zarówno białek, jak i specjalistycznych metabolitów.
2. Przetestuj kilka oddzielnych punktów docelowych, aby określić optymalną moc lasera i wzmocnienie detektora do użycia podczas pozyskiwania widm (będzie się to różnić z dnia na dzień i w zależności od instrumentu).
   UWAGA: Rysunek 2A i Rysunek 3A pokazuje optymalne widma, podczas gdy Rysunek 2D i Rysunek 3D to przykłady widm niskiej jakości.

Rysunek 2: Przykładowe widma białek przedstawiające efekt modyfikacji mocy lasera i wzmocnienia detektora. Jakość widm jest najlepsza w panelu A i maleje, aż do uzyskania niewystarczającej jakości widm w panelach C i D. Podczas gdy widmo w panelu B może skutkować użytecznymi pikami, panel A wyświetla optymalne dane. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Przykładowe wyspecjalizowane widma metabolitów przedstawiające efekt modyfikacji mocy lasera i wzmocnienia detektora. Jakość widm jest najlepsza w panelu A i maleje, aż do uzyskania niewystarczającej jakości widm w panelach C i D. Podczas gdy widmo w panelu B może skutkować użytecznymi pikami, panel A wyświetla optymalne dane. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Pobieraj widma, zapisując widma białek w jednym folderze, a wyspecjalizowane widma metabolitów w drugim, oddzielnym folderze.

4. Czyszczenie tarczy celowniczej MALDI (zaadaptowane z Sauer et al.⁷)

1. Wyjmij płytkę celowniczą MALDI z uchwytu i spłucz acetonem.
2. Umyj nieściernym mydłem w płynie, aby usunąć śladowe ilości białek i lipidów, oraz miękkimi chusteczkami papierowymi/szczoteczką do zębów z miękkim włosiem.
3. Płucz wodą dejonizowaną przez około 2 minuty, aby całkowicie usunąć mydło.
4. Sonikować płytkę docelową w wodzie (klasa HPLC lub wyższa) przez 5 minut.
5. Przepłukać płytkę docelową wodą (klasa HPLC lub wyższa).
6. Przepłukać płytkę docelową metanolem (klasa HPLC lub wyższa).

5. Instalacja oprogramowania IDBac

1. Pobierz oprogramowanie IDBac.
   UWAGA: Trwałe, wersjonowane kopie zapasowe są również dostępne do pobrania (patrz Spis materiałów).
2. Kliknij dwukrotnie pobrany plik "Install_IDBac.exe", aby uruchomić instalator i postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie.

6. Zaczynając od surowych danych

UWAGA: Szczegółowe wyjaśnienia i instrukcje dotyczące każdego kroku przetwarzania danych są wbudowane w IDBac, jednak główne analizy i interaktywne dane wejściowe są opisane poniżej.

1. Kliknij dwukrotnie skrót IDBac na pulpicie, aby uruchomić IDBac. IDBac otworzy się domyślnie na karcie Wprowadzenie.
2. Użyj przycisku Sprawdź aktualizacje, aby upewnić się, że jest używana najnowsza wersja IDBac (wymaga dostępu do Internetu). Jeśli dostępna jest nowsza wersja, IDBac automatycznie pobierze i zainstaluje aktualizację, po czym IDBac poprosi o ponowne uruchomienie.
3. Kliknij kartę Zaczynając od surowych danych i wybierz z menu typ danych, które mają być używane z IDBac; kontynuuj, postępując zgodnie z instrukcjami w aplikacji.
4. Podczas konfigurowania konwersji i przetwarzania plików danych wprowadź opisową nazwę eksperymentu w miejscu, w którym zostanie wyświetlony monit (patrz Rysunek 4). Eksperymenty będą później wyświetlane alfabetycznie, więc pomocną strategią jest rozpoczynanie nazw eksperymentów od atrybutu grupy (np. "bacillus-trials_experiment-1"; "bacillus-trials_experiment-2").

Rysunek 4: Etap konwersji i wstępnego przetwarzania danych IDBac. IDBac konwertuje surowe widma na otwarty format mzML i przechowuje mzML, listy pików i informacje o próbkach w bazie danych dla każdego eksperymentu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

7. Praca z poprzednimi eksperymentami

1. Po przekonwertowaniu plików i przetworzeniu ich za pomocą IDBac lub w dowolnym momencie, gdy ktoś chce ponownie przeanalizować eksperyment, przejdź do strony Praca z poprzednimi eksperymentami i wybierz eksperyment do pracy (Rysunek 5).

Rysunek 5: Strona "Praca z poprzednimi eksperymentami". Na stronie IDBac "Praca z poprzednimi eksperymentami" wybierz eksperyment do przeanalizowania lub zmodyfikowania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. (Opcjonalnie) Dodaj informacje o próbkach za pomocą menu Kliknij tutaj, aby zmodyfikować wybrany eksperyment. Wprowadź informacje do automatycznie wypełnionego arkusza kalkulacyjnego i naciśnij Zapisz (Rysunek 6). Opcja ta pozwala użytkownikowi na oznaczanie danych kolorami podczas analiz.

Rysunek 6: Wprowadzanie przykładowych informacji. Na stronie "Praca z poprzednimi eksperymentami" użytkownicy mogą wprowadzać informacje o próbkach, takie jak tożsamość taksonomiczna, lokalizacja pobrania, warunki izolacji itp. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

3. (Opcjonalnie) Przenieś wszystkie lub podzbiór próbek do nowego lub innego eksperymentu, klikając Przenieś próbki z poprzednich eksperymentów do nowych/innych eksperymentów i postępując zgodnie z podanymi instrukcjami (Rysunek 7).

Rysunek 7: Przesyłanie danych. Na stronie "Praca z poprzednimi eksperymentami" znajduje się opcja przenoszenia danych między istniejącymi eksperymentami i do nowych eksperymentów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Gdy wszystko będzie gotowe do rozpoczęcia analizy, upewnij się, że wybrano eksperyment, z którym chcesz pracować. Wybierz opcję Analiza danych białkowych lub Analiza danych małych cząsteczek.

8. Ustawianie analizy danych białkowych i tworzenie wykresów lustrzanych

1. Jeśli analizujesz dane dotyczące białek, najpierw przejdź do strony Analiza danych dotyczących białek. Wybierz ustawienia wybierania pików i oceń widma białek w próbkach za pomocą wyświetlanych wykresów lustrzanych (Rysunek 8).
   UWAGA: Na wykresach lustrzanych czerwony pik oznacza obecność tego piku tylko w górnym spektrum, podczas gdy niebieskie piki reprezentują te występujące w obu widmach.

Rysunek 8: Wybieranie sposobu zachowywania pików na potrzeby analizy. Po wybraniu eksperymentu do analizy, odwiedzenie strony "Analiza danych białkowych", a następnie otwarcie menu "Wybierz sposób zachowywania pików do analizy" pozwala użytkownikom wybrać ustawienia, takie jak stosunek sygnału do szumu w celu zachowania szczytów. Wyświetlany wykres lustrzany (lub dendrogram) zostanie automatycznie zaktualizowany, aby odzwierciedlić wybrane ustawienia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Należy skorygować odsetek kontrprób, w których musi występować pik, aby mógł on zostać uwzględniony w analizach (np. jeżeli próg jest ustawiony na 70 %, a pik występuje w co najmniej 7 z 10 powtórzeń, zostanie on uwzględniony).
3. Korzystając z wykresów lustrzanych jako wskazówek wizualnych, dostosuj sygnał do odcięcia szumu, który zachowuje najwięcej "prawdziwych" pików i najmniej szumów, zauważając, że więcej powtórzeń i wyższa wartość "procentowej obecności szczytu" pozwoli na wybór niższego odcięcia sygnału do szumu.
4. Określ dolną i górną granicę odcięcia m/z, dyktując zakres wartości masy w każdym widmie, które mają być wykorzystane w dalszych analizach przez IDBac.

9. Grupowanie próbek na podstawie danych o białkach

1. Na stronie Analiza danych białkowych wybierz kartę Dendrogram . Pozwala to na grupowanie próbek w dendrogram zgodnie z wybranymi przez użytkownika miarami odległości i algorytmami grupowania.
2. Kliknij opcję Wybierz próbki w menu i postępuj zgodnie z instrukcjami, aby wybrać próbki, które mają zostać uwzględnione w analizach. Tylko próbki zawierające widma białek będą wyświetlane w polu Dostępne próbki (Rysunek 9).

Rysunek 9: Wybierz próbki z wybranego eksperymentu, które mają zostać włączone do wyświetlanego dendrogramu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Użyj wartości domyślnych lub, w obszarze Wybierz ustawienia klastrowania, wybierz żądane algorytmy odległości i grupowania, które mają zostać zastosowane do generowania dendrogramu.
4. Wybierz opcję Obecność/Brak jako dane wejściowe. Alternatywnie, jeśli masz pewność co do wysokości pików próbek (np. po przeprowadzeniu badania w celu oceny zmienności intensywności piku), wybierz Intensywności jako dane wejściowe.
   UWAGA: W momencie publikacji IDBac zapewnia elastyczność w ustawieniach klastrowania, polegając na tym, że użytkownicy wybierają odpowiednie kombinacje. Jeśli nie jesteś zaznajomiony z tymi opcjami, sugeruje się sparowanie A: odległości "cosinusowej" i grupowania "średniej (UPGMA)"; lub B: odległość "euklidesowa" i grupowanie "Ward.D2".
5. Aby wyświetlić wartości bootstrap w dendrogramie, wprowadź liczbę z zakresu od 2 do 1000 w polu Bootstraps.
6. Podczas raportowania wyników skopiuj tekst z akapitu Sugestie dotyczące raportowania analizy białek. Zapewnia to ustawienia zdefiniowane przez użytkownika, które wygenerowały określony dendrogram.

10. Dostosowywanie dendrogramu białkowego

1. Aby rozpocząć dostosowywanie dendrogramu, otwórz menu Dostosuj dendrogram (Rysunek 10).

Rysunek 10: Wyreguluj dendrogram. IDBac udostępnia kilka opcji modyfikacji wyglądu dendrogramu, które można znaleźć w menu "Dostosuj dendrogram". Obejmuje to kolorowanie gałęzi i etykiet za pomocą k-means lub poprzez "cięcie" dendrogramu na wysokości podanej przez użytkownika. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Aby pokolorować linie i/lub etykiety dendrogramu, wybierz odpowiedni przycisk: Kliknij, aby zmodyfikować linie lub Kliknij, aby zmodyfikować etykiety i wybierz żądane opcje.
3. Aby wykreślić informacje z arkusza kalkulacyjnego obok dendrogramu (patrz krok 7.2), wybierz przycisk Uwzględnij informacje o próbkach. Spowoduje to otwarcie panelu, w którym kategoria (kolumna w arkuszu kalkulacyjnym) zostanie automatycznie wypełniona na podstawie wprowadzonych wartości (Rysunek 11).

Rysunek 11: Uwzględnij informacje o próbkach. W menu "Dostosuj dendrogram" znajduje się opcja "Uwzględnij informacje o próbkach". Wybranie tej opcji pozwoli na wykreślenie informacji o próbkach obok dendrogramu. Przykładowe informacje są wprowadzane na stronie "Praca z poprzednimi eksperymentami". Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

11. Wstaw próbki z oddzielnego eksperymentu do dendrogramu

1. Aby wstawić próbki z innego eksperymentu, wybierz przycisk menu Wstaw próbki z innego eksperymentu. Postępuj zgodnie ze wskazówkami w nowo otwartym panelu (Rysunek 12).

Rysunek 12: Wstawianie próbek z menu Inny eksperyment. Czasami pomocne jest porównanie próbek z innego eksperymentu. Użyj menu "Wstaw próbki z innego eksperymentu", aby wybrać próbki, które mają zostać uwzględnione w aktualnie wyświetlanym dendrogramie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

12. Analiza specjalistycznych danych o metabolitach i sieciach asocjacyjnych metabolitów (MANs)

1. Przejdź do strony Sieć asocjacji metabolitów (małe cząsteczki). Ta strona umożliwia wizualizację danych za pomocą analizy głównych składowych (PCA) i MAN, które wykorzystują sieci dwudzielne do wyświetlania korelacji wartości małych cząsteczek m/z z próbkami.
2. Jeśli utworzono dendrogram białkowy (punkt 9), zostanie on również wyświetlony na tej stronie. Kliknij i przeciągnij na dendrogramie, aby podświetlić wybrane próbki do analizy. Jeśli żadna próbka nie jest wyróżniona lub nie utworzono dendrogramu białkowego, pojawi się MAN z losowego podzbioru lub wszystkich próbek, z szacunkiem (Rysunek 13).

Rysunek 13: Analiza danych dotyczących małych cząsteczek". Jeśli dendrogram został utworzony na podstawie widm białek, zostanie on wyświetlony na stronie "Analiza danych małych cząsteczek". Na tej stronie zostaną również wyświetlone sieci skojarzeń metabolitów (MAN) i analiza podstawowych składników (PCA) dla danych o małych cząsteczkach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Aby odjąć ślepą próbę matrycy/nośnika w programie MAN, otwórz menu Wybierz próbkę do odjęcia i wybierz odpowiednią próbkę, która ma być używana jako ślepa próba.
4. Otwórz menu Pokaż/Ukryj Ustawienia MAN, aby wybrać żądane wartości procentowej obecności piku w powtórzeniach, sygnału do szumu oraz górnych i dolnych granic masy, tak jak to zrobiono dla widm białek w sekcji 9. Użyj wykresów lustrzanych małych cząsteczek, aby pokierować wyborem tych ustawień.
5. Wybierz opcję "Pobierz bieżące dane sieciowe", aby zapisać dane aktualnie wyświetlanego urządzenia MAN. Dane te mogą być używane w oprogramowaniu do analizy sieci innym niż IDBac.
6. Aby uzyskać wyniki raportowania, skopiuj tekst w akapicie Sugestie dotyczące raportowania analizy MAN. W ten sposób można uzyskać zdefiniowane przez użytkownika ustawienia używane do generowania utworzonego MAN.

13. Udostępnianie danych

1. Każdy "eksperyment" IDBac jest zapisywany jako pojedyncza baza danych SQLite. Zawiera przekonwertowane surowe widma mzML, wykryte piki i wszystkie informacje wejściowe użytkownika o próbkach. W związku z tym, aby udostępnić eksperyment IDBac, po prostu udostępnij plik SQlite o takiej samej nazwie jak eksperyment (lokalizacja pliku jest wyświetlana na stronie Praca z poprzednimi eksperymentami).

Results

Przeanalizowaliśmy sześć szczepów Micromonospora chokoriensis i dwa szczepy Bacillus subtilis, które wcześniej zostały scharakteryzowane⁶, korzystając z danych dostępnych pod adresem DOI: 10.5281/zenodo.2574096. Postępując zgodnie ze wskazówkami na karcie Rozpoczynanie od nieprzetworzonych danych, wybraliśmy opcję Kliknij tutaj, aby przekonwertować pliki Bruker i postępowaliśmy zgodnie z instrukcjami dostarczonymi przez IDBac dla każdego zestawu danych (Rysunek 14).

Po zakończeniu etapów automatycznej konwersji i wstępnego przetwarzania/szczytowania, przystąpiliśmy do tworzenia nowego połączonego eksperymentu IDBac, przenosząc próbki z dwóch eksperymentów do jednego eksperymentu zawierającego zarówno próbki Bacillus, jak i Micromonosopora (Rysunek 15). Uzyskana analiza polegała na porównaniu widm białek za pomocą wykresów lustrzanych, jak pokazano na rysunku Rysunek 16, co było przydatne do oceny jakości widm i dostosowywania ustawień wybierania pików. Rysunek 17 wyświetla zrzut ekranu z wynikami grupowania białek z wybranymi ustawieniami domyślnymi. Dendrogram został pokolorowany poprzez dostosowanie progu na działce (pojawia się jako przerywana linia). Na uwagę zasługuje wyraźny podział między rodzajami, przy czym zarówno izolaty M. chokoriensis, jak i B. subtilis grupują się oddzielnie.

Rysunek 18, Rysunek 19, oraz Rysunek 20 podkreślają możliwość generowania MAN-ów wybranych przez użytkownika regionów poprzez kliknięcie i przeciągnięcie w poprzek dendrogramu białkowego. Dzięki temu byliśmy w stanie szybko stworzyć MAN, aby porównać tylko szczepy B. subtilis (Rysunek 18), tylko szczepy M. chokoriensis (Rysunek 19) i wszystkie szczepy jednocześnie (Rysunek 20). Podstawową funkcją tych sieci jest zapewnienie naukowcom szerokiego przeglądu stopnia nakładania się wyspecjalizowanych metabolitów między bakteriami. Dysponując tymi danymi, naukowcy są teraz w stanie podejmować świadome decyzje na podstawie zaledwie niewielkiej ilości materiału pobranego z kolonii bakteryjnej.

Rysunek 14: Przetwarzanie widm.Pobrane widma Bruker autoFlex zostały przekonwertowane i przetworzone przy użyciu IDBac. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 15: Połączony eksperyment IDBac. Ponieważ widma Micromonospora i Bacillus zebrano na różnych płytkach docelowych MALDI, oba eksperymenty połączono następnie w jeden eksperyment - "Bacillus_Micromonsopora". Zostało to zrobione w zakładce "Praca z poprzednimi eksperymentami", postępując zgodnie ze wskazówkami w menu "Przenieś próbki z poprzednich eksperymentów do nowych/innych eksperymentów". Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 16: Porównanie. Widma Micromonspora i Bacillus porównano za pomocą wykresów lustrzanych na stronie "Analiza danych białkowych". Ostatecznie wybrano domyślne ustawienia szczytów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 17: Grupowanie hierarchiczne. Grupowanie hierarchiczne, przy użyciu ustawień domyślnych, poprawnie pogrupowane izolaty Bacillus i Micromonospora. Dendrogram był barwiony przez "cięcie" dendrogramu na dowolnej wysokości (wyświetlanej jako linia przerywana) i 100 pasków do butów, aby pokazać pewność rozgałęziania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 18: MAN utworzony przez selekcję szczepów Bacillus sp. z białka dendrogram wykazał zróżnicowaną produkcję wyspecjalizowanych metabolitów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 19: MAN utworzony przez wybór sześciu szczepów Micromonospora sp. z białka dendrogram wykazał zróżnicowaną produkcję wyspecjalizowanych metabolitów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 20: MAN szczepów Bacillus sp. i Micromonospora sp. wykazujących zróżnicowaną produkcję wyspecjalizowanych metabolitów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

Protokół IDBac szczegółowo opisuje gromadzenie i analizę danych dotyczących białek bakteryjnych i wyspecjalizowanych metabolitów nawet 384 izolatów bakteryjnych w ciągu 4 godzin przez jednego badacza. Dzięki IDBac nie ma potrzeby ekstrakcji DNA z izolatów bakteryjnych ani generowania specjalistycznych ekstraktów metabolitowych z płynnych bulionów fermentacyjnych i analizowania ich za pomocą metod chromatograficznych. Zamiast tego dane dotyczące białek i wyspecjalizowanych metabolitów są gromadzone poprzez proste rozprowadzenie materiału z kolonii bakteryjnych bezpośrednio na płytce docelowej MALDI. To znacznie skraca czas i koszty związane z alternatywnymi technikami, takimi jak sekwencjonowanie genu 16S rRNA i LCMS⁹.

Ważne jest, aby dodać ślepą próbę matrycy i punkty kalibracyjne do płytki MALDI i zalecamy użycie odpowiedniej liczby powtórzeń w celu zapewnienia odtwarzalności i pewności statystycznej. Liczba powtórzeń będzie zależała od eksperymentu. Na przykład, jeśli użytkownik zamierza odróżnić tysiące kolonii od zbioru płytek różnorodności środowiskowej, może być konieczna mniejsza liczba powtórzeń (nasze laboratorium zbiera trzy kontrpróby techniczne na kolonię). Alternatywnie, jeśli użytkownik chce utworzyć niestandardową bazę danych szczepów z określonych taksonów bakteryjnych w celu szybkiego określenia klasyfikacji podgatunków nieznanych izolatów, wówczas odpowiednie jest więcej powtórzeń (nasze laboratorium zbiera osiem powtórzeń biologicznych na szczep).

IDBac to narzędzie do szybkiego różnicowania wysoce powiązanych izolatów bakteryjnych w oparciu o przypuszczalne informacje taksonomiczne i wyspecjalizowaną produkcję metabolitów. Może uzupełniać lub służyć jako prekursor metod ortogonalnych, takich jak dogłębne analizy genetyczne, badania dotyczące produkcji i funkcji metabolitów lub charakterystyka wyspecjalizowanej struktury metabolitów za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego i/lub LC-MS/MS.

Wyspecjalizowana produkcja metabolitów (IDBac MANs) jest wysoce podatna na warunki rozwoju bakterii, zwłaszcza przy użyciu różnych pożywek, co stanowi potencjalne ograniczenie metody. Jednak cechy te mogą być wykorzystane przez użytkownika, ponieważ IDBac może łatwo generować MAN pokazujące różnice w wyspecjalizowanej produkcji metabolitów w różnych warunkach wzrostu. Ważne jest, aby zauważyć, że podczas gdy wyspecjalizowane odciski palców metabolitów mogą się różnić w zależności od warunków wzrostu, wcześniej wykazaliśmy, że odciski palców białek pozostają stosunkowo stabilne w odniesieniu do tych zmiennych (patrz Clark i ^wsp.6). W przypadku płytek różnorodności środowiskowej zalecamy oczyszczenie izolatów bakteryjnych przed analizą, aby zmniejszyć możliwy wpływ sąsiednich przesłuchów bakteryjnych.

Wreszcie, brak przeszukiwalnej publicznej bazy danych odcisków palców białek MS jest poważnym mankamentem w stosowaniu tej metody do klasyfikowania nieznanych bakterii środowiskowych. Mając to na uwadze, stworzyliśmy IDBac i uwzględniliśmy automatyczną konwersję danych do akceptowanego przez społeczność formatu open source (mzML)10,11,12 oraz zaprojektowaliśmy oprogramowanie umożliwiające wyszukiwanie, udostępnianie i tworzenie niestandardowych baz danych. Jesteśmy w trakcie tworzenia dużej publicznej bazy danych (>10 000 w pełni scharakteryzowanych szczepów), która pozwoli na klasyfikację niektórych izolatów do poziomu gatunku, w tym linki do numerów akcesyjnych GenBank, jeśli będą dostępne.

IDBac jest oprogramowaniem typu open source, a kod jest dostępny dla każdego, kto może dostosować swoje potrzeby w zakresie analizy i wizualizacji danych. Zalecamy, aby użytkownicy zapoznali się z obszerną literaturą (Sauer i ^wsp.7, Silva i wsp.5), aby pomóc w opracowaniu i opracowaniu celów eksperymentalnych. Udostępniamy forum dyskusyjne pod adresem: https://groups.google.com/forum/#!forum/idbac oraz sposób zgłaszania problemów z oprogramowaniem pod adresem: https://github.com/chasemc/IDBacApp/issues.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitryl	Fisher	60-002-65	LC-MS Ultra CHROMASOLV
Auto Speed LEF Przyrząd MALDI-TOF	Bruker Daltonics
Bruker Daltonics Standard testu bakteryjnego	Fisher	NC0884024	Bruker Daltonics 8604530
Wzorzec kalibracji peptydów Bruker	Fisher	NC9846988	Bruker Daltonics 8206195
Formid Acid	Fisher Chemical	A117-50	99,5 +%, Optima LC/MS Grade
MALDI-TOF Tarcza docelowa	Bruker Daltonics
Methanol	Fisher Chemical	A456-500	Optima LC/MS Grade
Wykałaczki			dowolne jest ok
Kwas trifluorooctowy	Fisher	AC293810010	99,5%, do biochemii, ACROS Organics
Water	VWR	7732-18-5	LC-MS
α-Kwas cyjano-4-hydroksycynamonowy	Sigma	28166-41-8	(C2020-25G) ≥ 98% (TLC), proszek