IDBac to open-source'owy potok bioinformatyczny oparty na spektrometrii mas, który integruje dane zarówno z nienaruszonych białek, jak i wyspecjalizowanych widm metabolitów, zebrane na materiale komórkowym zeskrobanym z kolonii bakteryjnych. Procedura ta pozwala naukowcom szybko zorganizować setki lub tysiące kolonii bakteryjnych w przypuszczalne grupy taksonomiczne i dalej je różnicować w oparciu o wyspecjalizowaną produkcję metabolitów.
Artykuł metodologiczny
Wykorzystanie potoku IDBac MALDI TOF-MS o otwartym kodzie źródłowym do analizy białek mikrobiologicznych i specjalistycznych danych metabolitowych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Aby zobrazować związek między filogenezą bakteryjną a wyspecjalizowaną produkcją metabolitów kolonii bakteryjnych rosnących na agarze odżywczym, opracowaliśmy IDBac - tanią i wysokoprzepustową metodę laserowej desorpcji/jonizacji spektrometrii mas czasu przelotu wspomaganej matrycą (MALDI-TOF MS). Oprogramowanie IDBac jest przeznaczone dla osób niebędących ekspertami, jest ogólnodostępne i jest w stanie analizować od kilku do tysięcy kolonii bakteryjnych. W tym miejscu przedstawiamy procedury przygotowania kolonii bakteryjnych do analizy MS MALDI-TOF, obsługi instrumentu MS oraz przetwarzania i wizualizacji danych w IDBac. W szczególności instruujemy użytkowników, jak grupować bakterie w dendrogramach na podstawie odcisków palców białek MS i interaktywnie tworzyć sieci asocjacji metabolitów (MAN) na podstawie specjalistycznych danych metabolitowych.
Wprowadzenie
Główną przeszkodą dla badaczy zajmujących się badaniem funkcji bakterii jest możliwość szybkiej i jednoczesnej oceny tożsamości taksonomicznej mikroorganizmu i jego zdolności do produkcji wyspecjalizowanych metabolitów. Uniemożliwiło to znaczne postępy w zrozumieniu związku między filogenezą bakteryjną a wyspecjalizowaną produkcją metabolitów u większości bakterii wyizolowanych ze środowiska. Chociaż metody oparte na stwardnieniu rozsianym, które wykorzystują odciski palców białek do grupowania i identyfikacji bakterii, są dobrze opisane1,2,3,4, badania te były na ogół przeprowadzane na małych grupach izolatów, w sposób specyficzny dla gatunku. Co ważne, informacje na temat wyspecjalizowanej produkcji metabolitów, głównego czynnika wpływającego na funkcjonowanie mikroorganizmów w środowisku, pozostały nieuwzględnione w tych badaniach. Silva et al.5 niedawno dostarczyli obszerną historię szczegółowo opisującą niedostateczne wykorzystanie MALDI-TOF MS do analizy wyspecjalizowanych metabolitów i niedobór oprogramowania, które mogłoby złagodzić obecne wąskie gardła w bioinformatyce. Aby zaradzić tym niedociągnięciom, stworzyliśmy IDBac, potok bioinformatyczny, który integruje zarówno tryby liniowe, jak i reflektronowe MALDI-TOF MS6. Pozwala to użytkownikom na szybką wizualizację i różnicowanie izolatów bakteryjnych na podstawie odcisków palców zarówno białek, jak i wyspecjalizowanych metabolitów MS.
IDBac jest opłacalny, wysokoprzepustowy i przeznaczony dla laików. Jest ogólnodostępny (chasemc.github.io/IDBac) i wymaga jedynie dostępu do spektrometru mas MALDI-TOF (tryb reflektronowy będzie wymagany do specjalistycznej analizy metabolitów). Przygotowanie próbki opiera się na prostej metodzie "rozszerzonego transferu bezpośredniego"7,8, a dane są zbierane za pomocą kolejnych akwizycji liniowych i reflektronowych w jednym miejscu docelowym MALDI. Dzięki IDBac możliwa jest analiza przypuszczalnej filogenezy i wyspecjalizowanej produkcji metabolitów setek kolonii w czasie krótszym niż cztery godziny, w tym przygotowanie próbki, akwizycja danych i wizualizacja danych. Daje to znaczną przewagę czasową i kosztową w porównaniu z tradycyjnymi metodami identyfikacji bakterii (takimi jak sekwencjonowanie genów) i analizą wyników metabolicznych (chromatografia cieczowa ze spektrometrią mas [LCMS] i podobne metody chromatograficzne).
Korzystając z danych uzyskanych w analizie liniowej, IDBac wykorzystuje hierarchiczne grupowanie do przedstawienia pokrewieństwa widm białek. Ponieważ widma reprezentują głównie zjonizowane białka rybosomalne, zapewniają one reprezentację różnorodności filogenetycznej obecnej w próbce. Ponadto IDBac wykorzystuje dane w trybie reflektronu do wyświetlania wyspecjalizowanych odcisków palców metabolitów jako sieci asocjacyjnych metabolitów (MAN). MAN to dwuczęściowe sieci, które pozwalają na łatwą wizualizację wspólnej i unikalnej produkcji metabolitów między izolatami bakteryjnymi. Platforma IDBac umożliwia naukowcom analizowanie zarówno danych dotyczących białek, jak i wyspecjalizowanych metabolitów w tandemie, ale także indywidualnie, jeśli pozyskiwany jest tylko jeden typ danych. Co ważne, IDBac przetwarza surowe dane z instrumentów Bruker i Xiamen, a także txt, tab, csv, mzXML i mzML. Eliminuje to konieczność ręcznej konwersji i formatowania zestawów danych oraz znacznie zmniejsza ryzyko błędu użytkownika lub niewłaściwej obsługi danych MS.
Protokół
1. Przygotowanie matrycy MALDI
- Przygotować roztwór kwasu α-cyjno-4-hydroksycynamonowego (CHCA) o stężeniu 10 mg/mL, klasy MALDI i/lub rekrystalizowany, w rozpuszczalnikach klasy MS: 50% acetonitrylu (ACN), 47,5% wody (H2O), 2,5% kwasu trifluorooctowego (TFA). Przykład: 100 µL roztworu = 50 µL ACN + 47,5 µL H2O + 2,5 µL TFA + 1 mg CHCA
- Przygotować co najmniej 1 µL roztworu matrycy na każdy punkt na płytce MALDI, a następnie mieszać w wirówce (vortex) lub poddać sonikacji do całkowitego rozpuszczenia (około 5 min sonikacji lub do momentu braku widocznych cząstek stałych).
OSTROŻNIE: TFA jest silnym kwasem, z którym należy pracować w wyciągu chemicznym, stosując odpowiednie środki ochrony indywidualnej, ponieważ kontakt z nim lub jego wdychanie może uszkodzić skórę, oczy i drogi oddechowe.
UWAGA: CHCA jest higroskopijny i wrażliwy na światło, dlatego należy go przechowywać w bursztynowych fiolkach w eksykatorze. Dostępnych jest wiele rodzajów matryc MALDI. CHCA jest najczęściej stosowany do profilowania białek bakterii, ale sprawdza się również w wyspecjalizowanej analizie metabolitów. Wybór matrycy zależy od indywidualnych potrzeb użytkownika lub eksperymentu.
- Przygotować co najmniej 1 µL roztworu matrycy na każdy punkt na płytce MALDI, a następnie mieszać w wirówce (vortex) lub poddać sonikacji do całkowitego rozpuszczenia (około 5 min sonikacji lub do momentu braku widocznych cząstek stałych).
2. Przygotowanie płytek docelowych do analizy MALDI
UWAGA: Więcej szczegółów znajduje się w pracy Sauer et al.7.
- Przepłucz płytkę MALDI metanolem (klasy HPLC lub wyższej) i wytrzyj do sucha miękkimi ręcznikami papierowymi. Podczas czyszczenia płytek docelowych nie należy używać szczotek ściernych, ponieważ może to trwale uszkodzić powierzchnię płytki.
- Wyznacz miejsca na kalibratory białek i wyspecjalizowanych metabolitów. Rozmieść punkty kalibracyjne równomiernie w obrębie populacji próbek, aby uwzględnić nierównomierności płytki MALDI oraz dryft urządzenia w czasie. Wyznacz odpowiednią liczbę punktów kontrolnych dla pożywki/matrycy (blank); punkty te powinny zawierać wyłącznie pożywkę i matrycę lub samą matrycę.
- Za pomocą sterylnego wykałaczką przenieś niewielką część kolonii bakteryjnej na odpowiednie miejsce na płytce MALDI. Rozprowadź kolonię bakteryjną równomiernie po punkcie. Plamka powinna być jak najbardziej płaska.
UWAGA: Łatwiejsze w spłaszczaniu będą kolonie bakteryjne o charakterze bardziej śluzowatym/amorficznym. W przypadku kolonii bardziej sztywnych/zwartych należy unikać pozostawiania widocznych skupisk masy komórkowej w punkcie MALDI (Rycina 1).
Rysunek 1: Płyta docelowa MALDI przedstawiająca dwa różne izolaty przed dodaniem kwasu mrówkowego i matrycy MALDI (górne 3 punkty – Bacillus sp.; dolne 3 punkty – Streptomyces sp.). W obu przypadkach kolumna 3 reprezentuje nadmiar próbki; kolumna 2 reprezentuje odpowiednią ilość próbki; kolumna 1 reprezentuje niewystarczającą ilość próbki do analizy MALDI. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
- Przygotować kontrolę matrycy/podłoża, przenosząc za pomocą sterylnego wyciora minimalną ilość agaru/podłoża na odpowiednie miejsca na płytce MALDI.
- Nałożyć 1 µL 70% kwasu mrowianego klasy do spektrometrii mas na każde miejsce z próbką, w tym na miejsca kontroli matrycy. Pozostawić kwas do całkowitego wyschnięcia w dygestorze chemicznym (około 5 min).
OSTRZEŻENIE: Kwas mrowiany jest substancją żrącą i powinien być obsługiwany w dygestorach chemicznych. W razie wdychania może uszkodzić drogi oddechowe. - Dodać 1 µL przygotowanego roztworu matrycy MALDI do każdego miejsca z próbką oraz do miejsc kontroli matrycy/podłoża. Pozostawić roztwór matrycy do całkowitego wyschnięcia (około 5 min).
UWAGA: Płytkę można przechowywać w deskrykatorze, w ciemności, do momentu analizy na spektrometrze mas MALDI-TOF. Dopuszczalny czas przechowywania może się różnić w zależności od stabilności próbki. - Dodać 0,5–1,0 µL kalibranta do wyznaczonych miejsc kalibracyjnych, a następnie 1 µL roztworu matrycy MALDI. Przesunąć roztwór pipetą w górę i w dół w celu wymieszania. Pozostawić wszystkie miejsca do całkowitego wyschnięcia przed wprowadzeniem do spektrometru mas MALDI-TOF.
UWAGA: Kalibranty białkowe i wyspecjalizowane kalibranty metabolitów należy dodać w ciągu 30 min przed analizą MALDI, ponieważ oba są podatne na degradację.
3. Pozyskiwanie danych
UWAGA: Ogólne parametry akwizycji danych znajdują się w Tabeli 1.
| Parametr | Białko | Metabolit wyspecjalizowany |
| Masa startowa (Da) | 1920 | 60 |
| Koniec masy (Da) | 21000 | 2700 |
| Ugięcie masy (Da) | 1900 | 50 |
| Ujęcia | 500 | 1000 |
| Częstotliwość (Hz) | 2000 | 2000 |
| Wielkość wiązki lasera | Duży | Pożywka |
| Maks. odchylenie standardowe (ppm) | 300 | 30 |
Tabela 1.
- Zgodnie z protokołami właściwymi dla używanego urządzenia, przygotuj kalibracje zarówno dla białek, jak i wyspecjalizowanych metabolitów.
- Przetestuj kilka oddzielnych punktów docelowych, aby określić optymalną moc lasera oraz wzmocnienie detektora do wykorzystania podczas pozyskiwania widm (parametry te zmieniają się codziennie i zależą od instrumentu).
UWAGA: Rysunek 2A oraz Rysunek 3A przedstawiają widma optymalne, natomiast Rysunek 2D i Rysunek 3D są przykładami widm o niskiej jakości.
Rysunek 2: Przykładowe widma białek obrazujące wpływ modyfikacji mocy lasera i wzmocnienia detektora. Jakość widma jest najlepsza na panelu A i spada, aż do niewystarczającej jakości widm na panelach C oraz D. Chociaż widmo na panelu B może dostarczyć użytecznych pików, panel A prezentuje dane optymalne. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Rysunek 3: Przykładowe widma metabolitów wyspecjalizowanych obrazujące wpływ zmiany mocy lasera i wzmocnienia detektora. Jakość widm jest najwyższa w panelu A i stopniowo spada, aż do niewystarczającej jakości widm w panelach C i D. Choć widmo w panelu B może dostarczać użytecznych pikúw, panel A prezentuje dane optymalne. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
- Należy zebrać widma, zapisując widma białek w jednym folderze, a widma wyspecjalizowanych metabolitów w drugim, osobnym folderze.
4. Czyszczenie płytki docelowej MALDI (adaptacja z Sauer et al.7)
- Wyjąć płytkę docelową MALDI z uchwytu i wypłukać acetonem.
- Umyć nieściernym mydłem w płynie w celu usunięcia śladowych ilości białek i lipidów, używając miękkich ręczników papierowych lub szczoteczki do zębów z miękkim włosiem.
- Płukać wodą dejonizowaną przez około 2 min, aby całkowicie usunąć mydło.
- Poddać płytkę docelową sonikacji w wodzie (klasy HPLC lub wyższej) przez 5 min.
- Wypłukać płytkę docelową wodą (klasy HPLC lub wyższej).
- Wypłukać płytkę docelową metanolem (klasy HPLC lub wyższej).
5. Instalacja oprogramowania IDBac
- Pobierz oprogramowanie IDBac.
UWAGA: Do pobrania dostępne są również trwałe, wersjonowane kopie zapasowe (patrz) Tabela materiałów). - Kliknij dwukrotnie pobrany plik „Install_IDBac.exe”, aby uruchomić instalator, a następnie postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie.
6. Rozpoczęcie od surowych danych
UWAGA: Szczegółowe wyjaśnienia i instrukcje dla każdego kroku przetwarzania danych są zawarte w programie IDBac, jednak główne analizy i interaktywne dane wejściowe zostały opisane poniżej.
- Kliknij dwukrotnie skrót IDBac na pulpicie, aby uruchomić program. Domyślnie IDBac otworzy się na karcie Wprowadzenie (Introduction).
- Użyj przycisku Sprawdź aktualizacje (Check for Updates), aby upewnić się, że używana jest najnowsza wersja IDBac (wymagany dostęp do Internetu). Jeśli dostępna jest nowsza wersja, IDBac automatycznie pobierze i zainstaluje aktualizację, a następnie poprosi o ponowne uruchomienie programu.
- Kliknij kartę Rozpoczęcie pracy z danymi surowymi (Starting with Raw Data) i wybierz z menu typ danych, które mają zostać użyte w IDBac; następnie postępuj zgodnie z instrukcjami w aplikacji.
- Podczas konfiguracji konwersji i przetwarzania plików danych, w wyświetlanym polu wpisz opisową nazwę eksperymentu (patrz Rysunek 4). Eksperymenty będą później wyświetlane w kolejności alfabetycznej, dlatego pomocną strategią jest rozpoczynanie nazw eksperymentów od atrybutu grupy (np. „bacillus-trials_experiment-1”; „bacillus-trials_experiment-2”).
Rycina 4: Etap konwersji i preprocessingu danych w programie IDBac. IDBac konwertuje surowe widma do otwartego formatu mzML i przechowuje pliki mzML, listy pików oraz informacje o próbkach w bazie danych dla każdego eksperymentu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
7. Praca z poprzednimi eksperymentami
- Po konwersji plików i ich przetworzeniu w programie IDBac, lub w dowolnym momencie, gdy chcemy ponownie przeanalizować eksperyment, należy przejść do strony Work with previous experiments i wybrać opcję Select an experiment to work with (Rysunek 5).
Rysunek 5: Strona „Work with Previous Experiments”.Użyj strony „Work with Previous Experiments” w programie IDBac, aby wybrać eksperyment do analizy lub modyfikacji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
- (Opcjonalnie) Dodaj informacje o próbkach za pomocą menu Click here to modify the selected experiment. Wprowadź dane do automatycznie wypełnionej arkusza i naciśnij Save (Rysunek 6). Opcja ta umożliwia użytkownikowi kolorowanie danych podczas analizy.
Rycina 6: Informacje o próbce wejściowej. Na stronie „Work with Previous Experiments” użytkownicy mogą wprowadzać informacje o próbkach, takie jak tożsamość taksonomiczna, miejsce pobrania, warunki izolacji itp. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
- (Opcjonalnie) Przenieś wszystkie lub wybrane próbki do nowego lub innego eksperymentu, klikając Transfer samples from previous experiments to new/other experiments i postępując zgodnie z podanymi instrukcjami (Rysunek 7).
Rycina 7: Transfer danych. Strona „Work with Previous Experiments” zawiera opcję transferu danych pomiędzy istniejącymi eksperymentami a nowymi eksperymentami. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
- Przed rozpoczęciem analizy należy upewnić się, że wybrano odpowiedni eksperyment. Wybierz opcję Protein Data Analysis lub Small Molecule Data Analysis.
8. Konfiguracja analizy danych białkowych i tworzenie wykresów lustrzanych
- W przypadku analizy danych białkowych, najpierw przejdź do strony Analiza danych białkowych. Wybierz ustawienia wyznaczania pików i oceń widma białek próbek za pomocą wyświetlonych wykresów lustrzanych (Rysunek 8).
UWAGA: Na wykresach lustrzanych czerwony pik oznacza obecność tego piku tylko w górnym widmie, natomiast piki niebieskie reprezentują te występujące w obu widmach.
Rycina 8: Wybór sposobu zatrzymywania pików do analizy. Po wybraniu eksperymentu do analizy, przejście na stronę „Protein Data Analysis” i następujące po tym otwarcie menu „Choose how Peaks are Retained for Analysis” pozwala użytkownikom na wybór ustawień, takich jak stosunek sygnału do szumu dla zatrzymywanych pików. Wyświetlony wykres lustrzany (lub dendrogram) zostanie automatycznie zaktualizowany, aby odzwierciedlić wybrane ustawienia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.
- Dostosuj procent powtórzeń, w których musi wystąpić pik, aby został on uwzględniony w analizach (np. jeśli próg zostanie ustawiony na 70% i pik wystąpi w co najmniej 7 z 10 powtórzeń, zostanie on uwzględniony).
- Kierując się wizualnie wykresami lustrzanymi (mirror plots), dostosuj próg stosunku sygnału do szumu tak, aby zachować jak najwięcej „prawdziwych” pików i jak najmniej szumu, pamiętając, że większa liczba powtórzeń i wyższa wartość „procentowej obecności piku” pozwolą na wybór niższego progu stosunku sygnału do szumu.
- Określ dolny i górny próg m/z, który wyznaczy zakres wartości masy w każdym widmie wykorzystywany w dalszych analizach przez program IDBac.
9. Grupowanie próbek z wykorzystaniem danych białkowych
- Na stronie Protein Data Analysis wybierz zakładkę Dendrogram. Pozwala ona na grupowanie próbek w dendrogramie zgodnie z wybranymi przez użytkownika miarami dystansu i algorytmami klastrowania.
- Kliknij Select Samples w menu i postępuj zgodnie z instrukcjami, aby wybrać próbki do włączenia do analiz. W polu Available Samples (Rycyna 9) zostaną wyświetlone tylko te próbki, które zawierają widma białek.
Rycina 9: Wybór próbek z wybranego eksperymentu do uwzględnienia w wyświetlanym dendrogramie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
- Użyj wartości domyślnych lub w sekcji Choose Clustering Settings wybierz odpowiednie algorytmy Distance (odległość) oraz Clustering (klastrowanie), które zostaną zastosowane do wygenerowania dendrogramu.
- Wybierz Presence/Absence (obecność/brak) jako dane wejściowe. Alternatywnie, jeśli wysokość pików w próbkach jest wiarygodna (np. po przeprowadzeniu badania oceniającego zmienność intensywności pików), wybierz Intensities (intensywności) jako dane wejściowe.
UWAGA: W momencie publikacji IDBac oferuje elastyczność w ustawieniach klastrowania, pozostawiając użytkownikowi wybór odpowiednich kombinacji. Jeśli nie znasz tych opcji, sugeruje się sparowanie albo wariantu A: odległość „cosine” i klastrowanie „average (UPGMA)”; albo wariantu B: odległość „Euclidean” i klastrowanie „Ward.D2”. - Aby wyświetlić wartości bootstrap na dendrogramie, wprowadź liczbę od 2 do 1000 w polu Bootstraps.
- Podczas raportowania wyników skopiuj tekst znajdujący się w akapicie Suggestions for Reporting Protein Analysis. Zawiera on zdefiniowane przez użytkownika ustawienia, które posłużyły do wygenerowania konkretnego dendrogramu.
10. Dostosowywanie dendrogramu białek
- Aby rozpocząć dostosowywanie dendrogramu, otwórz menu Adjust the dendrogram (Rysunek 10).
Rysunek 10: Dostosowywanie dendrogramu. IDBac oferuje kilka opcji modyfikacji wyglądu dendrogramu, które można znaleźć w menu „Adjust the Dendrogram”. Obejmują one m.in. kolorowanie gałęzi i etykiet metodą k-średnich lub „cięcie” dendrogramu na określonej przez użytkownika wysokości. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
- Aby pokolorować linie i/lub etykiety dendrogramu, należy wybrać odpowiedni przycisk: Click to modify lines lub Click to modify labels, a następnie wybrać pożądane opcje.
- Aby nanieść informacje z arkusza kalkulacyjnego obok dendrogramu (patrz krok 7.2), należy wybrać przycisk Incorporate info about samples. Otworzy to panel, w którym kategoria (kolumna w arkuszu) zostanie automatycznie wypełniona na podstawie wprowadzonych wartości (Rysunek 11).
Rycina 11: Uwzględnianie informacji o próbkach. W menu „Adjust the Dendrogram” znajduje się opcja „Incorporate info about samples”. Wybranie jej umożliwi wyświetlenie informacji o próbkach obok dendrogramu. Informacje o próbkach wprowadza się na stronie „Work with Previous Experiments”. Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.
11. Wstawienie próbek z oddzielnego eksperymentu do dendrogramu
- Aby wstawić próbki z innego eksperymentu, wybierz przycisk menu Insert Samples from Another Experiment. Postępuj zgodnie z instrukcjami w nowo otwartym panelu (Rysunek 12).
Rysunek 12: Menu Wstaw próbki z innego eksperymentu (Insert Samples from Another Experiment). Czasami pomocne jest porównanie próbek z innego eksperymentu. Użyj menu „Insert Samples from Another Experiment”, aby wybrać próbki, które mają zostać uwzględnione w aktualnie wyświetlanym dendrogramie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
12. Analiza danych o wyspecjalizowanych metabolitach i sieci powiązań metabolicznych (MANs)
- Przejdź do strony Metabolite Association Network (Small-Molecule). Strona ta umożliwia wizualizację danych za pomocą analizy głównych składowych (PCA) oraz sieci MANs, które wykorzystują sieci dwudzielne do wyświetlania korelacji wartości m/z małych cząsteczek z próbkami.
- Jeśli utworzono dendrogram białek (sekcja 9), zostanie on również wyświetlony na tej stronie. Kliknij i przeciągnij kursor po dendrogramie, aby zaznaczyć wybrane próbki interesujące badacza do analizy. Jeśli żadne próbki nie zostaną zaznaczone lub nie utworzono dendrogramu białek, pojawi się MAN losowego podzbioru lub wszystkich próbek, odpowiednio (Rycina 13).
Rysunek 13: Strona „Small Molecule Data Analysis” (Analiza danych o małych cząsteczkach). Jeśli z widm białek utworzono dendrogram, zostanie on wyświetlony na stronie „Small Molecule Data Analysis”. Na tej stronie wyświetlane będą również sieci powiązań metabolitów (MANs) oraz analiza głównych składowych (PCA) dla danych o małych cząsteczkach. Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.
- Aby odjąć próbkę kontrolną matrycy/medium w programie MAN, otwórz menu Select a Sample to Subtract i wybierz odpowiednią próbkę do wykorzystania jako kontrolę.
- Otwórz menu Show/Hide MAN Settings, aby wybrać pożądane wartości dla procentowej obecności piku w powtórzeniach, stosunku sygnału do szumu oraz górnych i dolnych zakresów masy, analogicznie do procedury dla widm białek opisanej w sekcji 9. W celu doboru tych ustawień skorzystaj z lustrzanych wykresów dla małych cząsteczek.
- Wybierz opcję „Download Current Network Data”, aby zapisać dane sieci MAN, która jest obecnie wyświetlana. Dane te mogą być wykorzystane w oprogramowaniu do analizy sieci innym niż IDBac.
- W celu raportowania wyników skopiuj tekst znajdujący się w akapicie Suggestions for Reporting MAN Analysis. Zawiera on zdefiniowane przez użytkownika ustawienia wykorzystane do wygenerowania danej sieci MAN.
13. Udostępnianie danych
- Każdy „eksperyment” w programie IDBac jest zapisywany jako pojedyncza baza danych SQLite. Zawiera ona przetworzone surowe widma mzML, wykryte piki oraz wszystkie wprowadzone przez użytkownika informacje o próbkach. Aby zatem udostępnić eksperyment IDBac, wystarczy przesłać plik SQLite o tej samej nazwie co eksperyment (lokalizacja pliku jest wyświetlana na stronie Working with Previous Experiments).
Wyniki
Przeanalizowaliśmy sześć szczepów Micromonospora chokoriensis i dwa szczepy Bacillus subtilis, które zostały wcześniej scharakteryzowane6, wykorzystując dane dostępne pod adresem DOI: 10.5281/zenodo.2574096. Postępując zgodnie z instrukcjami w zakładce Starting with Raw Data, wybraliśmy opcję Click here to convert Bruker files i zastosowaliśmy instrukcje dostarczone przez IDBac dla każdego zestawu danych (Rysunek 14).
Po zakończeniu automatycznej konwersji oraz etapów preprocessingu i wyznaczania pików (peak-picking), przystąpiono do utworzenia nowego, połączonego eksperymentu IDBac poprzez przeniesienie próbek z dwóch eksperymentów do jednego, zawierającego próbki Bacillus oraz Micromonospora (Rysunek 15). Przeprowadzona analiza polegała na porównaniu widm białek za pomocą wykresów lustrzanych, przedstawionych na Rysunku 16, co było pomocne w ocenie jakości widm i dostosowaniu ustawień wyznaczania pików. Rysunek 17 przedstawia zrzut ekranu z wynikami klastrowania białek przy wybranych ustawieniach domyślnych. Dendrogram został pokolorowany poprzez dostosowanie progu na wykresie (widocznego jako linia przerywana). Należy odnotować wyraźne oddzielenie rodzajów, przy czym izolaty M. chokoriensis i B. subtilis tworzyły osobne klastry.
Rysunek 18, Rysunek 19 oraz Rysunek 20 obrazują możliwość generowania sieci MAN dla wybranych przez użytkownika obszarów poprzez kliknięcie i przeciągnięcie kursora po dendrogramie białek. Dzięki temu mogliśmy szybko tworzyć sieci MAN w celu porównania wyłącznie szczepów B. subtilis (Rysunek 18), wyłącznie szczepów M. chokoriensis (Rysunek 19) oraz wszystkich szczepów jednocześnie (Rysunek 20). Główną funkcją tych sieci jest dostarczenie badaczom szerokiego przeglądu stopnia pokrywania się wyspecjalizowanych metabolitów pomiędzy bakteriami. Dysponując tymi danymi, badacze mogą teraz podejmować świadome decyzje na podstawie zaledwie niewielkiej ilości materiału pobranego z kolonii bakteryjnej.
Rycina 14: Przetwarzanie widm. Pobrane widma Bruker autoFlex zostały przekonwertowane i przetworzone przy użyciu IDBac. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 15: Połączony eksperyment IDBac. Ponieważ widma Micromonospora i Bacillus zostały zebrane na różnych płytkach docelowych MALDI, dwa eksperymenty zostały następnie połączone w jeden eksperyment – „Bacillus_Micromonsopora”. Zostało to wykonane w zakładce „Work with Previous Experiments”, zgodnie z instrukcjami w menu „Transfer samples from previous experiments to new/other experiments”. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 16: Porównanie. Widma Micromonspora i Bacillus porównano za pomocą wykresów lustrzanych na stronie „Protein Data Analysis”. Ostatecznie wybrano domyślne ustawienia piku. Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.
Rysunek 17: Grupowanie hierarchiczne. Grupowanie hierarchiczne, przy użyciu ustawień domyślnych, poprawnie pogrupowało izolaty Bacillus i Micromonospora. Dendrogram został pokolorowany poprzez „cięcie” dendrogramu na dowolnej wysokości (wyświetlonej jako linia przerywana), a 100 powtórzeń bootstrap zastosowano w celu wykazania pewności rozgałęzień. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Rycina 18: MAN stworzony poprzez wybór szczepów Bacillus sp. z dendrogramu białkowego wykazał zróżnicowaną produkcję wyspecjalizowanych metabolitów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 19: Analiza MAN przeprowadzona z wybranymi sześcioma szczepami Micromonospora sp. na podstawie dendrogramu białek wykazała zróżnicowaną produkcję metabolitów wyspecjalizowanych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Rycina 20: Analiza sieciowa (MAN) szczepów Bacillus sp. i Micromonospora sp. wykazująca zróżnicowaną produkcję metabolitów wyspecjalizowanych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Dyskusja
Protokół IDBac szczegółowo opisuje gromadzenie i analizę danych dotyczących białek bakteryjnych i wyspecjalizowanych metabolitów nawet 384 izolatów bakteryjnych w ciągu 4 godzin przez jednego badacza. Dzięki IDBac nie ma potrzeby ekstrakcji DNA z izolatów bakteryjnych ani generowania specjalistycznych ekstraktów metabolitowych z płynnych bulionów fermentacyjnych i analizowania ich za pomocą metod chromatograficznych. Zamiast tego dane dotyczące białek i wyspecjalizowanych metabolitów są gromadzone poprzez proste rozprowadzenie materiału z kolonii bakteryjnych bezpośrednio na płytce docelowej MALDI. To znacznie skraca czas i koszty związane z alternatywnymi technikami, takimi jak sekwencjonowanie genu 16S rRNA i LCMS9.
Ważne jest, aby dodać ślepą próbę matrycy i punkty kalibracyjne do płytki MALDI i zalecamy użycie odpowiedniej liczby powtórzeń w celu zapewnienia odtwarzalności i pewności statystycznej. Liczba powtórzeń będzie zależała od eksperymentu. Na przykład, jeśli użytkownik zamierza odróżnić tysiące kolonii od zbioru płytek różnorodności środowiskowej, może być konieczna mniejsza liczba powtórzeń (nasze laboratorium zbiera trzy kontrpróby techniczne na kolonię). Alternatywnie, jeśli użytkownik chce utworzyć niestandardową bazę danych szczepów z określonych taksonów bakteryjnych w celu szybkiego określenia klasyfikacji podgatunków nieznanych izolatów, wówczas odpowiednie jest więcej powtórzeń (nasze laboratorium zbiera osiem powtórzeń biologicznych na szczep).
IDBac to narzędzie do szybkiego różnicowania wysoce powiązanych izolatów bakteryjnych w oparciu o przypuszczalne informacje taksonomiczne i wyspecjalizowaną produkcję metabolitów. Może uzupełniać lub służyć jako prekursor metod ortogonalnych, takich jak dogłębne analizy genetyczne, badania dotyczące produkcji i funkcji metabolitów lub charakterystyka wyspecjalizowanej struktury metabolitów za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego i/lub LC-MS/MS.
Wyspecjalizowana produkcja metabolitów (IDBac MANs) jest wysoce podatna na warunki rozwoju bakterii, zwłaszcza przy użyciu różnych pożywek, co stanowi potencjalne ograniczenie metody. Jednak cechy te mogą być wykorzystane przez użytkownika, ponieważ IDBac może łatwo generować MAN pokazujące różnice w wyspecjalizowanej produkcji metabolitów w różnych warunkach wzrostu. Ważne jest, aby zauważyć, że podczas gdy wyspecjalizowane odciski palców metabolitów mogą się różnić w zależności od warunków wzrostu, wcześniej wykazaliśmy, że odciski palców białek pozostają stosunkowo stabilne w odniesieniu do tych zmiennych (patrz Clark i wsp.6). W przypadku płytek różnorodności środowiskowej zalecamy oczyszczenie izolatów bakteryjnych przed analizą, aby zmniejszyć możliwy wpływ sąsiednich przesłuchów bakteryjnych.
Wreszcie, brak przeszukiwalnej publicznej bazy danych odcisków palców białek MS jest poważnym mankamentem w stosowaniu tej metody do klasyfikowania nieznanych bakterii środowiskowych. Mając to na uwadze, stworzyliśmy IDBac i uwzględniliśmy automatyczną konwersję danych do akceptowanego przez społeczność formatu open source (mzML)10,11,12 oraz zaprojektowaliśmy oprogramowanie umożliwiające wyszukiwanie, udostępnianie i tworzenie niestandardowych baz danych. Jesteśmy w trakcie tworzenia dużej publicznej bazy danych (>10 000 w pełni scharakteryzowanych szczepów), która pozwoli na klasyfikację niektórych izolatów do poziomu gatunku, w tym linki do numerów akcesyjnych GenBank, jeśli będą dostępne.
IDBac jest oprogramowaniem typu open source, a kod jest dostępny dla każdego, kto może dostosować swoje potrzeby w zakresie analizy i wizualizacji danych. Zalecamy, aby użytkownicy zapoznali się z obszerną literaturą (Sauer i wsp.7, Silva i wsp.5), aby pomóc w opracowaniu i opracowaniu celów eksperymentalnych. Udostępniamy forum dyskusyjne pod adresem: https://groups.google.com/forum/#!forum/idbac oraz sposób zgłaszania problemów z oprogramowaniem pod adresem: https://github.com/chasemc/IDBacApp/issues.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez National Institute of General Medical Sciences Grant R01 GM125943, National Geographic Grant CP-044R-17; Grant Islandzkiego Funduszu Badawczego 152336-051; oraz fundusze start-upowe Uniwersytetu Illinois w Chicago. Dziękujemy również następującym współpracownikom: dr Amandzie Bulman za pomoc w parametrach akwizycji białka MALDI-TOF MS; Dr Terry Moore i dr Atul Jain za rekrystalizację matrycy kwasu alfa-cyjano-4-hydroksycynamonowego (CHCA).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Acetonitryl | Fisher | 60-002-65 | LC-MS Ultra CHROMASOLV |
| Auto Speed LEF Przyrząd MALDI-TOF | Bruker Daltonics | ||
| Bruker Daltonics Standard testu bakteryjnego | Fisher | NC0884024 | Bruker Daltonics 8604530 |
| Wzorzec kalibracji peptydów Bruker | Fisher | NC9846988 | Bruker Daltonics 8206195 |
| Formid Acid | Fisher Chemical | A117-50 | 99,5 +%, Optima LC/MS Grade |
| MALDI-TOF Tarcza docelowa | Bruker Daltonics | ||
| Methanol | Fisher Chemical | A456-500 | Optima LC/MS Grade |
| Wykałaczki | dowolne jest ok | ||
| Kwas trifluorooctowy | Fisher | AC293810010 | 99,5%, do biochemii, ACROS Organics |
| Water | VWR | 7732-18-5 | LC-MS |
| α-Kwas cyjano-4-hydroksycynamonowy | Sigma | 28166-41-8 | (C2020-25G) ≥ 98% (TLC), proszek |
Bibliografia
- Sandrin, T. R., Goldstein, J. E., Schumaker, S. MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level: A review. Mass Spectrometry Reviews. 32 (3), 188-217 (2013).
- Cain, T. C., Lubman, D. M., Weber, W. J., Vertes, A. Differentiation of bacteria using protein profiles from matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 8 (12), 1026-1030 (1994).
- Holland, R. D., Wilkes, J. G., et al. Rapid identification of intact whole bacteria based on spectral patterns using matrix-assisted laser desorption/ionization with time-of-flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 10 (10), 1227-1232 (1996).
- Rahi, P., Prakash, O., Shouche, Y. S. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass-spectrometry (MALDI-TOF MS) based microbial identifications: challenges and scopes for microbial ecologists. Frontiers in Microbiology. 7, 1359(2016).
- Silva, R., Lopes, N. P., Silva, D. B. Application of MALDI mass spectrometry in natural products analysis. Planta Medica. 82, 671-689 (2016).
- Clark, C. M., Costa, M. S., Sanchez, L. M., Murphy, B. T. Coupling MALDI-TOF mass spectrometry protein and specialized metabolite analyses to rapidly discriminate bacterial function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (19), 4981-4986 (2018).
- Freiwald, A., Sauer, S. Phylogenetic classification and identification of bacteria by mass spectrometry. Nature Protocols. 4 (5), 732-742 (2009).
- Schulthess, B., Bloemberg, G. V., Zbinden, R., Böttger, E. C., Hombach, M. Evaluation of the Bruker MALDI Biotyper for identification of Gram-positive rods: development of a diagnostic algorithm for the clinical laboratory. Journal of Clinical Microbiology. 52 (4), 1089-1097 (2014).
- Schumann, P., Maier, T. MALDI-TOF mass spectrometry applied to classification and identification of bacteria. Methods in Microbiology. 41, 275-306 (2014).
- Chambers, M. C., Maclean, B., et al. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).
- Kessner, D., Chambers, M., Burke, R., Agus, D., Mallick, P. ProteoWizard: open source software for rapid proteomics tools development. Bioinformatics. 24 (21), 2534(2008).
- Martens, L., Chambers, M., et al. mzML-a community standard for mass spectrometry data. Molecular & Cellular Proteomics. 10 (1), (2011).
Przedruki i uprawnienia
