Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ocena i charakterystyka naczyń hialoidalnych u myszy

9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59222

⸱

15 maja 2019

 ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, Boston Children's Hospital, Harvard Medical School, 2The Manton Center for Orphan Disease Research, Boston Children's Hospital, Harvard Medical School

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje zarówno metody in vivo, jak i ex vivo, aby w pełni uwidocznić i scharakteryzować naczynia hialoidalne, model regresji naczyniowej w oczach myszy, wykorzystując optyczną koherentną tomografię i angiografię fluoresceinową dna oka do obrazowania na żywo i izolacji ex vivo, a następnie płaskiego montażu hialoidu do analizy ilościowej.

Streszczenie

W oku, embrionalne naczynia hialoidalne odżywiają rozwijającą się soczewkę i siatkówkę i cofają się, gdy rozwijają się naczynia siatkówki. Uporczywą lub nieudaną regresję naczyń szklistych można zaobserwować w chorobach, takich jak przetrwałe przerost pierwotnego ciała szklistego (PHPV), prowadzące do zablokowania drogi światła i upośledzenia funkcji wzrokowych. Zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw regresji naczyń hialoidalnych może prowadzić do nowych badań molekularnych nad procesem regresji naczyniowej i potencjalnych nowych sposobów radzenia sobie z chorobami z przetrwałymi naczyniami szklistymi. Tutaj opisujemy procedury obrazowania hialoidu u żywych myszy za pomocą optycznej koherentnej tomografii (OCT) i angiografii fluoresceinowej dna oka (FFA) oraz szczegółowy protokół techniczny izolacji i płaskiego montażu hialoidu ex vivo do analizy ilościowej. Myszy z nokautem białka 5 związanego z receptorem lipoprotein o niskiej gęstości (LRP5) wykorzystano jako eksperymentalny model trwałych naczyń hialoidalnych, aby zilustrować techniki. Łącznie techniki te mogą ułatwić dokładną ocenę naczyń szklistych jako eksperymentalnego modelu regresji naczyniowej oraz badania nad mechanizmem utrzymywania się naczyń szklistych.

Wprowadzenie

Ukrwienie oka jest niezbędne do zapewnienia prawidłowego rozwoju siatkówki i otaczających tkanek oka oraz do prawidłowego funkcjonowania funkcji widzenia. W oku znajdują się trzy łożyska naczyniowe: naczyniówka siatkówki, naczyniówka i przejściowa embrionalna sieć krążenia naczyń szklistych. Rozwój układu naczyniowego oka wymaga koordynacji przestrzennej i czasowej przez cały okres embriogenezy i dojrzewania tkanek. Spośród trzech łożysk naczyniowych, naczynia hialoidalne są pierwszym funkcjonalnym systemem zaopatrzenia w krew, który dostarcza składniki odżywcze i tlen do nowo powstałej soczewki embrionalnej i rozwijającej się siatkówki. Naczynia hialoidalne cofają się w tym samym czasie, gdy rozwijają się i dojrzewają naczynia krwionośne siatkówki1. Regresja unaczynienia hialoidalnego ma kluczowe znaczenie dla umożliwienia wyraźnej ścieżki wzrokowej dla rozwoju funkcji wzrokowych; Dlatego ten proces regresji naczyniowej jest równie ważny jak wzrost unaczynienia siatkówki. Upośledzona regresja szklistakowa może prowadzić do chorób oczu. Co więcej, regresja naczyń hialoidalnych dostarcza systemu modelowego do badania mechanizmów komórkowych i molekularnych zaangażowanych w regulację regresji naczyniowej, co może mieć wpływ na regulację angiogenną również w innych narządach.

Unaczynienie hialoidalne, pochodzące z tętnicy szklistej (HA), składa się z vasa hyaloidea propria (VHP), tunica vasculosa lentis (TVL) i błony źrenicy (PM). Dostarcza składników odżywczych rozwijającej się siatkówce, pierwotnemu ciału szklistemu i soczewce podczas rozwoju embrionalnego2. Powstający z HA, VHP rozgałęzia się do przodu przez ciało szkliste do soczewki. TVL obejmuje tylną powierzchnię torebki soczewki i łączy się z PM, który łączy się z przednimi tętnicami rzęskowymi, pokrywając przednią powierzchnię soczewki2,3, co powoduje powstanie sieci naczyń w PM3,4,5. Co ciekawe, w unaczynieniu szklistym nie ma żył, a system wykorzystuje żyły naczyniówkowe do wykonania drenażu żylnego.

U ludzkiego embrionu unaczynienie szkliste jest prawie kompletne mniej więcej w dziewiątym tygodniu ciąży i zaczyna się cofać, gdy pojawiają się pierwsze naczynia siatkówkowe, w czwartym miesiącu ciąży2. Począwszy od atrofii VHP, regresji sieci kapilarnych TVL, PM, a na końcu HA następuje następnie2,3. W międzyczasie pierwotne ciało szkliste cofa się i zaczyna tworzyć się wtórne ciało szkliste, złożone ze składników macierzy zewnątrzkomórkowej, w tym włókien kolagenowych. W szóstym miesiącu ciąży pierwotne ciało szkliste zostaje zredukowane do małego przezroczystego kanału rozciągającego się od tarczy nerwu wzrokowego do soczewki, zwanego kanałem Cloqueta lub kanałem szklistym, a wtórne ciało szkliste staje się głównym składnikiem tylnego segmentu2,3. Krążenie szkliste zanika głównie w 35 do 36 tygodniu ciąży, tuż przed urodzeniem3.

W przeciwieństwie do ludzi, u których unaczynienie hialoidalne jest całkowicie cofnięte po urodzeniu, mysi hialoidalny układ naczyniowy zaczyna się cofać po urodzeniu. Gdy siatkówka myszy rodzi się jałowa, a naczynia siatkówki rozwijają się po urodzeniu, naczynia szkliste cofają się jednocześnie od dnia pourodzeniowego (P) 4 i są w większości całkowicie regresywne przez P216 (Rysunek 1). PM znika najpierw między P10 a P12, a VHP znika między P12 a P16, podczas gdy niewielka liczba komórek TVL i HA pozostaje nawet w P16, a przez P21 regresja szklistego układu naczyniowego jest prawie całkowita6. W międzyczasie po urodzeniu zaczyna rozwijać się unaczynienie siatkówki. Powierzchowna warstwa splotu naczyniowego w pełni rozciąga się do siatkówki obwodowej w P7–P8, warstwa głęboka (znajdująca się w zewnętrznej warstwie splotowatej) rozwija się od P7–P12, a wreszcie splot pośredni w wewnętrznej warstwie splotowatej rozwija się między P12 a P157. Wraz z rozwojem unaczynienia siatkówki stopniowo zastępuje funkcję jednocześnie cofających się naczyń szklistych, dostarczając odżywienie i tlen do rozwijającego się oka. Pourodzeniowe występowanie regresji naczyń szklistych u myszy stanowi łatwo dostępny model eksperymentalny do obserwacji i badania unaczynienia hialoidalnego, a także molekularnych podstaw rządzących procesami regresji naczyniowej zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i patologicznych8.

Niepowodzenie regresji hialoidalnej można zaobserwować w chorobach takich jak PHPV, która jest rzadką wrodzoną anomalią rozwojową oka wynikającą z nieudanej lub niepełnej regresji układu naczyniowego embrionalnego, pierwotnego ciała szklistego i szklistego9. Mechanizmy regulujące proces regresji naczyń krwionośnych są skomplikowane i szeroko zbadane. Jednym z głównych szlaków molekularnych niezbędnych do normalnej regresji naczyń hialoidalnych jest szlak sygnałowy Wnt10, ponieważ mutacje genetyczne w tym szlaku, wpływające zarówno na ligand Wnt, jak i receptory, zostały powiązane z PHPV u ludzi9. Badania eksperymentalne zidentyfikowały ligand Wnt, Wnt7b, który jest wytwarzany przez makrofagi wokół naczyń hialoidalnych w rozwijającym się oku, aby pośredniczyć w tym procesie regresji. Wnt7b aktywuje sygnalizację Wnt poprzez wiązanie się z receptorami frizzled4 (FZD4)/LRP5 w sąsiednich komórkach śródbłonka w celu zainicjowania apoptozy komórek, co prowadzi do regresji naczyń hialoidalnych10. W rezultacie, myszy z niedoborem Wnt7b wykazują trwałość naczyń hialoidalnych10. Podobnie, niekonwencjonalny ligand Wnt, Norrin (kodowany przez gen Ndp), również wiąże się z FZD4 / LRP5, aby wywołać regresję naczyń hialoidalnych podczas rozwoju. Myszy Ndpy/-, Lrp5-/- i Fzd4-/- wykazują opóźnioną regresję naczyń hialoidalnych, co potwierdza krytyczną rolę regulacyjną sygnalizacji Wnt11,12,13,14,15,16. Co więcej, inny koreceptor Wnt LRP6 pokrywa się z LRP5 w swojej funkcji modulowania szlaku sygnałowego Wnt w hialoidalnych komórkach śródbłonka naczyń krwionośnych17. Inne czynniki, które mogą również przyczyniać się do regresji kwasu hialoidalnego, obejmują czynnik indukowany hipoksją18,19, czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego20,21, collagen-1822,23, Arf24, angiopoetyna-225 i białko morfogenetyczne kości-426. W tym artykule używamy myszy Lrp5-/- jako modelu trwałych naczyń hialoidalnych, aby zademonstrować techniki oceny i charakterystyki unaczynienia hialoidalnego zarówno metodami in vivo, jak i ex vivo.

Wizualizacja unaczynienia hialoidalnego in vivo i ex vivo jest niezbędna do badania mechanizmów regresji naczyń hialoidalnych. Obecne metody obserwacji unaczynienia hialoidalnego koncentrują się głównie na wizualizacji i analizie VHP i HA, poprzez obrazy OCT i FFA, przekroje poprzeczne oczu i płaskie mocowanie hialoidalne. OCT i FFA to potężne narzędzia do obrazowania in vivo, umożliwiające obserwację podłużną u żywych zwierząt po otwarciu oczu. Co więcej, izolowany płaski uchwyt hialoidalny zapewnia wizualizację całego unaczynienia hialoidalnego i umożliwia osiągnięcie dokładnej kwantyfikacji liczby naczyń. Jednak delikatna i delikatna natura naczyń hialoidalnych oraz wynikające z nich trudności techniczne związane z ich izolacją mogły nieco ograniczyć jego zastosowanie w badaniach oczu10,17,27. W tym artykule przedstawiamy szczegółowy protokół wizualizacji naczyń hialoidalnych, łączący zarówno obrazowanie siatkówki na żywo in vivo, jak i izolowany ex vivo płaski montaż hialoidalny w celu zwiększenia wykonalności tych technik. Protokół ten został zaadaptowany z modyfikacją i rozszerzeniem w stosunku do poprzednich publikacji na temat metody in vivo żywego dna oka i obrazowania OCT28 oraz metody ex vivo izolowanego hialoidu flat mount11.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie zwierzęta były traktowane zgodnie z Oświadczeniem Stowarzyszenia Badań nad Wzrokiem i Okulistyką (ARVO) dotyczącym wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych do eksperymentów na zwierzętach, zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health (NIH) dotyczącymi opieki i wykorzystywania zwierząt do procedur eksperymentalnych oraz przepisami określonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) w Szpitalu Dziecięcym w Bostonie. Lrp5-/- myszy (nr magazynowy 005823; Jackson Laboratory) i jego myszy kontrolne C57BL/6J typu dzikiego (WT) (nr magazynowy 000664; Jackson Laboratory) wykorzystano w tym badaniu.

1. Część I: Obrazowanie in vivo naczyń szklistych za pomocą systemu obrazowania siatkówki gryzoni

  1. Przygotowanie znieczulenia myszy i rozszerzenia źrenicy
    1. Wybierz myszy.
      1. Do obrazowania siatkówki należy używać myszy starszych niż P12 (po otwarciu oczu); odpowiednie są obie płcie.
      2. Zgodnie z życzeniem, wyobraź sobie zmutowane myszy z opóźnioną regresją hialoidalną (i ich kontrole WT) przez całe dorosłe życie. Myszy WT starsze niż 3 tygodnie mogą nie wykazywać wielu wykrywalnych pozostałych naczyń hialoidalnych, dlatego P12-P21 jest idealny do obrazowania pozostałego widocznego hialoidu WT.
    2. Przygotuj mieszaninę ketaminy i ksylazyny do znieczulenia.
      1. Weź 2,3 ml roztworu podstawowego ketaminy (100 mg / ml) i 0,7 ml roztworu podstawowego ksylazyny (20 mg / ml) i dodaj 20 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej (0,9% chlorku sodu), aby uzyskać roztwór roboczy mieszaniny ketaminy / ksylazyny (10 mg / ml ketaminy i 0,6 mg / ml ksylazyny).
    3. Znieczulenie myszy poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie mieszaniny ketaminy/ksylazyny w objętości 8-krotności masy ciała myszy (np. mysz o wadze 20 g potrzebuje 160 μl mieszaniny roztworu roboczego ketaminy/ksylazyny, aby osiągnąć dawkę roboczą ketaminy [80 mg/kg masy ciała] i ksylazyny [4,8 mg/kg masy ciała]).
    4. Nałóż jedną kroplę roztworu leku rozszerzającego źrenice (patrz tabela materiałów) na każde oko, aby rozszerzyć źrenice myszy natychmiast po znieczuleniu.
    5. Oceń poziom znieczulenia za pomocą odruchu pedałowania (mocne uszczypnięcie palca kończyny tylnej). Poczekaj, aż mysz zostanie wystarczająco znieczulona (brak odruchu pedałowania), a jej źrenice zostaną szeroko rozszerzone.
  2. Obrazowanie naczyń szklistych metodą optycznej koherentnej tomografii
    1. Nawilż rogówki myszy sztucznymi łzami, a następnie umieść mysz na stoliku pozycjonującym.
    2. Delikatnie zetknij rogówkę myszy z soczewką sondy OCT. Wyreguluj mysz i sondę tak, aby głowa nerwu wzrokowego znajdowała się w środku pola widzenia na obrazie dna oka, aby kierować obrazowaniem OCT.
      UWAGA: Aby uzyskać więcej informacji na temat ogólnej konfiguracji systemu obrazowania siatkówki gryzoni (patrz Tabela materiałów) i regulacji pozycji myszy, zapoznaj się z Gong et al.28.
    3. Dostosuj ostrość, aby uzyskać optymalne obrazy OCT.
    4. Dostosuj kąt wskazanej linii w oprogramowaniu do obrazowania OCT (patrz Tabela materiałów), aby odsłonić trwałe naczynia hialoidalne, a następnie wykonaj zdjęcia.
  3. Fundus fluorescein aobrazowanie ngigraficzne naczyń szklistych
    1. Przygotować roztwór fluoresceiny: dodać 9 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) do 1 ml roztworu fluoresceiny (stężenie podstawowe: 100 mg/ml). Stężenie końcowego roztworu roboczego wynosi 10 mg/ml.
    2. Wstrzyknąć dootrzewnowo roztwór roboczy fluoresceiny (5 μl/g masy ciała).
    3. Nawilż rogówkę myszy sztucznymi łzami, a następnie umieść mysz na stoliku pozycjonującym.
    4. Ustaw soczewkę mikroskopu do obrazowania siatkówki Micron IV tak, aby miał bezpośredni, delikatny kontakt z rogówką myszy. Nieznacznie wyreguluj wyrównanie, aby ustawić głowę nerwu wzrokowego w środku view pole.
    5. Zmień filtr mikroskopu na zielony kanał fluorescencyjny.
    6. Skoncentruj się na trwałych naczyniach szklistych, aby robić zdjęcia.
    7. Wykonaj wiele zdjęć po 1 minucie, 3 minutach, 5 minutach i 10 minutach (nie więcej niż 10 minutach) po wstrzyknięciu, aby określić najlepszy punkt czasowy (stosunek sygnału do tła) do obserwacji naczyń szklistych. Procedurę FFA należy wykonać w ciągu 10 minut, po czym fluoresceina może stać się zbyt rozpylona i sprawić, że naczynia staną się niewidoczne.
  4. Rekonwalescencja myszy po znieczuleniu
    1. Po zabiegach trzymaj myszy na ciepłej poduszce grzewczej.
    2. Poczekaj, aż myszy znów będą mobilne, aby przywrócić je do klatki myszy.

2. Część II: Wizualizacja naczyń hialoidalnych ex vivo

  1. Przygotowanie stałych oczu myszy
    1. Wybierz myszy w odpowiednim wieku.
      UWAGA: Nowonarodzone myszy są zwykle poświęcane w P8 w celu rozwarstwienia kwasu hialoidalnego. Obie płcie są odpowiednie. Zmutowane myszy z opóźnioną regresją szklistą (i ich odpowiednimi kontrolami WT) mogą być preparowane i analizowane przez całe dorosłe życie.
    2. Poddaj myszy eutanazji przez narażenie na CO2 .
    3. Wyłuszczenie oczu myszy przez rozwarstwienie.
    4. Otwórz szeroko powieki za pomocą kleszczyków mikrochirurgicznych, aby umożliwić dostęp do gałki ocznej. Umieść zakrzywione kleszcze mikrochirurgiczne pod kulą ziemską na orbicie, aby uchwycić nerw wzrokowy bez ściskania gałki ocznej. Delikatnie pociągnij i usuń gałkę oczną za pomocą kleszczy.
    5. Alternatywnie, przeprowadź sekcję gałki ocznej za pomocą nożyczek mikrochirurgicznych, aby ostrożnie przeciąć równolegle do gałki ocznej z czterech stron w kierunku tyłu orbity i oddzielając gałkę oczną od otaczających tkanek łącznych.
    6. Zanurz oczy w 4% paraformaldehydzie w buforze PBS na 30 minut w temperaturze pokojowej w celu utrwalenia.
    7. Przenieś nieruchome gałki oczne do lodowatego bufora PBS.
      UWAGA: Gałki oczne mogą być przechowywane w PBS w temperaturze 4 °C przez okres do 1 tygodnia.
  2. Osadzanie naczyń szklistych za pomocą iniekcji żelatyny
    1. Przygotować 5% (w/v) roztwór żelatyny.
      1. Odważyć 50 mg żelatyny.
      2. Żelatynę rozpuścić w 1 ml wody destylowanej.
      3. Inkubować roztwór żelatyny w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C aż do całkowitego rozpuszczenia. Roztwór należy przechowywać w wodzie o temperaturze 37 °C do momentu użycia.
        UWAGA: Większa partia roztworu może być przygotowana i przechowywana w temperaturze 4 °C w postaci podwielokrotności. Każdorazowo przed użyciem roztwór należy podgrzać w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, aby uzyskać klarowną konsystencję.
    2. Pod mikroskopem preparacyjnym wstrzyknąć 50 μl roztworu żelatyny do ciała szklistego w rąbku; powtórzyć wstrzyknięcie 3 razy w różnych miejscach, aby wykonać w sumie cztery wstrzyknięcia, równomiernie rozmieszczone wokół rąbka (Rysunek 2A).
    3. Inkubować gałki oczne w lodówce o temperaturze 4 °C lub na lodzie przez 30 minut w celu zestalenia wstrzykniętej żelatyny w przestrzeni szklistej
  3. Wypreparowanie i izolacja naczyń szklistych
    UWAGA: Zobacz Rysunek 2B-E.
    1. Umieść gałki oczne na szalce Petriego zawierającej PBS, aby zapobiec wysuszeniu tkanki. Wykonaj nacięcie nożyczkami mikrochirurgicznymi w rąbku i usuń rogówkę.
    2. Odetnij i usuń nerw wzrokowy.
    3. Pod mikroskopem preparacyjnym użyj dwóch par kleszczy, aby odkleić i wyrzucić warstwy twardówki, naczyniówki i nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) oraz usunąć tęczówkę.
    4. Trzymając siatkówkę po stronie nerwu wzrokowego skierowaną do góry, a soczewką skierowaną w dół, wstrzyknij 50 μl PBS tuż pod miseczką siatkówki, aby umożliwić akumulację buforu PBS między żelatynizowanym ciałem szklistym a siatkówką.
    5. Delikatnie odklej i wyjmij miseczkę siatkówki i ciało rzęskowe z ciała szklistego za pomocą kleszczy mikrochirurgicznych.
    6. Za pomocą pipety transferowej przenieść kubek żelatynowy zawierający tkankę szklistą zanurzoną w PBS na szkiełko mikroskopowe
    7. Odwróć resztę tkanki (soczewkę/hialoid) tak, aby strona z soczewką była skierowana do góry.
    8. Podnieś soczewkę i delikatnie poluzuj połączenie między soczewką/TVL a VHP, a następnie przetnij HA nożyczkami mikrochirurgicznymi, aby usunąć soczewkę-TVL. Zachowaj część VHP kubka hialoidalnego do montażu płaskiego.
  4. Płaski montaż i barwienie naczyń hialoidalnych
    1. Delikatnie opłucz kubek hialoidalny z PBS na szkiełku, aby usunąć wszystkie resztki sekcyjne.
    2. Upewnij się, że kubek hialoidalny unosi się na szkiełku w odpowiednim roztworze PBS.
    3. Delikatnie ułóż i wyreguluj położenie żelatynizowanego kubka hialoidalnego za pomocą kleszczyków mikrochirurgicznych, z krawędzią kubka skierowaną w dół na szkiełku, aby uzyskać optymalny wygląd po stopieniu.
    4. Umieścić szkiełko z kubkiem hialoidalnym zanurzonym w PBS na szkiełku podstawowym w temperaturze 37 °C, poczekać, aż żelatyna się rozpuści, a kwas spłaszczy się, a następnie wyjąć szkiełko, gdy jest ledwo suche (nie suszyć nadmiernie).
    5. (Opcjonalnie) Barwienie immunologiczne naczyń szklistych
      1. Wytwarzać bufor blokujący i penetrujący (np. 5% albuminy surowicy bydlęcej [BSA] i 0,1% Triton X-100 w buforze PBS). Dodać 50 μl buforu blokującego do płaskiej izolacji hialoidowej i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
      2. Nałożyć 50 μl przeciwciała pierwszorzędowego (np. CD31) (rozcieńczenie 1:100 w buforze blokującym) na płaski wierzch izolacji hialoidowej, a następnie inkubować je w wilgotnym pojemniku w temperaturze 4 °C przez noc.
      3. Delikatnie spłucz 3x, za każdym razem przez 5 minut, PBS.
      4. Nałożyć 50 μl przeciwciała drugorzędowego (np. koziego przeciwciała drugorzędowego przeciwko królikowi - Alexa 488, rozcieńczenie 1:100) na płaski uchwyt hialoidalny i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
      5. Delikatnie spłucz 3x, za każdym razem przez 5 minut, PBS.
    6. Dodaj kroplę podłoża mocującego zapobiegającego blaknięciu z DAPI (4', 6-diamidyno-2-fenyloindol), aby zabarwić jądra w naczyniach szklistych.
    7. Delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe na hialoidzie, aby zakończyć płaskie mocowanie.
  5. Obrazowanie i kwantyfikacja płasko zamontowanych naczyń hialoidalnych
    1. Zobrazuj barwienie DAPI naczyń hialoidalnych za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego i upewnij się, że widoczny jest centralny kwas hialuronowy (wyklucz próbki bez kwasu hialuronowego).
    2. Zidentyfikuj gałęzie naczyń pochodzące bezpośrednio z HA i ręcznie policz liczbę odgałęzień naczyń w celu określenia ilościowego.
  6. Wizualizacja naczyń hialoidalnych w przekroju poprzecznym oczu
    1. Umieść nieruchome gałki oczne w związku o optymalnej temperaturze cięcia w odpowiedniej formie tkankowej, a następnie zamroź osadzone oczy na suchym lodzie lub przechowuj je w zamrażarce o temperaturze -20 °C.
    2. Za pomocą mikrotomu kriostatu przetworzyć przekrój poprzeczny osadzonych oczu na odcinki o grubości 12 μm w temperaturze -20 °C.
    3. Zbierz przekroje oczu na szkiełku mikroskopowym o temperaturze pokojowej, delikatnie dotykając skrawków tkanki, które będą przylegać do szkiełka.
    4. Suszyć na powietrzu w celu odwodnienia skrawków tkanki przez ~30 minut, które następnie można przechowywać w zamrażarce o temperaturze -20 °C, aż będą gotowe do barwienia.
    5. Przepłucz szkiełko 1x PBS, aby usunąć pozostały związek o optymalnej temperaturze cięcia ze szkiełka.
    6. (Opcjonalnie) Zanurzyć szkiełko w odpowiednim buforze utrwalającym (np. 4% paraformaldehydu w PBS) na 15 minut w temperaturze pokojowej w celu dodatkowego utrwalenia, jeśli to konieczne.
    7. Przepuszczalność tkanki za pomocą 0,1% Triton X-100 w PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    8. Przygotować bufor barwiący izollektynę-IB4 do barwienia naczyń krwionośnych.
    9. Rozpuścić i ponownie rozpuścić proszek izollektyny-IB4 (500 μg) w 50 ml PBS w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml.
    10. Powoli dodawać 50 μl 1 M roztworu CaCl2, kropla po kropli, do 50 ml mieszaniny PBS/izollektyny-IB4. Ten krok należy wykonywać powoli, aby uniknąć opadów. Końcowe stężenie CaCl2 wynosi 1 μM. Obecność Ca2+ jest wymagana do barwienia izollektyny-IB4.
    11. Nałożyć 30 μl buforu barwiącego izollektyny-IB4 na przekroje poprzeczne oczu na szkiełku i inkubować w wilgotnym pojemniku w temperaturze 4 °C przez noc.
    12. Płukać 3x, za każdym razem przez 5 minut, PBS.
    13. Dodaj kroplę podłoża mocującego zapobiegającego blaknięciu z DAPI, aby wybarwić jądra w sekcjach.
    14. Delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe na skrawkach tkanki, aby zakończyć płaskie mocowanie.
    15. Sprawdź tkankę pod mikroskopem, aby uwidocznić obecność naczyń szklistych w muszli ocznej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Obrazowanie in vivo naczyń hialoidalnych u żywych myszy
Rysunek 3A przedstawia przekrojowe widoki obrazów OCT dla siatkówki i tkanek szklistych u 3-miesięcznych myszy WT i Lrp5-//-, modelu zwierzęcego z trwałym hialoidem. Oko WT wykazuje brak tkanki szklistej, podczas gdy oko Lrp5-/- pokazuje dwa przetrwałe naczynia szkliste pochodzące z głowy nerwu wzrokowego. Rysunek 3B wyświe...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Techniki oceny i charakterystyki naczyń hialoidalnych są intuicyjnymi i niezbędnymi procedurami do obserwacji regresji naczyń hialoidalnych w modelach zwierzęcych, aby umożliwić badania nad mechanizmami leżącymi u podstaw regresji naczyniowej podczas rozwoju. Podczas gdy obrazowanie siatkówki in vivo umożliwia podłużną obserwację regresji hialoidalnej u tego samego zwierzęcia, dostęp do systemu obrazowania dna oka gryzoni dla OCT i FFA może być czynnikiem ograniczającym. Ponadto obrazowanie in vivo u żywych myszy nie jes...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty National Institutes of Health (NIH) (R01 EY024963 i EY028100) dla J.C. Z.W. była wspierana przez Knights Templar Eye Foundation Career Starter Grant. Procedura izolacji hialoidów opisana w tym badaniu została zaadaptowana z modyfikacją na podstawie protokołów hojnie udostępnionych przez dr Richarda Langa, Toshihide Kuriharę i Lois Smith, którym autorzy są wdzięczni.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AK-Fluor (wstrzyknięcie fluoresceiny, USP)Akorn17478-253-10
Przeciwciało anty-CD31Abcamab28364
Podłoże mocujące zapobiegające blaknięciuThermo FisherS2828
Podłoże montażowe zapobiegające blaknięciu z DAPIVector LaboratoriesH-1200
Krople do sztucznych łezSystaneN/A
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma-AldrichA2058
C57BL/6Jmyszy LaboratoriumJacksona Nr magazynowy: 000664
Chlorek wapnia (CaCl2)Sigma-AldrichC1016
KriostatLeicaCM3050S
KriostatLeicaCM3050 S
Chlorowodorek cyklopentolanu i fenylefryna chlorowodorek krople do oczuCyklomydrylN/A Żelatyna
 Sigma-AldrichG9382
Kozie przeciwciało anty-królicze IgG (H + L) Adsorbowane krzyżowo przeciwciało wtórne, Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificA-11008
Płyta grzewczaLab-Line Instruments Inc.Nie dotyczy
Izolektyna GS-IB4, 594 koniugatThermoFisher ScientificI21413
Chlorowodorek ketaminy do wstrzykiwańKetaVedNDC 50989-996-06
Lrp5-/-Jackson Laboratorynr 005823Opracowany przez Deltagen Inc., San Mateo, CA
Micron IV i OCTPhoenix Research LabsObrazowanie Niedotyczy oprogramowanie: Mikroskop InSight
Zeissdiscovery v8
Kleszcze mikrochirurgiczneScanlan International4004-05
Nożyczki mikrochirurgiczneScanlan International6006-44
Optymalna temperatura cięcia związekTissue-Tek4583
Optymalna temperatura cięcia związekAgar Scientific
Paraformaldehyd (16%)Elektron  Mikroskopia  Sciences15710
Jednorazowe formy do zatapiania Peel-A-Way (formy do tkanek)Fisher Scientific12-20
Bufor soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) (10X)TeknovaP0496
Szkiełko pokrywy do szkiełek szkiełkowychPremiere94-2222-10
Szkiełka mikroskopowe Superfrost Fisherbrand12-550-15
Triton X-100Sigma-AldrichX100
Sterylny roztwór ksylazynyAkorn: AnaSedNDC: 59399-110-20
Magazyn AGR1180

Bibliografia

  1. Lutty, G. A., McLeod, D. S. Development of the hyaloid, choroidal and retinal vasculatures in the fetal human eye. Progress in Retinal and Eye Research. 62, 58-76 (2018).
  2. Anand-Apte, B., Hollyfield, J. Developmental anatomy of the retinal and choroidal vasculature. The Retina and its Disorders. Besharse, J., Bok, D. , Academic Press. Oxford, UK. (2011).
  3. Hobbs, R. P., Hartnett, M. E. Chapter 2: The hyaloidal vasculature and its role in development. Pediatric Retina: Second Edition. Hartnett, M. E. , Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia. (2013).
  4. Fruttiger, M. Development of the retinal vasculature. Angiogenesis. 10 (2), 77-88 (2007).
  5. Saint-Geniez, M., D'Amore, P. A. Development and pathology of the hyaloid, choroidal and retinal vasculature. The International Journal of Developmental Biology. 48 (8-9), 1045-1058 (2004).
  6. Ito, M., Yoshioka, M. Regression of the hyaloid vessels and pupillary membrane of the mouse. Anatomy and Embryology. 200 (4), 403-411 (1999).
  7. Stahl, A., et al. The mouse retina as an angiogenesis model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (6), 2813-2826 (2010).
  8. Liu, C. H., Wang, Z., Sun, Y., Chen, J. Animal models of ocular angiogenesis: from development to pathologies. FASEB Journal. 31 (11), 4665-4681 (2017).
  9. Shastry, B. S. Persistent hyperplastic primary vitreous: congenital malformation of the eye. Clinical & Experimental Ophthalmology. 37 (9), 884-890 (2009).
  10. Lobov, I. B., et al. WNT7b mediates macrophage-induced programmed cell death in patterning of the vasculature. Nature. 437 (7057), 417-421 (2005).
  11. Kato, M., et al. Cbfa1-independent decrease in osteoblast proliferation, osteopenia, and persistent embryonic eye vascularization in mice deficient in Lrp5, a Wnt coreceptor. The Journal of Cell Biology. 157 (2), 303-314 (2002).
  12. Xia, C. H., et al. A model for familial exudative vitreoretinopathy caused by LPR5 mutations. Human Molecular Genetics. 17 (11), 1605-1612 (2008).
  13. Xu, Q., et al. Vascular development in the retina and inner ear: control by Norrin and Frizzled-4, a high-affinity ligand-receptor pair. Cell. 116 (6), 883-895 (2004).
  14. Ye, X., et al. Norrin, frizzled-4, and Lrp5 signaling in endothelial cells controls a genetic program for retinal vascularization. Cell. 139 (2), 285-298 (2009).
  15. Ohlmann, A. V., Adamek, E., Ohlmann, A., Lutjen-Drecoll, E. Norrie gene product is necessary for regression of hyaloid vessels. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (7), 2384-2390 (2004).
  16. Chen, J., et al. Retinal expression of Wnt-pathway mediated genes in low-density lipoprotein receptor-related protein 5 (Lrp5) knockout mice. PLoS One. 7 (1), 30203(2012).
  17. Nayak, G., et al. Developmental vascular regression is regulated by a Wnt/beta-catenin, MYC and CDKN1A pathway that controls cell proliferation and cell death. Development. 145 (12), (2018).
  18. Kurihara, T., et al. Astrocyte pVHL and HIF-alpha isoforms are required for embryonic-to-adult vascular transition in the eye. The Journal of Cell Biology. 195 (4), 689-701 (2011).
  19. Huang, T. Q., et al. Deletion of HIF-1alpha partially rescues the abnormal hyaloid vascular system in Cited2 conditional knockout mouse eyes. Molecular Vision. 18, 1260-1270 (2012).
  20. Yoshikawa, Y., et al. Developmental regression of hyaloid vasculature is triggered by neurons. The Journal of Experimental Medicine. 213 (7), 1175-1183 (2016).
  21. Garcia, C. M., et al. The function of VEGF-A in lens development: formation of the hyaloid capillary network and protection against transient nuclear cataracts. Experimental Eye Research. 88 (2), 270-276 (2009).
  22. Hurskainen, M., et al. Abnormal maturation of the retinal vasculature in type XVIII collagen/endostatin deficient mice and changes in retinal glial cells due to lack of collagen types XV and XVIII. FASEB journal. 19 (11), 1564-1566 (2005).
  23. Fukai, N., et al. Lack of collagen XVIII/endostatin results in eye abnormalities. The EMBO Journal. 21 (7), 1535-1544 (2002).
  24. McKeller, R. N., et al. The Arf tumor suppressor gene promotes hyaloid vascular regression during mouse eye development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (6), 3848-3853 (2002).
  25. Hackett, S. F., Wiegand, S., Yancopoulos, G., Campochiaro, P. A. Angiopoietin-2 plays an important role in retinal angiogenesis. Journal of Cellular Physiology. 192 (2), 182-187 (2002).
  26. Chang, B., et al. Haploinsufficient Bmp4 ocular phenotypes include anterior segment dysgenesis with elevated intraocular pressure. BMC Genetics. 2, 18(2001).
  27. Wang, Z., et al. Pharmacologic Activation of Wnt Signaling by Lithium Normalizes Retinal Vasculature in a Murine Model of Familial Exudative Vitreoretinopathy. The American Journal of Pathology. 186 (10), 2588-2600 (2016).
  28. Gong, Y., et al. Optimization of an Image-Guided Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model in Mice. PLoS One. 10 (7), 0132643(2015).
  29. Kishimoto, A., et al. Histochemical characteristics of regressing vessels in the hyaloid vascular system of neonatal mice: Novel implication for vascular atrophy. Experimental Eye Research. 172, 1-9 (2018).
  30. Lang, R. A., Bishop, J. M. Macrophages are required for cell death and tissue remodeling in the developing mouse eye. Cell. 74 (3), 453-462 (1993).
  31. Riazifar, H., et al. Phenotypic and functional characterization of Bst+/- mouse retina. Disease Models & Mechanisms. 8 (8), 969-976 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Optyczna Koherentna TomografiaAngiografia Fluorescencyjna dna okamyszy z nokautem genu LRP5regresja naczyniowatrwałe naczynia hialoidalneobrazowanie okamodel mysiizolacja naczyńpreparat flat-mount
Ocena i charakterystyka naczyń hialoidalnych u myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.