Ocena wpływu osobowości na wrażliwość na pola magnetyczne u danio pręgowanego

Podsumowanie

Opisujemy protokół behawioralny zaprojektowany do oceny, jak osobowość danio pręgowanego wpływa na ich reakcję na prądy wodne i słabe pola magnetyczne. Ryby o tych samych osobowościach są rozdzielane na podstawie ich zachowania eksploracyjnego. Następnie obserwuje się ich reotaktyczne zachowanie orientacyjne w tunelu pływackim o niskim natężeniu przepływu i w różnych warunkach magnetycznych.

Streszczenie

Aby zorientować się w swoim otoczeniu, zwierzęta integrują szeroki wachlarz zewnętrznych wskazówek, które wchodzą w interakcję z kilkoma wewnętrznymi czynnikami, takimi jak osobowość. W tym miejscu opisujemy protokół behawioralny przeznaczony do badania wpływu osobowości danio pręgowanego na ich reakcję orientacyjną na wiele zewnętrznych sygnałów środowiskowych, w szczególności prądy wodne i pola magnetyczne. Protokół ten ma na celu zrozumienie, czy proaktywne lub reaktywne danio pręgowane wykazują różne progi reotaktyczne (tj. prędkość przepływu, przy której ryby zaczynają płynąć w górę rzeki), gdy otaczające pole magnetyczne zmienia swój kierunek. Aby zidentyfikować danio pręgowanego o tej samej osobowości, ryby wprowadza się do ciemnej połowy zbiornika połączonego wąskim otworem do jasnej połowy. Tylko proaktywne ryby eksplorują nowe, jasne środowisko. Ryby reaktywne nie opuszczają ciemnej połowy zbiornika. Tunel pływacki o niskim natężeniu przepływu służy do określenia progu reotaktycznego. Opisujemy dwie konfiguracje do kontrolowania pola magnetycznego w tunelu, w zakresie natężenia pola magnetycznego Ziemi: jeden, który kontroluje pole magnetyczne wzdłuż kierunku przepływu (jeden wymiar) i drugi, który umożliwia trójosiową kontrolę pola magnetycznego. Ryby są filmowane podczas doświadczania stopniowego zwiększania prędkości przepływu w tunelu pod wpływem różnych pól magnetycznych. Dane dotyczące zachowania orientacyjnego są zbierane za pomocą procedury śledzenia wideo i stosowane do modelu logistycznego, aby umożliwić określenie progu reotaktycznego. Przedstawiamy reprezentatywne wyniki zebrane od ławicowych danio pręgowanego. W szczególności pokazują one, że tylko reaktywne, ostrożne ryby wykazują zmiany progu reotaktycznego, gdy pole magnetyczne zmienia się w swoim kierunku, podczas gdy ryby proaktywne nie reagują na zmiany pola magnetycznego. Metodologia ta może być zastosowana do badania wrażliwości magnetycznej i zachowań reotaktycznych wielu gatunków wodnych, zarówno wykazujących strategie pływania samotnego, jak i płycizny.

Wprowadzenie

W niniejszym badaniu opisujemy laboratoryjny protokół behawioralny, który ma zakres badania roli osobowości ryb na reakcję orientacyjną ryb na zewnętrzne sygnały orientacyjne, takie jak prądy wodne i pola magnetyczne.

Decyzje orientacyjne zwierząt wynikają z ważenia różnych informacji sensorycznych. Na proces decyzyjny ma wpływ zdolność zwierzęcia do nawigacji (np. zdolność do wyboru i utrzymania kierunku), jego stan wewnętrzny (np. potrzeby żywieniowe lub reprodukcyjne), zdolność do poruszania się (np. biomechanika lokomocji) oraz kilka dodatkowych czynników zewnętrznych (np. pora dnia, interakcja z przedstawicielami tego samego gatunku)¹.

Rola stanu wewnętrznego lub osobowości zwierzęcia w zachowaniu orientacyjnym jest często słabo rozumiana lub nie jest badana². Dodatkowe wyzwania pojawiają się w badaniach nad orientacją społecznych gatunków wodnych, które często wykonują skoordynowane i spolaryzowane zachowania ruchowe grupy³.

Prądy wodne odgrywają kluczową rolę w procesie orientacji ryb. Ryby orientują się w prądach wodnych poprzez bezwarunkową reakcję zwaną reotaksją⁴, która może być pozytywna (tj. zorientowana na prąd) lub negatywna (tj. zorientowana na dół) i jest używana do kilku działań, od żerowania po minimalizację wydatków energetycznych^5,6. Co więcej, coraz więcej literatury donosi, że wiele gatunków ryb wykorzystuje pole geomagnetyczne do orientacji i nawigacji^7,8,9.

Badanie reotaksji i wydajności pływania u ryb jest zwykle przeprowadzane w komorach przepływu (kanałach), gdzie ryby są narażone na stopniowy wzrost prędkości przepływu, od niskich do wysokich prędkości, często aż do wyczerpania (tzw. prędkość krytyczna)^10,11. Z drugiej strony, wcześniejsze badania badały rolę pola magnetycznego w orientacji poprzez obserwację zachowań pływackich zwierząt na arenach z wodą stojącą^12,13. W tym miejscu opisujemy technikę laboratoryjną, która pozwala naukowcom badać zachowanie ryb podczas manipulowania zarówno prądami wodnymi, jak i polem magnetycznym. Metoda ta została po raz pierwszy zastosowana na ławicach danio pręgowanego (Danio rerio) w naszym poprzednim badaniu, co doprowadziło do wniosku, że manipulacja otaczającym polem magnetycznym określa próg reotaktyczny (tj. minimalną prędkość wody, przy której ławice ryb orientują się w górę rzeki)¹⁴. Metoda ta opiera się na wykorzystaniu studzienki kanałowej o powolnym przepływie w połączeniu z układem przeznaczonym do kontroli pola magnetycznego w korycie, w zakresie natężenia pola magnetycznego Ziemi.

Tunel pływacki wykorzystywany do obserwacji zachowania danio pręgowanego jest opisany w Rysunek 1. Tunel (wykonany z nieodblaskowego akrylowego cylindra o średnicy 7 cm i długości 15 cm) jest podłączony do zestawu do kontroli natężenia przepływu¹⁴. Przy takiej konfiguracji zakres natężenia przepływu w tunelu waha się od 0 do 9 cm/s.

Aby manipulować polem magnetycznym w tunelu pływackim, stosujemy dwa podejścia metodologiczne: pierwsze jest jednowymiarowe, a drugie trójwymiarowe. W każdym zastosowaniu metody te manipulują polem geomagnetycznym w celu uzyskania określonych warunków magnetycznych w określonej objętości wody - dlatego wszystkie wartości natężenia pola magnetycznego zgłoszone w tym badaniu obejmują pole geomagnetyczne.

Jeśli chodzi o podejście jednowymiarowe¹⁵, pole magnetyczne jest manipulowane wzdłuż kierunku przepływu wody (zdefiniowanego jako oś x) za pomocą solenoidu owiniętego wokół tunelu pływackiego. Jest on podłączony do jednostki zasilającej i generuje jednorodne statyczne pola magnetyczne (Rysunek 2A). Podobnie w przypadku podejścia trójwymiarowego pole geomagnetyczne w objętości zawierającej tunel pływacki jest modyfikowane za pomocą zwojów przewodów elektrycznych. Jednakże, aby kontrolować pole magnetyczne w trzech wymiarach, cewki mają konstrukcję trzech ortogonalnych par Helmholtza (Rysunek 2B). Każda para Helmholtza składa się z dwóch okrągłych cewek zorientowanych wzdłuż trzech ortogonalnych kierunków przestrzeni (x, y i z) i wyposażonych w trójosiowy magnetometr pracujący w warunkach zamkniętej pętli. Magnetometr pracuje z natężeniem pola porównywalnym z naturalnym polem ziemskim i znajduje się blisko geometrycznego środka zestawu cewek (gdzie znajduje się tunel pływacki).

Implementujemy techniki opisane powyżej, aby przetestować hipotezę, że cechy osobowości ryb tworzących ławicę wpływają na sposób, w jaki reagują na pola magnetyczne¹⁶. Testujemy hipotezę, że osoby z osobowością proaktywną i reaktywną^17,18 reagują inaczej, gdy są wystawione na działanie przepływów wody i pól magnetycznych. Aby to przetestować, najpierw sortujemy danio pręgowanego przy użyciu ustalonej metodologii, aby przypisać i pogrupować osoby, które są proaktywne lub reaktywne^17,19,20,21. Następnie oceniamy zachowanie reotaktyczne danio pręgowanego pływającego w ławicach złożonych tylko z osobników reaktywnych lub złożonych tylko z osobników proaktywnych w zbiorniku z kanałami magnetycznymi, które przedstawiamy jako dane próbne.

Metoda sortowania opiera się na różnych tendencjach osób aktywnych i reaktywnych do odkrywania nowych środowisk²¹. W szczególności używamy zbiornika podzielonego na jasną i ciemną stronę^17,19,20,21 (Rysunek 3). Zwierzęta przyzwyczajają się do ciemnej strony. Kiedy dostęp do jasnej strony jest otwarty, osoby proaktywne mają tendencję do szybkiego opuszczania ciemnej połowy zbiornika, aby zbadać nowe środowisko, podczas gdy ryby reaktywne nie opuszczają ciemnego zbiornika.

Protokół

Następujący protokół został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Neapolitańskiego im. Fryderyka II, Neapol, Włochy (2015).

1. Opieka nad zwierzętami

1. Użyj zbiorników o pojemności co najmniej 200 litrów, aby pomieścić ławicę co najmniej 50 osobników obojga płci w każdym zbiorniku.
   nuta: Zagęszczenie ryb w zbiorniku musi wynosić jedno zwierzę na 2 litry lub mniej. W tych warunkach danio pręgowany będzie wykazywał normalne zachowanie podczas ławicowania.
2. Ustaw warunki konserwacji w następujący sposób: temperatura 27–28 °C; przewodność na poziomie <500 μS; pH 6,5–7,5; NO₃ przy <0,25 mg/L; i światło: ciemny fotoperiod po 10 godz. 14 godz.
   nuta: Jednakowe warunki przetrzymywania muszą być stosowane zarówno dla populacji mieszanej, jak i dla rozdzielonych populacji proaktywnych i reaktywnych.

2. Wybór osobowości u danio pręgowanego

1. Przygotuj i umieść zbiornik wyboru osobowości w cichym pomieszczeniu (Rysunek 3) z tą samą wodą, która jest używana w zbiornikach konserwacyjnych.
2. Umieść kamerę wideo nad lub z boku zbiornika. Podłącz kamerę do komputera z monitorem umieszczonym w miejscu, w którym nie ma kontaktu wzrokowego ze zbiornikiem.
3. Wybierz losowo dziewięć ryb ze zbiornika konserwacyjnego i przenieś je na ciemną stronę zbiornika wyboru osobowości za pomocą sieci bez węzłów.
   nuta: Staraj się ograniczyć interakcje ze zbiornikami i rybami do jak najmniejszej ilości czasu. Unikaj hałasu i szybkich ruchów. W razie potrzeby przenieść zwierzęta do zbiornika transportowego o małej pojemności (około 2 l) z wodą ze zbiornika gospodarstwa. Aby uniknąć kontaktu zwierząt z powietrzem, użyj zlewki o pojemności 250 ml i delikatnie nakłonij zwierzę do wejścia do zlewki. Staraj się zminimalizować czas chwytania, unikaj zbierania wielu ryb, ponieważ może to spowodować fizyczne uszkodzenie zwierząt i nie trzymaj ryb w sieci dłużej niż kilka sekund, ponieważ czynniki te mogą zwiększyć stres. Ryby muszą być karmione ad libitum przed przeniesieniem do zbiornika doświadczalnego. Ogranicza to możliwość, że różne tendencje zachowań związanych z poszukiwaniem pożywienia wpłynęłyby na zachowanie osobników podczas następnego eksperymentu²². Przeprowadzaj powtórzone eksperymenty o tej samej porze dnia. Minimalizuje to zmienność w zachowaniu grup eksperymentalnych spowodowaną możliwymi rytmami okołodobowymi²³.
4. Po 1 godzinie aklimatyzacji otwórz drzwi przesuwne.
   nuta: Osoby, które wyjdą z, odkrywając jasną stronę zbiornika w ciągu 10 minut, są uważane za proaktywne²¹.
5. Po 10 minutach delikatnie wyjmij proaktywne osoby ze zbiornika i przenieś je do zbiornika do proaktywnej konserwacji.
6. Po 15 minutach zbierz ryby, które pozostały w ciemnym pudełku, które są uważane za reaktywne²¹, i przenieś je do zbiornika do konserwacji reaktywnej.
   nuta: Odrzuć ryby, które przejdą na jasną stronę zbiornika po 10 min²¹. Wykonaj test osobowości z dziewięcioma rybami na raz, aż zostanie zebrana pożądana liczba ryb proaktywnych i reaktywnych niezbędnych do testów opisanych w sekcji 5. Spójność osobowości proaktywnej i reaktywnej można regularnie sprawdzać przy użyciu tego samego podejścia.

3. Konfiguracja pola magnetycznego za pomocą jednowymiarowej manipulacji polem magnetycznym²⁷

1. Włącz jednostkę napędową (Rysunek 2A).
2. Umieść zwinięty tunel w miejscu, w którym zostanie wykonany protokół reotaktyczny (sekcja 5), ale trzymaj go odłączonego od aparatu pływackiego (Rysunek 2A). Umieść sondę magnetyczną połączoną z gaussometrem/teslasometrem wewnątrz tunelu i sprawdź, jakie napięcie jest niezbędne do uzyskania wybranej wartości pola magnetycznego wzdłuż głównej osi tunelu.
   nuta: Ze względu na właściwości magnetyczne elektromagnesu, pole jest w miarę jednorodne wewnątrz tunelu; Można to sprawdzić, powoli przesuwając sondę zarówno w poziomie, jak i w pionie.
3. Odłącz sondę i podłącz tunel przepływowy do aparatu pływackiego.
4. Zacznij od protokołu reotaktycznego (sekcja 5).

4. Konfiguracja pola magnetycznego za pomocą trójwymiarowej manipulacji polem magnetycznym²⁷

1. Włącz procesor, przetwornik cyfrowo-analogowy i sterowniki cewek (Rysunek 2B).
2. Ustaw wybrane pole magnetyczne na każdej z trzech osi (x, y i z).
3. Umieść tunel na środku zestawu par Helmholtza.
4. Zacznij od protokołu reotaktycznego (sekcja 5).

5. Test reotaksji danio pręgowanego w komorze przepływowej

1. Przenieś od jednej do pięciu ryb do tunelu przepływowego za pomocą zbiornika o pojemności 2 litrów z zasłoniętymi bokami i dnem.
2. Włącz pompę i ustaw natężenie przepływu w tunelu na 1,7 cm/s.
   nuta: Ta wolno płynąca woda utrzyma natlenienie wody w tunelu i ułatwi zwierzętom powrót do zdrowia.
3. Pozwól zwierzętom zaaklimatyzować się w tunelu pływackim przez 1 godzinę.
4. Rozpocznij nagrywanie wideo zachowania ryb w tunelu.
   nuta: Użyliśmy kamery (np. Yi 4K Action) z pilotem (np. Bluetooth) i zapisaliśmy wideo jako .mpg (30 klatek/s).
5. Rozpocznij stopniowe zwiększanie natężenia przepływu zgodnie z wybranym protokołem eksperymentalnym (1,3 cm/s w tym badaniu; Rysunek 4).
   nuta: W tym protokole zastosowaliśmy niskie natężenia przepływu, które dla danio pręgowanego wahają się od 0 do 2,8 BL (długości ciała)/s. Te prędkości przepływu mieszczą się w dolnym zakresie natężeń przepływu, które indukują ciągłe zorientowane pływanie u danio pręgowanego (3%–15% krytycznej prędkości pływania [U_crit])²⁴. Stosowanie niskich natężeń przepływu (zgodnie z protokołem Bretta²⁵) jest związane ze specyficznymi cechami behawioralnymi tego gatunku w obecności prądów wodnych. Danio pręgowany ma tendencję do pływania wzdłuż głównej osi komory, często skręcając, nawet w obecności przepływu wody, i ma tendencję do pływania zarówno w górę, jak i w dół rzeki^24,26. Na to zachowanie ma wpływ natężenie przepływu wody, które znika przy stosunkowo dużych prędkościach (>8 BL/s)²⁶, gdy zwierzęta stale pływają przodem do prądu (pełna pozytywna odpowiedź reotaktyczna). Przemieszczenia pionowe i poprzeczne są bardzo rzadkie.
6. Wykonaj morfometrię zwierząt (płeć i długość całkowita [TL], długość widelca [FL] lub BL) na zdjęciach ryb w komorze morfometrycznej.
   1. Wybierz odpowiednie zdjęcie.
   2. Otwórz obraz w programie ImageJ.
   3. Zwróć uwagę na płeć zwierzęcia (samce danio pręgowanego są smukłe i mają tendencję do żółtawego koloru, podczas gdy samice są bardziej zaokrąglone i mają zwykle niebiesko-białe ubarwienie).
   4. Kliknij przycisk Analizuj > Ustaw skalę i ustaw skalę obrazu w centymetrach, używając całej długości tunelu w poziomie jako odniesienia.
   5. Kliknij przycisk Analizuj > Zmierz i zapisz długość liniową zwierzęcia.
   6. Obliczyć jego masę ciała (m.c.).
      nuta: BW jest obliczany na podstawie relacji płeć-FL-BW wcześniej zbudowanych w laboratorium lub na podstawie metadanych. Cała procedura pozwala uniknąć stresu manipulacyjnego u zwierząt.

6. Śledzenie wideo

1. Otwórz plik wideo za pomocą narzędzia Tracker 4.84 Video Analysis and Modeling Tool.
   nuta: W razie potrzeby skoryguj wszelkie zniekształcenia wideo za pomocą filtrów dystorsji perspektywicznej i radialnej
.
2. Kliknij Układ współrzędnych w górnym menu i ustaw jednostki długości na centymetry, a jednostki czasu na sekundy.
3. Kliknij Plik > Importuj > wideo i otwórz jeden z filmów w Trackerze 4.84.
4. Kliknij "Osie współrzędnych" i ustaw układ odniesienia tak, aby śledził pozycję ryby w czasie, z osią x wzdłuż tunelu. Ustaw początek układu współrzędnych w dolnym rogu dolnej ściany końcowej (na wylocie wody).
5. Kliknij Śledź > Nowy > Punkt masy i rozpocznij śledzenie jednej ryby na raz. Śledź ostatnie 5 minut każdego kroku, który ryba spędziła przy każdym natężeniu przepływu.
6. Przesuwaj wideo ręcznie w odstępach pięciu klatek (0,5 s) i zaznacz czas i pozycję zwierzęcia przy każdym skręcie w górę-w dół (UDt; czerwone kropki w Rysunek 5) i przy każdym zakręcie w dół-w górę (DUt; niebieskie kropki w Rysunek 5).
   nuta: Użyj pozycji rybiego oka jako odniesienia dla pozycji ryby. Śledź pozycję zwierzęcia za pomocą masy punktowej. Wyłącz ze śledzenia jakikolwiek okres pływania niezorientowanego (tj. czas manewrowania).
7. Na koniec każdej sesji śledzenia wybierz wartości x i wartości czasu z tabeli w prawym dolnym rogu okna oprogramowania. Kliknij dane prawym przyciskiem myszy i kliknij polecenie Kopiuj dane > pełną precyzją.
8. Zapisz wartości czasu i wartości x wszystkich pozycji toczenia w pliku arkusza kalkulacyjnego szablonu, aby obliczyć całkowity czas wysyłania (suma wszystkich interwałów między UDts i DUts) oraz całkowity czas downstream (suma interwałów między DUts i UDt), a także wartości indeksu reotaktycznego w procentach (RI%) dla każdego kroku przepływu (patrz Rysunek 5).
   nuta: Zachowanie reotaktyczne jest określane ilościowo przez proporcję całkowitego czasu zorientowanego, który ryby spędzają zwrócone w górę rzeki (pływając lub rzadko zamarzając [tj. pozostają nieruchomo na dnie tunelu]²⁷). Proporcja ta jest zdefiniowana jako RI% (Rysunek 5).
   

Wyniki

Jako przykładowe dane prezentujemy wyniki uzyskane kontrolując pole magnetyczne wzdłuż kierunku przepływu wody na proaktywnych i reaktywnych ławicach danio pręgowanego¹⁶ przy użyciu konfiguracji pokazanej w Rysunek 2A (patrz sekcja 3 protokołu). Wyniki te pokazują, w jaki sposób opisany protokół może uwypuklić różnice w reakcjach na pole magnetyczne u ryb o różnych osobowościach. Ogólna koncepcja tych prób opiera się na ustaleniu, że k...

Dyskusja

Protokół opisany w tym badaniu pozwala naukowcom określić ilościowo złożone reakcje orientacyjne gatunków wodnych wynikające z integracji między dwoma zewnętrznymi sygnałami (prądem wody i polem geomagnetycznym) oraz jednym wewnętrznym czynnikiem zwierzęcia, takim jak osobowość. Ogólna koncepcja polega na stworzeniu eksperymentalnego projektu, który pozwoli naukowcom oddzielić osoby o różnej osobowości i zbadać ich zachowania orientacyjne, kontrolując oddzielnie lub jednocześnie zewnętrzne sygnały środowiskowe.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
9500 G miernik	FWBell	N/A	Gaussmetr, DC-10 kHz; rozdzielczość sondy:  0,01 μ T
AD5755-1	Analog Devices	EVAL-AD5755SDZ	Czterokanałowy, 16-bitowy, przetwornik cyfrowo-analogowy
ALR3003D	podwójnie regulowany zasilacz	ELC	3760244880031
BeagleBone Black	Beagleboard.org	N/A	Jednopłytkowy sterownik
cewek	Domowy	N/A	oparty na komercyjnym OP (OPA544 firmy TI)
Pary Helmholtza	Domowa	nie dotyczy	Cewki wykonane ze standardowego drutu AWG-14
HMC588L	Honeywell	900405 Rev E Cyfrowy	magnetometr trójosiowy
MO99-2506	FWBell	129966	Jednoosiowa sonda magnetyczna
Aparat pływacki	M2M Engineering Niestandardowy sprzęt naukowy	Nie dotyczy	Aparat pływacki składający się z pompy perystaltycznej i SMC Przepływomierz z przełącznikiem przepływu z cyfrowym sprzężeniem zwrotnym
Kriostat TECO 278	TECO	N/A&	NBSP;