Artykuł metodologiczny

Ważne punkty końcowe i markery proliferacyjne do oceny uszkodzenia jelita cienkiego i adaptacji przy użyciu mysiego modelu zapalenia błony śluzowej wywołanego chemioterapią

DOI:

10.3791/59236

⸱

12 maja 2019

 ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, 2Novo Nordisk Foundation Center of Basic Metabolic Research, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół do ustalenia ważnych punktów końcowych i markerów proliferacyjnych uszkodzenia jelita cienkiego i hiperproliferacji kompensacyjnej przy użyciu modelu zapalenia błony śluzowej wywołanego chemioterapią. Demonstrujemy wykrywanie proliferujących komórek za pomocą markera specyficznego dla cyklu komórkowego i przy użyciu masy jelita cienkiego, głębokości krypty i wysokości kosmków jako punktów końcowych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Adaptacja jelitowa to naturalny mechanizm kompensacyjny, który występuje, gdy jelito zostaje utracone z powodu urazu. Reakcje adaptacyjne, takie jak proliferacja komórek kryptowych i zwiększone wchłanianie składników odżywczych, mają kluczowe znaczenie dla powrotu do zdrowia, ale są słabo poznane. Zrozumienie mechanizmu molekularnego stojącego za reakcjami adaptacyjnymi ma kluczowe znaczenie dla ułatwienia identyfikacji składników odżywczych lub leków w celu poprawy adaptacji. W literaturze opisano różne podejścia i modele, ale w celu uzyskania powtarzalnych danych potrzebny jest szczegółowy, opisowy sposób wykonywania procedur. W tym miejscu opisano metodę szacowania ważnych punktów końcowych i markerów proliferacyjnych uszkodzenia jelita cienkiego i hiperproliferacji kompensacyjnej przy użyciu modelu zapalenia błony śluzowej wywołanego chemioterapią u myszy. Demonstrujemy wykrywanie proliferujących komórek za pomocą markera specyficznego dla cyklu komórkowego, a także przy użyciu masy jelita cienkiego, głębokości krypty i wysokości kosmków jako punktów końcowych. Niektóre z krytycznych etapów opisanej metody to usunięcie i zważenie jelita cienkiego oraz dość złożony system oprogramowania sugerowany do pomiaru tej techniki. Metody te mają tę zaletę, że nie są czasochłonne, a także opłacalne oraz łatwe do przeprowadzenia i zmierzenia.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Adaptacja jelitowa to naturalny mechanizm kompensacyjny, który występuje, gdy jelito zostaje utracone z powodu choroby lub operacji1,2. Po urazie jelito przechodzi morfometryczną i funkcjonalną odpowiedź adaptacyjną, charakteryzującą się proliferacją komórek kryptowych i zwiększonym wchłanianiem składników odżywczych3. Ten krok ma kluczowe znaczenie w powrocie do zdrowia, ale jest słabo poznany. Badania eksperymentalne jelitowej odpowiedzi adaptacyjnej koncentrowały się na zmianach zachodzących po resekcji jelita cienkiego u myszy, szczurów i świń, ale zrozumienie mechanizmu molekularnego stojącego za odpowiedzią adaptacyjną w innych rodzajach urazów (np. chemicznych lub bakteryjnych) ma kluczowe znaczenie dla ułatwienia identyfikacji składników odżywczych lub leków w celu zwiększenia adaptacji. Eksperymentalnie zastosowano różne podejścia do opisania złożonego indeksu molekularnego i komórkowego patologii jelita cienkiego, w tym oceny histopatologicznej i pomiaru wyniku urazu. Mimo to w literaturze brakuje szczegółowego opisu, w jaki sposób należy wykonać procedury, które są niezbędne do uzyskania powtarzalnych danych. Identyfikując czynniki zaangażowane w adaptację, takie jak hormony jelitowe, uzasadniony jest łatwy, tani i powtarzalny model zwierzęcy i tutaj sugerujemy użycie modelu zapalenia błony śluzowej jelit wywołanego chemioterapią (CIM).

Jednym z najprostszych i bardzo pouczających punktów końcowych zarówno urazu, jak i adaptacji jest pomiar masy jelita cienkiego (SI). Wiemy, że cechą charakterystyczną zapalenia błony śluzowej jest apoptoza enterocytów, zależny od czasu zanik kosmków i zmniejszona mitoza. Dlatego badanie morfologii jelit jest bardzo istotne w modelach przedklinicznych4,5. U ludzi spadek cytruliny w osoczu, markera funkcjonowania enterocytów, koreluje z ocenami toksyczności i markerami stanu zapalnego6 oprócz zdolności absorpcyjnej7, co sugeruje, że ten aminokwas jest doskonałym biomarkerem zapalenia błony śluzowej. Cytrulinę można mierzyć zarówno u myszy, jak i szczurów, i wykazała doskonałe korelacje z długością kosmków8, crypt survival9 i zapaleniem błony śluzowej wywołanym promieniowaniem10.

Główną zaletą pomiaru cytruliny w osoczu jest możliwość zbierania powtarzających się pomiarów od jednego zwierzęcia. Jednak wielokrotne pobieranie próbek krwi u myszy jest ograniczone do całkowitej objętości krwi 6 μl/g/tydzień i wymaga znieczulenia ogólnego. To niestety ogranicza również stosowanie pomiarów cytruliny u myszy. Ponadto pomiar cytruliny wymaga wysokosprawnej chromatografii cieczowej11,12, co jest kosztowne i czasochłonne. Niedawno wykazaliśmy, że poziom cytruliny u myszy istotnie koreluje z masą SI (p < 0,001) (dane niepublikowane), co sprawia, że cytrulina jest bezpośrednim pomiarem odzwierciedlającym masę enterocytów. Ograniczeniem w pomiarze masy SI jest konieczność poświęcenia myszy, a zatem nie są możliwe powtórzenie pomiarów w obrębie tej samej myszy. Mimo to metoda ta daje możliwość przeprowadzenia szeregu innych analiz tkanek ukierunkowanych na pytanie badawcze, a fakty te mogą prawdopodobnie zrekompensować dodatkowe wykorzystanie zwierząt. Dlatego sugerujemy użycie masy SI jako łatwego, taniego i szybkiego biomarkera urazu i adaptacji u myszy. Aby zapewnić odtwarzalność i akceptowalną zmienność analityczną, jelita powinny być ostrożnie usunięte ze zwierzęcia, przepłukane solą fizjologiczną, opróżnione i wysuszone przed ważeniem. W tym artykule pokazujemy dokładnie, jak wykonuje się tę procedurę.

Inną cechą charakterystyczną zapalenia błony śluzowej jest utrata komórek proliferujących w kryptach i kompensacyjna hiperproliferacja podczas okresu regeneracyjnego3. Marker komórkowy Ki67 był często używany do określania szybko proliferujących komórek za pomocą immunohistochemii13. Mimo że Ki67 jest prostym markerem proliferacji, ma tendencję do niedokładności, ponieważ Ki67 jest obecny podczas wszystkich aktywnych faz cyklu komórkowego (G1, S, G2 i M)14. Specyficzne znakowanie jest niezbędne do wykrycia replikujących się komórek, dlatego sugerujemy inkorporację in situ 5-bromo-2'-deoksyurydyny (BrdU), syntetycznego analogu tymidyny, ponieważ jest ona w dużej mierze ograniczona do replikacji komórek w fazie S15. BrdU wstrzykuje się zwierzętom 150 minut przed złożeniem w ofierze, a następnie komórki można wykryć za pomocą immunohistochemii przy użyciu przeciwciał specyficznych dla BrdU. W tym artykule o metodzie pokazujemy dokładnie, jak zmierzyć obszar komórek immunopozytywnych BrdU w krypcie za pomocą bezpłatnego oprogramowania do obrazowania.

Zmiany morfologiczne i funkcjonalne są często badane w modelach zapalenia błony śluzowej wywołanego przez 5-FU, gdzie adaptacja jelitowa jest oceniana na podstawie wysokości kosmków i głębokości krypty. Podczas tego badania stwierdziliśmy, że podczas ostrej fazy zapalenia błony śluzowej, która jest równa fazie urazu, proliferacja mierzona przez włączenie BrdU nie jest skorelowana z głębokością krypty. W przeciwieństwie do tego, głębokość krypty jest istotnie skorelowana z proliferacją obserwowaną w fazie naprawy zapalenia błony śluzowej, 3 do 5 dni po indukcji. Sugeruje to, że ostra faza zapalenia błony śluzowej nie jest mierzona samą głębokością krypty. Sugerujemy, że przy stosowaniu proliferacji jako punktu końcowego w ostrej fazie zapalenia błony śluzowej myszy najlepiej zastosować inkorporację BrdU, ale przy ilościowym określaniu hiperproliferacji na późniejszym etapie w fazie regeneracyjnej, głębokość krypty jest rozsądną alternatywą dla inkorporacji BrdU. Celem tego badania było opisanie tego modelu w taki sposób, aby mógł być stosowany przez wszystkich badaczy, zarówno w dziedzinie onkologii, ale przede wszystkim badaczy niezaznajomionych z modelami uszkodzeń jelit.

Opisany model może być używany do fenotypowania modeli transgenicznych zgodnie z reakcją adaptacyjną, używając masy ciała, wagi SI i głębokości krypty jako punktów końcowych. Jako przykład pokazujemy tutaj, jak wykorzystaliśmy model zapalenia błony śluzowej wywołanego 5-fluorouracylem (5-FU) w modelu nokautu komórkowego z niewystarczającym wydzielaniem komórek L16. Peptyd glukagonopodobny 1 (GLP-1) i glukagonopodobny peptyd 2 (GLP-2) są hormonami jelitowymi wydzielanymi jednocześnie z komórek L enteroendokrynnych w odpowiedzi na przyjmowanie pokarmu17,18. GLP-2 jest uznawany za ważny czynnik gojenia jelit, regulacji apoptozy błony śluzowej i poprawy funkcji bariery klasy SI19,20,21,22. Na podstawie literatury postawiliśmy hipotezę, że hormony endogenne są niezbędne do kompensacyjnej hiperproliferacji zachodzącej w odpowiedzi adaptacyjnej po urazie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie opisane metody zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi duńskiego ustawodawstwa regulującego eksperymenty na zwierzętach (1987). Badania przeprowadzono za zgodą Duńskiego Inspektoratu Doświadczeń na Zwierzętach (2013-15-2934-00833) oraz lokalnej komisji etycznej.

UWAGA: Samice myszy C57BL/6J (~20−25 g) zostały uzyskane i trzymane po osiem w klatce w standardowym 12-godzinnym cyklu świetlnym, 12-godzinnym ciemnym ze swobodnym dostępem do wody i standardowej karmy. Zwierzęta pozostawiono do aklimatyzacji na tydzień przed rozpoczęciem eksperymentów.

1. Indukcja zapalenia błony śluzowej za pomocą 5-fluorouracylu

  1. Otrzymać 5-fluorouracyl (5-FU) w roztworze o stężeniu 50 mg/ml.
  2. Zważ i zapisz masę ciała myszy. Na podstawie masy ciała obliczyć ilość 5-FU do wstrzykiwań (np. 400 mg/kg).
  3. Przygotować strzykawkę o pojemności 1 ml podłączoną do igły o wymiarach 27 G x 30 mm i napełnić strzykawkę obliczoną ilością 5-FU do wstrzykiwań.
  4. Ogranicz mysz metodą scruff. Aby to zrobić, chwyć jedną ręką podstawę ogona i umieść go na powierzchni chwytającej palce, takiej jak pokrywa z drucianego pręta. Ustawiając ogon jedną ręką, drugą ręką trzymaj kark
    5. .
  5. Mocno ustaw korpus myszy w poprzek jednej ręki, wysuwając palec wskazujący i kciuk do tyłu tak daleko, jak to możliwe. Umieść ogon między palcami tej samej ręki, aby zabezpieczyć mysz.
  6. Trzymając mysz w mocnym, ale delikatnym uścisku, odsłoń brzuszną stronę myszy i włóż igłę do jamy dootrzewnowej w prawym lub lewym kwadrancie brzucha. Odessać, aby zapewnić prawidłowe umieszczenie, i wstrzyknąć 400 mg/kg 5-FU.

2. Pobieranie tkanek

  1. Znieczulić mysz wstrzyknięciem dootrzewnowym ketaminy/ksylazyny (100/10 mg/kg) rozcieńczonej w roztworze soli fizjologicznej (0,9% NaCl). Monitoruj głębokość znieczulenia, obserwując odruch wycofania szczypania.
    UWAGA: Znieczulenie jest znieczuleniem nieprzywracającym zdrowia.
  2. Zapisz wagę znieczulonej myszy.
  3. Umieść mysz w pozycji leżącej na plecach i wykonaj laparotomię, aby odsłonić jamę brzuszną, a następnie nacięcie jamy klatki piersiowej w celu wprowadzenia odmy opłucnowej.
  4. Za pomocą nożyczek poświęć zwierzę, rozcinając membranę.
  5. Usuń jelito cienkie. Przeciąć powyżej odźwiernika, ostrożnie cofnąć jelito cienkie od tuszy, aż do kąta dotrze do jelita ślepego i wykonać cięcie tuż przed jelitem ślepym.
  6. Za pomocą kleszczy delikatnie zaciśnij proksymalne światło. Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z dołączoną igłą 25 G przepłukać jelito cienkie solą fizjologiczną w celu usunięcia kału.
  7. Delikatnie usuń sól fizjologiczną ze światła jelita za pomocą narzędzi chirurgicznych.
  8. Umieść jelito cienkie na czystej bibułce, aby ostrożnie usunąć nadmiar soli fizjologicznej.
  9. Zapisać masę zaczerwienionej tkanki.
  10. Oblicz przepłukaną masę jelita cienkiego jako procent masy ciała.

3. Histologia jelita cienkiego

  1. Przygotowanie tkanek
    1. W dygestorium za pomocą nożyczek odciąć 3 cm odcinki zaczerwienionej tkanki jelitowej od każdej myszy z dwunastnicy, jelita czczego i jelita krętego i utrwalić odcinki w 10% formalinie przez 24 godziny w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Objętość utrwalacza powinna być 5−10 razy większa od objętości tkanki.
    2. Przenieś utrwaloną tkankę na deskę do krojenia.
    3. Za pomocą skalpela przyciąć tkankę do około 1 cm i przenieść do kasety do zatapiania.
      UWAGA: Kaseta powinna być oznaczona numerem identyfikacyjnym próbki (ID) ołówkiem.
    4. Zanurz kasetę w 70% etanolu i przechowuj w temperaturze 4 °C do czasu dalszej obróbki.
  2. Osadzanie tkanek w parafinie
    1. Odwodnić tkankę, umieszczając ją w wznoszących się roztworach alkoholu. Umieść kasetę w 70% etanolu na 1 godzinę, a następnie 80% etanolu na 1 godzinę, 95% etanolu na 1 godzinę i 100% etanolu na 1,5 godziny. Przenieś kasetę ze 100% etanolu na ksylen na 1,5 godziny.
    2. Zanurz kasetę w wosku parafinowym podgrzanym w temperaturze 58−60 °C. Za pomocą kleszczyków ustaw tkankę w orientacji poprzecznej i pozostaw bloki do ostygnięcia na dłużej niż 24 godziny, aż stwardnieją.
  3. Cięcie tkanek za pomocą mikrotomu
    1. Umieść blok tkanką zadrukowaną do dołu na lodzie na 5 minut. Za pomocą mikrotomu przyciąć bloki parafiny o grubości 10−30 μm, aby odsłonić powierzchnię tkanki.
    2. Wytnij przekroje bloku tkankowego między 3−5 μm, wykonując przekroje poprzeczne od dwunastnicy, jelita czczego i jelita krętego.
    3. Umieść wstęgę parafinową w łaźni wodnej o temperaturze 40−45 °C. Za pomocą kleszczy oddziel sekcje.
    4. Użyj szkiełek mikroskopowych, aby podnieść skrawki z wody.
    5. Suszyć szkiełka na powietrzu przez 30 minut przed barwieniem.
      UWAGA: W przypadku przechowywania przez dłuższy czas szkiełka należy przechowywać w lodówce.
  4. Barwienie tkanek hematoksyliną-eozyną
    1. Umieść szkiełka mikroskopowe w kołysce histologicznej. Odparafinować szkiełka w komorze grzewczej ustawionej na 60 °C przez 60 min.
      UWAGA: Szkiełka wyjęte bezpośrednio z lodówki należy pozostawić do osiągnięcia temperatury pokojowej przed umieszczeniem ich w szafie grzewczej.
    2. W dygestorii należy ponownie nawodnić tkankę w 3 zmianach środka czyszczącego (tabela materiałów), wykonać 20 zanurzeń w pierwszym słoiku ze środkiem czyszczącym, a następnie pozostawić je na 7-8 minut w każdym z dwóch dodatkowych słoików ze środkiem czyszczącym. Przenieś szkiełka do opadających roztworów alkoholu, zacznij od 3 zmian 99% etanolu, a następnie 2 zmian 96% etanolu i 70% etanolu. Zrób co najmniej 20 zanurzeń w każdym słoiku. Przełóż do bieżącej wody i odstaw zjeżdżalnie na 5 minut.
    3. Zanurz szkiełka w przefiltrowanej hematoksylinie Meyera na 1 minutę.
    4. Myć próbki pod bieżącą wodą z kranu przez 5 minut.
    5. Zanurz skrawki w plamie eozyny na 1-2 minuty, a następnie spłucz w wodzie z kranu.
    6. Odwodnić tkankę, umieszczając ją w wznoszących się roztworach alkoholu. Zacznij od 70% etanolu, następnie 96% etanolu, 96% etanolu i 4 razy 99% etanolu. Zrób co najmniej 20 zanurzeń w każdym słoiku i pozostaw kołyskę w 99% etanolu, aż zostaną zamontowane.
    7. Szkiełka nakrywkowe należy zamontować, nakładając niewielką ilość środka montażowego na powierzchnię szkiełek. Umieść szkiełko nakrywkowe na podłożu montażowym, nie tworząc pęcherzyków pod szkiełkiem nakrywkowym. Pozostaw do wyschnięcia na 24 godziny.
    8. Zbadaj tkankę za pomocą mikroskopu świetlnego podłączonego do kamery, aby uzyskać zdjęcia histologiczne. Użyj obiektywu 10x, aby robić zdjęcia, aż do osiągnięcia pełnego pokrycia szkiełka tkankowego.

4. Pomiar głębokości krypty i/lub wysokości kosmków

  1. Pobierz i zainstaluj oprogramowanie analityczne (np. Zen Lite, Tabela materiałów).
  2. Otwórz obraz w oprogramowaniu i połącz się z kamerą. Rób zdjęcia w trybie aparatu z obiektywem 20x.
  3. W trybie przetwarzania otwórz migawkę.
  4. Aby zmierzyć głębokość krypty: w widoku 2D wybierz narzędzie linii z zakładki grafika. Wybierz dobrze zorientowaną kryptę i rozpocznij linię na dole kosmku, a zakończ na dole krypty. Powtórz tę czynność dla 20 dobrze zorientowanych krypt (Rysunek Uzupełniający 1).
  5. Aby zmierzyć wysokość kosmków: w widoku 2D wybierz narzędzie linii z zakładki Grafika. Wybierz dobrze zorientowany kosmek i rozpocznij linię na końcu projekcji świetlnej i zakończ na początku krypty. Powtórz tę czynność dla 20 dobrze zorientowanych kosmków (rysunek uzupełniający 1).
  6. Przełącz się z widoku 2D na widok miary, aby wyświetlić pomiary.
  7. Eksportuj pomiary i oblicz średnią głębokości krypty i wysokości kosmków.

5. Kwantyfikacja BrdU (proliferacja) metodą immunohistochemiczną

  1. Wstrzykiwanie roztworu BrdU
    1. Zważ i zapisz masę ciała myszy.
    2. W dygestorium przygotować reprezentatywną ilość 0,5% m/v roztworu bromodeoksyurydyny (BrdU) w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
    3. W dygestorii wstrzyknąć 50 mg/kg BrdU we wstrzyknięciu dootrzewnowym.
      UWAGA: Aby upewnić się, że każda mysz zostanie poddana eutanazji dokładnie po 150 minutach od wstrzyknięcia BrdU, wstrzyknij każdą pojedynczą mysz kolejno w odstępach 10-20 minut między nimi, aby prawidłowo przeprowadzić pobranie tkanki.
    4. Zanotować czas wstrzyknięcia.
    5. Odczekaj 150 minut, a następnie znieczul myszy i zbierz tkankę zgodnie z opisem w krokach 2.1−2.7. Wykonać immunohistochemię BrdU zgodnie z opisem w punkcie 5.2.
  2. Immunohistochemia BrdU
    1. Przygotować tkankę zgodnie z opisem w krokach 3.1.1−3.3.4.
    2. W celu pobrania antygenu umieścić kołyskę szkiełkową z sekcjami w szklanym słoiku histologicznym i napełnić ją buforem EDTA (pH 9) w kuchence mikrofalowej na 1 minutę przy 750 W, a następnie 9 minut przy 350 W. Powtórz cykl.
      UWAGA: Upewnij się, że chusteczka nie wysycha, co może wymagać dodania większej ilości buforu do słoików między podgrzewaniem.
    3. Przemyć sekcje 2−3 razy w buforze soli fizjologicznej i polisorbatu 20 (TBS-T) przez 3 minuty każda.
    4. Zastosuj 5 kropli bloku nadtlenkowego (tabela materiałów) przez 10-15 minut w temperaturze pokojowej, aby zablokować aktywność endogennej peroksydazy. Umyj sekcje 2−3 razy w buforze TBS-T przez 3 minuty każda.
    5. Zastosuj 5 kropli bufora blokowego dla gryzoni (tabela materiałów) przez 30 minut w temperaturze pokojowej, aby zablokować niespecyficzne wiązanie. Umyj sekcje 2−3 razy w buforze TBS-T przez 3 minuty każda.
    6. Skrawki inkubować z monoklonalnym mysim przeciwciałem anty-BrdU rozcieńczonym w stosunku 1:500 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Umyj sekcje 2−3 razy w buforze TBS-T przez 3 minuty każda.
    7. Wizualizuj immunopozytywność za pomocą 3,3'-diaminobenzydyny (DAB), nakładając 5 kropli peroksydazy chrzanowej na każde szkiełko i inkubując przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Przenieść skrawki do dygestoriów, dodać 150 μl DAB i inkubować przez 5 min.
      UWAGA: Zawsze noś rękawice podczas obchodzenia się z DAB i odpowiednio utylizuj odpady.
    8. Opłucz sekcje w wodzie dejonizowanej.
    9. Odwodnić tkankę i założyć szkiełko nakrywkowe, jak opisano w krokach 3.4.6 i 3.4.7.
  3. Wizualizacja reakcji immunologicznych
    1. Wizualizacja próbki tkanki za pomocą mikroskopu świetlnego podłączonego do kamery.
    2. Skorzystaj z oprogramowania analitycznego, aby uzyskać obrazy mikroskopowe przy użyciu obiektywu 20x dla wszystkich przekrojów i zapisać pliki w formacie .JPG.
    3. Zrób zdjęcie mikrometru stolikowego za pomocą obiektywu 20x, który będzie używany jako narzędzie do kalibracji w oprogramowaniu ImageJ.
  4. Pomiar powierzchni komórek immunoreaktywnych BrdU
    1. Zainstaluj oprogramowanie ImageJ (tabela materiałów).
    2. Przypisywanie skali do obrazu w ImageJ: Otwieranie obrazu mikrometru stołu montażowego za pomocą pliku ImageJ | Otwórz polecenie menu. Wybierz narzędzie do zaznaczania linii prostej.
    3. Wybierz narzędzie proste i narysuj linię prostą na obrazie mikrometrycznym, aby zdefiniować znaną odległość.
    4. Wybierz opcję Ustaw skalę w menu Analizuj.
    5. Wprowadź wartość w polu Znana odległość i zdefiniuj jednostkę długości w polu Jednostka długości. Wybierz opcję Globalne, aby ta kalibracja miała zastosowanie do wszystkich obrazów otwieranych w tej sesji ImageJ.
    6. Otwieranie interesującego obrazu przy użyciu pliku ImageJ | Otwórz polecenie menu, aby zmierzyć obszar komórek immunoreaktywnych BrdU na kryptę.
    7. Ustaw kolorową grafikę na 8-bitową w menu Obraz/Typ.
    8. Zwiększ kontrast obrazu w obszarze Proces/Zwiększ kontrast i ustaw nasycone piksele na 0,4%.
    9. Zastosuj próg do obrazu, aby podzielić immunopozytywność. Wybierz Obraz/Dostosuj w menu, a następnie próg i wybierz kolor czerwony (ciemny obszar pokazany na czerwono). Wybierz próg około 10−20%, przesuwając pasek progu.
      UWAGA: Wybierz próg, który obejmuje wszystkie dodatnie komórki BrdU z jak najmniejszym tłem. Wybrana wartość procentowa powinna dotyczyć wszystkich sekcji.
    10. Wybierz dobrze zorientowaną kryptę, tj. kompletną kryptę z nienaruszonej tkanki i wybierz narzędzie do zaznaczania z wolnej ręki, aby zaznaczyć obszar wokół niej.
    11. Aby zmierzyć obszar progowy, wybierz zakładkę Analizuj, a następnie Analizuj cząstki. W oknie Analizuj cząstki ustaw Rozmiar na 20-nieskończoność, kliknij pole jednostek pikseli, ustaw Kołowość na 0,00−1,00 i ustaw opcję Pokaż na Kontury. Kliknij pola Wyświetl wyniki, Podsumuj i Uwzględnij otwory.
      UWAGA: Wartości dla dodatnich komórek BrdU są generowane automatycznie w oknie wyników, pokazującym indywidualne pomiary dla każdej dodatniej komórki BrdU. Ponadto automatycznie generowane jest okno podsumowania, pokazujące liczbę zliczeń, całkowitą powierzchnię, średni rozmiar i procent obszaru z komórkami dodatnimi BrdU.
    12. Powtórz kroki 5.4.10 i 5.4.11, aby zmierzyć nową kryptę. Wyniki wszystkich zmierzonych krypt zostaną wyświetlone w oknie Podsumowanie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W pierwszym eksperymencie wywołaliśmy zapalenie błony śluzowej u myszy w dniu 0 i poświęciliśmy grupę myszy każdego dnia przez 5 kolejnych dni. Mierząc masę ciała w układzie SI, stwierdziliśmy, że parametr ten zmniejszył się od 2 do 4 dnia, co sugeruje utratę masy enterocytów. Odkryliśmy również, że w dniu 5 waga SI nie różniła się znacząco od masy ciała w układzie SI w dniu 0 (myszy nieleczone) (Rycina 1). Proliferacja mierzona włączeniem BrdU została prawie zniesiona...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu demonstrujemy szeroko dostępną metodę badania uszkodzeń i regeneracji SI w modelu mysim. Istnieje wiele różnych przedklinicznych zwierzęcych modeli uszkodzeń jelit, ale ważne jest, abyśmy zrozumieli, że każdy model jest unikalny i że punkty końcowe muszą być odpowiednie, aby odpowiedzieć na pytanie badawcze. Model ten doskonale nadaje się do badania adaptacyjnej odpowiedzi na uraz, ale punkty końcowe powinny być modyfikowane podczas korzystania z modelu jako przedklinicznego modelu zapalenia błony śluzowej....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została wsparta przez nieograniczony grant od Novo Nordisk Center for Basic Metabolic Research i Fundacji Lundbeck.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
5-FluorouracylHospira Nordic AB, Szwecja137853
Ketaminol® VetMerck, New Jersey, Stany Zjednoczone511485
Rompun® Weterynarz XylazineRompunvet, Bayer, Leverkusen, Niemcy.
10% naturalny bufor formalinowyCell Path Ltd, Powys, Wielka BrytaniaBAF-5000-08A
HistoClearNational Diagnostics, Wielka BrytaniaHS-200
PertexHistoLab®, Szwecja840
BrdUSigma-Aldrich, Niemcy.B5002
Bufor Tris/EDTA pH 9Thermofisher scientific, DaniaTA-125-PM4X
Blok nadtlenkowyUltravision Zestaw myszy Quanto na myszy, Thermofisher Scientific, DaniaTL-060-QHDM
Bufor bloku gryzoniZestaw Ultravision Quanto Mouse on Mysz, Thermofisher Scientific, DaniaTL-060-QHDM
Monoklonalne mysie przeciwciałoanty-BrdUThermofisher Scientific, Dania.MA1-81890
Rozcieńczalnik przeciwciał Lab Vision OP QuantoThermofisher Scientific, Dania.TA-125-ADQ
Peroksydaza chrzanowaZestaw Ultravision Quanto Mouse on Mouse, Thermofisher Scientific, DaniaTL-060-QHDM
Podłoże DAB Quanto Zestawsubstratów DAB, Thermofisher Scientific, DaniaTA-125-QHDX
Zestaw podłoża DAB Quanto ChromogenDAB, Thermofisher Scientific, DaniaTA-125-QHDX
Zen Lite (edycja niebieska)Carl Zeiss A/Shttps://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen-lite.html
ImageJ SoftwareLOCI, Uniwersytet Wisconsinhttps://imagej.nih.gov/ij/
148999 Oprogramowanie

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weinstein, L. D., Shoemaker, C. P., Hersh, T., Wright, H. K. Enhanced intestinal absorption after small bowel resection in man. The Archives of Surgery. 99 (5), 560-562 (1969).
  2. Helmrath, M. A., VanderKolk, W. E., Can, G., Erwin, C. R., Warner, B. W. Intestinal adaptation following massive small bowel resection in the mouse. Journal of the American College of Surgeons. 183 (5), 441-449 (1996).
  3. Kissow, H., et al. Exogenous glucagon-like peptide-2 (GLP-2) prevents chemotherapy-induced mucositis in rat small intestine. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 70 (1), 39-48 (2012).
  4. Kaczmarek, A., Brinkman, B. M., Heyndrickx, L., Vandenabeele, P., Krysko, D. V. Severity of doxorubicin-induced small intestinal mucositis is regulated by the TLR-2 and TLR-9 pathways. The Journal of Pathology. 226 (4), 598-608 (2012).
  5. Pontoppidan, P. L., et al. Intestinal response to myeloablative chemotherapy in piglets. Experimental Biology and Medicine. 239 (1), 94-104 (2014).
  6. Pontoppidan, P. L., et al. Associations between gastrointestinal toxicity, micro RNA and cytokine production in patients undergoing myeloablative allogeneic stem cell transplantation. International Immunopharmacology. 25 (1), 180-188 (2015).
  7. Crenn, P., Messing, B., Cynober, L. Citrulline as a biomarker of intestinal failure due to enterocyte mass reduction. Clinical Nutrition. 27 (3), 328-339 (2008).
  8. Fijlstra, M., et al. Lactose maldigestion during methotrexate-induced gastrointestinal mucositis in a rat model. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 300 (2), G283-G291 (2011).
  9. Jones, J. W., et al. Citrulline as a Biomarker in the Murine Total-Body Irradiation Model: Correlation of Circulating and Tissue Citrulline to Small Intestine Epithelial Histopathology. Health Physics. 109 (5), 452-465 (2015).
  10. Lutgens, L. C., et al. Citrulline: a physiologic marker enabling quantitation and monitoring of epithelial radiation-induced small bowel damage. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 57 (4), 1067-1074 (2003).
  11. Demacker, P. N., et al. Plasma citrulline measurement using UPLC tandem mass-spectrometry to determine small intestinal enterocyte pathology. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 877 (4), 387-392 (2009).
  12. van Eijk, H. M., Rooyakkers, D. R., Deutz, N. E. Rapid routine determination of amino acids in plasma by high-performance liquid chromatography with a 2-3 microns Spherisorb ODS II column. Journal of Chromatography. 620 (1), 143-148 (1993).
  13. Scholzen, T., Gerdes, J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown. Journal of Cellular Physiology. 182 (3), 311-322 (2000).
  14. Khoshyomn, S., Lew, S., DeMattia, J., Singer, E. B., Penar, P. L. Brain tumor invasion rate measured in vitro does not correlate with Ki-67 expression. Journal of Neuro-Oncology. 45 (2), 111-116 (1999).
  15. Matatall, K. A., Kadmon, C. S., King, K. Y. Detecting Hematopoietic Stem Cell Proliferation Using BrdU Incorporation. Methods in Molecular Biology. , 91-103 (2018).
  16. Hytting-Andreasen, R., et al. Endogenous glucagon-like peptide- 1 and 2 are essential for regeneration after acute intestinal injury in mice. PLoS One. 13 (6), e0198046(2018).
  17. Elliott, R. M., et al. Glucagon-like peptide-1 (7-36)amide and glucose-dependent insulinotropic polypeptide secretion in response to nutrient ingestion in man: acute post-prandial and 24-h secretion patterns. Journal of Endocrinology. 138 (7-36), 159-166 (1993).
  18. Orskov, C., Wettergren, A., Holst, J. J. Secretion of the incretin hormones glucagon-like peptide-1 and gastric inhibitory polypeptide correlates with insulin secretion in normal man throughout the day. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 31 (7), 665-670 (1996).
  19. Drucker, D. J., Erlich, P., Asa, S. L., Brubaker, P. L. Induction of intestinal epithelial proliferation by glucagon-like peptide 2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (15), 7911-7916 (1996).
  20. Lee, S. J., et al. Disruption of the murine Glp2r impairs Paneth cell function and increases susceptibility to small bowel enteritis. Endocrinology. 153 (3), 1141-1151 (2012).
  21. Shin, E. D., Estall, J. L., Izzo, A., Drucker, D. J., Brubaker, P. L. Mucosal Adaptation to Enteral Nutrients is Dependent on the Physiologic Actions of Glucagon-Like Peptide-2 in Mice. Gastroenterology. 128 (5), 1340-1353 (2005).
  22. Tsai, C. H., et al. Intestinal growth-promoting properties of glucagon-like peptide-2 in mice. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 273 (1), E77-E84 (1997).
  23. Sangild, P. T., Shen, R. L., Pontoppidan, P., Rathe, M. Animal models of chemotherapy-induced mucositis: translational relevance and challenges. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 314 (2), G231-G246 (2017).
  24. Gibson, R. J., et al. Irinotecan causes severe small intestinal damage, as well as colonic damage, in the rat with implanted breast cancer. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 18 (9), 1095-1100 (2003).
  25. Zhang, C., et al. Bone marrow stromal cells upregulate expression of bone morphogenetic proteins 2 and 4, gap junction protein connexin-43 and synaptophysin after stroke in rats. Neuroscience. 141 (2), 687-695 (2006).
  26. Biebl, M., Cooper, C. M., Winkler, J., Nl Kuhn, H. G. J. Analysis of neurogenesis and programmed cell death reveals a self-renewing capacity in the adult rat brain. Neuroscience Letters. 291 (1), 17-20 (2000).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wbudowywanie BrdUpomiar g boko ci kryptanaliza wysoko ci kosmk wmasa jelita cienkiegoopracowanie histologiczneanaliza w programie ImageJ

Powiązane artykuły