Celem tego protokołu jest opisanie podejścia do analizy zachowania dorosłych nerwowych komórek macierzystych/progenitorowych w odpowiedzi na manipulację chemogenetyczną specyficznego lokalnego obwodu neuronowego.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Regulacja specyficzna dla obwodu testowego dorosłych nerwowych komórek prekursorowych hipokampa
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Neurogeneza u dorosłych jest dynamicznym procesem, w którym nowo aktywowane nerwowe komórki macierzyste (NSC) w strefie subkrystalicznej (SGZ) zakrętu zębatego (DG) generują nowe neurony, które integrują się z istniejącym obwodem neuronalnym i przyczyniają się do określonych funkcji hipokampa. Co ważne, neurogeneza dorosłych jest wysoce podatna na bodźce środowiskowe, co pozwala na zależną od aktywności regulację różnych funkcji poznawczych. Szeroki zakres obwodów neuronalnych z różnych regionów mózgu koordynuje te złożone funkcje poznawcze. Dlatego ważne jest, aby zrozumieć, w jaki sposób określone obwody neuronalne regulują neurogenezę dorosłych. W tym miejscu opisujemy protokół manipulowania aktywnością obwodów nerwowych za pomocą receptora projektanta aktywowanego wyłącznie przez technologię (DREADDs), która reguluje NSC i nowonarodzone potomstwo u gryzoni. Ten kompleksowy protokół obejmuje stereotaktyczne wstrzykiwanie cząstek wirusa, chemogenetyczną stymulację określonych obwodów nerwowych, podawanie analogu tymidyny, przetwarzanie tkanek, znakowanie immunofluorescencyjne, obrazowanie konfokalne i analizę obrazową różnych etapów nerwowych komórek prekursorowych. Protokół ten zawiera szczegółowe instrukcje dotyczące technik pobierania antygenu stosowanych do wizualizacji NSC i ich potomstwa oraz opisuje prosty, ale skuteczny sposób modulowania obwodów mózgowych za pomocą N-tlenku klozapiny (CNO) lub wody pitnej zawierającej CNO i wirusów eksprymujących DREADD. Siła tego protokołu polega na jego zdolności adaptacyjnej do badania różnorodnego zakresu obwodów neuronalnych, które wpływają na neurogenezę dorosłych pochodzącą z NSC.
Wprowadzenie
Neurogeneza dorosłego człowieka to proces biologiczny, w którym nowe neurony rodzą się u dorosłego człowieka i integrują się z istniejącymi sieciami neuronowymi1. U ludzi proces ten zachodzi w zakręcie zębatym (DG) hipokampa, gdzie każdego dnia rodzi się około 1400 nowych komórek2. Komórki te znajdują się w wewnętrznej części DG, w której znajduje się nisza neurogenna, zwana strefą subgranularną (SGZ). W tym przypadku dorosłe nerwowe komórki macierzyste hipokampa (NSC) przechodzą złożony proces rozwojowy, aby stać się w pełni funkcjonalnymi neuronami, które przyczyniają się do regulacji określonych funkcji mózgu, w tym uczenia się i pamięci, regulacji nastroju i reakcji na stres3,4,5,6. Aby wpływać na zachowania, dorosłe NSC są silnie regulowane przez różne bodźce zewnętrzne w sposób zależny od aktywności, reagując na szereg lokalnych i dystalnych sygnałów chemicznych. Te sygnały chemiczne obejmują neuroprzekaźniki i neuromodulatory i działają w sposób specyficzny dla obwodu z różnych obszarów mózgu. Co ważne, konwergencja tych sygnałów chemicznych w NSC w całym obwodzie pozwala na unikalną i precyzyjną regulację aktywacji, różnicowania i decyzji dotyczących losu komórek macierzystych.
Jednym z najskuteczniejszych sposobów badania regulacji obwodów u dorosłych NSC in vivo jest połączenie analizy immunofluorescencji z manipulacjami obejmującymi cały obwód. Analiza immunofluorescencyjna dorosłych NSC jest powszechnie stosowaną techniką, w której przeciwciała przeciwko określonym markerom molekularnym są wykorzystywane do wskazania stadium rozwojowego dorosłych NSC. Markery te obejmują: nestynę jako radialną komórkę glejową i wczesny marker progenitorowy neuronów, Tbr2 jako pośredni marker progenitorowy oraz dcx jako marker neuroblastów i niedojrzałych neuronów7. Dodatkowo, podając analogi tymidyny, takie jak BrdU, CidU, Idu i Edu, populacje komórek przechodzące fazę S mogą być indywidualnie oznaczane i wizualizowane8,9,10. Łącząc te dwa podejścia, można zbadać szeroki zakres pytań, począwszy od tego, w jaki sposób proliferacja jest regulowana na określonych etapach rozwoju, a skończywszy na tym, jak różne sygnały wpływają na różnicowanie NSC i neurogenezę.
Istnieje kilka opcji skutecznego manipulowania obwodami neuronalnymi, w tym stymulacja elektryczna, optogenetyka i chemogenetyka, każda z własnymi zaletami i wadami. Stymulacja elektryczna obejmuje rozległą operację, w której elektrody są wszczepiane do określonego obszaru mózgu, a następnie są wykorzystywane do przesyłania sygnałów elektrycznych w celu modulowania docelowego obszaru mózgu. Jednak w tym podejściu brakuje zarówno specyficzności komórkowej, jak i obwodowej. Optogenetyka polega na dostarczaniu cząsteczek wirusa, które kodują receptor aktywowany światłem, który jest stymulowany przez laser emitowany przez wszczepiony światłowód, ale wymaga rozległych manipulacji, dużych kosztów i skomplikowanych operacji11. Chemogenetyka polega na dostarczaniu cząstek wirusa, które kodują receptor projektanta aktywowany wyłącznie przez lub DREADDs, które są następnie aktywowane przez specyficzny i biologicznie obojętny ligand znany jako N-tlenek klozapiny (CNO)12. Zaletą wykorzystania DREADD do manipulowania lokalnymi obwodami neuronalnymi, które regulują dorosłe NSC, jest łatwość i różne drogi podawania CNO. Pozwala to na mniej czasochłonne podejście przy ograniczonym obchodzeniu się ze zwierzętami, które można łatwo dostosować do długoterminowych badań w celu modulacji obwodów neuronalnych.
Podejście opisane w tym protokole to obszerny zbiór różnych protokołów wymaganych do skutecznego zbadania regulacji obwodów neurogenezy dorosłego hipokampa, który łączy zarówno techniki immunofluorescencji, jak i manipulacje obwodami za pomocą chemogenetyki. Metoda opisana w poniższym protokole jest odpowiednia do jednoczesnego stymulowania lub hamowania jednego lub wielu obwodów in vivo w celu określenia ich funkcji regulacyjnej w neurogenezie dorosłych. Takie podejście najlepiej sprawdza się, jeśli pytanie nie wymaga wysokiego stopnia rozwiązania czasowego. Pytania wymagające precyzyjnej kontroli czasowej stymulacji/hamowania przy określonej częstotliwości można lepiej rozwiązać za pomocą optogenetics13,14. Opisane tutaj podejście można łatwo zaadaptować do długoterminowych badań przy minimalnym obchodzeniu się ze zwierzętami, zwłaszcza tam, gdzie stres jest głównym problemem.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury, w tym tematy związane ze zwierzętami, zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Karoliny Północnej w Chapel Hill.
1. Stereotaktyczne wstrzykiwanie cząstek wirusa
- Określ obwody neuronowe, o których mowa. Spowoduje to określenie wirusa i linii myszy użytej do następującej procedury.
nuta: W tym przykładzie przeciwległe projekcje komórek mszystych są stymulowane w celu analizy ich wpływu na neurogenezę dorosłych. Cząsteczki wirusa kodujące AAV5-hSyn-DIO-hM3Dq-mCherry są dostarczane do DG myszy 5ht2A-Cre myszy15. - Meloksykam (5 mg/kg mc., podskórnie) należy podawać co najmniej 30 minut przed operacją, aby zapewnić prewencyjną analgezję 8-tygodniowemu samcowi heterozygotycznej myszy 5ht2A-Cre.
- Znieczulenie myszy za pomocą 4% mieszaniny tlenu izofluranu, aż jej oddech zwolni i mysz straci przytomność, korzystając z komory izofluranowej. Ściśnij palce myszy, aby upewnić się, że nie reaguje.
- Umieść mysz w stereotax na poduszce grzewczej dla małych zwierząt w celu regulacji termicznej i nałóż smar do oczu na każde oko. Zmniejsz stężenie izofluranu do 1,5%, gdy zwierzę znajdzie się w stereotax.
nuta: Umieszczenie paska na uszy na tym etapie jest ważne. Upewnij się, że głowa jest wypoziomowana po umieszczeniu paska na ucho. Bardziej szczegółowe instrukcje można znaleźć w Geiger et al.16. - Umieść produkt do depilacji na głowie i pozostaw go na maksymalnie 1 minutę. Usuń włosy, przecierając głowę chusteczkami z etanolu. Jeśli włosy nie zostaną całkowicie usunięte, powtarzaj ten proces, aż czubek głowy będzie bezwłosy.
- Zdezynfekuj obszar bez włosów roztworem jodu powidonu co najmniej 3 razy.
- Umieść miejscowy roztwór lidokainy na bezwłosej skórze głowy i odczekaj 1 minutę. Usuń miejscową lidokainę z głowy i wykonaj małe nacięcie na głowie od początku oczu do początku uszu około 2 mm za pomocą skalpela chirurgicznego.
nuta: Uszczypnij mysz u stóp, aby upewnić się, że jest całkowicie uspokojona przed wykonaniem jakichkolwiek nacięć. - Cofnij skórę głowy i oczyść tkankę łączną na czubku głowy za pomocą wysterylizowanych wacików, aż bregma będzie łatwa do zidentyfikowania.
- Zlokalizuj bregmę i wyreguluj głowicę tak, aby bregma i lambda znajdowały się w tej samej płaszczyźnie, umieszczając wiertło w obu współrzędnych i upewniając się, że są wyrównane. Dodatkowo wyrównaj lewą i prawą półkulę, umieszczając wiertło po lewej/prawej stronie obszaru między bregma a lambda.
nuta: Ten krok jest bardzo ważny; Nieprawidłowo ustawione ułożenie głowy zakłóci współrzędne stereotaktyczne. - Za pomocą wiertła 0,5 mm wywierć wiertło 0,5 mm pod następującymi współrzędnymi od bregma: przednia tylna oś (AP) -2,00 mm, przyśrodkowa oś boczna (ML) +1,50 mm. Wykonaj otwór o średnicy od 0,5 mm do 1 mm.
nuta: Zmodyfikuj ten krok, podając współrzędne specyficzne dla danego obwodu. Ten przykład dotyczy jednostronnego zakrętu zębatego zawierającego komórki mcha i określa ich wpływ na dorosłe nerwowe komórki macierzyste po stronie przeciwnej. - Zmień wiertło na strzykawkę 5 μl i igłę 26−33 G. Wyzeruj w bregma, a następnie wstrzyknij w następujących współrzędnych, umieszczając igłę w wywierconym otworze w przedniej tylnej osi -2,00 mm, przyśrodkowej osi bocznej -1,50 mm, grzbietowej osi brzusznej -2,3 mm.
- Wlać 500 nl wirusa związanego z adenowirusem (AAV) z rdzenia wirusa lub źródła komercyjnego do odpowiedniej półkuli w tempie 50-100 nL/min za pomocą pompy infuzyjnej (tabela materiałów). Należy odczekać co najmniej 5 minut po wstrzyknięciu, zanim zacznie się powoli wyjmować igłę z mózgu.
nuta: Te współrzędne mogą wymagać dostosowania w zależności od wieku i rozmiaru myszy. Niektóre serotypy wirusów mają różne wzorce dyfuzji, dlatego najlepiej jest przeprowadzić eksperymenty pilotażowe w celu zbadania rozprzestrzeniania się wirusa przed pełnym eksperymentem. - Oczyść skórę głowy i skórę wokół nacięcia za pomocą soli fizjologicznej, a następnie uszczelnij nacięcie za pomocą kleju tkankowego (tabela materiałów), przytrzymując skórę razem pęsetą. Wykonuj wszystkie zabiegi pooperacyjne, takie jak monitorowanie podczas rekonwalescencji na poduszce grzewczej, aż mysz będzie aktywna, nakładanie środków przeciwbólowych na ranę i podawanie środków przeciwbólowych przez dwa dni.
nuta: Wiele eksperymentów wymaga 2-4 tygodniowego czasu oczekiwania po infuzji wirusa na prawidłową ekspresję wirusa.
2. Podawanie N-tlenku klozapiny
- Przygotować podstawowy roztwór CNO, rozpuszczając 10 mg CNO w 100 μl dimetylosulfotlenku (DMSO) i wirując.
nuta: Jeśli roztwór nie rozpuści się całkowicie, zwiększ objętość DMSO, ale zbyt dużo DMSO może sprawić, że woda będzie gorzka. Nie przekraczać 0,1% DMSO w roztworze wodnym CNO lub więcej niż 200 μl DMSO w przypadku 200 ml roztworu. Roztwór podstawowy CNO można przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do dwóch tygodni. - Dodać 10−50 μl 10 mg/100 μl roztworu podstawowego CNO do każdych 200 ml wody, aby uzyskać końcowe stężenie 1−5 mg/200 ml. Codziennie przygotowuj świeżą mieszankę wody CNO.
nuta: Niektóre grupy uzupełniły do 1% sacharyny w wodzie, aby zamaskować gorycz, jeśli myszy powstrzymują się od picia. Badane obwody wykazywały różną reakcję w zależności od stopnia aktywacji. Ogólnie rzecz biorąc, 1 mg CNO/200 ml wystarcza do stymulacji większości obwodów17. - Umieścić roztwór CNO w pojemniku pokrytym folią lub zabezpieczonym przed światłem podczas podawania myszom dwa tygodnie po wyzdrowieniu po wstrzyknięciu stereotaktycznym z kroku 1.13 przez okres 4 dni.
nuta: CNO jest wrażliwy na światło; Zmniejsz ekspozycję na światło podczas całego procesu. - Mierz i zapisuj spożyty roztwór wodny CNO każdego dnia podczas przygotowywania świeżego roztworu CNO. Średnio dorosła mysz spożywa około 4 ml mieszanki wody CNO. Dodatkowo codziennie rejestruj wagę myszy, aby upewnić się, że piją.
- Upewnij się, że w każdym eksperymencie zastosowano odpowiednie kontrole. Uwzględnij zarówno kontrolkę CNO, jak i DREADD. Przykład konfiguracji eksperymentalnej obejmowałby: (1) pojazd + autonomiczny pojazd amfibijny (AAV) z wirusowym reporterem bez DREADD, (2) CNO + AAV z wirusowym reporterem bez DREADD oraz (3) CNO + AAV DREADD.
nuta: Wszystkie grupy uwzględniają DMSO w rozwiązaniu. Kontrole DMSO nie są uwzględnione, ponieważ zwierzęta otrzymują mniej niż 0,1% DMSO, co nie wykazano, aby miało niekorzystny wpływ na dorosłe nerwowe komórki macierzyste u myszy. Jeśli istnieją obawy dotyczące stosowania DMSO w wodzie pitnej, dodaj dodatkowy brak DMSO i kontrolę soli fizjologicznej.
3. Etykietowanie analogów tymidyny
- W dniu pobrania tkanki, 4 dni po podaniu CNO, oznacz proliferujące komórki, wykonując serię wstrzyknięć dootrzewnowych analogu tymidyny, 5-etynylo-2'-deoksyurydyny (Edu).
UWAGA: Ten protokół wykorzystuje Edu. Istnieje jednak kilka analogów tymidyny, które mogą skutecznie oznaczać proliferujące populacje komórek, w tym Brdu, Idu i Cidu8.- Zważyć Edu i rozpuścić w 0,9% roztworze chlorku sodu do wstrzykiwań klasy weterynaryjnej o stężeniu 4 mg/ml przez wirowanie i umieszczenie na wirniku na 15 min.
nuta: Analogi tymidyny są toksyczne i wrażliwe na światło. Podczas obchodzenia się z materiałem należy postępować zgodnie z kartami charakterystyki substancji niebezpiecznej (MSDS) i przykryć roztwór przed światłem folią aluminiową. - Lek Edu należy podawać dootrzewnowo w dawce 40 mg/kg mc. lub 0,1 ml/10 g masy ciała roztworu 4 mg/ml Edu 4 razy co 2 godziny
nuta: Dawki powyżej 50 mg/kg osiągają poziomy bliskie nasycenia i nie zwiększą znacząco ilości znakowanych komórek proliferujących18. Bardzo ważne jest, aby wszystkie myszy otrzymały taką samą ilość zastrzyków Edu, ponieważ niewłaściwe oznakowanie może zniekształcić wyniki.
- Zważyć Edu i rozpuścić w 0,9% roztworze chlorku sodu do wstrzykiwań klasy weterynaryjnej o stężeniu 4 mg/ml przez wirowanie i umieszczenie na wirniku na 15 min.
4. Przygotowanie i przetwarzanie tkanek
- Dwie godziny po ostatnim wstrzyknięciu leku Edu należy znieczulić mysz za pomocą komory izofluranowej, aż oddech zostanie znacznie zmniejszony i uszczypnąć palce u stóp, aby upewnić się, że jest całkowicie uspokojona.
- Przymocuj mysz do powierzchni za pomocą igieł i wykonaj małe nacięcie odsłaniające serce. Wprowadzić igłę 25 G do lewej aorty i przeciąć prawą komorę w celu perfuzji przezsercowej roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) przy szybkości przepływu 1−4 ml / min, aż tkanka wątroby zostanie usunięta.
- Zmień roztwór perfuzyjny na 4% paraformaldehydu (PFA) i perfuzuj około 15-20 ml, aby naprawić tkankę mózgową.
nuta: Bardziej szczegółowe instrukcje dotyczące procesu perfuzji można znaleźć w Gage et al.19. Drżenie zwierząt będzie obserwowane, jeśli zostanie wykonane prawidłowo. - Usuń głowę za pomocą dużych nożyczek, a następnie wykonaj serię ostrożnych nacięć, aby uwolnić mózg od czaszki. Przechowuj tkankę mózgową w temperaturze 4 °C w 4% PFA przez noc, aby kontynuować utrwalanie.
- Usunąć tkankę mózgową z 4% roztworu PFA i umieścić w 10% roztworze sacharozy w PBS w celu krioochrony tkanki na 24 godziny w temperaturze 4 °C. Następnie przenieść tkankę do 30% roztworu sacharozy PBS na kolejne 24 godziny w temperaturze 4 °C przed cięciem.
nuta: Tkanka mózgowa zatopi się w sacharozy, gdy będzie gotowa do cięcia mikrotomem. Tkanka mózgowa może być przechowywana przez długi czas w 30% sacharozy. - Wyciąć tkankę mózgową koronalnie w odcinkach 40 μm za pomocą mikrotomu. Zbierz odcinki zaczynające się na początku zakrętu zębatego, około -1,20 mm od bregmy, a kończące się po ukończeniu płytki, przy czym pierwsza sekcja jest najbardziej przednia, a ostatnia sekcja jest najbardziej tylna. Skonsultuj się z atlasem mózgu myszy, aby dokładnie określić DG i początkowe współrzędne pobierania tkanek.
- Przechowywać każdą sekcję szeregowo w rzędach po 6 sztuk na 48-dołkowej płytce wypełnionej roztworem płynu niezamarzającego (Tabela 1).
| Roztwór przeciw zamarzaniu | Glikol etylenowy 150 ml + sacharoza 150 g + napełnienie do 500 ml 0,1 M PB na 500 ml roztworu |
| Bufor cytrynianowy | 9 ml bulionu kwasu cytrynowego + 41 ml buforu cytrynianu trisodu + 450 ml ddH2O |
| Bulion z kwasu cytrynowego | [0,1 m] Kwas cytrynowy 21 g/1 l ddH2O |
| Zapas cytrynianu trisodowego | [0,1 m] Cytrynian trisodowy 29,4 g/1 l ddH2O |
| Tris Buforowana sól fizjologiczna -Tryton (TBS -Tryton) | 0,05% 100-x Tryton w TBS |
| Bufor przepuszczalności | 0,5% 100-x Tryton w TBS |
| Bufor blokujący | 0,33 ml osła w 10 ml TBS-Triton |
| Rozwiązanie reakcyjne Edu | Przygotować roztwór CuSO4·5H2O, dodając 1 mg CuSO4·5H2O w 4 ml roztworu o [0,1 M] Tris pH 8,5. Następnie dodać 1:40 600 μM roztworu azydku Alexa488 i 10 mg/ml askorbinianu L-Na+ do roztworu CuSO4·5H2O przed nałożeniem na tkankę. |
Tabela 1: Roztwory stosowane w immunohistochemii.
5. Immunohistochemia
- Podstawowy protokół zmiennoprzecinkowy
nuta: W przypadku barwienia gniazda należy pominąć sekcję 5.1 i przejść do sekcji 5.2. Podstawowy protokół pływania jest przeznaczony tylko dla Tbr2 lub podwójnej kortyny (DCX) bez barwienia analogiem tymidyny Edu.- Przenieść skrawki z roztworu płynu niezamarzającego do soli fizjologicznej buforowanej Tris (TBS) w kolejności seryjnej na płytce 48-dołkowej.
- Przemyć sekcje dwukrotnie w TBS-tryton (0,05% TBS-triton, Tabela 1) przez 5 minut, zasysając roztwór za każdym razem podczas potrząsania lub na bujaku przy niskich prędkościach.
- Przepuszczalność skrawków za pomocą bufora przepuszczalnego (0,5% TBS-tryton, tabela 1) przez 20-30 minut podczas wytrząsania przy niskich prędkościach.
- Utworzyć bufor blokujący, dodając 0,33 μl surowicy osła do 10 ml TBS-trytonu. Przygotuj świeże i zużyj w ciągu 3 dni.
- Odessać bufor permeabilizacyjny i inkubować sekcje w buforze blokującym przez 30 min do 1 h w temperaturze pokojowej (RT).
- Przygotować pierwszorzędowy roztwór przeciwciał w buforze blokującym i dodać do każdej studzienki. 500 μl / dołek wystarczy, aby wszystkie odcinki tkanki były całkowicie zanurzone. Inkubować przez noc w temperaturze pokojowej na bujaku lub shakerze.
- Odessać roztwór i przepłukać sekcje w TBS-triton 3x przez 10 minut każda, aby usunąć ślady przeciwciała pierwotnego.
- Inkubować w sprzężonym z fluoroforem przeciwciałie drugorzędowym przeciwko przeciwciałom pierwszorzędowym przygotowanym w blokującym roztworze buforowym przez 2 godziny w temperaturze pokojowej na kołysce.
- Przemyć sekcje 3x przez 5 minut każda w TBS-tryton, a następnie inkubować sekcje w roztworze 4′,6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) (roztwór 300 μM w stosunku 1:100) rozcieńczonym w PBS przez 15 min.
- Umyj sekcje 3x w PBS i zamontuj sekcje zachowując porządek szeregowy od przodu do tyłu na dodatnio naładowanym szkiełku. Pozostaw tkankę do wyschnięcia w temperaturze pokojowej, aż wilgoć wyraźnie zniknie, zwykle około 2-5 minut, przed nałożeniem szkiełka nakrywkowego za pomocą środka montażowego.
- Pobieranie antygenu
nuta: Ta sekcja jest wymagana tylko dla nestin. W przypadku barwienia gniazda należy wykonać tę sekcję przed barwieniem analogiem tymidyny (sekcja 5.3). Pomiń barwienie Tbr2 lub DCX za pomocą Edu.- Umieść skrawki tkanki w PBS i zamontuj 5-8 odcinków na dodatnio naładowanym szkiełku, zachowując porządek szeregowy od przodu do tyłu. Pozostaw skrawki tkanek do wyschnięcia w temperaturze pokojowej, aby całkowicie przylegały do szkiełek, co zajmuje około 2-5 minut. Tkanka powinna być widocznie pozbawiona wilgoci.
- Przygotować bufor cytrynianu (Tabela 1) w pojemniku, zwykle w pudełku z końcówkami do pipet o pojemności 1 000 μl.
- Podgrzej bufor cytrynianu w kuchence mikrofalowej (1 000 W) przez 5 minut, aż roztwór się zagotuje. Podczas podgrzewania roztworu umieść zamontowane sekcje w 20-suwakowym uchwycie na szklane prowadnice. Po 5 minutach ostrożnie umieść uchwyt szkiełka z sekcjami w pudełku z pipetami.
- Ustaw moc kuchenki mikrofalowej na 50% i czas gotowania przez 7 minut. Uruchom minutnik na 7 minut i obserwuj kuchenkę mikrofalową. W ciągu tych 7 minut zatrzymaj kuchenkę mikrofalową, gdy roztwór zacznie wrzeć i kontynuuj kuchenkę mikrofalową po ustaniu gotowania.
nuta: Celem tego kroku jest utrzymanie temperatury wody tuż poniżej temperatury wrzenia przez 7 minut. Zatrzymaj się po upływie timera, nawet jeśli czas gotowania w kuchence mikrofalowej nie dobiegł końca. Bardziej szczegółowe instrukcje można znaleźć w Hussaini et al.20. - Wyjmij ciepłe pudełko z buforem cytrynianowym i szkiełkami tkankowymi i umieść je w wiaderku z lodem do ostygnięcia. Przykryj, aby zapobiec przedostawaniu się lodu lub innych materiałów do roztworu. Odczekaj około 30 minut lub do momentu, gdy roztwór ostygnie w dotyku.
- Przejdź do etapu barwienia analogu tymidyny 5.3.2 w przypadku stosowania analogu tymidyny.
- Barwienie analogiem tymidyny
nuta: Zacznij tutaj, jeśli barwisz Edu i Tbr2 lub Edu i DCX.- Umieść skrawki tkanki w PBS i zamontuj 5−8 odcinków na dodatnio naładowanym szkiełku, zachowując porządek szeregowy od przodu do tyłu i tę samą orientację. Pozostaw skrawki tkanki do wyschnięcia, aby całkowicie przylegały do szkiełek, a następnie narysuj granicę za pomocą pisaka hydrofobowego lub pisaka PAP.
- Przepuszczalność skrawków z buforem przepuszczalnym (0,5% TBS-tryton) przez 20−30 min. Następnie umyj sekcje 2x przy użyciu TBS-tryton przez 5 min każda.
nuta: Permeabilizacja wspomaga wewnątrzkomórkową penetrację przeciwciał. Czas przepuszczalności można dostosować w zależności od grubości tkanki i wydajności przeciwciał. Alternatywnie można zwiększyć stężenie detergentu, aby zwiększyć siłę przepuszczalności. Należy jednak uważać, aby nie przenikać zbyt długo, ponieważ kruchość tkanek wzrasta wraz z wydłużonym czasem przepuszczalności. - Przygotować roztwór reakcyjny Edu zgodnie z tabelą 1. Końcowe stężenie azydku Alexa488 wynosi 15 μM w 1 ml roztworu reakcyjnego Edu.
- Inkubować skrawki w roztworze reakcyjnym Edu przez 30 min do 1 h, a następnie myć 3x w TBS-tryton przez 5 min każda. Po tym kroku pokrowiec zasłania folią aluminiową, aby chronić przed światłem. Na tym etapie sprawdź, czy reakcja Edu zadziała, używając mikroskopu fluorescencyjnego. Komórki znakowane Edu będą fluoryzować pod mikroskopem epifluorescencyjnym.
- Protokół zamontowanego wycinka tkanki
- Blokować skrawki tkanek zamontowane na szkiełku podstawowym z kroku 5.3.4 za pomocą buforu blokującego wyhodowanego u tych samych zwierząt, co przeciwciało drugorzędowe, np. surowica osła, przez 30 minut do 1 godziny, a następnie przemywać 2x w TBS-tryton przez 5 minut każdy.
- Przygotować roztwór przeciwciała pierwszorzędowego (tj. anty-nestyny kurzej) podczas etapu blokowania, mieszając przeciwciała pierwszorzędowe w roztworze buforowym blokującym w stosunku 1:200. 250 μl na szkiełko jest wystarczające, aby zapewnić, że tkanka jest całkowicie zanurzona w roztworze.
- Skrawki tkanek inkubować w roztworze przeciwciała pierwszorzędowego przez noc w temperaturze pokojowej po zablokowaniu płukania. Zmodyfikuj ten krok w zależności od użytego przeciwciała pierwszorzędowego.
nuta: Jeśli przeciwciała mają wysokie wiązanie tła lub niespecyficzne, inkubacja w temperaturze 4 °C zamiast RT może poprawić wyniki. W razie potrzeby przeciwciała o słabej penetracji tkanek można pozostawić do inkubacji na 2 dni. - Inkubować skrawki tkanek 3x w TBS-tryton przez 5 minut, aby usunąć nadmiar przeciwciał pierwszorzędowych. Następnie inkubować skrawki tkanek w sprzężonych z fluoroforem przeciwciałach drugorzędowych (tj. Alexa 647 anty-kurczak w stosunku 1:200) przygotowanych w blokującym roztworze buforowym przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
- Inkubować skrawki tkanek 3x w TBS-tryton przez 5 minut w celu usunięcia nadmiaru przeciwciał drugorzędowych i nakładać 300 μM roztwór DAPI w stosunku 1:100 w PBS przez 15 minut w RT.
- Inkubuj skrawki tkanek 3x w PBS przez 5 minut, aby usunąć nadmiar DAPI i usuń krąg pisaka z wokół tkanki za pomocą bawełnianego wacika lub delikatnej chusteczki do zadań. Pozostaw sekcje do wyschnięcia, a następnie nałóż media montażowe i szkiełko nakrywkowe. Poczekaj, aż nośnik montażowy wyschnie przed użyciem szkiełek do obrazowania.
6. Kolekcja obrazów
- Ślepe grupy eksperymentalne z grup kontrolnych zakrywając etykiety slajdów i obrazując tę samą stronę DG za pomocą mikroskopu konfokalnego (tabela materiałów) z 40-krotnym powiększeniem oleju soczewki optycznej o rozmiarze kroku 1 μm lub 20-krotnym zoomie przy 1 μm,
nuta: 40-krotne powiększenie oleju zapewni większą rozdzielczość, ale zajmie więcej czasu niż 20-krotny zoom. - Ustaw soczewkę obiektywu na 40x, a następnie kliknij zakładkę lokalizacji w lewym górnym rogu w oprogramowaniu konfokalnym (tabela materiałów) i ustaw żądaną sekcję DG na środku pola view.
- Znajdź DG, przejdź do zakładki pobierania w lewym górnym rogu i zaznacz następujące pola: Z-stack, kafelek-skan i pozycja.
- Ustaw ustawienia kanału w zakresie wzmocnienia 600−750, intensywności lasera 1%−15% i przesunięcia 1−10. Nie przekraczaj 20% intensywności lasera dla żadnego z kanałów. Upewnij się, że żadne piksele nie są przesycone podczas ustawiania wzmocnienia i intensywności.
nuta: Zakresy te będą się różnić w zależności od wydajności używanego sprzętu i skuteczności barwienia. - Ustaw kafelki na 7 w poziomie na 3 w pionie w oknie skanowania kafelków i naciśnij skanuj obraz podglądu przy użyciu tych samych ustawień, które są aktualnie używane. Na przykład użyj obiektywu 7 w poziomie na 3 w pionie i obiektywu 20x z zoomem 2x.
- Upewnij się, że DG znajduje się całkowicie w oczekiwanym obrazie po skanowaniu ogólnym. Jeśli nie, dostosuj widok DG do momentu, aż znajdzie się całkowicie na obrazie ogólnym, ponieważ jest to reprezentatywny obraz, który zostanie uzyskany.
- Ustaw głębię obrazu, przewijając różne stosy Z za pomocą pokrętła precyzyjnej ostrości. Upewnij się, że cała dyrekcja generalna znajduje się w obrębie punktu początkowego i końcowego. Zakładając rozmiar kroku 1 μm, każdy obraz powinien mieć około 40 kroków.
- Ustaw szybkość skanowania na 9 ze skanowaniem dwukierunkowym i bez uśredniania w oknie trybu akwizycji. Następnie dodaj pozycję w oknie pozycji.
nuta: Powtórz kroki 6.3−6.8, aby zobrazować kilka DG jednocześnie. Zwiększenie szybkości skanowania obniża jakość obrazu, ale skraca całkowity czas obrazowania. Jeśli jakość obrazu jest zbyt niska, zmniejsz szybkość skanowania lub zwiększ średnie. - Kliknij przycisk Rozpocznij eksperyment, gdy będziesz gotowy. Zeskanuj 5 sekcji DG na mysz wzdłuż osi od przodu do tyłu. Na przykład, jeśli lewa DG jest zobrazowana dla sekcji pierwszej, wyobraź sobie następną najbardziej wysuniętą po lewej DG dla sekcji drugiej.
- Zszyj ze sobą oddzielne obrazy, aby utworzyć pełny obraz zakrętu zębatego za pomocą funkcji ściegu w zakładce procesu w oprogramowaniu konfokalnym. Alternatywnie, użyj FIJI (ImageJ), aby zszyć obrazy razem, aby utworzyć kompletny zakręt zębaty.
- Zapisz zszyte obrazy w celu oceny ilościowej.
7. Analiza obrazu
- Otwórz każdy obraz każdego odcinka zakrętu zębatego, używając FIJI zarówno jako maksymalnej projekcji, jak i jako obrazu złożonego z kanałami połączonymi w różnych kolorach, aby łatwo zwizualizować kolokalizację.
- Zmierz obszar DG dla każdej sekcji maksymalnego obrazu projekcji za pomocą narzędzia do zaznaczania wielokątów (trzecie pole od lewej) i nagraj dla każdej sekcji każdej myszy. Będzie to obszar DG wykorzystywany do obliczania gęstości.
- Zapisz liczbę komórek w DG z obrazu złożonego, które mają kolokalizujące przeciwciało pierwszorzędowe (tj. Nestynę) i analog tymidyny Edu, korzystając z licznika komórek wtyczki FIJI znajdującego się w sekcji wtyczki | analiza | licznik komórek | licznik komórek. Dodatkowo zapisz całkowitą liczbę komórek Edu dodatnich i gniazdynowo-dodatnich w procesie promieniowym.
nuta: W przypadku nestiny bardzo ważne jest zwrócenie uwagi na morfologię. W przypadku ilościowego oznaczania nerwowych komórek macierzystych należy upewnić się, że tylko komórki z procesem promieniowym są oznaczane ilościowo. Podczas ilościowego określania przekrojów zakrętu zębatego zastosuj te same kryteria do wszystkich, zwłaszcza podczas wizualizacji komórek poza płaszczyzną ogniskową. Jeśli komórki nie znajdują się w płaszczyźnie ogniskowej, nie licz ich. Zobacz West et al.21, aby uzyskać bardziej szczegółowe instrukcje dotyczące kwantyfikacji stereologicznej. - Wprowadź liczbę komórek w arkuszu kalkulacyjnym, aby skompilować wszystkie dane do późniejszej analizy.
- Oblicz gęstość kolokalizowanych komórek dla każdej sekcji, dzieląc całkowitą liczbę kolokalizowanych komórek przez całkowitą objętość każdej sekcji u każdego zwierzęcia. Na przykład gęstość komórek macierzystych uzyskaj, dzieląc sumę komórek nestin+/edu+ u jednego zwierzęcia przez sumę objętości DG u jednego zwierzęcia. Oblicz objętość każdej sekcji, mnożąc powierzchnię przez całkowite przyrosty kroku Z, przyjmując, że każdy krok wynosi 1 μm.
nuta: W tym protokole łączna liczba kroków powinna być bliska 40, ponieważ tkanka jest cięta na 40 μm. Upewnij się, że każde zwierzę jest punktem danych, ponieważ celem tego podejścia jest oszacowanie całkowitej ilości kolokalizowanych komórek w jednej półkuli hipokampa. - Wykonaj dodatkowe niezbędne obliczenia dla pytania, na które próbujesz odpowiedzieć. W tym przykładzie oblicz całkowitą liczbę proliferujących komórek, całkowitą populację komórek macierzystych i procent proliferujących komórek macierzystych po stymulacji przeciwległych komórek omszałych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Po przeprowadzeniu procedur eksperymentalnych opisanych powyżej (Rycina 1A,B) byliśmy w stanie określić wpływ stymulacji kontralateralnych rzutów komórek mchowych na niszę neurogenną w hipokampie. Wykorzystując wirusa DREADD sprzężony z białkiem Gq w sposób zależny od Cre, w połączeniu z linią komórek mchowych opisanych za pomocą 5-HT2A Cre, mogliśmy selektywnie aktywować rzuty pobudzające komórek mchowych na kontralateralny DG i stwierdziliśmy, że silna stymulacja komórek m...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Celem tego protokołu jest ocena, w jaki sposób manipulowanie określonymi obwodami neuronalnymi reguluje neurogenezę dorosłego hipokampa in vivo przy użyciu szeregu technik immunohistochemicznych. Testowanie zależnej od aktywności regulacji neurogenezy dorosłych, w której pośredniczą określone obwody neuronalne, jest cenną techniką o dużym potencjale modyfikacji w celu badania różnorodnego zakresu obwodów neuronalnych. Powodzenie tego typu eksperymentów zależy od wielu czynników, w tym dokładnego dostarczania wirusa, właś...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
L.J.Q. był wspierany przez Narodowy Instytut Zdrowia Psychicznego Narodowych Instytutów Zdrowia w ramach Dodatku do Różnorodności R01MH111773 oraz grant szkoleniowy T32 T32NS007431-20. Projekt ten był wspierany z grantów przyznanych J.S. z NIH (MH111773, AG058160 i NS104530).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Płytka 24-dołkowa | Thermo Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| 48 Płytka studzienkowa | Denville Scientific | T1049 | |
| 5-etynylo-2'-deoksyurydyna (Edu) | NE08701 | karbosynterowy | |
| 70% Izopropyl | Thermo Fisher Scientific | 64-17-5 | |
| Podkładki nasączone alkoholem | Thermo Fisher Scientific | 13-680-63 | |
| Alexa-488 Azide | Thermo Fisher Scientific | A10266 | |
| Gniazdo przeciw kurczakom | Aves | NES; RRID: AB_2314882 | |
| Anty-Koza DCX | Santa Cruz | Cat# SC_8066; RRID: AB_2088494 | |
| Anty-mysz Tbr2 | Thermo Fisher Scientific | 14-4875-82; RRID: AB_11042577 | |
| Roztwór betadyny (powidon-jod) | Amazon | ||
| Kwas cytrynowy [.1M] Kwas cytrynowy (21g/L kwas cytrynowy) | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| N-tlenek klozapiny | Sigma-Aldrich | C08352-5MG | |
| Oprogramowanie konfokalne (Zen Black) | Zeiss Microscopy | Zen 2.3 SP1 FP1 () | |
| Siarczan miedzi (II) Pentahydrate | Thermo Fisher Scientific | AC197722500 | |
| Waciki bawełniane | Amazon | ||
| Scientific | M1100-02 | ||
| Delikatna chusteczka do zadań Kimwipes | Wiertło Kimtech Science | 7557 | |
| 0,5 mm | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| Glikol etylenowy | Thermo Fisher Scientific | E178-1 | |
| Igła Hamilton 2 cale | Hmailton Company | 7803-05 | |
| Strzykawka Hamilton 5 μ L Model 75 RN | Hmailton Company | Nr ref.: 87931 | |
| Wiertarka szybkoobrotowa | Foredom | 1474 | |
| Pompa infuzyjna | Aparat Harvard | 70-4511 | |
| Roztwór soli fizjologicznej do wstrzykiwań | Mountainside Health Care | NDC 0409-4888-20 | |
| Strzykawka insulinowa | BD Ultra-drobne strzykawki do insuliny | ||
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| Stereotax dla małych zwierząt | Instrumenty KOPF | Model 942 | |
| Leica M80 | Leica | ||
| Leica Microtome | Leica | SM2010 R | |
| LSM 780 | Mikroskopia | ||
| Nair (produkt do depilacji) | Nair | ||
| Paraformaldahyde 4% | Sigma-Aldrich | ||
| 158127 Plus Naładowana szkiełko | Denville Scientific | M1021 | |
| Roztwór buforowany fosforanem (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010031 | |
| Puralube Maść weterynaryjna | Puralube | ||
| Slide Rack 20 suwaków Mikroskopia | elektronowa Science | 70312-24 | |
| Uchwyt na stojak na slajdy | Nauka o mikroskopii elektronowej | 70312-25 | |
| Poduszka grzewcza dla małych zwierząt | K& H | ||
| Sacharoza | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Super PAP Pen końcówka 4 mm | PolySciences | 24230 | |
| Skalpel chirurgiczny | MedPride | 47121 | |
| Roztwór buforowy Tris (TBS) | Sigma-Aldrich | T5912 | |
| Cytrynian trójsodowy [0,1 M] Cytrynian trójsodowy (29,4 g/l cytrynian trójsodu) | Sigma-Aldrich | C8532 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Pęseta | Amazon | ||
| Vet Bond Klej tkankowy | 3M | 1469SB |
Bibliografia
- Zhao, C., Deng, W., Gage, F. H. Mechanisms and Functional Implications of Adult Neurogenesis. Cell. 132 (4), 645-660 (2008).
- Spalding, K. L., et al. Dynamics of hippocampal neurogenesis in adult humans. Cell. 153 (6), 1219-1227 (2013).
- Hill, A. S., Sahay, A., Hen, R. Increasing Adult Hippocampal Neurogenesis is Sufficient to Reduce Anxiety and Depression-Like Behaviors. Neuropsychopharmacology. 40 (10), 2368-2378 (2015).
- Clelland, C. D., et al. A functional role for adult hippocampal neurogenesis in spatial pattern separation. Science. 325, (2009).
- Sahay, A., et al. Increasing adult hippocampal neurogenesis is sufficient to improve pattern separation. Nature. 472 (7344), 466-470 (2011).
- Anacker, C., et al. Hippocampal neurogenesis confers stress resilience by inhibiting the ventral dentate gyrus. Nature. , 1(2018).
- Kuhn, H. G., Eisch, A. J., Spalding, K., Peterson, D. A. Detection and Phenotypic Characterization of Adult Neurogenesis. Cold Spring Harb Perspect Biol. , (2016).
- Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis. Journal of Visualized Experiments. (98), 1-13 (2015).
- Podgorny, O., Peunova, N., Park, J. H., Enikolopov, G. Triple S-Phase Labeling of Dividing Stem Cells. Stem Cell Reports. 10 (2), 615-626 (2018).
- Taupin, P. BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: Paradigms, pitfalls, limitations, and validation. Brain Research Reviews. 53 (1), 198-214 (2007).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (12), 5163-5168 (2007).
- Sidor, M. M., Davidson, T. J., Tye, K. M., Warden, M. R., Diesseroth, K., Mcclung, C. A. In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System. J Vis Exp. , (2015).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Primer Optogenetics in Neural Systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
- Yeh, C., Asrican, B., Moss, J., Lu, W., Toni, N., Song, J. Mossy Cells Control Adult Neural Stem Cell Quiescence and Maintenance through a Dynamic Balance between Direct and Indirect Pathways. Neuron. , 1-18 (2018).
- Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable Stereotaxic Surgery in Rodents. Journal of Visualized Experiments. (20), 20-22 (2008).
- Roth, B. L. Primer DREADDs for Neuroscientists. Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).
- Zeng, C., et al. Evaluation of 5-ethynyl-2 ′ -deoxyuridine staining as a sensitive and reliable method for studying cell proliferation in the adult nervous system. Brain Research. 1319, 21-32 (2010).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), 1-9 (2012).
- Hussaini, S. M. Q., Jun, H., Cho, C. H., Kim, H. J., Kim, W. R., Jang, M. Heat-induced antigen retrieval: an effective method to detect and identify progenitor cell types during adult hippocampal neurogenesis. J Vis Exp. , (2013).
- West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. G. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. The Anatomical Record. 231 (4), 482-497 (1991).
- Kuhn, H., Dickinson-Anson, H., Gage, F. Neurogenesis in the dentate gyrus of the adult rat: age-related decrease of neuronal progenitor proliferation. The Journal of Neuroscience. 16 (6), 2027-2033 (1996).
- Gomez, J. L., et al. Chemogenetics revealed: DREADD occupancy and activation via converted clozapine. Science. 357 (6350), 503-507 (2017).
- Thompson, K. J., et al. Dreadd Agonist 21 (C21) Is an Effective Agonist for Muscarnic-Based Dreadds in Vitro and in Vivo. ACS Pharmacology & Translational Science. 72 (3), (2018).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
