Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Platforma wektorów lentiwirusowych do efektywnego dostarczania narzędzi do edycji epigenomu do modeli chorób pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

9.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59241

⸱

29 marca 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, Duke University Medical Center, 2Center for Genomic and Computational Biology, Duke University Medical Center, 3Viral Vector Core, Duke University Medical Center, 4Division of Gynecologic Oncology, Department of Obstetrics and Gynecology, Duke University Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

Ukierunkowana edycja epigenomu DNA reprezentuje potężne podejście terapeutyczne. Protokół ten opisuje produkcję, oczyszczanie i koncentrację wektorów lentiwirusowych typu "wszystko w jednym" zawierających transgen CRISPR-dCas9-DNMT3A do zastosowań w edycji epigenomu w neuronach pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC).

Streszczenie

Wykorzystanie komórek pochodzących z hiPSC stanowi wartościowe podejście do badania ludzkich chorób neurodegeneracyjnych. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowany protokół różnicowania hiPSC pochodzących od pacjenta z potrojeniem locus genu alfa-synukleiny (SNCA) do populacji neuronów dopaminergicznych istotnych dla choroby Parkinsona (PD). Coraz więcej dowodów wykazało, że wysoki poziom SNCA jest przyczyną rozwoju choroby Parkinsona. Uznając niezaspokojoną potrzebę ustanowienia nowych podejść terapeutycznych dla PD, zwłaszcza tych ukierunkowanych na regulację ekspresji SNCA, niedawno opracowaliśmy system oparty na metylacji DNA CRISPR/dCas9 do epigenetycznej modulacji transkrypcji SNCA poprzez wzbogacanie poziomów metylacji w SNCA Region regulacyjny Intron 1. Do dostarczenia systemu, składającego się z martwej (dezaktywowanej) wersji Cas9 (dCas9) połączonej z domeną katalityczną enzymu metylotransferazy DNA 3A (DNMT3A), stosuje się wektor lentiwirusowy. System ten jest stosowany do komórek z potrojeniem locus SNCA i zmniejsza poziom SNCA-mRNA i białka o około 30% poprzez ukierunkowaną metylację DNA intronu SNCA 1. Precyzyjnie dostrojona regulacja w dół poziomów SNCA ratuje fenotypy komórkowe związane z chorobą. W obecnym protokole staramy się opisać krok po kroku procedurę różnicowania hiPSC w neuronalne komórki progenitorowe (NPC) oraz ustanowienie i walidację testów pirosekwencjonowania w celu oceny profilu metylacji w intronie SNCA 1. Aby bardziej szczegółowo przedstawić system lentivirus-CRISPR/dCas9 używany w tych eksperymentach, w niniejszym protokole opisano sposób produkcji, oczyszczania i koncentracji wektorów lentiwirusowych oraz podkreślono ich przydatność do zastosowań związanych z edycją epigenomu i genomu przy użyciu hiPSC i NPC. Protokół jest łatwy do dostosowania i może być stosowany do produkcji lentiwirusów o wysokim mianie do zastosowań in vitro i in vivo.

Wprowadzenie

Ostatnio opracowano wiele platform do edycji epigenomu, które celują w dowolne sekwencje DNA w regionach kontrolujących ekspresję genów1,2. Stworzone narzędzia do edycji epigenomu mają na celu (i) regulację transkrypcji, (ii) zmianę potranslacyjnych modyfikacji histonów, (iii) modyfikację metylacji DNA oraz (iv) modulację interakcji elementów regulatorowych. Podejście polegające na zakotwiczeniu modyfikatorów transkrypcji/chromatyny w dezaktywowanym (martwym) Cas9 (dCas9) powstało na podstawie wcześniej opracowanych platform edycji epigenomu, takich jak białka palca cynkowego (ZFP) i efektory podobne do aktywatorów transkrypcji (TALE), zawierające silną domenę efektorową transkrypcji (ED) połączoną z zaprojektowaną domeną wiążącą DNA (DBD)3. Wyniki pożądanego fenotypu, takie jak aktywacja lub represja, są definiowane przez cząsteczkę efektorową zakotwiczoną w endogennych loci (Rysunek 1). Aby stworzyć programowalne aktywatory transkrypcji, moduły dCas9/gRNA są połączone z VP164,5,6 (Rysunek 1A), domeną aktywacji wirusa, która rekrutuje Pol II i ogólną maszynerię transkrypcyjną. Modyfikacja tego systemu obejmowała VP64, tetramer domen VP16, zapewniający jeszcze bardziej solidny współczynnik aktywacji5,6. System został z powodzeniem wykorzystany do aktywacji regionów kodujących i niekodujących poprzez ukierunkowanie na promotory i elementy regulacyjne. Co ważne, mimo że cząsteczki VP64 nie modyfikują bezpośrednio struktury chromatyny w regionie docelowym, rekrutują modyfikatory chromatyny, które wiążą wyniki w osadzaniu się znaczników aktywnych (euchromatyny), w tym jako acetylacja H3/H4 i H3-K4 di/trimetylacja5,6. Oprócz VP64, podjednostka p65 ludzkiego kompleksu NF-κB została podłączona do modułu dCas9/gRNA7. Co ciekawe, wiązanie tych efektorów z regionami przed miejscami rozpoczęcia transkrypcji (TSS) i w obrębie promotorów powoduje silną indukcję genów. Niemniej jednak, efektory VP64 i p65 mogą również wywierać efekty aktywacyjne, będąc połączonym z regionami znajdującymi się poniżej TSS i w dystalnych wzmacniaczach7,8. Aby wywołać bardziej solidną odpowiedź transkrypcyjną, należy zrekrutować wiele fuzji dCas9-VP64 lub dCas9-p65 do jednego docelowego locus9,10. W związku z tym niedawny rozwój aktywatorów nowej generacji, które rekrutują wiele domen efektorowych przez pojedynczy kompleks dCas9-gRNA, takich jak SunTag, zaowocował większą zdolnością aktywacji w porównaniu z odpowiednikami fuzji dCas9-VP6411,12. Ulepszoną aktywację transkrypcyjną uzyskano poprzez fuzję VP64, p65 i Rta (VPR), domeny transaktywacyjnej z gamma-herpeswirusów, do C-końca dCas913 (Rysunek 1A). Podobne systemy CRISPR/dCas9 zostały opracowane do represji specyficznej dla celu (Rysunek 1B).

Endogenna represja genów może być osiągnięta za pomocą inżynieryjnych fuzji represorów za pomocą różnych mechanizmów (Rysunek 1B). Wykazano, że systemy CRISPR/dCas9, połączone z represorem DBD (nawet bez domeny efektorowej), mogą skutecznie wyciszać ekspresję genów, gdy są przywiązane do promotora lub regionów upstream/downstream-TSS3,6,14. Wpływ na transkrypcję jest spowodowany steryczną interferencją wiązania czynnika transkrypcyjnego i przetwarzania polimerazy RNA. Niemniej jednak potrzebne są bardziej kompleksowe podejścia, ponieważ represja genów przez samą przeszkodę steryczną często nie wystarcza do solidnego wyciszenia. Niedawny rozwój nowej generacji tłumików opartych na systemach CRISPR/dCas9 przenoszących domeny represorowe transkrypcji (TRD), modyfikatory histonów (di-/trimetylacja H3-K9, di-/trimetylacja H3-K27; H3-K36 di-/tri-metylacja, deacetylacja H3/H4) i metylacja DNA (CpG) doprowadziły do skonstruowania narzędzi epigenetycznych, które pozwoliły na bardziej silne efekty wyciszania4,5,15,16,17,18,19,20. Wykazano, że rekrutacja tych modyfikatorów epigenetycznych do DNA może prowadzić do powstania bardziej zamkniętej i skondensowanej chromatyny, która zazwyczaj generuje silniejszy wynik wyciszania21,22. Najczęściej używaną domeną wyciszającą z DBD jest skrzynka powiązana z Krüppel (KRAB)4,5. Wykazano, że rekrutacja czynnika odpowiada zmianom chromatyny; Niemniej jednak mechanizmy tych modyfikacji nie zostały jeszcze wyjaśnione16,17,18. Ostatnio wykazano, że lokalizacja KRAB w DNA może sprzyjać składaniu się metylotransferazy histonowej SETDB1 i kompleksów NuRD deacetylacji histonów (HDAC), co sugeruje możliwość, że te interakcje pośredniczą w tworzeniu kondensacji chromatyny i wyciszaniu transkrypcji3,13. Alternatywnym podejściem jest fuzja domen efektorowych z DBD w celu stworzenia niestandardowego epigenetycznego białka wyciszającego. System ten bezpośrednio katalizuje represyjne znaczniki DNA lub modyfikacje histonów.

Ostatnio, użycie syntetycznych systemów CRISPR/dCas9 związanych z enzymem DNMT3A zostało ponownie wykorzystane do dezaktywacji transkrypcji. DNMT3A katalizuje metylację DNA, która wywiera represję transkrypcyjną podczas tworzenia heterochromatyny na endogennych promotorach genów i innych regionach regulatorowych (Rysunek 1B)18,20. McDonald et al.18 oraz Vojta et al.20 byli pierwszymi autorami, którzy poinformowali, że metylacja DNA może być wykorzystana do wyciszania lub represji genu epigenomu, wykazując, że system fuzyjny dCas9-DNMT3A dostarczany przez plazmid może silnie zwiększać metylację cytozyny wokół klasy TSS18,20. McDonald i współpracownicy wykazali, że zastosowanie tej strategii może skutkować znacznym zmniejszeniem (około 40%) poziomu mRNA genu supresorowego nowotworu, CDKN2A mRNA18. Podobnie, celowanie w niemetylowany region promotora genów BACH lub IL6ST pokazuje zwiększoną metylację CpG, która została skorelowana z dwukrotnym zmniejszeniem ekspresji genu20. Nasze laboratorium niedawno zmieniło przeznaczenie metylacji DNA do łagodzenia patologicznych skutków nadekspresji SNCA ( Rysunek 2) 23. Strategia opiera się na selektywnym zwiększaniu metylacji DNA w regionie intronu SNCA 1, ponieważ wcześniej donoszono, że jest on hipometylowany w PD i demencji z ciałami Lewy'ego (DLB) mózgi24,25,26. Ta hipometylacja została powiązana z nadekspresją SNCA, oferując w ten sposób atrakcyjny cel dla interwencji terapeutycznej24,27,28. Niedawno wykazaliśmy niski poziom metylacji DNA w regionie intronu SNCA 1 w dopaminergicznych NPC pochodzących z hiPSC uzyskanych od pacjenta z PD z potrójnym SNCA 23. Zaletą tego modelu eksperymentalnego jest to, że NPC mogą być silnie rozmnażane w kulturze lub dalej różnicowane w dojrzałe neurony, co umożliwia skuteczne badanie przesiewowe w celu identyfikacji czynników genetycznych, które pośredniczą w fenotypach komórkowych, w tym stresu oksydacyjnego i apoptozy29. Co więcej, ten system modelowy umożliwia naukowcom podsumowanie zdarzeń rozwojowych, które wystąpiły przed wystąpieniem objawów u pacjentów. Ponadto NPC pochodzące z hiPSC stanowią doskonałe narzędzie do testowania szlaków komórkowych i molekularnych związanych z ekspresją genów. Co ważne, NPC pochodzące z hiPSC w połączeniu z najnowocześniejszą technologią epigenomu CRISPR/Cas9 mogą znacznie ułatwić opracowywanie "leków nowej generacji" na wiele chorób neurodegeneracyjnych.

Aby zmniejszyć patologiczne poziomy ekspresji SNCA, niedawno opracowaliśmy system oparty na lentiwirusie, przenoszący białko fuzyjne dCas9-DNMT3A i gRNA, aby specyficznie celować w metylację CpG w intronie SNCA 1 (Rysunek 2A)23. Protokół ten szczegółowo opisuje projektowanie i produkcję wektora lentiwirusowego (LV). Pojazdy LV stanowią skuteczny sposób dostarczania komponentów CRISPR/dCas9 z kilku powodów, a mianowicie: (i) ich zdolności do przenoszenia dużych insercji DNA, (ii) wysokiej wydajności transdukcji szerokiego zakresu komórek, w tym zarówno komórek dzielących, jak i niedzielących się30, oraz (iii) ich zdolności do wywoływania minimalnych odpowiedzi cytotoksycznych i immunogennych. Niedawno zastosowaliśmy system LV do neuronów dopaminergicznych pochodzących z hiPSC od pacjenta z potrojeniem locus SNCA i wykazaliśmy potencjał terapeutyczny LV w dostarczaniu narzędzi metylacji do edycji epigenomu23 (Figura 2B). Rzeczywiście, układ LV-gRNA/dCas9-DNMT3A powoduje znaczny wzrost metylacji DNA w regionie intronu SNCA 1. Wzrost ten odpowiada obniżeniu poziomów mRNA SNCA i białka23. Co więcej, regulacja w dół SNCA ratuje fenotypy związane z PD w neuronach dopaminergicznych pochodzących z potrójnej i hiPSC SNCA (np. produkcja mitochondrialnych ROS i żywotność komórek)23. Co ważne, wykazaliśmy, że zmniejszenie ekspresji SNCA przez system LV-gRNA-dCas9-DMNT3A jest w stanie odwrócić fenotypy, które są charakterystyczne dla neuronów dopaminergicznych pochodzących z hiPSC od pacjenta z chorobą Parkinsona, który był nosicielem potrojenia SNCA, takich jak mitochondrialna produkcja ROS i żywotność komórek23. Celem tego protokołu jest: 1) nakreślenie protokołu produkcji i koncentracji zoptymalizowanej platformy LV do generowania preparatów wirusowych o wysokiej daweczkowaniu oraz 2) opisanie różnicowania hiPSC w NPC o wzorcu dojrzałych neuronów dopaminergicznych31,32 oraz charakterystyka poziomów metylacji docelowego regionu w obrębie intronu SNCA 1.

Platformy lentiwirusowe mają dużą przewagę nad najpopularniejszą platformą wektorową, a mianowicie wektorami związanymi z adenowirusami (AAV), którą jest zdolność tych pierwszych do przyjmowania większych wstawek genetycznych33,34. AAV mogą być generowane ze znacznie wyższą wydajnością, ale mają niską pojemność pakowania (<4,8 kb), co ogranicza ich zastosowanie do dostarczania kompleksowych systemów CRISPR/Cas9. W związku z tym wydaje się, że LV byłyby platformą z wyboru w aplikacjach związanych z dostarczaniem narzędzi CRISPR/dCas9. W związku z tym przedstawiony tutaj protokół będzie cennym narzędziem dla badaczy pragnących skutecznie dostarczyć komponenty do edycji epigenomu do komórek i narządów. Protokół dodatkowo nakreśla strategię zwiększania możliwości produkcyjnych i ekspresyjnych wektorów poprzez modyfikację w cis elementów w wyrażeniu wektorowym cassette30,35. Strategia opiera się na nowatorskim systemie opracowanym i badanym w naszym laboratorium i podkreśla jego zdolność do wytwarzania cząsteczek wirusa w zakresie 1010 jednostek wirusowych (VU)/ml30,35.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Projekt systemu i produkcja wirusa

  1. Projektowanie i konstrukcja plazmidu
    UWAGA: Konstrukcja all-in-one wektora LV-gRNA-dCas9-DNMT3A jest przeprowadzana z wykorzystaniem kasety ekspresyjnej zoptymalizowanej pod kątem produkcji i ekspresji, opublikowanej przez Ortinskiego i wsp.30. Kaseta wektora zawiera powtórzenie sekwencji rozpoznawczej czynnika transkrypcyjnego Sp1 oraz nowoczesną delecję w regionie nietranslacyjnym (U3') długiego powtórzenia końcowego (LTR) 3' (Rysunek 2A)30,36. Wykazano, że szkielet wektora jest skuteczny w dostarczaniu i ekspresji CRISPR/Cas930,35.
    1. Uzyskać zdezaktywowaną (martwą) wersję białka SpCas9 (dCas9) poprzez mutogenezę celowaną (dane nie przedstawiono). Zastąpić klon zawierający mutacje D10A i H840A odpowiednio w domenach katalitycznych HNH i RuvC enzymu aktywnym białkiem Cas9 w pBK30129 poprzez wymianę fragmentów AgeI-BamHI (Rysunek 3).
    2. Wyizolować domenę katalityczną DNMT3A z pdCas9-DNMT3A-eGFP (patrz Tabela materiałów) poprzez amplifikację części DNMT3A za pomocą starterów BamHI-429/R 5'-GAGCGGATCCCCCTCCCG-3' oraz BamHI-429/L 5'-CTCTCCACTGCCGGATCCGG-3' (Rysunek 3). Do amplifikacji regionu zawierającego DNMT3A zastosować następujące warunki: (1) 95 °C przez 60 s, (2) 95 °C przez 10 s, (3) 60 °C przez 20 s, (4) 68 °C przez 60 s. Powtórzyć cykle od 2 do 4 30x. Do końcowej elongacji zastosować 68 °C przez 3 min, a następnie utrzymać 4 °C.
    3. Sklonować fragment DNMT3A, potraktowany enzymem restrykcyjnym BamHI, w miejsce BamHI zmodyfikowanego wektora pBK301 zawierającego dCas9. Zweryfikować klonowanie za pomocą bezpośredniego sekwencjonowania metodą Sangera. Należy zauważyć, że otrzymany plazmid zawiera transgen dCas9-DNMT3A-p2a-puromycyna. Plazmid ten ekspresuje rusztowanie gRNA z ludzkiego promotora U6 (Rysunek 3).
    4. Zastąpić gen reporterowy puromycyny zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP), aby stworzyć dCas9-DNMT3A-p2a-GFP. Potraktować plazmid dCas9-DNMT3A-p2a-Puro enzymem FseI. Oczyścić fragment wektora metodą oczyszczania z żelu. Przygotować insert, trawiąc pBK201a (pLenti-GFP) enzymem FseI. Sklonować fragment FseI do wektora. Otrzymany plazmid pBK539 zawiera transgen dCas9-DNMT3A-p2a-GFP (Rysunek 3).
  2. Hodowla komórek HEK-293T i wysiew komórek do transfekcji
    UWAGA: Ludzkie komórki embrionalnej nerki 293T (HEK-293T) hoduje się w pełnej pożywce DMEM z wysoką zawartością glukozy (DMEM; 10% serum cielęce, 1x antybiotyk-antymykotyk, 1x pirogronian sodu, 1x nieessentialne aminokwasy, 2 mM L-glutamina) w temperaturze 37 °C przy 5% CO2. Dla zapewnienia powtarzalności protokołu zaleca się przetestowanie serum cielęcego przy zmianie partii/serii. Do produkcji lentiwirusów potrzebnych jest do sześciu płytek 15 cm.
    1. Do rozpoczęcia nowej hodowli użyć komórek o niskim numerze pasażu (niższym niż 20). Gdy komórki osiągną 90%–95% konfluencji, odessać pożywkę i delikatnie przemyć sterylnym 1x roztworem soli fosforanowej w buforze (PBS).
    2. Dodać 2 mL trypsyny-EDTA (0,05%) i inkubować w 37 °C przez 3–5 min. Aby inaktywować odczyn rozszczepiający, dodać 8 mL pełnej pożywki DMEM z wysoką zawartością glukozy i pipetować 10x–15x pipetą serologiczną 10 mL, aby stworzyć zawiesinę pojedynczych komórek o stężeniu 4 x 106 komórek/mL.
    3. Do transfekcji płytki 15 cm pokryć 0,2% żelatyną. Dodać 22,5 mL pożywki z wysoką zawartością glukozy i wysiać komórki, dodając 2,5 mL zawiesiny komórkowej (łącznie ~1 x 107 komórek/płytkę). Inkubować płytki w 37 °C przy 5% CO2 do osiągnięcia 70%–80% konfluencji.
  3. Transfekcja komórek HEK-293T
    1. Przygotować 2x roztwór buforowy BES (BBS) oraz 1 M CaCl2 zgodnie z metodą Vijayraghavana i Kantora35. Przefiltrować roztwory przez filtr 0,22 µm i przechowywać w 4 °C. Mieszanina do transfekcji musi być klarowna przed dodaniem do komórek. Jeśli mieszanina zmętnieje podczas inkubacji, przygotować świeży 2x BBS (pH = 6,95).
    2. Aby przygotować mieszaninę plazmidów, użyć czterech wymienionych plazmidów (poniższa mieszanina jest wystarczająca dla jednej płytki 15 cm): 37,5 µg wektora transferowego CRISPR/dCas9 (pBK492 [DNMT3A-Puro-NO-gRNA] lub pBK539 [DNMT3A-GFP-NO-gRNA]); 25 µg pBK240 (psPAX2); 12,5 µg pMD2.G; 6,25 µg pRSV-rev (Rysunek 4A). Obliczyć objętość plazmidów na podstawie stężeń i dodać wymagane ilości do probówki stożkowej 15 mL. Dodać 312,5 µL 1 M CaCl2 i dopełnić objętość końcową do 1,25 mL sterylną wodą dd-H2O. Delikatnie dodać 1,25 mL roztworu 2x BBS podczas mieszania w wortexie. Inkubować przez 30 min w temperaturze pokojowej. Komórki są gotowe do transfekcji, gdy osiągną 70%–80% konfluencji.
    3. Odessać pożywkę i zastąpić ją 22,5 mL świeżo przygotowanej pożywki DMEM z wysoką zawartością glukozy bez serum. Do każdej płytki 15 cm dodać kroplami 2,5 mL mieszaniny do transfekcji. Zamieszać płytki okrężnie i inkubować w 37 °C przy 5% CO2 przez 2–3 h.
    4. Po 3 h dodać 2,5 mL (10%) serum na płytkę i inkubować przez noc w 37 °C przy 5% CO2.
    5. W 1. dniu po transfekcji sprawdzić komórki, aby upewnić się, że śmierć komórek jest minimalna lub nie występuje, a komórki utworzyły konfluentną kulturę (100%).
      1. Wymienić pożywkę, dodając do każdej płytki 25 mL świeżo przygotowanej pożywki DMEM z wysoką zawartością glukozy i 10% serum.
    6. Inkubować w 37 °C przy 5% CO2 przez 48 h.
  4. Zbiór wirusa
    1. Zebrać nadsącz ze wszystkich transfektowanych komórek i połączyć w probówkach stożkowych 50 mL. Wirować przy 400–450 x g przez 10 min. Przefiltrować nadsącz przez jednostkę filtra próżniowego 0,45 µm. Po filtracji nadsącz można przechowywać w 4 °C w celu krótkoterminowego przechowywania (do 4 dni). Do długoterminowego przechowywania przygotować aliquoty i przechowywać w -80 °C.
      UWAGA: Przewiduje się, że niekoncentrowane preparaty wirusowe będą miały miano ~2 x 107 do 3 x 107 vu/mL (patrz sekcja 1.5 w celu oznaczenia miana). Wysoce zaleca się przygotowanie aliquotów do jednorazowego użycia, ponieważ wielokrotne cykle zamrażania i rozmrażania spowodują utratę miana funkcjonalnego o 10%–20%.
  5. Koncentracja cząstek wirusowych
    UWAGA: Do oczyszczania stosuje się dwuetapową metodę podwójnej sacharozy, obejmującą etap gradientu sacharozy i etap poduszki sacharozowej (Rysunek 4B).
    1. Aby stworzyć gradient sacharozy, przygotować stożkowe probówki do ultrawirowania w następującej kolejności: 0,5 mL 70% sacharozy w 1x PBS, 0,5 mL 60% sacharozy w DMEM, 1 mL 30% sacharozy w DMEM i 2 mL 20% sacharozy w 1x PBS.
    2. Ostrożnie dodać nadsącz, zebrany zgodnie z sekcją 1.4, do gradientu. Ponieważ całkowita objętość zebrana z czterech płytek 15 cm wynosi 100 mL, do przetworzenia nadsączu wirusowego należy użyć sześciu probówek do ultrawirowania.
    3. Równomiernie rozdzielić nadsącz wirusowy pomiędzy probówki do ultrawirowania. Aby uniknąć pęknięcia probówek podczas wirowania, napełnić je co najmniej do trzech czwartych ich całkowitej pojemności. Zrównoważyć probówki za pomocą 1x PBS. Wirować próbki przy 70 000 x g przez 2 h w 17 °C.
      UWAGA: Aby utrzymać warstwę sacharozy podczas etapów przyspieszania i zwalniania, należy ustawić ultrawirowarkę tak, aby rotor powoli przyspieszał od 0 do 200 x g i zwalniał od 200 do 0 x g odpowiednio podczas pierwszych i ostatnich 3 min wirowania.
    4. Delikatnie zebrać frakcje 30%–60% sacharozy do czystych probówek (Rysunek 4B). Dodać zimny 1x PBS do uzyskania całkowitej objętości 100 mL. Pomieszać poprzez wielokrotne pipetowanie.
    5. Ostrożnie nałożyć preparat wirusowy na poduszkę sacharozową, dodając do probówki 4 mL 20% sacharozy (w 1x PBS). Następnie nalać pipetą ~20–25 mL roztworu wirusowego do każdej probówki. Dopełnić probówki 1x PBS, jeśli objętość zawartości jest mniejsza niż trzy czwarte probówki. Ostrożnie zrównoważyć probówki. Wirować przy 70 000 x g przez 2 h w 17 °C. Odlać nadsącz i odwrócić probówki na ręcznikach papierowych, aby pozostały ciecze spłynęły.
    6. Usunąć całą ciecz, ostrożnie odsysając pozostałości. Należy zauważyć, że na tym etapie pellety zawierające wirusa są ledwie widoczne jako małe, półprzezroczyste plamki. Dodać 70 µL 1x PBS do pierwszej probówki, aby resuspendować pellet. Dokładnie wymieszać zawiesinę pipetą i przenieść ją do następnej probówki, aż wszystkie pellety zostaną resuspendowane.
    7. Przemyć probówki dodatkowymi 50 µL 1x PBS i wymieszać jak wcześniej. Należy zauważyć, że na tym etapie objętość końcowej zawiesiny wynosi ~120 µL i ma ona lekko mleczny wygląd. Aby uzyskać klarowną zawiesinę, przeprowadzić 60-sekundowe wirowanie przy 10 000 x g. Przenieść nadsącz do nowej probówki, przygotować aliquoty 5 µL i przechowywać w -80 °C.
      ​UWAGA: Preparaty wektorów lentiwirusowych są wrażliwe na powtarzające się cykle zamrażania i rozmrażania. Ponadto sugeruje się, aby pozostałe kroki były wykonywane w komorze do kultur tkankowych lub w wyznaczonych obszarach spełniających odpowiednie standardy poziomu bezpieczeństwa biologicznego (Rysunek 4B).
  6. Ilościowe oznaczenie miana wirusa
    UWAGA: Szacowanie miana wirusa jest przeprowadzane metodą enzymatycznego testu immunoabsorpcyjnego (ELISA) dla p24 (ELISA p24gag) zgodnie z protokołem National Institutes of Health (NIH) AIDS Vaccine Program dla testu wychwytu antygenu HIV-1 p24 z niewielkimi modyfikacjami.
    1. Użyć 200 µL 0,05% Tween 20 w zimnym 1x PBS (PBS-T), aby 3x przemyć dołki płytki 96-dołkowej.
    2. Aby pokryć płytkę, użyć 100 µL monoklonalnego przeciwciała anty-p24 rozcieńczonego 1:1 500 w 1x PBS. Inkubować płytkę przez noc w 4 °C.
    3. Przygotować odczyn blokujący (1% albuminy surowicy wołowej [BSA] w 1x PBS) i dodać 200 µL do każdego dołka, aby uniknąć niespecyficznego wiązania. Przemyć dołki 200 µL PBS-T 3x przez co najmniej 1 h w temperaturze pokojowej.
    4. Przystąpić do przygotowania próbek. W przypadku pracy z skoncentrowanymi preparatami wektora, rozcieńczyć wektor 1:100, używając 1 µL próbki, 89 µL dd-H2O i 10 µL Triton X-100 (do stężenia końcowego 10%). Dla preparatów niekoncentrowanych rozcieńczyć próbki 1:10.
    5. Przygotować standardy HIV-1, stosując dwukrotne rozcieńczenia seryjne (stężenie początkowe wynosi 5 ng/mL).
    6. Rozcieńczyć skoncentrowane próbki (przygotowane w kroku 1.6.4) w pożywce RPMI 1640 uzupełnionej o 0,2% Tween 20 i 1% BSA, aby uzyskać rozcieńczenia 1:10 000, 1:50 000 i 1:250 000. Podobnie rozcieńczyć niekoncentrowane próbki (przygotowane w kroku 1.6.4) w RPMI 1640 z 0,2% Tween 20 i 1% BSA, aby uzyskać rozcieńczenia 1:500, 1:2 500 i 1:12 500.
    7. Nanieść próbki i standardy na płytkę w trzech powtórzeniach. Inkubować przez noc w 4 °C.
    8. Następnego dnia przemyć dołki 6x.
    9. Dodać 100 µL poliklonalnego przeciwciała króliczego anty-p24, rozcieńczonego 1:1 000 w RPMI 1640, 10% płodowej surowicy wołowej (FBS), 0,25% BSA i 2% normalnej surowicy mysiej (NMS), i inkubować w 37 °C przez 4 h.
    10. Przemyć dołki 6x. Dodać kozie przeciwciało anty-królicze IgG z peroksydazą chrzanową rozcieńczone 1:10 000 w RPMI 1640 uzupełnionej o 5% normalnej surowicy koziej, 2% NMS, 0,25% BSA i 0,01% Tween 20. Inkubować w 37 °C przez 1 h.
    11. Przemyć dołki 6x. Dodać substrat peroksydazowy TMB i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 min.
    12. Aby zatrzymać reakcję, dodać 100 µL 1 N HCl. W czytniku mikropłytek zmierzyć absorbancję przy 450 nm.
  7. Pomiar intensywności fluorescencyjnego reportera
    1. Użyć zawiesiny wirusowej do przygotowania 10-krotnego rozcieńczenia seryjnego (od 10-1 do 10-5) w 1x PBS.
    2. Wysiać 5 x 105 komórek HEK-293T do każdego dołka płytki 6-dołkowej. Nanieść 10 µL każdego rozcieńczenia wirusa na komórki i inkubować w 37 °C przy 5% CO2 przez 48 h.
    3. Przeprowadzić analizę za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS) w następujący sposób: odłączyć komórki, dodając 200 µL 0,05% roztworu trypsyny-EDTA. Inkubować komórki w 37 °C przez 5 min i resuspendować je w 2 mL pożywki DMEM (z serum). Zebrać próbki do probówki stożkowej 15 mL i wirować przy 400 x g w 4 °C. Resuspendować pellet w 500 µL zimnego 1x PBS.
    4. Utrwalić komórki, dodając 500 µL 4% paraformaldehydu (PFA) i inkubować przez 10 min w temperaturze pokojowej.
    5. Wirować przy 400 x g w 4 °C i resuspendować pellet w 1 mL 1x PBS. Przeanalizować ekspresję GFP za pomocą urządzenia FACS, zgodnie z opisem Ortinskiego i wsp.30. Aby określić funkcjonalne miano wirusa, zastosować następujący wzór.
      figure-protocol-1
      Gdzie:
      Tg = liczba komórek GFP-dodatnich;
      Tn = całkowita liczba komórek;
      N = całkowita liczba przetransdukowanych komórek;
      V = objętość użyta do transdukcji (w mikrolitrach).
  8. Liczenie komórek GFP-dodatnich
    UWAGA: Określić wielokrotność infekcji (MOI) stosowaną do transdukcji. Przetestować szeroki zakres MOI (od MOI = 1 do MOI = 10).
    1. Wysiać od 3 x 105 do 4 x 105 komórek HEK-293T do każdego dołka płytki 6-dołkowej.
    2. Gdy komórki osiągną konfluencję >80%, przetransdukować je wektorem przy interesującym MOI.
    3. Inkubować w 37 °C przy 5% CO2 i monitorować sygnał GFP w komórkach przez 1–7 dni.
    4. Policzyć liczbę komórek GFP-dodatnich. Użyć mikroskopu fluorescencyjnego (obiektyw Plan 4x, 0,1 N.A., powiększenie 40x) z filtrem GFP (długość fali wzbudzenia = 470 nm, długość fali emisji = 525 nm). Użyć nieprzetransdukowanych komórek do ustalenia populacji kontrolnej komórek GFP-ujemnych.
    5. Zastosować następujący wzór w celu określenia funkcjonalnego miana wirusa.
      figure-protocol-2
      Gdzie:
      N = liczba komórek GFP-dodatnich;
      D = czynnik rozcieńczenia;
      M = czynnik powiększenia;
      V = objętość wirusa użyta do transdukcji.
      UWAGA: Obliczyć wyniki zgodnie z poniższym przykładem: dla 10 komórek GFP-dodatnich (N) policzonych przy rozcieńczeniu (D) 10-4 (1:10 000) przy powiększeniu 20x (M) w próbce 10 µL (V), liczba TU na mililitr wyniesie (10 x 104) x (20) x (10) x (100) = 2 x 108 vu/mL.

2. Różnicowanie dopaminergicznych komórek progenitorowych neuronów

  1. Hodowla hiPSC
    UWAGA: hiPSC od pacjenta z triplikacją locus SNCA, ND34391, pobrano z katalogu National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) (patrz Tabela materiałów).
    1. Hoduj hiPSC w warunkach niezależnych od komórek karmiacych, stosując bezkarmowe pożywne środowisko do hodowli ESC-iPSC (patrz Tabela materiałów) na płytki pokryte błoną z macierzy podstawowej (BMM) zakwalifikowaną dla hESC (patrz Tabela materiałów). Przemyć zlane kolonie 1 ml DMEM/F12, dodać 1 ml odczynnika dysocjującego (patrz Tabela materiałów), a następnie inkubować przez 3 min w temperaturze pokojowej.
    2. Odssać odczyn rozdrabniający i dodać 1 ml pożywki do hodowli ESC-iPSC bez komórek karmicielskich.
    3. Zeskrobać zawartość płytki za pomocą zgarniacza do komórek (cell lifter) i resuspender kolonie w 11 ml pożywki do hodowli ESC-iPSC bez komórek karmionym, pipetując 4–5 razy za pomocą pipet borokrzemianowych.
    4. Nanieś 2 ml zawiesiny kolonii na płytki pokryte BMM i umieść płytkę w 37 °C z 5% CO2Wymieniaj medium codziennie i pasażuj komórki co 5–7 dni.
  2. Różnicowanie w dopaminergiczne progenitorowe komórki neuronalne
    UWAGA: Różnicowanie hiPSC w dopaminergiczne komórki progenitorowe neuronów (MD NPCs) przeprowadza się zgodnie z instrukcjami producenta, stosując komercyjnie dostępny protokół z użyciem medium do indukcji neuronalnej z niewielkimi modyfikacjami.31,32 (patrz Tabela materiałów). Pierwszy dzień różnicowania uznaje się za dzień 0Do wydajnej różnicowania w kierunku neuronalnym wymagane są wysokiej jakości hiPSC. Indukcja NPC z mezodermy (MD NPC) jest przeprowadzana zgodnie z protokołem opartym na ciałach embrionalnych (EB).
    1. Przed rozpoczęciem różnicowania hiPSC należy przygotować płytkę hodowlaną z mikrowellami (patrz Tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta.
    2. Po przygotowaniu płytki do hodowli w mikrootworach, dodać 1 ml pożywki do indukcji neuronalnej (NIM; patrz Tabela materiałów) uzupełnione o 10 µM Y-27632.
    3. Odstaw płytkę do czasu rozpoczęcia procedury.
    4. Przemyć hiPSC medium DMEM/F12, a następnie dodać 1 ml roztworu do odrywania komórek (patrz Tabela materiałów), a następnie inkubować przez 5 min w temperaturze 37 °C z 5% CO2.
    5. Resuspenduj pojedyncze komórki w medium DMEM/F12 i odwiruj je przy 300 x g przez 5 min.
    6. Ostrożnie odessaj nadsącz i resuspenduj komórki w NIM + 10 µM Y-27632 w celu uzyskania stężenia końcowego 3 x 106 komórek/ml
    7. Dodaj 1 ml zawiesiny pojedynczych komórek do pojedynczej studni płytki hodowlanej z mikrostudniami i odwiruj płytkę z prędkością 100 x g przez 3 min.
    8. Obejrzyj płytkę pod mikroskopem, aby upewnić się, że komórki są równomiernie rozłożone w mikrodołkach, a następnie inkubuj komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2.
    9. Włączony dni 1–4wykonywać codzienną częściową wymianę pożywki.
    10. Za pomocą mikropipety 1 ml odessać 1,5 ml pożywki i ją usunąć. Powoli dodać 1,5 ml świeżego NIM bez Y-27632.
    11. Powtarzaj krok 2.2.10 do 4. dnia.
    12. Włączony dzień 5, pokryj jedną studzienkę płytki 6-dołkowej BMM.
    13. Umieść 37 µm odwracalny filtr siatkowy (patrz Tabela materiałów) na wierzchu probówki stożkowej o pojemności 50 ml (odpady). Strzałkę na sitku odwracalnym skieruj ku górze.
    14. Usunąć pożywkę z płytki do hodowli w mikrowodzykach, nie naruszając powstałych ciał embrioidalnych (EB).
    15. Dodać 1 ml DMEM/F12, a następnie niezwłocznie zebrać ciała embroidalne (EB) za pomocą pipety borokrzemianowej i przefiltrować je przez sitko.
    16. Powtarzaj krok 2.2.15 do momentu usunięcia wszystkich EB z płytki hodowlanej z mikrodofkami.
    17. Odwróć sitko nad nową probówką stożkową o pojemności 50 ml i dodaj 2 ml NIM, aby zebrać wszystkie ciała inkluzyjne (EB).
    18. Przenieś 2 ml zawiesiny EB do pojedynczej studni płytki pokrytej BMM za pomocą pipety borokrzemianowej. Inkubuj EB w temperaturze 37 °C z 5% CO2.
    19. Włączony dzień 6przygotować 2 ml NIM + 200 ng/ml SHH (patrz Tabela materiałów) i codziennie wymieniać pożywkę.
    20. Włączone dzień 8, oceniając procent indukcji neuronalnej.
    21. Należy policzyć wszystkie przytwierdzone ciała embroidalne (EB) i w szczególności określić liczbę poszczególnych EB, w których utworzyły się rozety neuralne. Indukcję rozet neuralnych należy określić ilościowo za pomocą następującego wzoru.
      figure-protocol-3
      UWAGA: Jeśli indukcja neuronalna jest <przy 75%, selekcja rozet neuronalnych może być niewydajna.
    22. Włączony dzień 12przygotować 250 ml pożywki N2B27, łącząc 119 ml pożywki neurobasal, 119 ml pożywki DMEM/F12, 2,5 ml GlutaMAX, 2,5 ml NEAA, 2,5 ml suplementu N2 oraz 5 ml B27 bez witaminy A, 250 μL gentamycyny (50 mg/ml) oraz 19.66 μL BSA (7 mg/ml).
    23. Aby przygotować 50 ml pełnej pożywki N2B27, należy dodać 3 μM CHIR99021, 2 μM SB431542, 20 ng/mL bFGF, 20 ng/mL EGF oraz 200 ng/mL SHH.
      UWAGA: Ważne jest, aby przygotować gotowe podłoże bezpośrednio przed użyciem.
    24. Odssać pożywkę z dołków zawierających rozetki neuralne i przemyć je 1 ml DMEM/F12.
    25. Dodaj 1 ml odczynnika do selekcji rozet neuralnych (patrz Tabela materiałów) i inkubować w temperaturze 37 °C z dodatkiem 5% CO2 przez 1 h.
    26. Usunąć odczynnik selekcyjny i, używając pipety o objętości 1 ml, skierować strumień bezpośrednio na skupiska rozetek.
    27. Przenieś zawiesinę do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i powtarzaj kroki 2.2.25 oraz 2.2.26 do czasu zebrania większości skupisk rozet neuronalnych.
      UWAGA: Aby uniknąć kontaminacji innymi typami komórek niż neurony, nie należy przeprowadzać nadmiernej selekcji.
    28. Odwiruj zawiesinę rozet z prędkością 350 x g przez 5 min. Odessać nadsącz i resuspender rozetki neuralne w pożywce N2B27 z dodatkiem 200 ng/mL SHH. Przenieść zawiesinę rozetek neuralnych do studzienki pokrytej BMM i inkubować płytkę w 37 °C z 5% CO2.
    29. Włączone dni 13–17codziennie wymieniaj pożywkę na gotową pożywkę N2B27. Passażuj komórki, gdy kultury osiągną 80%–90% konfluencji.
    30. Aby rozdzielić komórki, należy przygotować płytkę pokrytą BMM.
    31. Przemyj komórki 1 ml pożywki DMEM/F12, odessij medium i dodaj 1 ml odczynnika do dysocjacji (patrz Tabela materiałów).
    32. Inkubować przez 5 min w temperaturze 37 °Cdodać 1 ml DMEM/F12 i odłączyć przytwierdzone komórki poprzez pipetowanie w górę i w dół. Zawiesinę NPC zebrać do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Wirować przy 300 x g przez 5 min.
    33. Odssać nadsącz i resuspenderować komórki w 1 ml kompletnego medium N2B27 z dodatkiem 200 ng/mL SHH.
    34. Należy policzyć komórki, a następnie wysiać je z gęstością 1,25 x 105 komórki/cm2i inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2.
    35. Wymieniać pożywkę co drugi dzień, stosując pełne pożywkę N2B27 + 200 ng/mL SHH.
      UWAGA: Na tym etapie NPC są uznawane za pasaż (P) 0. SHH można usunąć z pożywki N2B27 w pasażu P2.
    36. Przesiej komórki, gdy osiągną 80%–90% konfluencji.
    37. Na tym etapie należy potwierdzić ekspresję markerów Nestin i FoxA2 w komórkach za pomocą immunocytochemii oraz qPCR. Niniejszy protokół prowadzi do uzyskania 85% komórek podwójnie dodatnich dla markerów Nestin i FoxA2.
    38. W celu pasażowania komórek należy powtórzyć kroki 2.2.31–2.2.36.
    39. Zamrozić komórki, zaczynając od pasażu P2. W celu zamrożenia komórek powtórzyć kroki 2.2.31–2.2.36 i resuspendować osad komórkowy w stężeniu 2 x 106 do 4 x 106 komórek/ml, używając zimnego medium do mrożenia progenitorów neuronalnych (patrz Tabela materiałów).
    40. Przenieś 1 ml zawiesiny komórkowej do każdej kryfiolki i zamroź komórki, korzystając ze standardowego systemu kontrolowanego powolnego chłodzenia. Do długotrwałego przechowywania umieść komórki w ciekłym azocie.
  3. Rozmrażanie MD NPC
    1. Przygotować płytkę powlekaną BMM i ogrzać pełną pożywkę N2B27. Do probówki stożkowej o pojemności 15 ml dodać 10 ml ogrzanego DMEM/F12. Umieścić krio probówkę w 37 °C inkubować w bloku grzejnym przez 2 min.
      1. Przenieś komórki z krioprobówki do probówki zawierającej pożywkę DMEM/F12. Wiruj przy 300 x g przez 5 min.
      2. Odssać nadosad, resuspendować komórki w 2 mL pożywki N2B27, a następnie przenieść zawiesinę komórkową do jednego dołka płytki pokrytej BMM. Inkubować komórki w 37 °C z 5% CO2.

3. Transdukcja komórek NPC z choroby MD i analiza zmian metylacji

  1. Transdukcja MD NPC
    1. Transdukować MD NPC przy 70% konfluencji wektorami LV-gRNA/dCas9-DNMT3A przy MOI = 2. Wymienić pożywkę N2B27 16 h po transdukcji.
    2. Dodać N2B27 z 5 µg/mL puromycyny 48 h po transdukcji. Hodować komórki przez 3 tygodnie w pożywce N2B27 z puromycyną w celu uzyskania stabilnych linii MD NPC. Komórki są gotowe do dalszych zastosowań (analiz DNA, RNA i białek, charakterystyki fenotypowej23, zamrażania i pasażowania).
  2. Charakterystyka profilu metylacji intronu 1 SNCA
    1. Wyizolować DNA z każdej stabilnie transdukowanej linii komórkowej za pomocą zestawu do ekstrakcji DNA (patrz Tabela materiałów).
    2. Wykorzystać 800 ng DNA do przeprowadzenia konwersji pirosiarczynowej przy użyciu dostępnego komercyjnie zestawu (patrz Tabela materiałów). Po konwersji pirosiarczynowej eluiować DNA poddane konwersji do stężenia 20 ng/µL.
  3. PCR do analizy pirosekwencjonowania
    1. Przygotować master mix do PCR w probówce wolnej od nukleaz. Do każdej reakcji użyć 0,4 µL startera rewersyjnego (10 µM), 0,4 µL startera forward (10 µM), 1,6 µL MgCl2 (25mM), 2 µL 10x CoralLoad Concentrate, 10 µL 2x PCR master mix, 4 µL 5x Q-Solution, 1 µL DNA oraz 0,6 µL wody wolnej od nukleaz.
    2. Przenieść płytkę reakcyjną do termocyklera i przeprowadzić PCR zgodnie z następującymi warunkami: 95 °C przez 15 min, 50 cykli: 94 °C przez 30 s, 56 °C przez 30 s i 72 °C przez 30 s, z końcowym etapem elongacji przez 10 min w 72 °C. Startery użyte do pirosekwencjonowania intronu 1 SNCA wymieniono w Tabeli 1, na Rysunku 7A oraz na Rysunku uzupełniającym 1.
    3. Po amplifikacji zwizualizować amplikony, nakładając 2 µL produktu PCR z barwieniem bromkiem etydyny, po elektroforezie w żelu agarozowym.
    4. Testy pirosekwencjonowania waliduje się, używając mieszanin niezmetylowanego (U) i zmetylowanego (M) DNA poddanego konwersji pirosiarczynowej w następujących proporcjach: 100U:0M, 75U:25M, 50U:50M, 25U:75M oraz 0U:100M (patrz Tabela materiałów).
    5. Przeprowadzić pirosekwencjonowanie przy użyciu odczynników do pirosekwencjonowania (patrz Tabela materiałów) i obliczyć wartości metylacji dla każdego miejsca CpG za pomocą oprogramowania do pirosekwencjonowania. Szczegółowy protokół pirosekwencjonowania znajduje się w pracy Bassil et al.37.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Walidacja mian produkcji wektorów LV-dCas9-DNMT3A-GFP/Puro w porównaniu do naiwnego odpowiednika GFP

Przeprowadziliśmy test ELISA dla p24gag, aby porównać miana fizyczne LV-dCas9-DNMT3A-GFP/Puro z odpowiadającymi im kontrolnymi wektorami GFP/Puro. Reprezentatywne wyniki przedstawione na Rysunku 5A wykazują, że fizyczne wydajności wektorów wygenerowanych zgodnie z opisanym...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

LV zaczęły pojawiać się jako narzędzie z wyboru do edycji epigenomu, zwłaszcza w kontekście chorób genetycznych, głównie ze względu na ich zdolność do (i) przyjmowania dużych ładunków DNA oraz (ii) wydajnej transdukcji szerokiego zakresu komórek dzielących się i niedzielących się. Duża skuteczność pakowania LV jest szczególnie korzystna w zastosowaniach obejmujących pakowanie systemów CRISPR/dCas9, które są ponadwymiarowe. Z tej perspektywy LV stanowią platformę z wyboru do dostarczania kompleksowych systemów CRISPR/Cas9...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Uniwersytet Duke'a złożył tymczasowy wniosek patentowy związany z tym badaniem.

Podziękowania

Ta praca została częściowo sfinansowana przez Kahn Neurotechnology Development Award (dla O.C.) oraz National Institutes of Health/National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NIH/NINDS) (R01 NS085011 do O.C.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Wyposażenie
Optima XPN-80 UltrawirówkaBeckman CoulterA99839
0,22 μ M jednostka filtrująca, 1 LCorning430513
0,45-μ m jednostka filtrująca, 500 mlCorning430773
100 mm Naczynie do hodowli z powłoką TCCorning430167
stożkowe probówki wirówkowe 15 mlCorning430791
150 mm Naczynia do hodowli komórkowych z siatką 20 mmCorning353025
stożkowe probówki wirówkowe o pojemności 50 mlCorning430291
6-dołkowe płytkiCorning3516
Aggrewell 800StemCell Technologies34811
Wirówka stołowa Allegra 25RBeckman Coulter369434
BD FACSBecton Dickinson338960
Stożkowe dolne probówki ultrawirówkoweSeton Scientific5067
Adaptery do rur stożkowychSeton ScientificPN 4230
Szkiełka do obrazowania komórekEppendorf Eppendorf30742060
96-dołkowe płytki o wysokim poziomie wiązaniaCorning3366
Odwrócony mikroskop fluorescencyjnyLeicaDM IRB2
QIAprep Spin Miniprep Kit (50)Qiagen27104
Odwracalne sitkoStemCell Technologies27215
SW32Ti rotorBeckman Coulter369650
VWR® Jednorazowe pipety serologiczne, szklane, niepirogenneVWR93000-694
VWR® Systemy filtracji próżniowejVWR89220-694
xMark™ Czytnik płytek absorbancyjnych do mikropłytekBio-Rad1681150
NazwaFirmaNumer katalogowyUwagi
Odczynniki do hodowli komórkowych
Ludzkie komórki nerki embrionalnej 293T (HEK 293T)ATCCCRL-3216
AccutaseStemCell Technologies7920
Roztwór do płukania zapobiegający przywieraniuStemCell Technologies7010
Przeciwciało anty-FOXA2AbcamAb60721
Przeciwciało anty-nestynoweAbcamAb18102
Roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy, 100xSigma AldrichA5955-100ML
Suplement B-27 (50x), bez witaminy AThermo Fisher Scientific12587010
BESSigma AldrichB9879 - BES
Albumina bydlęca frakcja V (7,5% roztwór)Thermo Fisher Scientific15260037
CHIR99021StemCell Technologies72052
Corning Matrigel z kwalifikacją hESCMatryca Corning08-774-552
Hyklon kosmicznej surowicy cielęcejSH30087.04
DMEM-F12Lonza12-719
DMEM, podłoże o wysokiej zawartości glukozyGibco11965
DNeasy Blood & Zestaw tkanekQiagen69504
EpiTect PCR Control Zestaw DNAQiagen596945
EZ DNA ZymoResearchD5001
ŻelatynaSigma AldrichG1800-100G
GentamynaThermo Fisher Scientific15750078
Delikatny odczynnik do dysocjacji komórekstemCell Technologies7174
GlutaMAXThermo Fisher Scientific35050061
Technologie ludzkich rekombinowanychkomórek macierzystych78003
Rekombinowany ludz  EGFStemCell Technologies78006
Ludzki rekombinowany Shh (C24II)StemCell Technologies78065
MEM Roztwór aminokwasów endogennych (100x)Thermo Fisher Scientific11140050
mTeSR1StemCell Technologies85850
Suplement N-2 (100x)Thermo Fisher Scientific17502001
Neurobasal MediumThermo Fisher Scientific21103049
Hyklonaminokwasami endogennymi (NEAA)SH30087.04
PyroMark Zestaw do PCRQiagen978703
RPMI 1640 ThermoFisher Scientific11875-085
SB431542StemCell Technologies72232
PirogroniansoduSigma AldrichS8636-100ML
STEMdiff  Indukcja neuronalna MediumStemCell Technologies5835
STEMdiff Neural Progenitor Freezing MediumStemCell Technologies5838
Test TaqMan FOXA2Thermo Fisher ScientificHs00232764
Test TaqMan GAPDHThermo Fisher ScientificHs99999905
Test TaqMan NestinThermo Fisher ScientificHS04187831
Test TaqMan OCT4Thermo Fisher ScientificHs04260367
Test TaqMan PPIAThermo Fisher ScientificHs99999904
Trypsyna-EDTA 0,05%Gibco25300054
Y27632StemCell Technologies72302
NazwaCompanyNumer katalogowy<strong>Komentarze
p24 Odczynniki ELISA
Monoklonalne przeciwciało anty-p24NIH AIDS Research and Reference Reagent Program3537
Kozia peroksydaza anty-króliczo-chrzanowa IgGSigma Aldrich12-348Stężenie robocze 1:1500
Surowica kozia, sterylna, 10 mlSigmaG9023Stężenie robocze 1:1000
Normy HIV-1NIH AIDS Research and Reference Reagent ProgramSP968F
Normalna surowica mysie, sterylna, 500 mlEquitech-BioSM30-0500
Poliklonalne przeciwciało anty-p24NIH AIDS Research and Reference Reagent ProgramSP451T
Podłoże peroksydazy TMBKPL5120-0076Stężenie robocze 1:10 000
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Plasmids
pMD2.GAddgene12253
pRSV-RevAddgene52961
psPAX2Addgene12259
NazwaCompanyNumer katalogowyUwagi
Enzymy restrykcyjne
BsmBINowa Anglia BiolabsR0580S
BsrGINowa Anglia BiolabsR0575S
EcoRVNowa Anglia BiolabsR0195S
KpnINowa Anglia BiolabsR0142S
PacINowa Anglia BiolabsR0547S
SphINowa Anglia BiolabsR0182S
bFGF z

Bibliografia

  1. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
  2. Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. 3rd ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).
  3. Thakore, P. I., Black, J. B., Hilton, I. B., Gersbach, C. A. Editing the epigenome: technologies for programmable transcription and epigenetic modulation. Nature Methods. 13 (2), 127-137 (2016).
  4. Gilbert, L. A., et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154 (2), 442-451 (2013).
  5. Gilbert, L. A., et al. Genome-Scale CRISPR-Mediated Control of Gene Repression and Activation. Cell. 159 (3), 647-661 (2014).
  6. Perez-Pinera, P., et al. RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors. Nature Methods. 10 (10), 973-976 (2013).
  7. Chavez, A., et al. Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming. Nature Methods. 12 (4), 326-328 (2015).
  8. Horlbeck, M. A., et al. Nucleosomes impede Cas9 access to DNA in vivo and in vitro. eLife. 5, (2016).
  9. Chavez, A., et al. Comparison of Cas9 activators in multiple species. Nature Methods. 13 (7), 563-567 (2016).
  10. Zhou, H., et al. In vivo simultaneous transcriptional activation of multiple genes in the brain using CRISPR-dCas9-activator transgenic mice. Nature Neuroscience. 21 (3), 440-446 (2018).
  11. Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., Vale, R. D. A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging. Cell. 159 (3), 635-646 (2014).
  12. Konermann, S., et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature. 517 (7536), 583-588 (2015).
  13. Holtzman, L., Gersbach, C. A. Editing the Epigenome: Reshaping the Genomic Landscape. Annual Review of Genomics and Human Genetics. , (2018).
  14. Perez-Pinera, P., et al. Synergistic and tunable human gene activation by combinations of synthetic transcription factors. Nature Methods. 10 (3), 239-242 (2013).
  15. Thakore, P. I., et al. Highly specific epigenome editing by CRISPR-Cas9 repressors for silencing of distal regulatory elements. Nature Methods. 12 (12), 1143-1149 (2015).
  16. Amabile, A., et al. Inheritable Silencing of Endogenous Genes by Hit-and-Run Targeted Epigenetic Editing. Cell. 167 (1), 219-232 (2016).
  17. Liu, X. S., et al. Editing DNA Methylation in the Mammalian Genome. Cell. 167 (1), 233-247 (2016).
  18. McDonald, J. I., et al. Reprogrammable CRISPR/Cas9-based system for inducing site-specific DNA methylation. Biology Open. 5 (6), 866-874 (2016).
  19. Huang, Y. H., et al. DNA epigenome editing using CRISPR-Cas SunTag-directed DNMT3A. Genome Biology. 18 (1), 176(2017).
  20. Vojta, A., et al. Repurposing the CRISPR-Cas9 system for targeted DNA methylation. Nucleic Acids Research. 44 (12), 5615-5628 (2016).
  21. Razin, A., Kantor, B. DNA methylation in epigenetic control of gene expression. Progress in Molecular and Subcellular Biology. 38, 151-167 (2005).
  22. Kantor, B., Ma, H., Webster-Cyriaque, J., Monahan, P. E., Kafri, T. Epigenetic activation of unintegrated HIV-1 genomes by gut-associated short chain fatty acids and its implications for HIV infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (44), 18786-18791 (2009).
  23. Kantor, B., et al. Downregulation of SNCA Expression by Targeted Editing of DNA Methylation: A Potential Strategy for Precision Therapy in PD. Molecular Therapy. , (2018).
  24. Jowaed, A., Schmitt, I., Kaut, O., Wullner, U. Methylation regulates alpha-synuclein expression and is decreased in Parkinson's disease patients' brains. Journal of Neuroscience. 30 (18), 6355-6359 (2010).
  25. Wang, Y., et al. A DNA methyltransferase inhibitor, 5-aza-2'-deoxycytidine, exacerbates neurotoxicity and upregulates Parkinson's disease-related genes in dopaminergic neurons. CNS Neuroscience & Therapeutics. 19 (3), 183-190 (2013).
  26. Matsumoto, L., et al. CpG demethylation enhances alpha-synuclein expression and affects the pathogenesis of Parkinson's disease. PLOS One. 5 (11), e15522(2010).
  27. Desplats, P., et al. Alpha-synuclein sequesters Dnmt1 from the nucleus: a novel mechanism for epigenetic alterations in Lewy body diseases. Journal of Biological Chemistry. 286 (11), 9031-9037 (2011).
  28. Ai, S. X., et al. Hypomethylation of SNCA in blood of patients with sporadic Parkinson's disease. Journal of the Neurological Sciences. 337 (1-2), 123-128 (2014).
  29. Tagliafierro, L., Chiba-Falek, O. Up-regulation of SNCA gene expression: implications to synucleinopathies. Neurogenetics. 17 (3), 145-157 (2016).
  30. Ortinski, P. I., O’Donovan, B., Dong, X., Kantor, B. Integrase-Deficient Lentiviral Vector as an All-in-One Platform for Highly Efficient CRISPR/Cas9-Mediated Gene Editing. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 5, 153-164 (2017).
  31. Tagliafierro, L., et al. Genetic analysis of alpha-synuclein 3' untranslated region and its corresponding microRNAs in relation to Parkinson's disease compared to dementia with Lewy bodies. Alzheimer’s & Dementia. 13 (11), 1237-1250 (2017).
  32. Tagliafierro, L., Zamora, M. E., Chiba-Falek, O. Multiplication of the SNCA locus exacerbates neuronal nuclear aging. Human Molecular Genetics. , (2018).
  33. Kantor, B., McCown, T., Leone, P., Gray, S. J. Clinical applications involving CNS gene transfer. Advances in Genetics. 87, 71-124 (2014).
  34. Kantor, B., Bailey, R. M., Wimberly, K., Kalburgi, S. N., Gray, S. J. Methods for gene transfer to the central nervous system. Advances in Genetics. 87, 125-197 (2014).
  35. Vijayraghavan, S., Kantor, B. A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells. Journal of Visualized Experiments. (130), e56915(2017).
  36. Bayer, M., et al. A large U3 deletion causes increased in vivo expression from a nonintegrating lentiviral vector. Molecular Therapy. 16 (12), 1968-1976 (2008).
  37. Bassil, C. F., Huang, Z., Murphy, S. K. Bisulfite pyrosequencing. Methods in Molecular Biology. 1049, 95-107 (2013).
  38. Truong, D. J., et al. Development of an intein-mediated split-Cas9 system for gene therapy. Nucleic Acids Research. 43 (13), 6450-6458 (2015).
  39. Nishimasu, H., et al. Crystal Structure of Staphylococcus aureus Cas9. Cell. 162 (5), 1113-1126 (2015).
  40. Ran, F. A., et al. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature. 520 (7546), 186-191 (2015).
  41. Van Lint, C., Ghysdael, J., Paras, P., Burny, A., Verdin, E. A transcriptional regulatory element is associated with a nuclease-hypersensitive site in the pol gene of human immunodeficiency virus type 1. Journal of Virology. 68 (4), 2632-2648 (1994).
  42. Van Lint, C., et al. Transcription factor binding sites downstream of the human immunodeficiency virus type 1 transcription start site are important for virus infectivity. Journal of Virology. 71 (8), 6113-6127 (1997).
  43. Goffin, V., et al. Transcription factor binding sites in the pol gene intragenic regulatory region of HIV-1 are important for virus infectivity. Nucleic Acids Research. 33 (13), 4285-4310 (2005).
  44. Kim, Y. S., et al. Artificial zinc finger fusions targeting Sp1-binding sites and the trans-activator-responsive element potently repress transcription and replication of HIV-1. Journal of Biological Chemistry. 280 (22), 21545-21552 (2005).
  45. Kantor, B., et al. Notable reduction in illegitimate integration mediated by a PPT-deleted, nonintegrating lentiviral vector. Molecular Therapy. 19 (3), 547-556 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Produkcja wektor w lentiwirusowychr nicowanie hiPSCsystem CRISPR dCas9analiza metylacji SNCAmodele neuron w dopaminergicznychanaliza pirosekwencjonowaniemoczyszczanie wektor w wirusowychludzkie indukowane pluripotencjalne kom rki macierzystemodele choroby Parkinsona
Platforma wektorów lentiwirusowych do efektywnego dostarczania narzędzi do edycji epigenomu do modeli chorób pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.