Artykuł metodologiczny

Platforma wektorów lentiwirusowych do efektywnego dostarczania narzędzi do edycji epigenomu do modeli chorób pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

DOI:

10.3791/59241

⸱

29 marca 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, Duke University Medical Center, 2Center for Genomic and Computational Biology, Duke University Medical Center, 3Viral Vector Core, Duke University Medical Center, 4Division of Gynecologic Oncology, Department of Obstetrics and Gynecology, Duke University Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ukierunkowana edycja epigenomu DNA reprezentuje potężne podejście terapeutyczne. Protokół ten opisuje produkcję, oczyszczanie i koncentrację wektorów lentiwirusowych typu "wszystko w jednym" zawierających transgen CRISPR-dCas9-DNMT3A do zastosowań w edycji epigenomu w neuronach pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC).

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykorzystanie komórek pochodzących z hiPSC stanowi wartościowe podejście do badania ludzkich chorób neurodegeneracyjnych. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowany protokół różnicowania hiPSC pochodzących od pacjenta z potrojeniem locus genu alfa-synukleiny (SNCA) do populacji neuronów dopaminergicznych istotnych dla choroby Parkinsona (PD). Coraz więcej dowodów wykazało, że wysoki poziom SNCA jest przyczyną rozwoju choroby Parkinsona. Uznając niezaspokojoną potrzebę ustanowienia nowych podejść terapeutycznych dla PD, zwłaszcza tych ukierunkowanych na regulację ekspresji SNCA, niedawno opracowaliśmy system oparty na metylacji DNA CRISPR/dCas9 do epigenetycznej modulacji transkrypcji SNCA poprzez wzbogacanie poziomów metylacji w SNCA Region regulacyjny Intron 1. Do dostarczenia systemu, składającego się z martwej (dezaktywowanej) wersji Cas9 (dCas9) połączonej z domeną katalityczną enzymu metylotransferazy DNA 3A (DNMT3A), stosuje się wektor lentiwirusowy. System ten jest stosowany do komórek z potrojeniem locus SNCA i zmniejsza poziom SNCA-mRNA i białka o około 30% poprzez ukierunkowaną metylację DNA intronu SNCA 1. Precyzyjnie dostrojona regulacja w dół poziomów SNCA ratuje fenotypy komórkowe związane z chorobą. W obecnym protokole staramy się opisać krok po kroku procedurę różnicowania hiPSC w neuronalne komórki progenitorowe (NPC) oraz ustanowienie i walidację testów pirosekwencjonowania w celu oceny profilu metylacji w intronie SNCA 1. Aby bardziej szczegółowo przedstawić system lentivirus-CRISPR/dCas9 używany w tych eksperymentach, w niniejszym protokole opisano sposób produkcji, oczyszczania i koncentracji wektorów lentiwirusowych oraz podkreślono ich przydatność do zastosowań związanych z edycją epigenomu i genomu przy użyciu hiPSC i NPC. Protokół jest łatwy do dostosowania i może być stosowany do produkcji lentiwirusów o wysokim mianie do zastosowań in vitro i in vivo.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ostatnio opracowano wiele platform do edycji epigenomu, które celują w dowolne sekwencje DNA w regionach kontrolujących ekspresję genów1,2. Stworzone narzędzia do edycji epigenomu mają na celu (i) regulację transkrypcji, (ii) zmianę potranslacyjnych modyfikacji histonów, (iii) modyfikację metylacji DNA oraz (iv) modulację interakcji elementów regulatorowych. Podejście polegające na zakotwiczeniu modyfikatorów transkrypcji/chromatyny w dezaktywowanym (martwym) Cas9 (dCas9) powstało na podstawie wcześniej opracowanych platform edycji epigenomu, takich jak białka palca cynkowego (ZFP) i efektory podobne do aktywatorów transkrypcji (TALE), zawierające silną domenę efektorową transkrypcji (ED) połączoną z zaprojektowaną domeną wiążącą DNA (DBD)3. Wyniki pożądanego fenotypu, takie jak aktywacja lub represja, są definiowane przez cząsteczkę efektorową zakotwiczoną w endogennych loci (Rysunek 1). Aby stworzyć programowalne aktywatory transkrypcji, moduły dCas9/gRNA są połączone z VP164,5,6 (Rysunek 1A), domeną aktywacji wirusa, która rekrutuje Pol II i ogólną maszynerię transkrypcyjną. Modyfikacja tego systemu obejmowała VP64, tetramer domen VP16, zapewniający jeszcze bardziej solidny współczynnik aktywacji5,6. System został z powodzeniem wykorzystany do aktywacji regionów kodujących i niekodujących poprzez ukierunkowanie na promotory i elementy regulacyjne. Co ważne, mimo że cząsteczki VP64 nie modyfikują bezpośrednio struktury chromatyny w regionie docelowym, rekrutują modyfikatory chromatyny, które wiążą wyniki w osadzaniu się znaczników aktywnych (euchromatyny), w tym jako acetylacja H3/H4 i H3-K4 di/trimetylacja5,6. Oprócz VP64, podjednostka p65 ludzkiego kompleksu NF-κB została podłączona do modułu dCas9/gRNA7. Co ciekawe, wiązanie tych efektorów z regionami przed miejscami rozpoczęcia transkrypcji (TSS) i w obrębie promotorów powoduje silną indukcję genów. Niemniej jednak, efektory VP64 i p65 mogą również wywierać efekty aktywacyjne, będąc połączonym z regionami znajdującymi się poniżej TSS i w dystalnych wzmacniaczach7,8. Aby wywołać bardziej solidną odpowiedź transkrypcyjną, należy zrekrutować wiele fuzji dCas9-VP64 lub dCas9-p65 do jednego docelowego locus9,10. W związku z tym niedawny rozwój aktywatorów nowej generacji, które rekrutują wiele domen efektorowych przez pojedynczy kompleks dCas9-gRNA, takich jak SunTag, zaowocował większą zdolnością aktywacji w porównaniu z odpowiednikami fuzji dCas9-VP6411,12. Ulepszoną aktywację transkrypcyjną uzyskano poprzez fuzję VP64, p65 i Rta (VPR), domeny transaktywacyjnej z gamma-herpeswirusów, do C-końca dCas913 (Rysunek 1A). Podobne systemy CRISPR/dCas9 zostały opracowane do represji specyficznej dla celu (Rysunek 1B).

Endogenna represja genów może być osiągnięta za pomocą inżynieryjnych fuzji represorów za pomocą różnych mechanizmów (Rysunek 1B). Wykazano, że systemy CRISPR/dCas9, połączone z represorem DBD (nawet bez domeny efektorowej), mogą skutecznie wyciszać ekspresję genów, gdy są przywiązane do promotora lub regionów upstream/downstream-TSS3,6,14. Wpływ na transkrypcję jest spowodowany steryczną interferencją wiązania czynnika transkrypcyjnego i przetwarzania polimerazy RNA. Niemniej jednak potrzebne są bardziej kompleksowe podejścia, ponieważ represja genów przez samą przeszkodę steryczną często nie wystarcza do solidnego wyciszenia. Niedawny rozwój nowej generacji tłumików opartych na systemach CRISPR/dCas9 przenoszących domeny represorowe transkrypcji (TRD), modyfikatory histonów (di-/trimetylacja H3-K9, di-/trimetylacja H3-K27; H3-K36 di-/tri-metylacja, deacetylacja H3/H4) i metylacja DNA (CpG) doprowadziły do skonstruowania narzędzi epigenetycznych, które pozwoliły na bardziej silne efekty wyciszania4,5,15,16,17,18,19,20. Wykazano, że rekrutacja tych modyfikatorów epigenetycznych do DNA może prowadzić do powstania bardziej zamkniętej i skondensowanej chromatyny, która zazwyczaj generuje silniejszy wynik wyciszania21,22. Najczęściej używaną domeną wyciszającą z DBD jest skrzynka powiązana z Krüppel (KRAB)4,5. Wykazano, że rekrutacja czynnika odpowiada zmianom chromatyny; Niemniej jednak mechanizmy tych modyfikacji nie zostały jeszcze wyjaśnione16,17,18. Ostatnio wykazano, że lokalizacja KRAB w DNA może sprzyjać składaniu się metylotransferazy histonowej SETDB1 i kompleksów NuRD deacetylacji histonów (HDAC), co sugeruje możliwość, że te interakcje pośredniczą w tworzeniu kondensacji chromatyny i wyciszaniu transkrypcji3,13. Alternatywnym podejściem jest fuzja domen efektorowych z DBD w celu stworzenia niestandardowego epigenetycznego białka wyciszającego. System ten bezpośrednio katalizuje represyjne znaczniki DNA lub modyfikacje histonów.

Ostatnio, użycie syntetycznych systemów CRISPR/dCas9 związanych z enzymem DNMT3A zostało ponownie wykorzystane do dezaktywacji transkrypcji. DNMT3A katalizuje metylację DNA, która wywiera represję transkrypcyjną podczas tworzenia heterochromatyny na endogennych promotorach genów i innych regionach regulatorowych (Rysunek 1B)18,20. McDonald et al.18 oraz Vojta et al.20 byli pierwszymi autorami, którzy poinformowali, że metylacja DNA może być wykorzystana do wyciszania lub represji genu epigenomu, wykazując, że system fuzyjny dCas9-DNMT3A dostarczany przez plazmid może silnie zwiększać metylację cytozyny wokół klasy TSS18,20. McDonald i współpracownicy wykazali, że zastosowanie tej strategii może skutkować znacznym zmniejszeniem (około 40%) poziomu mRNA genu supresorowego nowotworu, CDKN2A mRNA18. Podobnie, celowanie w niemetylowany region promotora genów BACH lub IL6ST pokazuje zwiększoną metylację CpG, która została skorelowana z dwukrotnym zmniejszeniem ekspresji genu20. Nasze laboratorium niedawno zmieniło przeznaczenie metylacji DNA do łagodzenia patologicznych skutków nadekspresji SNCA ( Rysunek 2) 23. Strategia opiera się na selektywnym zwiększaniu metylacji DNA w regionie intronu SNCA 1, ponieważ wcześniej donoszono, że jest on hipometylowany w PD i demencji z ciałami Lewy'ego (DLB) mózgi24,25,26. Ta hipometylacja została powiązana z nadekspresją SNCA, oferując w ten sposób atrakcyjny cel dla interwencji terapeutycznej24,27,28. Niedawno wykazaliśmy niski poziom metylacji DNA w regionie intronu SNCA 1 w dopaminergicznych NPC pochodzących z hiPSC uzyskanych od pacjenta z PD z potrójnym SNCA 23. Zaletą tego modelu eksperymentalnego jest to, że NPC mogą być silnie rozmnażane w kulturze lub dalej różnicowane w dojrzałe neurony, co umożliwia skuteczne badanie przesiewowe w celu identyfikacji czynników genetycznych, które pośredniczą w fenotypach komórkowych, w tym stresu oksydacyjnego i apoptozy29. Co więcej, ten system modelowy umożliwia naukowcom podsumowanie zdarzeń rozwojowych, które wystąpiły przed wystąpieniem objawów u pacjentów. Ponadto NPC pochodzące z hiPSC stanowią doskonałe narzędzie do testowania szlaków komórkowych i molekularnych związanych z ekspresją genów. Co ważne, NPC pochodzące z hiPSC w połączeniu z najnowocześniejszą technologią epigenomu CRISPR/Cas9 mogą znacznie ułatwić opracowywanie "leków nowej generacji" na wiele chorób neurodegeneracyjnych.

Aby zmniejszyć patologiczne poziomy ekspresji SNCA, niedawno opracowaliśmy system oparty na lentiwirusie, przenoszący białko fuzyjne dCas9-DNMT3A i gRNA, aby specyficznie celować w metylację CpG w intronie SNCA 1 (Rysunek 2A)23. Protokół ten szczegółowo opisuje projektowanie i produkcję wektora lentiwirusowego (LV). Pojazdy LV stanowią skuteczny sposób dostarczania komponentów CRISPR/dCas9 z kilku powodów, a mianowicie: (i) ich zdolności do przenoszenia dużych insercji DNA, (ii) wysokiej wydajności transdukcji szerokiego zakresu komórek, w tym zarówno komórek dzielących, jak i niedzielących się30, oraz (iii) ich zdolności do wywoływania minimalnych odpowiedzi cytotoksycznych i immunogennych. Niedawno zastosowaliśmy system LV do neuronów dopaminergicznych pochodzących z hiPSC od pacjenta z potrojeniem locus SNCA i wykazaliśmy potencjał terapeutyczny LV w dostarczaniu narzędzi metylacji do edycji epigenomu23 (Figura 2B). Rzeczywiście, układ LV-gRNA/dCas9-DNMT3A powoduje znaczny wzrost metylacji DNA w regionie intronu SNCA 1. Wzrost ten odpowiada obniżeniu poziomów mRNA SNCA i białka23. Co więcej, regulacja w dół SNCA ratuje fenotypy związane z PD w neuronach dopaminergicznych pochodzących z potrójnej i hiPSC SNCA (np. produkcja mitochondrialnych ROS i żywotność komórek)23. Co ważne, wykazaliśmy, że zmniejszenie ekspresji SNCA przez system LV-gRNA-dCas9-DMNT3A jest w stanie odwrócić fenotypy, które są charakterystyczne dla neuronów dopaminergicznych pochodzących z hiPSC od pacjenta z chorobą Parkinsona, który był nosicielem potrojenia SNCA, takich jak mitochondrialna produkcja ROS i żywotność komórek23. Celem tego protokołu jest: 1) nakreślenie protokołu produkcji i koncentracji zoptymalizowanej platformy LV do generowania preparatów wirusowych o wysokiej daweczkowaniu oraz 2) opisanie różnicowania hiPSC w NPC o wzorcu dojrzałych neuronów dopaminergicznych31,32 oraz charakterystyka poziomów metylacji docelowego regionu w obrębie intronu SNCA 1.

Platformy lentiwirusowe mają dużą przewagę nad najpopularniejszą platformą wektorową, a mianowicie wektorami związanymi z adenowirusami (AAV), którą jest zdolność tych pierwszych do przyjmowania większych wstawek genetycznych33,34. AAV mogą być generowane ze znacznie wyższą wydajnością, ale mają niską pojemność pakowania (<4,8 kb), co ogranicza ich zastosowanie do dostarczania kompleksowych systemów CRISPR/Cas9. W związku z tym wydaje się, że LV byłyby platformą z wyboru w aplikacjach związanych z dostarczaniem narzędzi CRISPR/dCas9. W związku z tym przedstawiony tutaj protokół będzie cennym narzędziem dla badaczy pragnących skutecznie dostarczyć komponenty do edycji epigenomu do komórek i narządów. Protokół dodatkowo nakreśla strategię zwiększania możliwości produkcyjnych i ekspresyjnych wektorów poprzez modyfikację w cis elementów w wyrażeniu wektorowym cassette30,35. Strategia opiera się na nowatorskim systemie opracowanym i badanym w naszym laboratorium i podkreśla jego zdolność do wytwarzania cząsteczek wirusa w zakresie 1010 jednostek wirusowych (VU)/ml30,35.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Projekt systemu i produkcja wirusów

  1. Projektowanie i budowa plazmidów
    nuta: Konstrukcja wektora LV-gRNA-dCas9-DNMT3A typu "wszystko w jednym" odbywa się przy użyciu zoptymalizowanej pod kątem produkcji i ekspresji kasety ekspresji opublikowanej przez Ortinski et al.30. Kaseta wektorowa zawiera powtórzenie miejsca rozpoznawania czynnika transkrypcyjnego Sp1 i najnowocześniejszą delecję w nieulegającym translacji (U3') regionie 3'-długiego powtórzenia końcowego (LTR) (Rysunek 2A)30,36. Stwierdzono, że szkielet wektorowy jest skuteczny w dostarczaniu i wyrażaniu CRISPR/Cas930,35.
    1. Uzyskaj dezaktywowaną (martwą) wersję SpCas9 (dCas9) za pomocą mutagenezy kierowanej na stronę (dane nie są pokazane). Zastąp klon zawierający mutacje D10A i H840A odpowiednio w domenach katalitycznych HNH i RuvC enzymu aktywnym Cas9 w pBK30129 poprzez wymianę między fragmentami AgeI-BamHI (Rysunek 3).
    2. Wyprowadź domenę katalityczną DNMT3A z pdCas9-DNMT3A-eGFP (patrz tabela materiałów) poprzez amplifikację części DNMT3A BamHI-429/R 5'-GAGCGGATCCCCCCCTCCCG-3' BamHI-429/L 5'-CTCTCCACTGCCGGATCCGG-3' (Rysunek 3). Aby wzmocnić obszar zawierający DNMT3A, należy zastosować następujące warunki: (1) 95 °C przez 60 s, (2) 95 °C przez 10 s, (3) 60 °C przez 20 s, (4) 68 °C przez 60 s. Powtórz warunki od 2 do 4 30x. Do ostatecznego przedłużenia użyj 68 °C przez 3 minuty i przytrzymaj 4 °C.
    3. Sklonuj fragment DNMT3A, strawiony przez enzym restrykcyjny BamHI, do miejsca BamHI zmodyfikowanego wektora pBK301 przenoszącego dCas9. Sprawdź klonowanie za pomocą bezpośredniego sekwencjonowania Sangera. Należy zauważyć, że powstały plazmid zawiera transgen dCas9-DNMT3A-p2a-puromycyny. Plazmid eksprymuje rusztowanie gRNA z ludzkiego promotora U6 (Figura 3).
    4. Zastąp gen reporterowy puromycyny białkiem zielonej fluorescencji (GFP), aby utworzyć dCas9-DNMT3A-p2a-GFP. Trawić plazmid dCas9-DNMT3A-p2a-Puro za pomocą FseI. Oczyść fragment wektora za pomocą metody oczyszczania żelowego. Przygotować wkładkę, trawiąc pBK201a (pLenti-GFP) za pomocą FseI. Sklonuj fragment FseI do wektora. Powstały plazmid pBK539 zawiera transgen dCas9-DNMT3A-p2a-GFP (Figura 3).
  2. Hodowla komórek HEK-293T i komórek posiewnych do transfekcji
    nuta: Ludzkie embrionalne komórki nerkowe 293T (HEK-293T) są hodowane w kompletnej, zmodyfikowanej pożywce Eagle's Eagle's firmy Dulbecco o wysokiej zawartości glukozy (DMEM; 10% surowica cielęca bydlęca, 1x antybiotyk przeciwgrzybiczy, 1x pirogronian sodu, 1x aminokwas endogenny, 2 mM L-glutamina) w temperaturze 37 °C z 5% CO2 . W celu zapewnienia powtarzalności protokołu zaleca się przetestowanie surowicy cielęcej przy zmianie na inną partię. Do produkcji lentiwirusa potrzeba do sześciu płytek o średnicy 15 cm.
    1. Użyj komórek o niskim pasażu, aby rozpocząć nową hodowlę (poniżej pasażu 20). Gdy komórki osiągną zbieżność 90%-95%, odessać pożywkę i delikatnie przemyć ją sterylną solą fizjologiczną buforowaną 1x fosforanem (PBS).
    2. Dodać 2 ml trypsyny-EDTA (0,05%) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 3–5 minut. Aby dezaktywować odczynnik dysocjacyjny, dodaj 8 ml kompletnego DMEM o wysokiej zawartości glukozy i pipetuj 10x-15x pipetą serologiczną 10 mL, aby utworzyć zawiesinę jednokomórkową 4 x 106 komórek/ml.
    3. Do transfekcji pokryj 15 cm płytki 0,2% żelatyny. Dodaj 22,5 ml pożywki o wysokiej zawartości glukozy i zasiej komórki, dodając 2,5 ml zawiesiny komórkowej (łącznie ~1 x 107 komórek / płytkę). Inkubować płytki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 aż do osiągnięcia 70–80% konfluencji.
  3. Transfekcja komórek HEK-293T
    1. Przygotuj 2x buforowany przez BES roztwór BBS i 1 M CaCl2, zgodnie z Vijayraghavan i Kantor35. Przefiltrować roztwory, przepuszczając je przez filtr 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C. Mieszanka transfekcyjna musi być klarowna przed dodaniem do komórek. Jeśli mieszanina stanie się mętna podczas inkubacji, przygotuj świeże 2x BBS (pH = 6,95).
    2. Aby przygotować mieszaninę plazmidów, użyj czterech plazmidów wymienionych (poniższa mieszanka jest wystarczająca na jedną płytkę o średnicy 15 cm): 37,5 μg wektora przenoszenia CRISPR/dCas9 (pBK492 [DNMT3A-Puro-NO-gRNA] lub pBK539 [DNMT3A-GFP-NO-gRNA]); 25 μg pBK240 (psPAX2); 12,5 μg pMD2.G; 6,25 μg pRSV-rev (Rysunek 4A). Obliczyć objętość plazmidów na podstawie stężeń i dodać wymagane ilości do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Dodać 312,5 μl 1 M CaCl2 i doprowadzić końcową objętość do 1,25 ml, używając sterylnego dd-H2O. Delikatnie dodaj 1,25 ml 2x roztworu BBS, jednocześnie mieszając mieszankę. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Komórki są gotowe do transfekcji, gdy zlewają się w 70%–80%.
    3. Odessać pożywkę i zastąpić ją 22,5 ml świeżo przygotowanego DMEM o wysokiej zawartości glukozy bez surowicy. Dodawać kroplami 2,5 ml mieszaniny do transfekcji na każdą płytkę o średnicy 15 cm. Zakręcić płytki i inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 2–3 godziny.
    4. Po 3 godzinach dodać 2,5 ml (10%) surowicy na płytkę i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
    5. W 1 dniu po transfekcji obserwuj komórki, aby upewnić się, że nie ma lub nie ma minimalnej śmierci komórki i że komórki utworzyły zlewającą się kulturę (100%).
      1. Zmień podłoże, dodając 25 ml świeżo przygotowanego DMEM o wysokiej zawartości glukozy i 10% surowicy do każdej płytki.
    6. Inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 48 godzin.
  4. Żniwo wirusa
    1. Zebrać supernatant ze wszystkich transfekowanych komórek i umieścić je w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml. Wirować przy 400–450 x g przez 10 min. Przefiltrować supernatant przez filtr próżniowy 0,45 μm. Po filtracji supernatant może być przechowywany w temperaturze 4 °C do krótkotrwałego przechowywania (do 4 dni). Do długotrwałego przechowywania należy przygotować porcje i przechowywać je w temperaturze -80 °C.
      nuta: Oczekuje się, że nieskoncentrowane preparaty wirusowe będą miały wymiary ~2 x 107 do 3 x 107 vu/ml (patrz sekcja 1.5 w celu określenia miana). Zdecydowanie zaleca się przygotowanie jednorazowych podwielokrotności, ponieważ wielokrotne cykle zamrażania i rozmrażania spowodują utratę 10%–20% mian funkcjonalnych.
  5. Stężenie cząsteczek wirusa
    nuta: W celu oczyszczenia przeprowadza się dwuetapową metodę podwójnej sacharozy, obejmującą etap gradientu sacharozy i etap poduszki sacharozy (Rysunek 4B).
    1. Aby utworzyć gradient sacharozy, przygotuj stożkowe probówki do ultrawirowania w następującej kolejności: 0,5 ml 70% sacharozy w 1x PBS, 0,5 ml 60% sacharozy w DMEM, 1 ml 30% sacharozy w DMEM i 2 ml 20% sacharozy w 1x PBS.
    2. Ostrożnie dodać do gradientu sklarowany nad nim szwaczek zebrany zgodnie z ppkt 1.4. Ponieważ całkowita objętość zebrana z czterech 15-centymetrowych płytek wynosi 100 ml, należy użyć sześciu probówek do ultrawirowania do przetworzenia supernatantu wirusa.
    3. Równomiernie rozprowadzić supernatant wirusa w każdej probówce do ultrawirowania. Aby uniknąć pęknięcia probówki podczas wirowania, należy napełnić probówki ultrawirówki do co najmniej trzech czwartych ich całkowitej pojemności. Zrównoważyć probówki za pomocą 1x PBS. Odwirować próbki przy 70 000 x g przez 2 godziny w temperaturze 17 °C.
      nuta: Aby utrzymać warstwę sacharozy podczas etapów przyspieszania i zwalniania, należy pozwolić ultrawirówce powoli przyspieszać i zwalniać wirnik odpowiednio od 0 do 200 x g i od 200 do 0 x g odpowiednio podczas pierwszych i ostatnich 3 minut wirowania.
    4. Delikatnie zbierz 30%-60% frakcji sacharozy do czystych probówek (Rysunek 4B). Dodaj 1x PBS (na zimno) do 100 ml całkowitej objętości. Mieszać przez wielokrotne pipetowanie.
    5. Ostrożnie rozwarstwić preparat wirusowy na poduszce sacharozy, dodając 4 ml 20% sacharozy (w 1x PBS) do probówki. Kontynuuj, pipetując ~20–25 ml roztworu wirusa na każdą probówkę. Napełnij probówki 1x PBS, jeśli objętość ich zawartości jest mniejsza niż trzy czwarte na probówkę. Ostrożnie wyważ rurki. Wirować przy 70 000 x g przez 2 godziny w temperaturze 17 °C. Opróżnić supernatant i odwrócić probówki na ręcznikach papierowych, aby umożliwić spłynięcie pozostałej cieczy.
    6. Usuń cały płyn, ostrożnie zasysając pozostały płyn. Należy pamiętać, że na tym etapie granulki zawierające wirusa są ledwo widoczne jako małe, półprzezroczyste plamki. Dodaj 70 μl 1x PBS do pierwszej probówki, aby ponownie zawiesić osad. Dokładnie odpipetować zawiesinę i przenieść ją do następnej probówki, aż wszystkie granulki zostaną ponownie zawieszone.
    7. Umyj probówki dodatkowymi 50 μl 1x PBS i wymieszaj jak poprzednio. Należy pamiętać, że na tym etapie objętość końcowej zawiesiny wynosi ~120 μL i wydaje się lekko mleczna. Aby uzyskać klarowną zawiesinę, należy przeprowadzić 60-sekundowe wirowanie przy 10 000 x g. Przenieść supernatant do nowej probówki, przygotować 5 μl porcji i przechowywać je w temperaturze -80 °C.
      nuta: Preparaty wektorów lentiwirusowych są wrażliwe na powtarzające się cykle zamrażania i rozmrażania. Ponadto sugeruje się, aby pozostałe etapy były wykonywane w hermetyzacji hodowli tkankowej lub w wyznaczonych obszarach kwalifikujących się pod względem odpowiedniego poziomu standardów bezpieczeństwa biologicznego (Rysunek 4B).
  6. Kwantyfikacja mian wirusów
    nuta: Oszacowanie mian wirusa przeprowadza się przy użyciu metody testu immunoenzymatycznego p24 (ELISA) (p24gag ELISA) i zgodnie z protokołem programu szczepień przeciw AIDS National Institutes of Health (NIH) dla testu wychwytywania antygenu HIV-1 p24 z niewielkimi modyfikacjami.
    1. Użyj 200 μL 0,05% Tween 20 na zimno 1x PBS (PBS-T) do umycia studzienek płytki 96-dołkowej 3x.
    2. Aby pokryć płytkę, użyj 100 μl przeciwciała monoklonalnego anty-p24 rozcieńczonego w stosunku 1:1,500 w 1x PBS. Inkubować płytkę przez noc w temperaturze 4 °C.
    3. Przygotować odczynnik blokujący (1% albuminy surowicy bydlęcej [BSA] w 1x PBS) i dodać 200 μl do każdego dołka, aby uniknąć niespecyficznego wiązania. Użyj 200 μL PBS-T do mycia studzienki 3x przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    4. Kontynuuj przygotowanie próbki. Podczas pracy ze skoncentrowanymi preparatami wektorowymi należy rozcieńczyć wektor w stosunku 1:100, używając 1 μl próbki, 89 μl dd-H20 i 10 μL Triton X-100 (przy stężeniu końcowym 10%). W przypadku preparatów nieskoncentrowanych należy rozcieńczyć próbki w stosunku 1:10.
    5. Wzorzec HIV-1 przy użyciu dwukrotnego seryjnego rozcieńczania (stężenie wyjściowe wynosi 5 ng/ml).
    6. Rozcieńczyć skoncentrowane próbki (przygotowane w kroku 1.6.4) w RPMI 1640 uzupełnionym 0,2% Tween 20 i 1% BSA, aby uzyskać rozcieńczenia 1:10 000, 1:50 000 i 1:250 000. Podobnie, rozcieńczyć nieskoncentrowane próbki (przygotowane w kroku 1.6.4) w RPMI 1640 uzupełnionym 0,2% Tween 20 i 1% BSA, aby uzyskać rozcieńczenia 1:500, 1:2,500 i 1:12,500.
    7. Dodać próbki i wzorce na płytce w trzech egzemplarzach. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
    8. Następnego dnia umyj studzienki 6x.
    9. Dodać 100 μl poliklonalnego króliczego przeciwciała anty-p24, rozcieńczonego w stosunku 1:1,000 w RPMI 1640, 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 0,25% BSA i 2% normalnej surowicy myszy (NMS) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 4 godziny.
    10. Umyj studzienki 6 razy. Dodaj kozią peroksydazę przeciw królikowi chrzanowi IgG rozcieńczoną w stosunku 1:10 000 w RPMI 1640 uzupełnioną 5% normalną surowicą kozią, 2% NMS, 0,25% BSA i 0,01% Tween 20. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
    11. Umyj studzienki 6x. Dodaj substrat peroksydazy TMB i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 15 min.
    12. Aby zatrzymać reakcję, dodać 100 μl 1 N HCl. W czytniku mikropłytek zmierzyć absorbancję przy 450 nm.
  7. Pomiar intensywności reportera fluorescencyjnego
    1. Użyj zawiesiny wirusa, aby uzyskać 10-krotne seryjne rozcieńczenie (od 10-1 do 10-5) w 1x PBS.
    2. Płytka: 5 x 105 komórek HEK-293T w każdym dołku płytki 6-dołkowej. Nałożyć 10 μl każdego rozcieńczenia wirusa na komórki i inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 48 godzin.
    3. Przejdź do analizy sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS) w następujący sposób: odłącz komórki, dodając 200 μl 0,05% roztworu trypsyny-EDTA. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 5 minut i ponownie zawiesić je w 2 ml pożywki DMEM (z surowicą). Zebrać próbki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 400 x g w temperaturze 4 °C. Zawiesić osad w 500 μl zimnego 1x PBS.
    4. Utrwal komórki, dodając 500 μl 4% paraformaldehydu (PFA) i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    5. Odwirować przy 400 x g w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić osad w 1 ml 1x PBS. Przeanalizuj wyrażenie GFP za pomocą instrumentu FACS, zgodnie z opisem w Ortinski et al.30. Aby określić miano funkcjonalne wirusa, użyj następującego wzoru.
      figure-protocol-1
      Tutaj,
      Tg = liczba komórek GFP-dodatnich;
      Tn = całkowita liczba komórek;
      N = całkowita liczba transdukowanych komórek;
      V = objętość użyta do transdukcji (w mikrolitrach).
  8. Zliczanie komórek GFP-dodatnich
    nuta: Określ wielość infekcji (MOI), która jest wykorzystywana do transdukcji. Przetestuj szeroki zakres MOI (od MOI = 1 do MOI = 10).
    1. Zasiew 3 x 105 do 4 x 105 komórek HEK-293T na każdy dołek płytki 6-dołkowej.
    2. Gdy komórki osiągną >80% konfluencji, transdukuj je z wektorem w interesującym je MOI.
    3. Inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i monitorować sygnał GFP w komórkach przez 1–7 dni.
    4. Policz liczbę komórek GFP-dodatnich. Zastosować mikroskop fluorescencyjny (obiektyw Plan 4x, 0,1 N.A., powiększenie 40x) przy użyciu filtra GFP (długość fali wzbudzenia = 470 nm, długość fali emisji = 525 nm). Użyj komórek nietransdukowanych, aby ustawić populację kontrolną komórek GFP-ujemnych.
    5. Zastosuj następujący wzór, aby określić funkcjonalne miano wirusa.
      figure-protocol-2
      Tutaj,
      N = liczba komórek dodatnich pod względem GFP;
      D = współczynnik rozcieńczenia;
      M = współczynnik powiększenia;
      V = objętość wirusa użytego do transdukcji.
      UWAGA: Oblicz wyniki w następujący sposób: dla 10 komórek GFP-dodatnich (N) liczonych w rozcieńczeniu (D) 10-4 (1:10 000) przy 20-krotnym powiększeniu (M) w próbce o pojemności 10 μl (V), TU na mililitr wyniesie (10 x 104) x (20) x (10) x (100) = 2 x 108 vu/ml.

2. Różnicowanie dopaminergicznych nerwowych komórek progenitorowych

  1. Hodowla hiPSCs
    UWAGA: hiPSC od pacjenta z potrojeniem locus SNCA, ND34391, uzyskano z katalogu National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) (patrz tabela materiałów).
    1. Hodowla hiPSC w warunkach niezależnych od zasilacza w pożywce hodowlanej ESC-iPSC bez karmienia (patrz tabela materiałów) na płytkach pokrytych membraną macierzy podstawowej (BMM) z kwalifikacją hESC (patrz tabela materiałów). Przemyć zbiegające się kolonie 1 ml DMEM/F12, dodać 1 ml odczynnika dysocjacyjnego (patrz tabela materiałów) i inkubować przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
    2. Odessać odczynnik dysocjacyjny i dodać 1 ml pożywki hodowlanej ESC-iPSC bez pożywki.
    3. Zeskrobać płytkę za pomocą podnośnika komórkowego i ponownie zawiesić kolonie w 11 ml pożywki hodowlanej ESC-iPSC, pipetując 4x–5x za pomocą pipet borokrzemianowych.
    4. Umieścić na płytce o objętości 2 ml zawiesiny kolonii na płytkach pokrytych BMM i umieścić płytkę w temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Wykonuj codzienną zmianę pożywki i dziel komórki co 5-7 dni.
  2. Różnicowanie w dopaminergiczne neuronalne komórki progenitorowe
    nuta: Różnicowanie hiPSC w dopaminergiczne neuronalne komórki progenitorowe (NPC MD) odbywa się przy użyciu dostępnego na rynku protokołu pożywki do indukcji neuronalnej zgodnie z instrukcjami producenta, z niewielkimi modyfikacjami31,32 (patrz tabela materiałów). Pierwszy dzień różnicowania uznaje się za dzień 0. Wysokiej jakości hiPSC są niezbędne do efektywnego różnicowania neuronów. Indukcja NPC MD odbywa się przy użyciu protokołu opartego na ciele embrionalnym (EB).
    1. Przed przystąpieniem do różnicowania hiPSC należy przygotować płytkę do hodowli mikrodołkowej (patrz tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta.
    2. Po przygotowaniu płytki do hodowli mikrostudzienki dodać 1 ml pożywki do indukcji neuronalnej (NIM; patrz tabela materiałów) uzupełnionej 10 μM Y-27632.
    3. Odłóż talerz na bok, aż będzie gotowy do użycia.
    4. Przemyć hiPSC DMEM/F12, dodać 1 ml roztworu do oddzielania komórek (patrz tabela materiałów) i inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
    5. Zawiesić pojedyncze komórki w DMEM/F12 i odwirować je przy 300 x g przez 5 minut.
    6. Ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w NIM + 10 μM Y-27632, aby uzyskać końcowe stężenie 3 x 106 komórek/ml.
    7. Dodać 1 ml zawiesiny jednokomórkowej do pojedynczego dołka płytki do hodowli mikrodołkowej i odwirować płytkę przy 100 x g przez 3 minuty.
    8. Zbadać płytkę pod mikroskopem, aby zapewnić równomierne rozmieszczenie komórek w mikrostudzience i inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
    9. W dniach 1–4 wykonuj codzienną częściową zmianę pożywki.
    10. Za pomocą mikropipety o pojemności 1 ml usuń 1,5 ml pożywki i wyrzuć. Powoli dodawaj 1,5 ml świeżego NIM bez Y-27632.
    11. Powtarzaj krok 2.2.10 do 4 dnia.
    12. W dniu 5 pokryj jeden dołek z płytki 6-dołkowej BMM.
    13. Umieść odwracalne sitko o pojemności 37 μm (patrz tabela materiałów) na stożkowej probówce o pojemności 50 ml (odpad). Skieruj strzałkę odwracalnego filtra siatkowego w górę.
    14. Usuń pożywkę z płytki do hodowli mikrostudzienki, nie naruszając utworzonych EB.
    15. Dodać 1 ml DMEM/F12 i niezwłocznie zebrać EBs za pomocą pipety borokrzemianowej i przefiltrować je przez sitko.
    16. Powtarzać krok 2.2.15, aż wszystkie EB zostaną usunięte z płytki do hodowli mikrostudzienki.
    17. Odwróć sitko na nowej stożkowej probówce o pojemności 50 ml i dodaj 2 ml NIM, aby zebrać wszystkie EBs.
    18. Wprowadzić 2 ml zawiesiny EB do pojedynczego dołka na płytce pokrytej BMM za pomocą pipety borokrzemianowej. Inkubować EB w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
    19. W dniu 6 przygotować 2 ml NIM + 200 ng/mL SHH (patrz Tabela Materiałów) i przeprowadzić codzienną wymianę pożywki.
    20. W 8 dniu zbadaj procent indukcji neuronalnej.
    21. Policz wszystkie dołączone EB, a konkretnie określ liczbę każdego pojedynczego EB, który jest wypełniony rozetami neuronowymi. Określ ilościowo indukcję rozety neuronalnej za pomocą następującego wzoru.
      figure-protocol-3
      nuta: Jeśli indukcja neuronalna wynosi <75%, wybór rozety neuronalnej może być nieefektywny.
    22. W dniu 12 przygotuj 250 ml pożywki N2B27 ze 119 ml pożywki neuropodstawnej, 119 ml pożywki DMEM/F12, 2,5 ml pożywki GlutaMAX, 2,5 ml NEAA, 2,5 ml suplementu N2, 5 ml witaminy B27 bez witaminy A, 250 μl gentamycyny (50 mg/ml) i 19.66 μl BSA (7 mg/ml).
    23. Aby przygotować 50 ml kompletnej pożywki N2B27, dodaj 3 μM CHIR99021, 2 μM SB431542, 20 ng/ml bFGF, 20 ng/ml EGF i 200 ng/ml SHH.
      nuta: Ważne jest, aby przygotować gotowe podłoże tuż przed użyciem.
    24. Odessać pożywkę ze studzienek zawierających rozety nerwowe i przemyć 1 ml DMEM/F12.
    25. Ad 1 ml odczynnika selekcyjnego rozety neuronalnej (patrz Tabela materiałów) i inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 1 godzinę.
    26. Usunąć odczynnik selekcyjny i za pomocą pipetora o pojemności 1 ml wycelować bezpośrednio w klastry rozety.
    27. Dodać zawiesinę do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i powtarzać kroki 2.2.25 i 2.2.26, aż większość skupisk rozety neuronalnej zostanie zebrana.
      nuta: Aby uniknąć zanieczyszczenia typami komórek nieneuronalnych, nie należy dokonywać nadmiernej selekcji.
    28. Odwirować zawiesinę rozety o sile 350 x g przez 5 min. Odessać supernatant i ponownie zawiesić rozety nerwowe w N2B27 + 200 ng/ml SHH. Dodać zawiesinę rozety nerwowej do studzienki pokrytej BMM i inkubować płytkę w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
    29. W dniach 13–17 wykonaj codzienną zmianę pożywki, używając kompletnej pożywki N2B27. Przejdź przez komórki, gdy kultury są zlewające się w 80%–90%.
    30. Aby podzielić komórki, przygotuj płytkę pokrytą BMM.
    31. Przemyć komórki 1 ml DMEM/F12, odessać pożywkę i dodać 1 ml odczynnika dysocjacyjnego (patrz tabela materiałów).
    32. Inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C, dodać 1 ml DMEM/F12 i usunąć przyłączone komórki, pipetując w górę i w dół. Zbierz zawiesinę NPC do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Wirować przy 300 x g przez 5 min.
    33. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml kompletnego N2B27 + 200 ng/ml SHH.
    34. Policz komórki i umieść je w płytkach o gęstości 1,25 x 105 komórek/cm2, a następnie inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
    35. Zmieniaj pożywkę co drugi dzień, używając kompletnego N2B27 + 200 ng/ml SHH.
      nuta: W tym przejściu NPC są traktowani jako przejście (P) 0. SHH można pobrać z pożywki N2B27 w P2.
    36. Przejdź przez komórki, gdy osiągną 80%-90% konfluencji.
    37. Na tym etapie potwierdź, że komórki wyrażają markery Nestin i FoxA2 za pomocą immunocytochemii i qPCR. Protokół ten prowadzi do wygenerowania 85% podwójnie dodatnich komórek dla markerów Nestin i FoxA2.
    38. W przypadku komórek pasujących powtórz kroki 2.2.31–2.2.36.
    39. Zamroź komórki, zaczynając od przejścia P2. W przypadku zamrażania komórek powtórz kroki 2.2.31–2.2.36 i ponownie zawieś osad komórkowy w temperaturze 2 x 106 do 4 x 106 komórek/ml przy użyciu zimnej pożywki do zamrażania progenitorów nerwowych (patrz tabela materiałów).
    40. Przenieś 1 ml zawiesiny komórek do każdego kriowialnego i zamroź komórki za pomocą standardowego systemu chłodzenia sterowanego powoli. W celu długotrwałego przechowywania utrzymuj komórki w ciekłym azocie.
  3. Rozmrażanie NPC MD
    1. Przygotować płytkę pokrytą BMM i ogrzać komplet N2B27. Dodaj 10 ml ciepłego DMEM/F12 do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Umieść kriowial w bloku grzewczym o temperaturze 37 °C na 2 minuty.
      1. Przenieść komórki z kriowialu do probówki zawierającej DMEM/F12. Wirować przy 300 x g przez 5 min.
      2. Odessać supernatant, ponownie zawiesić komórki w 2 ml N2B27 i dodać zawiesinę komórek do jednego dołka płytki pokrytej BMM. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .

3. Transdukcja NPC MD i analiza zmian metylacji

  1. Transdukcja NPC MD
    1. Transdukuj NPC MD przy 70% konfluencji z wektorami LV-gRNA/dCas9-DNMT3A przy MOI = 2. Wymień medium N2B27 16 godzin po transdukcji.
    2. Dodać N2B27 z 5 μg/ml puromycyny, 48 godzin po transdukcji. Hoduj komórki przez 3 tygodnie w N2B27 plus puromycyna, aby uzyskać stabilne linie NPC MD. Komórki są gotowe do dalszych zastosowań (DNA, RNA, analizy białek, charakterystyka fenotypowa23, zamrażanie i pasażowanie).
  2. Charakterystyka profilu metylacji intronu SNCA 1
    1. Ekstrahować DNA z każdej stabilnie transdukowanej linii komórkowej za pomocą zestawu do ekstrakcji DNA (patrz tabela materiałów).
    2. Użyj 800 ng DNA do przeprowadzenia konwersji wodorosiarczynu, używając dostępnego w handlu zestawu (patrz Tabela materiałów). Po konwersji wodorosiarczynu eluować DNA przekształcone w wodorosiarczyn do 20 ng/μl.
  3. PCR do analizy pirosekwencjonowania
    1. Przygotuj główną mieszankę PCR w probówce wolnej od nukleaz. Do każdej reakcji użyj 0,4 μl startera odwrotnego (10 μM), 0,4 μl startera (10 μM), 1,6 μl MgCl2 (25mM), 2 μL 10x koncentratu CoralLoad, 10 μL 2x PCR master mix, 4 μl 5x Q-Solution, 1 μl DNA i 0,6 μl wody wolnej od nukleaz.
    2. Przenieść płytkę reakcyjną do termocyklera i przeprowadzić PCR w następujących warunkach: 95 °C przez 15 minut, 50 cykli po 94 °C przez 30 s, 56 °C przez 30 s i 72 °C przez 30 s, z końcowym 10-minutowym krokiem przedłużania w temperaturze 72 °C. Startery stosowane do pirosekwencjonowania intronu SNCA 1 są wymienione w tabeli 1, Rysunek 7A i Rysunek uzupełniający 1.
    3. Po amplifikacji uwidocznić amplikony za pomocą 2 μl produktu PCR z barwieniem bromkiem etydyny, po elektroforezie w żelu agarozowym.
    4. Testy pirosekwencjonowania są walidowane przy użyciu mieszanin niemetylowanych (U) i metylowanych (M) DNA przekształconych w wodorosiarczyn w następujących proporcjach, a mianowicie 100U:0M, 75U:25M, 50U:50M, 25U:75M i 0U:100M (patrz tabela materiałów).
    5. Przeprowadzić pirosekwencjonowanie przy użyciu odczynników do pirosekwencjonowania (patrz tabela materiałów) i obliczyć wartości metylacji dla każdego miejsca CpG za pomocą oprogramowania do pirosekwencjonowania. Szczegółowy protokół pirosekwencjonowania można znaleźć w Bassil et al.37.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Walidacja mian produkcyjnych wektorów LV-dCas9-DNMT3A-GFP/Puro w porównaniu do naiwnego odpowiednika GFP

Przeprowadziliśmy test ELISAp24 gag, aby porównać fizyczne miana LV-dCas9-DNMT3A-GFP/Puro z naiwnymi odpowiednikami GFP/Puro. Reprezentatywne wyniki, przedstawione w Rysunek 5A, pokazują, że fizyczne plony wektorów, wygenerowane przy użyciu opisanego poniżej protokołu,...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LV zaczęły pojawiać się jako narzędzie z wyboru do edycji epigenomu, zwłaszcza w kontekście chorób genetycznych, głównie ze względu na ich zdolność do (i) przyjmowania dużych ładunków DNA oraz (ii) wydajnej transdukcji szerokiego zakresu komórek dzielących się i niedzielących się. Duża skuteczność pakowania LV jest szczególnie korzystna w zastosowaniach obejmujących pakowanie systemów CRISPR/dCas9, które są ponadwymiarowe. Z tej perspektywy LV stanowią platformę z wyboru do dostarczania kompleksowych systemów CRISPR/Cas9...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uniwersytet Duke'a złożył tymczasowy wniosek patentowy związany z tym badaniem.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została częściowo sfinansowana przez Kahn Neurotechnology Development Award (dla O.C.) oraz National Institutes of Health/National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NIH/NINDS) (R01 NS085011 do O.C.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Wyposażenie
Optima XPN-80 UltrawirówkaBeckman CoulterA99839
0,22 μ M jednostka filtrująca, 1 LCorning430513
0,45-μ m jednostka filtrująca, 500 mlCorning430773
100 mm Naczynie do hodowli z powłoką TCCorning430167
stożkowe probówki wirówkowe 15 mlCorning430791
150 mm Naczynia do hodowli komórkowych z siatką 20 mmCorning353025
stożkowe probówki wirówkowe o pojemności 50 mlCorning430291
6-dołkowe płytkiCorning3516
Aggrewell 800StemCell Technologies34811
Wirówka stołowa Allegra 25RBeckman Coulter369434
BD FACSBecton Dickinson338960
Stożkowe dolne probówki ultrawirówkoweSeton Scientific5067
Adaptery do rur stożkowychSeton ScientificPN 4230
Szkiełka do obrazowania komórekEppendorf Eppendorf30742060
96-dołkowe płytki o wysokim poziomie wiązaniaCorning3366
Odwrócony mikroskop fluorescencyjnyLeicaDM IRB2
QIAprep Spin Miniprep Kit (50)Qiagen27104
Odwracalne sitkoStemCell Technologies27215
SW32Ti rotorBeckman Coulter369650
VWR® Jednorazowe pipety serologiczne, szklane, niepirogenneVWR93000-694
VWR® Systemy filtracji próżniowejVWR89220-694
xMark™ Czytnik płytek absorbancyjnych do mikropłytekBio-Rad1681150
NazwaFirmaNumer katalogowyUwagi
Odczynniki do hodowli komórkowych
Ludzkie komórki nerki embrionalnej 293T (HEK 293T)ATCCCRL-3216
AccutaseStemCell Technologies7920
Roztwór do płukania zapobiegający przywieraniuStemCell Technologies7010
Przeciwciało anty-FOXA2AbcamAb60721
Przeciwciało anty-nestynoweAbcamAb18102
Roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy, 100xSigma AldrichA5955-100ML
Suplement B-27 (50x), bez witaminy AThermo Fisher Scientific12587010
BESSigma AldrichB9879 - BES
Albumina bydlęca frakcja V (7,5% roztwór)Thermo Fisher Scientific15260037
CHIR99021StemCell Technologies72052
Corning Matrigel z kwalifikacją hESCMatryca Corning08-774-552
Hyklon kosmicznej surowicy cielęcejSH30087.04
DMEM-F12Lonza12-719
DMEM, podłoże o wysokiej zawartości glukozyGibco11965
DNeasy Blood & Zestaw tkanekQiagen69504
EpiTect PCR Control Zestaw DNAQiagen596945
EZ DNA ZymoResearchD5001
ŻelatynaSigma AldrichG1800-100G
GentamynaThermo Fisher Scientific15750078
Delikatny odczynnik do dysocjacji komórekstemCell Technologies7174
GlutaMAXThermo Fisher Scientific35050061
Technologie ludzkich rekombinowanychkomórek macierzystych78003
Rekombinowany ludz  EGFStemCell Technologies78006
Ludzki rekombinowany Shh (C24II)StemCell Technologies78065
MEM Roztwór aminokwasów endogennych (100x)Thermo Fisher Scientific11140050
mTeSR1StemCell Technologies85850
Suplement N-2 (100x)Thermo Fisher Scientific17502001
Neurobasal MediumThermo Fisher Scientific21103049
Hyklonaminokwasami endogennymi (NEAA)SH30087.04
PyroMark Zestaw do PCRQiagen978703
RPMI 1640 ThermoFisher Scientific11875-085
SB431542StemCell Technologies72232
PirogroniansoduSigma AldrichS8636-100ML
STEMdiff  Indukcja neuronalna MediumStemCell Technologies5835
STEMdiff Neural Progenitor Freezing MediumStemCell Technologies5838
Test TaqMan FOXA2Thermo Fisher ScientificHs00232764
Test TaqMan GAPDHThermo Fisher ScientificHs99999905
Test TaqMan NestinThermo Fisher ScientificHS04187831
Test TaqMan OCT4Thermo Fisher ScientificHs04260367
Test TaqMan PPIAThermo Fisher ScientificHs99999904
Trypsyna-EDTA 0,05%Gibco25300054
Y27632StemCell Technologies72302
NazwaCompanyNumer katalogowy<strong>Komentarze
p24 Odczynniki ELISA
Monoklonalne przeciwciało anty-p24NIH AIDS Research and Reference Reagent Program3537
Kozia peroksydaza anty-króliczo-chrzanowa IgGSigma Aldrich12-348Stężenie robocze 1:1500
Surowica kozia, sterylna, 10 mlSigmaG9023Stężenie robocze 1:1000
Normy HIV-1NIH AIDS Research and Reference Reagent ProgramSP968F
Normalna surowica mysie, sterylna, 500 mlEquitech-BioSM30-0500
Poliklonalne przeciwciało anty-p24NIH AIDS Research and Reference Reagent ProgramSP451T
Podłoże peroksydazy TMBKPL5120-0076Stężenie robocze 1:10 000
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Plasmids
pMD2.GAddgene12253
pRSV-RevAddgene52961
psPAX2Addgene12259
NazwaCompanyNumer katalogowyUwagi
Enzymy restrykcyjne
BsmBINowa Anglia BiolabsR0580S
BsrGINowa Anglia BiolabsR0575S
EcoRVNowa Anglia BiolabsR0195S
KpnINowa Anglia BiolabsR0142S
PacINowa Anglia BiolabsR0547S
SphINowa Anglia BiolabsR0182S
bFGF z

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
  2. Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. 3rd ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).
  3. Thakore, P. I., Black, J. B., Hilton, I. B., Gersbach, C. A. Editing the epigenome: technologies for programmable transcription and epigenetic modulation. Nature Methods. 13 (2), 127-137 (2016).
  4. Gilbert, L. A., et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154 (2), 442-451 (2013).
  5. Gilbert, L. A., et al. Genome-Scale CRISPR-Mediated Control of Gene Repression and Activation. Cell. 159 (3), 647-661 (2014).
  6. Perez-Pinera, P., et al. RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors. Nature Methods. 10 (10), 973-976 (2013).
  7. Chavez, A., et al. Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming. Nature Methods. 12 (4), 326-328 (2015).
  8. Horlbeck, M. A., et al. Nucleosomes impede Cas9 access to DNA in vivo and in vitro. eLife. 5, (2016).
  9. Chavez, A., et al. Comparison of Cas9 activators in multiple species. Nature Methods. 13 (7), 563-567 (2016).
  10. Zhou, H., et al. In vivo simultaneous transcriptional activation of multiple genes in the brain using CRISPR-dCas9-activator transgenic mice. Nature Neuroscience. 21 (3), 440-446 (2018).
  11. Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., Vale, R. D. A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging. Cell. 159 (3), 635-646 (2014).
  12. Konermann, S., et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature. 517 (7536), 583-588 (2015).
  13. Holtzman, L., Gersbach, C. A. Editing the Epigenome: Reshaping the Genomic Landscape. Annual Review of Genomics and Human Genetics. , (2018).
  14. Perez-Pinera, P., et al. Synergistic and tunable human gene activation by combinations of synthetic transcription factors. Nature Methods. 10 (3), 239-242 (2013).
  15. Thakore, P. I., et al. Highly specific epigenome editing by CRISPR-Cas9 repressors for silencing of distal regulatory elements. Nature Methods. 12 (12), 1143-1149 (2015).
  16. Amabile, A., et al. Inheritable Silencing of Endogenous Genes by Hit-and-Run Targeted Epigenetic Editing. Cell. 167 (1), 219-232 (2016).
  17. Liu, X. S., et al. Editing DNA Methylation in the Mammalian Genome. Cell. 167 (1), 233-247 (2016).
  18. McDonald, J. I., et al. Reprogrammable CRISPR/Cas9-based system for inducing site-specific DNA methylation. Biology Open. 5 (6), 866-874 (2016).
  19. Huang, Y. H., et al. DNA epigenome editing using CRISPR-Cas SunTag-directed DNMT3A. Genome Biology. 18 (1), 176(2017).
  20. Vojta, A., et al. Repurposing the CRISPR-Cas9 system for targeted DNA methylation. Nucleic Acids Research. 44 (12), 5615-5628 (2016).
  21. Razin, A., Kantor, B. DNA methylation in epigenetic control of gene expression. Progress in Molecular and Subcellular Biology. 38, 151-167 (2005).
  22. Kantor, B., Ma, H., Webster-Cyriaque, J., Monahan, P. E., Kafri, T. Epigenetic activation of unintegrated HIV-1 genomes by gut-associated short chain fatty acids and its implications for HIV infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (44), 18786-18791 (2009).
  23. Kantor, B., et al. Downregulation of SNCA Expression by Targeted Editing of DNA Methylation: A Potential Strategy for Precision Therapy in PD. Molecular Therapy. , (2018).
  24. Jowaed, A., Schmitt, I., Kaut, O., Wullner, U. Methylation regulates alpha-synuclein expression and is decreased in Parkinson's disease patients' brains. Journal of Neuroscience. 30 (18), 6355-6359 (2010).
  25. Wang, Y., et al. A DNA methyltransferase inhibitor, 5-aza-2'-deoxycytidine, exacerbates neurotoxicity and upregulates Parkinson's disease-related genes in dopaminergic neurons. CNS Neuroscience & Therapeutics. 19 (3), 183-190 (2013).
  26. Matsumoto, L., et al. CpG demethylation enhances alpha-synuclein expression and affects the pathogenesis of Parkinson's disease. PLOS One. 5 (11), e15522(2010).
  27. Desplats, P., et al. Alpha-synuclein sequesters Dnmt1 from the nucleus: a novel mechanism for epigenetic alterations in Lewy body diseases. Journal of Biological Chemistry. 286 (11), 9031-9037 (2011).
  28. Ai, S. X., et al. Hypomethylation of SNCA in blood of patients with sporadic Parkinson's disease. Journal of the Neurological Sciences. 337 (1-2), 123-128 (2014).
  29. Tagliafierro, L., Chiba-Falek, O. Up-regulation of SNCA gene expression: implications to synucleinopathies. Neurogenetics. 17 (3), 145-157 (2016).
  30. Ortinski, P. I., O’Donovan, B., Dong, X., Kantor, B. Integrase-Deficient Lentiviral Vector as an All-in-One Platform for Highly Efficient CRISPR/Cas9-Mediated Gene Editing. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 5, 153-164 (2017).
  31. Tagliafierro, L., et al. Genetic analysis of alpha-synuclein 3' untranslated region and its corresponding microRNAs in relation to Parkinson's disease compared to dementia with Lewy bodies. Alzheimer’s & Dementia. 13 (11), 1237-1250 (2017).
  32. Tagliafierro, L., Zamora, M. E., Chiba-Falek, O. Multiplication of the SNCA locus exacerbates neuronal nuclear aging. Human Molecular Genetics. , (2018).
  33. Kantor, B., McCown, T., Leone, P., Gray, S. J. Clinical applications involving CNS gene transfer. Advances in Genetics. 87, 71-124 (2014).
  34. Kantor, B., Bailey, R. M., Wimberly, K., Kalburgi, S. N., Gray, S. J. Methods for gene transfer to the central nervous system. Advances in Genetics. 87, 125-197 (2014).
  35. Vijayraghavan, S., Kantor, B. A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells. Journal of Visualized Experiments. (130), e56915(2017).
  36. Bayer, M., et al. A large U3 deletion causes increased in vivo expression from a nonintegrating lentiviral vector. Molecular Therapy. 16 (12), 1968-1976 (2008).
  37. Bassil, C. F., Huang, Z., Murphy, S. K. Bisulfite pyrosequencing. Methods in Molecular Biology. 1049, 95-107 (2013).
  38. Truong, D. J., et al. Development of an intein-mediated split-Cas9 system for gene therapy. Nucleic Acids Research. 43 (13), 6450-6458 (2015).
  39. Nishimasu, H., et al. Crystal Structure of Staphylococcus aureus Cas9. Cell. 162 (5), 1113-1126 (2015).
  40. Ran, F. A., et al. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature. 520 (7546), 186-191 (2015).
  41. Van Lint, C., Ghysdael, J., Paras, P., Burny, A., Verdin, E. A transcriptional regulatory element is associated with a nuclease-hypersensitive site in the pol gene of human immunodeficiency virus type 1. Journal of Virology. 68 (4), 2632-2648 (1994).
  42. Van Lint, C., et al. Transcription factor binding sites downstream of the human immunodeficiency virus type 1 transcription start site are important for virus infectivity. Journal of Virology. 71 (8), 6113-6127 (1997).
  43. Goffin, V., et al. Transcription factor binding sites in the pol gene intragenic regulatory region of HIV-1 are important for virus infectivity. Nucleic Acids Research. 33 (13), 4285-4310 (2005).
  44. Kim, Y. S., et al. Artificial zinc finger fusions targeting Sp1-binding sites and the trans-activator-responsive element potently repress transcription and replication of HIV-1. Journal of Biological Chemistry. 280 (22), 21545-21552 (2005).
  45. Kantor, B., et al. Notable reduction in illegitimate integration mediated by a PPT-deleted, nonintegrating lentiviral vector. Molecular Therapy. 19 (3), 547-556 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Lentiviral Vector ProductionhiPSC DifferentiationCRISPR dCas9 SystemSNCA Methylation AnalysisDopaminergic Neuron ModelsPyrosequencing AssayViral Vector PurificationHuman Induced Pluripotent Stem CellsParkinson s Disease Models

Powiązane artykuły