Artykuł metodologiczny

Dokomorowy przeszczep zmodyfikowanych prekursorów neuronalnych do badań neuroarchitektury in vivo

5.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59242

⸱

11 maja 2019

 ,  , 
1Laboratory of Cerebral Cortex Development, SISSA

W tym artykule

Podsumowanie

Oparta na inżynierii lentiwirusowej in vitro prekursorów neuronów, ich kotransplantacji do mózgów dzikich typów i sparowanej ocenie morfometrycznej pochodnych "testowych" i "kontrolnych", metoda ta pozwala na dokładne modelowanie in vivo kontroli genów morfologii neuronów kory nowej w prosty i niedrogi sposób.

Streszczenie

Kontrola genów w cytoarchitekturze neuronów jest obecnie przedmiotem intensywnych badań. Opisana poniżej jest prosta metoda opracowana do badania in vivo kontroli genów morfologii neuronów projekcyjnych kory nowej. Metoda ta opiera się na (1) inżynierii lentiwirusowej in vitro prekursorów neuronów jako komórek "testowych" i "kontrolnych", (2) ich kotransplantacji do mózgów typu dzikiego oraz (3) sparowanej ocenie morfometrycznej ich neuronalnych pochodnych. W szczególności do tego celu wykorzystuje się paliaalne prekursory E12.5 od panneuronalnych, genetycznie znakowanych dawców. Zostały zaprojektowane tak, aby wykorzystywać wybrane promotory i technologię tetON/OFF i są przeszczepiane z wolnej ręki do bocznych komór noworodków. Później, po profilowaniu immunofluorescencyjnym mózgów biorców, sylwetki przeszczepionych neuronów są wprowadzane do oprogramowania open source NeurphologyJ, wyodrębniane są ich parametry morfometryczne oraz obliczana jest średnia długość i wskaźnik rozgałęzień. W porównaniu z innymi metodami, ta metoda ma trzy główne zalety: pozwala na osiągnięcie precyzyjnej kontroli ekspresji transgenów przy przystępnych kosztach, wymaga jedynie podstawowych umiejętności chirurgicznych i zapewnia statystycznie wiarygodne wyniki po analizie ograniczonej liczby zwierząt. Ze względu na swoją konstrukcję nie jest jednak odpowiedni do rozwiązania problemu nieautonomicznej kontroli neuroarchitektury przez komórkę. Co więcej, powinien być preferowany do badania kontroli morfologii neurytów po zakończeniu migracji neuronów. W swojej obecnej formule metoda ta jest doskonale dostrojona do badania kontroli genów architektury neuronów kory nowej glutaminergicznej. Wykorzystując linie transgeniczne wyrażające EGFP w innych specyficznych typach komórek nerwowych, można go ponownie wykorzystać do kontroli genów nad ich architekturą.

Wprowadzenie

Tutaj opisujemy prostą metodę, którą opracowaliśmy do analizy in vivo kontroli genów cytoarchitektury neuronów. Opierając się na inżynierii in vitro prekursorów neuronalnych, ich przeszczepieniu do mózgu noworodka i sparowanej ocenie morfometrycznej komórek "testowych" i "kontrolnych", pozwala w szybki i niedrogi sposób odkryć funkcjonalne implikacje genów testowych w precyzyjnej kontroli morfologii neuronów. Aby zbadać kontrolę genów in vivo nad architekturą neuronalną, należy zająć się trzema kluczowymi kwestiami technicznymi: (1) osiągnięciem odpowiednio wzorcowej ekspresji genu będącego przedmiotem zainteresowania (GOI) i dokładnej kontroli ilościowej tego zjawiska; (2) uzyskanie odpowiednio segmentowanej wizualizacji wyraźnych sylwetek neuronalnych; (3) Uzyskiwanie istotności statystycznej wyników przy wykorzystaniu ograniczonej liczby zwierząt.

Jeśli to możliwe, zmutowane linie myszy zawierające transgeny kontrolowane przez tetracyklinę (tet) mogą być najlepszym narzędziem do rozwiązania pierwszego problemu1. Alternatywnie można zastosować transgenezę somatyczną. W takich przypadkach transgen jest dostarczany za pomocą elektroporacji2 lub transdukcji wirusa3. Następnie jest zachowywany jako episom (np. po standardowej elektroporacji4) lub jest integrowany z genomem (losowo, za pomocą integrazy retrowirusowej5; lub w określonym miejscu, poprzez rekombinację homologiczną promowaną przez CRISPR (SLENDR)6).

Po drugie, wizualizację sylwetki neuronów można osiągnąć poprzez (a) rzadkie jednolite etykietowanie lub (b) gęste etykietowanie różnicowe. Jeśli chodzi o znakowanie rzadkie, można zastosować zaawansowane metodologie podobne do Golgiego7, wybrane minizestawy neuronalne można wypełnić biocytiną8, a znakowanie solą i pieprzem można uzyskać dzięki słabo wyrażonemu transgenowi. Taki transgen może wykazywać różnorodną transkrypcję (Thy-EGFP)9 lub może być aktywowany przez rekombinację stochastyczną (MORF)10. Jeśli chodzi o (b), najnowocześniejsze strategie obejmują stochastyczną rekombinację za pośrednictwem Cre w ramach wielofloksowej matrycy transgenów fluoroproteinowych (Brainbow)11, a także integrację genomową genów fluoroproteinowych opartą na piggyBac-transposazie, wcześniej dostarczaną przez transgenezę somatyczną (CLoNE)12.

Jeśli chodzi o trzecią kwestię, na wynik morfometryczny często wpływa duża losowa zmienność, wynikająca z różnic między zwierzętami i przypadkowości iniekcji komórkowych. Z tego powodu zwykle wykorzystuje się dużą liczbę zwierząt w celu osiągnięcia mocy statystycznej niezbędnej do oceny aktywności morfometrycznej rządu Indii.

Opisane wcześniej podejścia często opierają się na zaawansowanych umiejętnościach technicznych i wymagają znacznych środków finansowych, co może ograniczyć ich rozpowszechnienie w społeczności naukowej. Aby obejść te problemy, opracowaliśmy łatwy i prosty proces analizowania kontroli genów neuroarchitektury in vivo w szybki i niedrogi sposób. Jest to inspirowane podobnym projektem kotransplantacji, opracowanym wcześniej do szybkiej oceny in vivo aktywności transgenu przeciwblastycznego13.

Konkretnie, uważa się, że jednoczesna transplantacja "zielonych" prekursorów nerwowych (komórek testowych i "kontrolnych") do "czarnego" mózgu noworodka biorcy może jednocześnie rozwiązać trzy kluczowe problemy wymienione powyżej. W rzeczywistości, inżynieria lentiwirusowa prekursorów in vitro, w dobrze kontrolowanych warunkach, pozwala na utrzymanie zmienności ekspresji transgenu neuronalnego na minimalnym poziomie, znacznie niższym niż zwykle kojarzonym z manipulacjami somatycznymi in vivo (wykonanymi wcześniej14,15 i w naszych niepublikowanych wynikach). Uzyskana w ten sposób dokładna kontrola ekspresji genów jest porównywalna z tą osiągniętą przez modele transgeniczne kontrolowane przez tet. Jednak koszty tej procedury są znacznie niższe niż te wynikające z utrzymania linii myszy transgenicznych. Następnie, wstrzyknięcie komórek z wolnej ręki jest łatwe i wymaga minimalnego szkolenia. Co więcej, ilość znakowanych prekursorów wstrzykiwanych do każdego mózgu można łatwo dostosować, aby osiągnąć wystarczającą skumulowaną liczbę rzadko rozmieszczonych prekursorów, przy jednoczesnym utrzymaniu całkowitej liczby przeszczepionych zwierząt na minimalnym poziomie. Wreszcie, co nie mniej ważne, jednoczesne wstrzykiwanie różnie znakowanych fluorowo, "testowych" i "kontrolnych" prekursorów oraz późniejsza analiza statystyczna wyników parami przeciwdziałają skutkom zmienności doświadczalnej między zwierzętami, umożliwiając osiągnięcie istotności statystycznej wyników, nawet przy analizie ograniczonej liczby osobników13.

Należy podkreślić, że ta metoda, choć szybka i tania, ma dwie główne ograniczenia. Po pierwsze, ma on na celu zbadanie autonomicznej kontroli genów nad architekturą neuronów i nie jest właściwe zajmowanie się kontrolą środowiska. Po drugie, ponieważ przeszczepione prekursory neuronów osiągają swoją ostateczną lokalizację zgodnie z harmonogramem heterochronicznym, metoda ta jest preferowana do modelowania kontroli neuroarchitektonicznej zachodzącej po zakończeniu migracji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie opisane tutaj metody i procedury zostały zatwierdzone przez SISSA Organismo preposto al Benessere Animale (SISSA IACUC).

1. Generacja zaprojektowanych "zielonych" pul przodków

  1. Przygotowanie "zielonej" puli
    1. Skryj samicę CD1 typu dzikiego z MtaptEGFP/+ founder16. Poddać eutanazji ciężarną matkę przez zwichnięcie szyjki macicy po 12,5 dniu po stosunku (dzień 0 określa się na podstawie kontroli czopa pochwowego) i pobrać zarodki z zarodka w 12,5 dniu (E12,5). Umieść je w indywidualnych dołkach na 24-dołkowej płytce w zimnym roztworze PBS.
    2. Szybko genotypuj zarodki poprzez oględziny pod lampą światła niebieskiego, sprawdzając emisję zielonej fluorescencji w mózgu.
    3. Umieść "zielone" zarodki na szalce Petriego o średnicy 10 cm wypełnionej zimnym 1x PBS z 0,6% glukozy i przenieś je pod mikroskop stereoskopowy.
    4. Odetnij główki zarodków za pomocą standardowych nożyczek i wydobądź z nich kresomózgowie za pomocą kleszczy #3 i #5.
    5. Oddziel dwa pęcherzyki kresomózgowia i wypreparuj korę nową za pomocą kleszczy; upewnij się, że usunąłeś hipokamp i zwoje podstawy17.
    6. Zebrać korę nową, przenosząc ją pipetą P1000 do probówki o pojemności 1,5 ml trzymanej na lodzie.
    7. Niech wypreparowana kora nowa osiądzie na dnie rurki.
    8. Odessać supernatant tak bardzo, jak to możliwe.
    9. Zawiesić korę nową w 400 μl świeżej pożywki proliferacyjnej [DMEM-F12, 1x Glutamax, 1X N2, 1 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 0,6% glukozy, 2 μg/ml heparyny, 20 ng/ml zasadowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF), 20 ng/ml naskórkowego czynnika wzrostu (EGF), 1X pen-strep i 10 pg/ml amfoterycyny B].
    10. Delikatnie pipetować korę nową w górę i w dół, kolejno za pomocą końcówek P1000, P200 i P20, 4 razy na końcówkę, aby uzyskać mętną zawiesinę komórek.
      UWAGA: Tkanka kory nowej E12.5 jest bardzo miękka; dysocjacja na pojedyncze komórki w ogóle nie wymaga trawienia enzymatycznego; Wystarczające jest wielokrotne pipetowanie.
    11. Pozwól oponom mózgowym i resztkowym grudkom kory nowej osiąść na 2 minuty.
    12. Przenieść 150 μl z górnej części zawiesiny komórek (zawierających głównie pojedyncze komórki) do nowej sterylnej probówki o pojemności 1,5 ml.
    13. Dodać 150 μl świeżej pożywki proliferacyjnej i powtarzać czynności 1.1.10-1.1.12 do momentu, aż nie będą widoczne już grudki tkanek. Należy przy tym pominąć etap pipetowania P1000 (w kroku 1.1.10).
      UWAGA: Trzy iteracje kroków 1.1.10-1.1.12 są zwykle wystarczające do osiągnięcia pełnej dysocjacji tkanek.
    14. Policz komórki ("zieloną" pulę) metodą wykluczania błękitu trypanowego w komorze Bürkera17 i dodaj świeżą pożywkę proliferacyjną, aby dostosować stężenie do 103 komórek/μL.
      UWAGA: Kroki 1.1.7-1.1.14 należy wykonać pod sterylnym okapem z przepływem laminarnym, zdezynfekowanym 70% etanolem i utrzymywanym w wentylacji przez co najmniej 20 minut.
  2. Inżynieria "zielonych" podpul
    1. Podziel "zieloną" pulę na dwie podpule w dwóch oddzielnych probówkach o pojemności 1,5 ml do infekcji lentiwirusowej.
    2. Infekuj podpule niezależnie za pomocą dwóch dedykowanych mieszanek lentiwirusowych. Każda mieszanka zawiera wirusa "czerwonej etykiety" (Pgk1_mCherry) lub "czarnego" wirusa (pCAG_lacZ) jako kontrolę, a także wirusy o ekspresji transgenu napędzanego przez tetOFF (Pgk1p_tTA i TRE_transgene) lub kontrolnej (Pgk1p_tTA i TRE_PLAP).
      UWAGA: Manipuluj lentiwirusami w środowisku BLS-2 ze wszystkimi pomiarami ochronnymi zalecanymi przez obowiązujące przepisy i prawa.
      UWAGA: Każdy lentiwirus musi być podawany przy wielokrotności infekcji (MOI) wynoszącej 8, co (jak pokazano wcześniej14) jest wystarczające do transdukcji zdecydowanej większości komórek nerwowych w takich warunkach eksperymentalnych (Rysunek 1). Lentiwirus zawierający transaktywatory tet może być zbudowany poprzez zastosowanie różnych promotorów neuronalnych napędzających ekspresję tTA/rtTA (np. pTα1, pSyn, pCaMKII, pGAD1 itp.) (Rysunek 2). MOI to stosunek (a) liczby dostarczonych zakaźnych cząstek wirusa do (b) liczby ich komórek docelowych. W tym przypadku pierwsza (a) jest obliczana zgodnie z konwencjonalną procedurą opisaną w innym miejscu14, druga (b) jest po prostu obliczana za pomocą komory Bürkera.
    3. Umieść 600 000 komórek z każdej zakażonej podpuli na studzienkę 12-dołkowej płytki wielodołkowej, w 600 μl pożywki proliferacyjnej z 2 μg/ml doksycykliny.
      UWAGA: W tym przypadku studzienki nie są wstępnie traktowane polilizyną, co zapobiega przyczepianiu się komórek nerwowych do ich dna.
    4. Przenieść komórki do inkubatora w 5% CO2 w temperaturze 37 °C.
    5. Po 2 dniach, aby ocenić skuteczność infekcji i różnicowe oznakowanie zaprojektowanych basenów, należy sprawdzić komórki pod konwencjonalnym mikroskopem fluorescencyjnym. Dwie podpule muszą wyglądać jak zawiesiny małych neurosfer, homogenicznie wyrażające białko czerwonej fluorescencji (próbka "kontrolna") lub nie (próbka (próbka "testowa"). W tych neurosferach transgen MtaptEGFP jest aktywny ograniczony do mniejszości komórek (neuronów postmitotycznych) i cichy w większości z nich (proliferujące prekursory) (Ryc. 3).

2. Ustawienie narzędzi chirurgicznych i obszaru operacyjnego

  1. Przygotowanie igieł borokrzemianowych
    1. Stosować kapilary ze szkła borokrzemianowego o średnicy zewnętrznej i wewnętrznej wynoszącej odpowiednio 1,5 mm i 1,12 mm.
    2. Pociągnij kapilarę za pomocą ściągacza P 1000.
    3. Skonfiguruj program ściągania. Typowe parametry programu to: ciepło = 614; vel = 60; czas = 1; ciśnienie = 600. Muszą być wyregulowane zgodnie z modelem ściągacza i zastosowanym rezystorem grzewczym.
    4. Umieść kapilę w uchwytach ściągacza i dokręć je.
    5. Uruchom program i weź dwie wyciągnięte mikrokapilary.
    6. Końcówkę kapilarną należy przeciąć ręcznie skalpelem pod mikroskopem stereoskopowym, aby uzyskać końcówkę o średnicy zewnętrznej ~200-250 μm.
    7. Umieść kapilary na podłożu z plasteliny (np. plasteliny) na zamkniętej szalce Petriego i przenieś ją pod maskę.
  2. Ustawianie okapu i przygotowanie roztworu do śledzenia komórek
    1. Dokładnie wyczyść okap z przepływem poziomym i zdezynfekuj go przy użyciu 70% etanolu.
    2. Zdezynfekuj światłowody za pomocą 70% etanolu i umieść je pod maską.
    3. Wymieszaj 10 μl 125 mM roztworu EGTA i 10 μl Fast Green, aby przygotować "roztwór do śledzenia komórek" i umieść go pod maską.
    4. Wytnij małe kawałki (o wymiarach 4 cm x 2 cm) laboratoryjnej folii uszczelniającej do plamienia zawiesiny komórek.
    5. Przygotować roztwór 1 mg/ml sterylnej doksycykliny i odessać go do strzykawki o pojemności 0,3 ml.
    6. Włącz okap i utrzymuj włączony przepływ laminarny przez 20 minut przed operacją.
  3. Montaż rurki iniekcyjnej
    1. Weź ustnik z twardego plastiku, dwie rurki lateksowe (każda o długości około 30 cm) i uchwyt kapilarny z zestawu do montażu probówek aspiratora do kalibrowanych pipet mikrokapilarnych.
    2. Przymocuj ustnik z twardego plastiku do jednego końca lateksowej rurki.
    3. Przymocuj uchwyt kapilary do jednego końca innej rurki lateksowej.
    4. Połącz wolne końce dwóch rurek lateksowych ze sterylnym filtrem 0,45 μm, jako barierę przed zarazkami operatora.
    5. Umieść powstały zespół rurki aspiratora na uchwycie z plasteliny, który ma być trzymany pod maską.

3. Mieszanie komórek i przeszczep dokomorowy

  1. Mieszanie "testowych" i "kontrolnych" podpul zielonych komórek
    1. Zebrać neurosfery "testowe" i "kontrolne" (patrz krok 1.2.5) w oddzielnych probówkach o pojemności 1,5 ml.
    2. Odwirować zawiesinę neurosfer w dawce 200 g przez 5 min.
    3. Zebrać i wyrzucić supernatant, unikając zakłócenia osadu komórkowego.
    4. Delikatnie zawiesić neurosfery w 500 μL 1x PBS.
    5. Odwiruj je przy 200 g przez 1 minutę.
    6. Usunąć supernatant.
    7. Powtórz kroki 3.1.4-3.1.6 jeszcze dwa razy.
    8. Delikatnie ponownie zawiesić kulki w 200 μL 2x roztworu trypsyny (2x Trypsyna, 1x PBS) i pipetować osad komórek w górę iw dół 4x-5x.
      UWAGA: Zwróć uwagę, aby nie tworzyć pęcherzyków powietrza.
    9. Pozostawić komórki w inkubatorze na 5 minut w temperaturze 37 °C w celu uzyskania zawiesiny jednokomórkowej.
    10. Zablokuj trypsynę 200 μl roztworu inhibitora trypsyny (DMEM-F12, 10 μg/ml DNAzy I, 0,28 mg/ml inhibitora trypsyny), pipetując w górę iw dół 4x-5x.
    11. Odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić je w 1 ml świeżej pożywki proliferacyjnej (DMEM-F12, 1x Glutamax, 1x N2, 1 mg/ml BSA, 0,6% glukozy, 2 μg/ml heparyny, 20 ng/ml bFGF, 20 ng/ml EGF, 1x pen-strep, 10 pg/ml amfoterycyny B).
    12. Policz komórki dwóch basenów za pomocą metody wykluczania błękitu trypanowego w komorze Bürkera.
    13. Dostosuj ich stężenie do 100 000 komórek/μl w pożywce proliferacyjnej.
    14. Wymieszaj komórki "testowe" 1:1 z komórkami "kontrolnymi".
    15. Sprawdź otrzymaną mieszaninę pod mikroskopem fluorescencyjnym (powiększenie obiektywu: 10x), aby upewnić się, że mieszanina jest jednokomórkową zawiesiną dwóch pul (Rysunek 3C).
    16. Umieść mieszankę na lodzie pod maską.
  2. Przeszczep wewnątrzkomorowy
    1. Przygotuj klatkę z matką i młodymi P0 na stole z dala od obszaru chirurgicznego.
    2. Umieść klatkę odzyskiwania na wózku w pobliżu maski.
    3. Na dnie klatki rekonwalescencji umieść mieszaninę trocin pobranych z klatki matki i umieść ją pod lampą.
    4. Na bok ustaw pojemnik na lód przykryty folią aluminiową do znieczulenia szczeniąt P0.
    5. Tuż przed przeszczepem dodać 1/10 objętości roztworu znacznika komórek (z kroku 2.2.3) do 1 objętości zawiesiny komórek (z kroku 3.1.16) i umieścić 3 μl powstałej "mieszanki iniekcyjnej" na kawałku laboratoryjnej folii uszczelniającej.
    6. Umieść szczeniaka na chłodnej folii aluminiowej na 1 minutę i sprawdź, czy jest w pełni znieczulony.
      UWAGA: Aby potwierdzić znieczulenie, delikatnie ściśnij łapę i monitoruj szczeniaka pod kątem braku ruchów, nadal oddychając.
    7. W międzyczasie należy zassać 3 μl mieszanki do wstrzykiwań (z kroku 3.2.5) do szklanej kapilary.
    8. Delikatnie przetrzyj głowę znieczulonego szczeniaka 70% etanolem.
    9. Umieść podbródek szczeniaka na końcówce światłowodu, aby wyraźnie zidentyfikować półkule korowe.
      UWAGA: W P0-P1 skóra głowy jest bardzo cienka, co pozwala na prostą wizualną identyfikację półkul tuż nad gałkami ocznymi i za opuszkami węchowymi.
    10. Utrzymać naczynia włosowate (obciążone zgodnie z opisem w kroku 3.2.7) w jednej z dwóch środkowych płaszczyzn przystrzałkowych (lewej lub prawej), powyżej opuszki węchowej i przebić skórę czoła na jej przecięciu z płaszczyzną czołową zawierającą środki gałek ocznych. Uważaj, aby nie uszkodzić naczyń krwionośnych. Wprowadź naczynia włosowate do kory czołowej i uzyskaj dostęp do jamy komorowej (Rysunek 4A).
    11. Aby zapobiec przypadkowemu uszkodzeniu wyniosłości zwojowej, obróć igłę na boki o 30 stopni, kierując jej końcówkę w stronę ogonowo-przyśrodkową (Rysunek 4B).
    12. Delikatnie wstrzyknij komórki do jamy komorowej i monitoruj ich dyfuzję za pomocą Fast Green (Rysunek 4C).
    13. Poczekaj 5-10 sekund.
    14. Usunąć szklaną igłę, uważając, aby nie zassać zawiesiny komórek i wyrzucić ją do odpowiedniego pojemnika na odpady.
    15. Przed wyzdrowieniem szczeniąt ze znieczulenia należy wstrzyknąć dootrzewnowo 150 μl roztworu doksycykliny, aby utrzymać ekspresję transgenu po przeszczepie.
    16. Po wstrzyknięciu należy umieścić szczenię bezpośrednio pod lampą w celu wyzdrowienia.
    17. Pozostaw szczenięta pod lampą na 5-10 minut, a po pełnym rozbudzeniu umieść je w klatce z matką.
    18. Obserwuj operowane młode przez 2-3 godziny, aby upewnić się, że matka je akceptuje.
    19. Zaopatrz klatkę w wodę pitną zawierającą 0,5 mg/ml doksycykliny i 50 g/l sacharozy, aby utrzymać ekspresję transgenu.
    20. Zastąp wodę zawierającą doksycyklinę wodą wolną od doksy 4 dni po przeszczepie, aktywując w ten sposób transgen w neuronach postmitotycznych. Trzymaj myszy w reżimie wolnym od doksy przez 6 dni i poddaj je eutanazji w temperaturze P10 przez wdychanie dwutlenku węgla, a następnie ścinanie głowy.

4. Analiza przeszczepionych mózgów

  1. Histologia i immunofluorescencja
    1. Eutanazja przeszczepionych szczeniąt 10 dni po przeszczepieniu komórek przez wdychanie dwutlenku węgla, a następnie dekapitację. Napraw mózgi uśpionych szczeniąt w 4% paraformaldehydzie (PFA) w temperaturze 4 °C przez noc.
      UWAGA: PFA jest wysoce toksyczny; obchodzić się z nim ostrożnie, ściśle przestrzegając zaleceń producenta, pod wyciągiem chemicznym; wyrzuć resztki roztworu PFA do oznakowanego pojemnika na odpady.
    2. Usuń roztwór PFA i zastąp go 30% roztworem sacharozy.
    3. Pozostawić mózgi w temperaturze 4 °C lub do momentu, gdy opadną na dno fiolki.
    4. Przenieś mózgi do jednorazowej formy do osadzania wypełnionej w przybliżeniu do połowy pożywką do krioinkluzji.
    5. Zamrozić dołączone mózgi w temperaturze -80 °C.
    6. Wytnij skrawki koronalne o grubości 60 μm za pomocą kriostatu.
      UWAGA: Unikaj stosowania cieńszych sekcji, ponieważ może to spowodować niedopuszczalną utratę informacji dotyczących całej architektury pojedynczych neuronów.
    7. Sekcje procesu dla immunofluorescencji18,19, przy użyciu przeciwciał anty-GFP [1:400] i anty-RFP (mCherry) [1:500]. Jądra barwnika przeciwstawnego roztworem DAPI o stężeniu 1 mg/ml [1:200].
  2. Morfometria
    1. Ustawić parametry pracy mikroskopu konfokalnego w następujący sposób: wysokość stosu z = 40 μm; krok = 2 μm.
    2. Zbierz zdjęcia wycinków poddanych testom immunologicznym, wybierając pola fotograficzne bogate w neurony GFP dodatnie, ślepe na dystrybucję sygnału RFP.
    3. Wyeksportuj obrazy jako pliki .nd2.
    4. Wygeneruj maksymalne projekcje Z z nich jako pliki .tiff (Rysunek 5A).
    5. Aby umożliwić subsekwencyjną szkieletyzację neuronów ślepą na genotyp komórek, ukryj czerwony sygnał. Aby to zrobić, otwórz każdy plik .tiff za pomocą odpowiedniego oprogramowania i dodaj warstwę dopasowania. Wybierz "poziomy", "czerwony", a następnie ustaw "wyjście" na zero. Zapisz plik w następujący sposób.
      UWAGA: Szkieletyzacja jest następnie wykonywana przez nowego operatora, który nie miał wcześniej dostępu do oryginalnych, zwykłych czerwonych plików.
    6. Dla każdego ukrytego czerwonego pliku dodaj warstwę rysunkową do obrazu podstawowego i wybierz narzędzie ołówka (kolor biały). Śledź somę na podstawie sygnału GFP, a następnie śledź neuryty.
      UWAGA: narzędzie ołówka można ustawić na 40 pikseli dla somy i na trzy piksele dla neurytów.
    7. Zapisz plik wielowarstwowy, w tym sylwetki neuronów (Rysunek 5B).
      UWAGA: Późniejsza analiza szkieletu neuronalnego może być wykonana przez dowolnego operatora.
    8. Utwórz nowy 16-bitowy plik w skali szarości o wymiarach 1024 x 1024 z czarnym tłem, po jednym na neuron.
    9. Skopiuj i wklej sylwetki pojedynczych neuronów z obrazu podstawowego do nowego pliku w skali szarości. Wróć do pliku wielowarstwowego i wyłącz warstwę dostosowawczą, aby odsłonić genotypy neuronów. Zapisz 16-bitowy plik w skali szarości z adnotacją o odpowiednim genotypie neuronalnym.
    10. Importuj obrazy w skali szarości do ImageJ jeden po drugim i analizuj szkielety za pomocą wtyczki NeurphologyJ oprogramowania ImageJ20 (Rysunek 5C).
    11. Skopiuj podstawowe dane NeurphologyJ (neurite_length, attachment_points i punkty końcowe; dla każdego z nich weź wartości "Całkowita powierzchnia", wklej je do arkusza kalkulacyjnego i wykorzystaj do obliczenia drugorzędnych parametrów morfometrycznych (średnia długość neurytu, indeks rozgałęzień) (Rysunek 5D).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Istnieje pięć głównych zestawów danych dostarczających przydatnych informacji na temat kluczowych aspektów procedury: (1) wydajność transdukcji i kotransdukcji prekursorów neuronalnych za pomocą wektorów lentiwirusowych. (2) Przykład kluczowych cech promotorów wykorzystanych do sterowania „genem testowym”. (3) Przykład zmodyfikowanych komórek przygotowanych do transplantacji. (4) Schemat zawierający kluczowe szczegóły proceduralne dotyczące mikroiniekcji komórek do mózgu noworodka. (5) St...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Poszczególne aspekty/etapy tej procedury są krytyczne i wymagają szczególnej uwagi. Po pierwsze, (a) operatorzy muszą być odpowiednio przeszkoleni w zakresie bezpiecznego manipulowania lentiwirusami w środowisku laboratoryjnym zgodnym z BSL-2. Po drugie, (b) przed zmieszaniem "testowych" i "kontrolnych" preparatów nerwowych, obowiązkowe jest dokładne umycie dwóch odpowiadających im zawiesin neurosfery, jak opisano, w celu zapobieżenia opóźnionemu zakażeniu krzyżowemu obu preparatów z powodu niepożądanego przeniesienia le...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Mihn Duc Do za jego wkład w wczesne wprowadzenie tej procedury.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Strzykawka 0,3 mlBD320840przechowywać w RT
0,45 μ m sterylny filtrMillex-HVSLHU033RSprzechowywać na
płytce wielodołkowej RT 12Falcon353043przechowywać w RT
1X PBSGibco14190-094przechowywać na
płytce wielodołkowej RT 24Falcon351147przechowywać w
przeciwciało anty-EGFP, kurczak poliklonalny, RRID:AB_371416TebubioGTX13970przechowywać w temperaturze -20 ° Przeciwciało
anty-RFP C, monoklonalne szczurze, RRID:AB_10795839Przeciwciała ABIN334653 sklepie internetowympod numerem -20 i #176; Przeciwciało
anty-Tubb3 C, monoklonalne myszy, RRID:AB_2313773CovanceMMS-435Pprzechowywać w temperaturze -20 i #176; C
Zestaw zespołów probówek aspiratora do kalibrowanych pipet mikrokapilarnychSigmaA5177-5EAsklep w RT
Lampa światła niebieskiegoNightseaBLS2sklep w RT
Kapilary borokrzemianoweKwik-FilTW150-4sklep w RT
BSASigmaA9647sklep pod adresem -20 ° C
Bü Komora rakowaSigmaBR7195200,0025 mm2, 0,100 mm
Pożywka krioinkluzyjna (Killik)Bio-Optica05-9801sklep w RT
DAPISigmaD9542sklep pod adresem -20 ° C
Jednorazowa forma do zatapianiaBio-Optica07MP7070sklep w RT
DMEM/F-12Gibco31331-028sklep pod numerem +4 i #176; C
Dnase IRoche10104159001sklepie pod adresem -20 ° C
DoksycyklinaSigmaD1822sklep pod adresem -20 ° C
Kleszcze Dumont #3cFine Science Tools11231-20sklep w RT
Kleszcze Dumont #5Fine Science Tools11251-20sklep w RT
EGFGibcoPHG0311sklep pod adresem -20 i #176; C
EGTASigmaE3889sklep w RT
FGFGibcoPHG0261sklep pod adresem -20 ° C
Drobne nożyczki - SharpFine Science Tools14060-09sklep w RT
Fungizone (Amfoterycyna B)Gibco15290018sklep pod adresem -20 ° C
GlukozaSigmaG8270sklep w RT
GlutaMAX SuplementGibco35050061sklep w RT
Goat anty-kurczak Alexa 488InvitrogenA11039sklep pod adresem -20 ° C
Koza anty-szczur Alexa 594InvitrogenA11007sklep pod adresem -20 ° C
Heparyna RoztwórTechnologie komórek macierzystych07980sklep pod adresem -20 ° C
N2 SuplementGibco17502048sklep pod adresem -20 ° C
Światłowody:ściągacz LeicaCLS150X
P1000,Sutter Instrumentsmodel P-1000, Parafilm
BemisPM-996sklep w RT
Pen, StrepSigma, P0781sklep pod adresem -20 i #176; C
Szalka PetriegoFalcon353003przechowywać w RT
PFASigma158127sklepie w RT
Plasmid #363 [LV_TREt_(IRES)PLAP]zbudowany in housestore at -20 ° C
Plasmid #386 [LV_pTa1_mCherry]zbudowany in housestore pod adresem -20 ° C
Plasmid #401 [LV_pTa1_rtTA(M2)]zbudowany w domustore pod adresem -20 ° C
Plasmid #408 [LV_Ppgk1p_rtTA(M2)]zbudowany in housestore at -20 ° C
Plasmid #484 [LV_lacZ]Addgene12108sklep pod adresem -20 ° C
Plasmid #529 [LV_Pgk1p_mCherry]zbudowany in housestore pod adresem -20 ° C
Plasmid #730 [LV_pSyn_rtTA(M2)]zbudowany in housestore at -20 ° C
SkalpelBraunBB515sklep w RT
SteromikroskopLeicaMZ6sklep w RT
Trypan niebieskiGibco15250-061sklep w RT
TrypsinGibco15400-054sklep -20 ° C
Inhibitor trypsynySigmaT6522sklep pod adresem -20 ° Z
RT , , , ,

Bibliografia

  1. Kistner, A., et al. Doxycycline-mediated quantitative and tissue-specific control of gene expression in transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (1996).
  2. Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection. Journal of visualized experiments: JoVE. , (2011).
  3. Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction. Journal of Visualized Experiments. , (2014).
  4. Puram, S. V., et al. A CaMKIIβ 2 signaling pathway at the centrosome regulates dendrite patterning in the brain. Nature Neuroscience. , (2011).
  5. Zuccotti, A., Le Magueresse, C., Chen, M., Neitz, A., Monyer, H. The transcription factor Fezf2 directs the differentiation of neural stem cells in the subventricular zone toward a cortical phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2014).
  6. Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by in Vivo Genome Editing. Cell. , (2016).
  7. Spiga, S., Acquas, E., Puddu, M. C., Mulas, G., Lintas, A., Diana, M. Simultaneous Golgi-Cox and immunofluorescence using confocal microscopy. Brain Structure and Function. , (2011).
  8. Chen, B., et al. The Fezf2-Ctip2 genetic pathway regulates the fate choice of subcortical projection neurons in the developing cerebral cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2008).
  9. Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. , (2000).
  10. Lu, X. H., Yang, X. W. Genetically-directed Sparse Neuronal Labeling in BAC Transgenic Mice through Mononucleotide Repeat Frameshift. Scientific Reports. , (2017).
  11. Cai, D., Cohen, K. B., Luo, T., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Improved tools for the Brainbow toolbox. Nature Methods. , (2013).
  12. Garcia-Moreno, F., Vasistha, N. A., Begbie, J., Molnar, Z. CLoNe is a new method to target single progenitors and study their progeny in mouse and chick. Development. , (2014).
  13. Falcone, C., Daga, A., Leanza, G., Mallamaci, A. Emx2 as a novel tool to suppress glioblastoma. Oncotarget. , (2016).
  14. Brancaccio, M., Pivetta, C., Granzotto, M., Filippis, C., Mallamaci, A. Emx2 and Foxg1 inhibit gliogenesis and promote neuronogenesis. Stem Cells. , (2010).
  15. Fimiani, C., Goina, E., Su, Q., Gao, G., Mallamaci, A. RNA activation of haploinsufficient Foxg1 gene in murine neocortex. Scientific Reports. , (2016).
  16. Tucker, K. L., Meyer, M., Barde, Y. A. Neurotrophins are required for nerve growth during development. Nature Neuroscience. , (2001).
  17. Currle, D. S., Hu, J. S., Kolski-Andreaco, A., Monuki, E. S. Culture of mouse neural stem cell precursors. Journal of Visualized Experiments. , (2007).
  18. Park, J. J., Cunningham, M. G. Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry. Journal of Visualized Experiments. , (2007).
  19. Puzzolo, E., Mallamaci, A. Cortico-cerebral histogenesis in the opossum Monodelphis domestica: Generation of a hexalaminar neocortex in the absence of a basal proliferative compartment. Neural Development. , (2010).
  20. NeurphologyJ Manual. , http://life.nctu.edu.tw/~ehwang/Manual.pdf (2012).
  21. Chiola, S., Do, M. D., Centrone, L., Mallamaci, A. Foxg1 Overexpression in Neocortical Pyramids Stimulates Dendrite Elongation Via Hes1 and pCreb1 Upregulation. Cerebral Cortex. , (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

In ynieria lentiwirusowaarchitektura neuron w korowychanaliza morfometrycznaoprogramowanie NeurphologyJprofilowanie immunofluorescencyjnemikroskopia konfokalnatechnologia TetON OFFkontrola ekspresji gen w

Powiązane artykuły