Artykuł metodologiczny

Wizualizacja upośledzenia barier śródbłonkowych i glejowych jednostki nerwowo-naczyniowej podczas eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia mięśniowego in vivo

DOI:

10.3791/59249

⸱

26 marca 2019

 , 
1Theodor Kocher Institute, University of Bern

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokoły do badania upośledzenia jednostki nerwowo-naczyniowej podczas eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia in vivo. W szczególności zajmujemy się tym, jak określić przepuszczalność bariery krew-mózg i aktywność żelatynazy zaangażowaną w migrację leukocytów przez limity gleju.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jednostka nerwowo-naczyniowa (NVU) składa się z mikronaczyniowych komórek śródbłonka tworzących barierę krew-mózg (BBB), błonę podstawną śródbłonka z osadzonymi perycytami, oraz limitany gleju złożone z miąższowej błony podstawnej i astrocytowego kanału końcowego obejmującego abluminalny aspekt mikronaczyń ośrodkowego układu nerwowego (OUN). Oprócz utrzymania homeostazy OUN, NVU kontroluje transport komórek odpornościowych do OUN. Podczas nadzoru immunologicznego OUN mała liczba aktywowanych limfocytów może przekroczyć barierę śródbłonka, nie powodując dysfunkcji bariery BBB ani choroby klinicznej. Natomiast podczas zapalenia układu nerwowego, takiego jak stwardnienie rozsiane lub jego eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia (EAE), duża liczba komórek odpornościowych może przekroczyć barierę krew-mózg, a następnie granice gleju, ostatecznie docierając do miąższu OUN, co prowadzi do klinicznej choroby. Migracja komórek odpornościowych do miąższu OUN jest zatem procesem dwuetapowym, który obejmuje sekwencyjną migrację przez barierę śródbłonkową i glejową NVU z wykorzystaniem różnych mechanizmów molekularnych. Jeśli po przejściu przez barierę śródbłonkową limfocyty T napotkają pokrewny antygen na komórkach prezentujących antygen okołonaczyniowy, ich lokalna reaktywacja zainicjuje kolejne mechanizmy prowadzące do ogniskowej aktywacji żelatynaz, co umożliwi limfocytom T przekroczenie bariery glejowej i wejście do miąższu OUN. Tak więc ocena zarówno przepuszczalności BBB, jak i aktywności MMP w korelacji przestrzennej z akumulacją komórek odpornościowych w OUN podczas EAE pozwala określić utratę integralności barier śródbłonkowych i glejowych NVU. Pokazujemy tutaj, jak indukować EAE u myszy C57BL / 6 przez aktywną immunizację, a następnie analizować przepuszczalność BBB in vivo przy użyciu kombinacji egzogennych znaczników fluorescencyjnych. Ponadto pokazujemy, jak wizualizować i lokalizować aktywność żelatynazy w mózgach EAE za pomocą zymogaphy in situ sprzężonej z immunofluorescencyjnymi barwieniami błon podstawnych BBB i atakującymi komórkami odpornościowymi CD45 +.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ośrodkowy układ nerwowy (OUN) koordynuje wszystkie funkcje ciała i umysłu u kręgowców, a homeostaza OUN jest niezbędna do prawidłowej komunikacji neuronów. Homeostaza OUN jest gwarantowana przez jednostkę nerwowo-naczyniową (NVU), która chroni OUN przed zmieniającym się środowiskiem krwiobiegu. NVU składa się z mikronaczyniowych komórek śródbłonka OUN, które są biochemicznie unikalne i tworzą barierę krew-mózg (BBB) w ciągłym przesłuchu z perycytami, astrocytami, neuronami i składnikami macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), tworząc dwie odrębne błony podstawne1. Błona podstawna śródbłonka, która otacza abluminalny aspekt komórek śródbłonka BBB, zawiera dużą liczbę perycytów i składa się z lamininy α4 i lamininy α5, a także innych białek ECM2. Natomiast błona podstawna miąższu składa się z lamininy α1 i lamininy α2 i jest objęta przez astrocytarne stopy końcowe. Miąższowa błona podstawna wraz ze stopami końcowymi astrocytów tworzy limitany gleju, które oddzielają sieć neuronalną OUN od wypełnionych płynem mózgowo-rdzeniowym przestrzeni okołonaczyniowych lub podpajęczynówkowych3. Ze względu na unikalną architekturę NVU, transport komórek odpornościowych do OUN różni się od transportu do tkanek obwodowych, ponieważ wymaga dwuetapowego procesu z komórkami odpornościowymi, najpierw naruszając śródbłonek BBB, a następnie granice gleju w celu dotarcia do miąższu OUN.

Stwardnienie rozsiane (SM) jest powszechną chorobą neurozapalną OUN, w której duża liczba krążących komórek odpornościowych dostaje się do OUN i powoduje zapalenie nerwów, demielinizację i ogniskową utratę integralności BBB4. Utrata integralności BBB jest wczesną cechą charakterystyczną stwardnienia rozsianego, na co wskazuje obecność zmian zwiększających kontrast gadolinu w OUN, co uwidoczniono za pomocą obrazowania metodą rezonansu magnetycznego (MRI)5. Wynaczynienie leukocytów do OUN następuje na poziomie żyłek zawłosionych naczyń włosowatych; jednak dokładne mechanizmy zaangażowane w diapedezę komórek odpornościowych przez błonę podstawną BBB, a następnie przez barierę glejową, pozostają do zbadania. Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia kręgowego (EAE) służy jako model zwierzęcy dla SM i znacząco przyczyniło się do naszej obecnej wiedzy na temat patogenezy SM. Na przykład, korzystając z modelu EAE, odkryto, że wynaczynienie leukocytów zachodzi w wieloetapowym procesie, w tym w początkowym etapie wychwytywania i toczenia, w którym pośredniczą selektyny i cząsteczki podobne do mucyny, takie jak ligand glikoproteiny selektyny P (PSGL)-1, po którym następuje zależne od integryny mocne zatrzymanie i pełzanie limfocytów T na komórkach śródbłonka BBB do stron permisywnych dla diapedezy6.

Gdy limfocyty T przejdą przez barierę krew-mózg śródbłonka i błonę podstawną śródbłonka, muszą napotkać swój pokrewny antygen na makrofagach lub komórkach dendrytycznych strategicznie zlokalizowanych w przestrzeniach oponowo-rdzeniowych lub okołonaczyniowych. Ta interakcja indukuje ogniskową produkcję mediatorów prozapalnych, które uruchamiają kolejne mechanizmy wymagane do inwazji tkanek OUN na komórki odpornościowe za pośrednictwem limitów gleju7,8,9. Ogniskowa aktywacja metaloproteinaz macierzy (MMP)-2 i MMP-9 zmienia aktywację chemokiny i indukuje degradację receptorów macierzy zewnątrzkomórkowej na końcach astrocytów, co jest warunkiem wstępnym migracji komórek odpornościowych przez granice gleju do miąższu OUN i wywołanie wystąpienia objawów klinicznych EAE10,11.

Połączenie wykrywania komórek immunologicznych naciekających OUN z wyciekiem BBB i aktywnością żelatynazy w skrawkach tkanki OUN dostarcza cennych informacji na temat funkcjonalnej integralności śródbłonka i bariery glejowej w kontekście zapalenia nerwów. Na przykład niedawno badaliśmy konstytutywną utratę cząsteczki ścisłego połączenia śródbłonka cząsteczki adhezji złącza (JAM)-B w transporcie komórek odpornościowych do OUN w kontekście EAE. W porównaniu ze zdrowymi myszami C57BL/6 typu dzikiego, zdrowe rodzeństwo z miotu z niedoborem JAM-B nie wykazywało upośledzenia integralności BBB, jak wykazano w ocenie przepuszczalności in vivo przy użyciu zarówno endogennych, jak i egzogennych znaczników12. W kontekście EAE, myszy C57BL / 6 z niedoborem JAM-B wykazywały złagodzone objawy choroby, co było związane z uwięzieniem komórek zapalnych w przestrzeniach oponowo-rdzeniowych i okołonaczyniowych12. Aby zbadać to zjawisko, zastosowaliśmy zymografię in situ, pozwalającą na identyfikację aktywności żelatynazy w celu sprawdzenia, czy brak aktywności żelatynazy u myszy z niedoborem JAM-B może być odpowiedzialny za zmniejszoną liczbę komórek odpornościowych zdolnych do naruszenia limitów gleju12.

Biorąc pod uwagę dostępność różnych genetycznie modyfikowanych modeli myszy, które nie mają np. różnych cząsteczek o ścisłym połączeniu BBB, które mogłyby powodować zmiany w funkcji BBB, ważne są metodologie badania integralności BBB. Ponadto nowo opracowane leki mogą mieć wpływ na bariery związane z NVU. Tutaj pokazujemy, jak indukować EAE u myszy C57BL / 6 poprzez aktywną immunizację peptydem glikoproteiny oligodendrocytów mieliny (MOG) aa35-55 w kompletnych adiuwantach Freunda. Następnie wyjaśniamy, jak zlokalizować infiltrację komórek odpornościowych przez bariery śródbłonkowe i glejowe NVU oraz jak badać in vivo integralność śródbłonka i bariery glejowej poprzez wykrywanie in situ odpowiednio egzogennych znaczników i aktywności żelatynazy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie badania zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi zgodnie ze szwajcarskim ustawodawstwem dotyczącym ochrony zwierząt i zostały zatwierdzone przez Biuro Weterynaryjne Kantonu Berno, Szwajcaria (numery zezwoleń: BE 31/17 i BE 77/18).

1. Trzymanie myszy C57BL/6 w warunkach wolnych od specyficznych patogenów (SPF)

  1. Myszy domowe w indywidualnych wentylowanych klatkach z cyklem 12/12 godzin światła i ciemności. Zapewnij jedzenie i wodę ad libidum. Aby nadzorować jakość mikrobiologiczną myszy, kohorta eksperymentalna była poddawana kwartalnemu monitorowaniu stanu zdrowia przez strażników brudnej ściółki zgodnie z zaleceniami FLAASA13.
  2. Użyj dziurkaczy do uszu, aby indywidualnie oznaczyć 8-12 tygodniowe samice myszy C57BL/6.

2. Immunizacja myszy C57BL/6

  1. Przygotowanie roztworów14:
    1. W przypadku Complete Freund's Adjuvant (CFA) należy zmieszać 30 ml Incomplete Freund's Adjuvant ze 120 mg świeżo wcieranego inaktywowanego termicznie Mycobacterium tuberculosis (H37RA) pod wyciągiem. Przechowywać roztwór podstawowy w temperaturze 4 °C.
    2. W przypadku roztworu podstawowego peptydu MOGaa35-55 należy rozpuścić MOGaa35-55-peptyd w sterylnym PBS (4 mg/ml) i przechowywać w temperaturze -80 °C.
    3. Przygotuj emulsję MOG:
      1. Rozcieńczyć CFA w stosunku 1:2 roztworem podstawowym peptydu MOG w mikroprobówce o pojemności 2 ml.
      2. Uszczelnij mikroprobówkę folią uszczelniającą i przymocuj do mieszalnika Vortex, całkowicie pokrywając rurkę taśmą klejącą. Emulsję wirową przez 4 godziny w temperaturze 4 °C.
    4. Przygotować strzykawki z emulsją stabilną:
      1. Weź mikroprobówkę i szybko odwiruj emulsję za pomocą małej wirówki stołowej. Zebrać emulsję do strzykawki za pomocą igły iniekcyjnej 18G x 11/2'' (1,2 mm x 40 mm).
      2. W zależności od liczby myszy dostosuj objętość emulsji w strzykawce (100 μl / mysz) i zastąp igłę 18G igłą iniekcyjną 27G x 3/4'' (0,4 mm x 19 mm). Uszczelnić igłę do wstrzykiwań dołączoną do strzykawki folią uszczelniającą.
    5. W przypadku roztworu podstawowego toksyny krztuścowej (PTx) rozpuścić 50 μg liofilizowanego PTx w 500 μl sterylnego PBS (100 ng/μl). Przechowywać roztwór podstawowy w temperaturze 4 °C.
    6. W przypadku roztworu roboczego PTx zmieszać 97 μl sterylnego PBS z 3 μl roztworu podstawowego PTx (300 ng/100 μl) na mysz (do wstrzyknięcia dootrzewnowego należy użyć igły 30G x 1/2'' (0,3 mm x 13 mm)).
  2. Indukcja EAE
    1. Znieczulenie myszy C57BL/6 izofluoranem za pomocą systemu parownika. Aby wywołać znieczulenie u myszy, wystaw mysz na działanie 4,5% izofluoranu w tlenie w małej komorze inkubacyjnej przed przeniesieniem myszy na maskę na twarz z 2,1% izofluoranem. Użyj jednostki anestezjologicznej wyposażonej w poduszkę grzewczą, aby zapobiec hipotermii myszy.
    2. Zamocuj znieczuloną mysz w jednej ręce i najpierw wstrzyknij 30 μl emulsji MOG35-55/CFA podskórnie w boki tylnych nóg (ryc. 1: 1 + 2; łącznie 60 μl; lewy bok 30 μl i prawy bok 30 μl) w bliskiej odległości od pachwinowych węzłów chłonnych.
    3. Umieść mysz na brzuchu i wstrzyknij 20 μl emulsji MOGaa35-55/CFA w lewą i prawą miękką tkankę tłuszczową u nasady ogona (Rysunek 1: 3 + 4; łącznie 40 μL; korzeń ogona po lewej stronie 20 μL i korzeń ogona po prawej stronie 20 μL) i niewielką kropelkę emulsji MOGaa35-55/CFA w szyję myszy (Rysunek 1: 5).
    4. Wstrzyknąć myszu dootrzewnowo 100 μl roztworu PTx. Trzymaj głowę myszy poniżej środka ciała, unikając wstrzyknięcia do jelita.
    5. Zastąp dietę konserwacyjną (ekstruduj główne składniki odżywcze: białko surowe 18,5%; tłuszcz surowy 4,5%; włókno surowe 4,5%; popiół surowy 6,5%; skrobia 35%; energia metaboliczna: 13,1 MJ/kg) na dietę hodowlaną (ekstruduj główne składniki odżywcze: białko surowe 23,5%; tłuszcz surowy 5,5%; włókno surowe 3%; popiół surowy 5,7%; skrobia 36%; energia metaboliczna: 14,3 MJ/kg) w celu dostarczenia myszom pokarmu o wyższej zawartości energii przed i w trakcie spodziewanej choroby klinicznej.
    6. Zdejmij maskę na twarz i przenieś mysz do klatki domowej z podkładką rozgrzewającą. Upewnij się, że mysz jest w pełni obudzona i ruchliwa po 10 minutach.
    7. Powtórzyć wstrzyknięcie PTx (2.2.4) 48 godzin po pierwszym zabiegu.

3. Punktacja myszy EAE

  1. Każdego ranka sprawdzaj stan zdrowia myszy EAE, zaglądając do wnętrza klatek.
  2. Oceniaj myszy EAE każdego popołudnia.
  3. Wyjmij z klatki każdą pojedynczą mysz biorącą udział w eksperymencie EAE i sprawdź, czy ogon ma tonus, przesuwając go palcem w górę. Zdrowa mysz będzie trzymać ogon w górze (ogon ma tonus). Jeśli rozpoczął się kliniczny EAE, tonus ogonowy będzie niższy, widoczny przez stopniowe opadanie ogona. W końcu mysz nie będzie w stanie w ogóle podnieść ogona.
  4. Umieść każdą pojedynczą mysz biorącą udział w eksperymencie EAE na czystej ławce i obserwuj oraz dokumentuj zachowanie podczas chodzenia. Zobacz Tabelę 115 dla kryteriów oceny ciężkości choroby (wynik EAE).
  5. Oceń i udokumentuj wagę każdej myszy biorącej udział w eksperymencie.
  6. Aby zapewnić odpowiednie pobieranie pokarmu i wody przez myszy wykazujące kliniczny wynik EAE równy 1, należy dostarczać zwilżoną karmę w plastikowym naczyniu na dnie klatki i codziennie odświeżać.

4. Test przepuszczalności in vivo

  1. Przygotowanie roztworów:
    1. W przypadku roztworów podstawowych dekstranu rozpuścić 10 mg 10 kDa Dextran Alexa Fluor 488 oraz 3 kDa Dextran Texas Red w 500 μl 0,9% roztworu chlorku sodu (20 mg/ml).
    2. W przypadku roztworu roboczego dekstranu, tuż przed wstrzyknięciem, odpipetować 55 μl roztworu podstawowego 10 kDa Dextran Alexa Fluor 488 (20 mg/ml) na kawałek folii uszczelniającej i dodać 55 μl roztworu podstawowego dekstranu Texas Red o stężeniu 3 kDa (20 mg/ml). Wymieszać i zebrać 100 μl do jednorazowej drobnej strzykawki (końcowe stężenie 2 mg/100 μl).
    3. W przypadku 10% roztworu podstawowego formaldehydu (PFA) należy połączyć 10 g ekstra czystego proszku PFA, 100 ml PBS i 200 μl 1N NaOH w czystej szklanej zlewce i podgrzać dokładnie do 56 °C podczas mieszania za pomocą mieszadła magnetycznego; utrzymywać w temperaturze 56 °C przez 30 minut, aż PFA całkowicie się rozpuści; schłodzić do temperatury pokojowej; dostosować pH do 7,4 i przefiltrować przez filtr bibułowy. Przechowywać w temperaturze -20 °C. Roztwór podstawowy można dalej rozcieńczać za pomocą PBS.
  2. Krótko znieczulij zdrowe myszy C57BL/6 lub myszy C57BL/6 cierpiące na EAE izofluranem (mysz będzie uspokojona przez około 1 minutę). Użyj zautomatyzowanego systemu, jak w kroku 2.2.1 (myszy zostaną wystawione na działanie 4,5% izofluranu w tlenie w komorze indukcyjnej, a następnie przeniesione do maski na twarz z 2,1% izofluranem).
  3. Umieść znieczuloną mysz w pozycji bocznej na stole, a następnie dożylnie (np. zaorbitalnie) wstrzyknij myszowi 100 μl znaczników fluorescencyjnych, zanim mysz się obudzi.
  4. Natychmiast zdejmij maskę na twarz i upewnij się, że mysz jest w pełni przytomna i ruchliwa po krótkim znieczuleniu. Pozwól znacznikowi krążyć przez 15 minut.
  5. Przejdź do kroku 5.1.

5. Perfuzja myszy

  1. Do oceny przepuszczalności in vivo:
    1. Rozpocznij procedurę 15 minut po wstrzyknięciu znacznika fluorescencyjnego, indukując głębokie znieczulenie izofluranem. Aby wywołać głębokie znieczulenie u myszy, użyj 2,3% izofluranu w tlenie. Użyj odruchu wycofania łapy, aby ocenić głębokość znieczulenia (ściśnij skórę między palcami; brak zgięcia wskazuje na wystarczającą głębokość) i zbadaj odruchy zarówno kończyny przedniej, jak i tylnej u myszy poddanych EAE.
    2. Zamocuj mysz na plecach i spryskaj brzuch etanolem. Otwórz klatkę piersiową za pomocą nożyczek i zdejmij membranę. Otwórz prawy przedsionek bijącego serca za pomocą nożyczek i przeprowadź mysz przez lewą komorę serca za pomocą 10 ml PBS, a następnie 10 ml 4% PFA w PBS.
      UWAGA: Aby uniknąć wdychania PFA, przepłucz mysz w dygestorium.
    3. Przejdź do sekcji 6.
  2. Dla symografii in situ:
    1. Wywołaj głębokie znieczulenie izofluranem przy użyciu 2,3% izofluranu w tlenie u myszy cierpiącej na EAE i sprawdź głębokość znieczulenia, jak w kroku 5.1.1.
    2. Następnie przymocuj mysz na plecach i spryskaj brzuch etanolem. Otwórz klatkę piersiową za pomocą nożyczek i zdejmij membranę. Otwórz prawy przedsionek bijącego serca za pomocą nożyczek i przeprowadź mysz przez lewą komorę serca za pomocą 20 ml PBS.
    3. Przejdź do sekcji 6.

6. Preparacja i zamrażanie mózgów

  1. Przygotowanie kąpieli chłodzącej:
    1. Napełnij płaski pojemnik Dewara pokruszonym suchym lodem i dodaj 2-metylobutan (izopentan), aż płyn osiągnie około 1 cm powyżej opakowania z suchego lodu. Przykryj luźną pokrywką – np. pokrywą wiaderka na lód.
  2. Odetnij głowę perfundowanej myszy ostrymi nożyczkami i usuń skórę i uszy za pomocą mniejszego zestawu nożyczek.
  3. Ostrożnie rozkrój jarmułkę, przecinając ją od otworu wielkiego w kierunku przodu po lewej i prawej stronie, co pozwala na złożenie jarmułki nad mózgiem. Następnie ostrożnie wyjmij nienaruszony mózg z podstawy czaszki, przecinając nerwy wzrokowe za pomocą płaskiej metalowej szpatułki.
  4. Umieść mózg na folii aluminiowej i przetnij mózg na trzy części (mózg czołowy, mózg środkowy i móżdżek + pień mózgu), umieszczając dwa nacięcia koronalne.
  5. Napełnij kriomold (25 mm x 20 mm x 5 mm) do pierwszej ćwiartki matrycą do cięcia w optymalnej temperaturze (O.C.T.), umieść wycinki mózgu przednią stroną każdego kawałka mózgu skierowaną w dół do krioformy i całkowicie przykryj tkankę matrycą OCT.
  6. Umieść kriomold z tkanką w orientacji poziomej w kąpieli 2-metylobutanowej i upewnij się, że tkanka zamarznie od dołu do góry w ciągu 1 minuty, unikając zanurzania całego bloku tkanki w kąpieli.
  7. Przenieść zamrożoną tkankę do temperatury -80 °C w celu przechowywania i postępować zgodnie z sekcją 7.

7. Przygotowanie zamrożonych skrawków tkanek

  1. Wyrównać temperaturę zamrożonej tkanki od -80 °C do -20 °C w kriostacie przez 30 minut.
  2. Usunąć blok tkanki z kriofordu i zamontować na uchwycie na kriostat (ustawiony na -15 °C) za pomocą matrycy OCT.
  3. Przytnij krawędzie bloku tkankowego na uchwycie kriostatu ostrym skalpelem i rozpocznij cięcie w bloku tkanki, usuwając 20 μm skrawki nożem do kriostatu, aż tkanka będzie widoczna.
  4. Do analizy przepuszczalności BBB in vivo:
    1. Wyciąć skrawki tkanek o grubości 6-10 μm, zebrać je na szkiełkach adhezyjnych i natychmiast zobrazować skrawki pokryte szkiełkiem nakrywkowym za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.
    2. Oceń wygląd naczyń krwionośnych w mózgu (zwróć uwagę na ostre granice nieszczelnych naczyń krwionośnych w porównaniu z rozproszonymi wzorcami fluorescencji obserwowanymi dla nieszczelnych naczyń krwionośnych). W ramach kontroli dodatniej należy sprawdzić, czy znacznik nie przecieka do zrębu narządów okołokomorowych lub splotu naczyniówkowego, w których nie ma bariery krew-mózg.
  5. Dla symografii in situ:
    1. Wyciąć skrawki tkanek o wielkości 6 μm za pomocą kriostatu, zebrać je na szkiełkach przylepnych i zamrozić skrawki tkanki w temperaturze -20 °C w pojemniku zamrażającym zawierającym żel krzemionkowy w pokrywce.

8. Zymografia in situ w połączeniu z barwieniem immunofluorescencyjnym lamininy/CD45

  1. Przygotuj roztwory:
    1. Przygotuj rozwiązanie do osadzania:
      1. Wymieszaj 6 g glicerolu (klasy analitycznej), 2,4 g poli(alkoholu winylowego), 6 ml ddH2O i 12 ml 0,2 M buforu Tris o pH 8 i mieszaj (mieszadło magnetyczne) roztwór przez 4 godziny w temperaturze pokojowej.
      2. Przenieść roztwór do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i pozostawić na 2 godziny w temperaturze pokojowej Następnie inkubować roztwór przez 10 minut w temperaturze 50 °C (łaźnia wodna) i wirować przez 20 minut w temperaturze 2 700 x g w temperaturze pokojowej.
      3. Pobrać supernatant i zamrozić w podwielokrotnościach w temperaturze -20 °C.
    2. Przygotuj zimny roztwór żelatyny:
      1. Rozpuścić 0,1 g zimnej żelatyny ze skóry bydła w 10 ml ddH2O.
      2. Pozostawić do namoczenia przez co najmniej 1 dzień i przechowywać porcje w temperaturze 4 °C.
    3. Przygotować metanol w lodowaty sposób (-20 °C):
      1. Wlej 100% metanol do słoika z kopeliną i ostudź do -20 °C.
    4. Przygotować 10% roztwór podstawowy azydku sodu:
      1. Dodać 1 g azydku sodu do 10 ml ddH2O i przechowywać w temperaturze pokojowej.
    5. Przygotować 0,1% roztwór roboczy azydku sodu:
      1. Zmieszać 99 μl ddH2O z 1 μl 10% roztworu podstawowego azydku sodu.
    6. Rozpuścić 1 mg żelatyny hartowanej barwnikiem (DQ) ze skóry świni w 1 ml roztworu roboczego azydku sodu i przechowywać 100 μl podwielokrotności w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem.
    7. Rozpuścić 30 mg monohydratu 1,10-fenantroliny w 76 μl etanolu i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    8. Przygotuj 25x roztwór inhibitora proteazy:
      1. Dodaj 1 tabletkę inhibitora proteazy wolnej od EDTA do 2 ml ddH2O. Przechowywać w temperaturze -20 °C.
    9. Tuż przed użyciem przygotować roztwór reakcyjny (150 μl/sekcję):
      1. Odwirować roztwór żelatyny o stężeniu 1 mg/ml DQ przez 5 minut przy 13 300 x g.
      2. Wymieszać 127,2 μl ddH2O, 15 μl 10x buforu reakcyjnego (zestaw do oznaczania żelatynazy/kolagenazy; patrz tabela materiałów), 0,3 μl 20 mg/ml zimnej żelatyny, 1,5 μl 1 mg/ml żelatyny DQ i 6 μl 25x roztworu inhibitora proteazy.
    10. Tuż przed użyciem należy przygotować roztwór do reakcji kontroli ujemnej fenantroliny (150 μL/sekcję):
      1. Wymieszaj 125,2 μl ddH2O, 15 μl 10x buforu reakcyjnego, 0,3 μl 20 mg/ml zimnej żelatyny, 1,5 μl 1 mg/ml żelatyny DQ, 6 μl 25x inhibitora proteazy wolnego od EDTA i 2 μl 2 μl 2 M 1,10-fenantroliny (inhibitor MMP).
    11. Tuż przed użyciem należy przygotować zimny żelatynowy (niefluorescencyjny) roztwór do reakcji kontroli ujemnej (150 μL/sekcję):
      1. Wymieszaj 128,7 μl ddH2O, 15 μl 10x buforu reakcyjnego, 0,3 μl 20 mg/ml zimnej żelatyny i 6 μl 25-krotnego inhibitora proteazy wolnego od EDTA.
    12. Przygotować pierwszorzędowy koktajl przeciwciał do barwienia przeciwdziałającego, na przykład 0,95 μg/ml poliklonalnego królika przeciwko lamininie i 10 μg/ml poliklonalnego szczurzego przeciwciała anty-CD45 w 1% BSA w PBS i przygotować odpowiednie koktajle przeciwciał pierwotnych do kontroli izotypu.
    13. Przygotować drugorzędowy roztwór przeciwciał, na przykład 7,5 μg/ml koziego antyszczura Cy3 + 15 μg/ml AMCA anty-królika w 1% BSA w PBS (chronić przed światłem).
  2. Rozmrozić 6 μm nieutrwalone skrawki tkanki mózgowej myszy EAE w plastikowym pudełku do zamrażania zawierającym żel krzemionkowy w pokrywie w dygestorium, aby uniknąć zatrzymywania wody w tkance i oddzielić 2 sekcje tkanki na jednym szkiełku, rysując linie pisakiem odpychowym
  3. Przygotować roztwory reakcyjne (etapy 8.1.9-8.1.11), odwirować przez 5 minut przy 13 400 x g w temperaturze pokojowej i wstępnie ogrzać do temperatury 37 °C w łaźni wodnej.
  4. Nawadniać skrawki tkanek przez 5 minut w temperaturze 37 °C przy użyciu 1x buforu reakcyjnego. Następnie odlać 1x bufor reakcyjny, dodać roztwór reakcyjny na skrawki tkanki i inkubować przez 4 godziny w temperaturze 37 °C. Przemyć szkiełka 5 razy w ddH2O.
  5. Utrwalać skrawki przez 5 minut lodowatym metanolem w temperaturze -20 °C, a następnie raz umyć sekcje PBS w temperaturze pokojowej.
  6. Dodać 1% BSA w PBS do sekcji i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej (chronić przed światłem). Następnie wyrzuć 1% BSA w PBS z sekcji, odwracając szkiełka na tkance, dodaj koktajl przeciwciał pierwszorzędowych i inkubuj przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (chronić przed światłem).
  7. Przemyć skrawki dwukrotnie PBS, dodać wtórny koktajl przeciwciał i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (chronić przed światłem).
  8. Umyj sekcje dwukrotnie PBS, zamontuj szkiełka roztworem do zatapiania, pozostaw zamontowane sekcje do wyschnięcia na noc w temperaturze pokojowej (chronić przed światłem). Na koniec przeanalizuj wybarwione skrawki tkanek za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ocena przebiegu klinicznego EAE u myszy C57BL/6 powinna skutkować krzywą choroby, jak pokazano w Rysunek 2A i zmiany w masie ciała myszy przedstawione w Rysunek 2B. Myszy C57BL/6 zaszczepione MOGaa35-55 zwykle zaczynają rozwijać objawy choroby około 10-12 dnia po aktywnym szczepieniu (Rysunek 1A). Zazwyczaj uodpornione myszy wykazują przejściowy spadek masy ciała następnego dnia po wstrzyknięciu emulsji i pierwszej dawki toksyny krztuścowej (...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu przedstawiamy protokół indukcji i monitorowania EAE u samic myszy C57BL/6. Preferowane są kobiety, a częstość występowania występuje u kobiet : mężczyźni w skali 3:1 w SM. Aby ocenić powagę EAE, skorzystaliśmy z 3-punktowego arkusza punktacji. Nasilenie EAE jest na ogół oceniane w odniesieniu do nasilenia dysfunkcji motorycznych. Myszy w zaawansowanym stadium EAE, tj. wykazujące wynik powyżej 2 powinny zostać uśmiercone, aby uniknąć niepotrzebnego cierpienia zwierząt. Dlatego zaleca się ocenianie myszy w kr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Z wdzięcznością dziękujemy Lydii Sorokin, która podzieliła się z nami swoim oryginalnym protokołem zymografii in situ10.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przeciwciało przeciw królikowi AMCAJackson ImmunoResearch111-156-045Przechowywać w 4 & stopni; C; chronić przed światłem
Przeciwciało anty-CD45 (30F11)Pharmingen07-1401Przechowywać w temperaturze 4 stopni; C
Przeciwciało anty-lamininoweDAKOZ0097Przechowywać w temperaturze 4 & deg; C
Karma hodowlananp. PROVIMI KLIBA SA3336
Klatki wentylowane indywidualnie, Linia niebieska Typ II lub III, np. Tecniplast 1145T, frakcja BSA 1285L
VApplichemA1391Przechowywać pod adresem 4 ° C
Żelatyna na zimnoSigma-AldrichG 9391
Słoik z kopiny + stojaknp. Carl Roth GmbH + Co. KGH554.1; Przeciwciało przeciw szczurom H552.1
Cy3Jackson ImmunoResearch111-156-144Przechowywać w temperaturze 4 & st.; C; chronić przed światłem
Szkiełka nakrywkowe 24 x 40 mm # 1np. Thermo Scientific85-0186-00
Dextran Alexa Fluor 488 (10 000 MW)np. Sondy molekularneD22910Przechowywać w temperaturze -20 ° C; chronić przed światłem
Dekstran Texas Red (3000 MW)InvitrogenD3328Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C; chronić przed światłem
Zestaw do oznaczania żelatynazy/kolagenazy EnzChek Thermo Fisher Naukowy; EnzCheckE12055Przechowywać pod adresem -20 ° C; chronić przed światłem
Samice myszy C57BL/6J (8-12 tygodni)np. Janvier LabsSamice, 8-12 tygodni
Zamrażarka do szkiełek histologicznych, np. Carl Roth GmbH + Co. KG2285.1
18G x 1½ ’ ’ (1,2mm x 40mm) igła iniekcyjnanp. BD, BD Microlance 3304622
27G x ¾ ’ ’ – 20 (0,4mm x 19mm) igły iniekcyjnej, np. BD, BD Microlance 3302200
30G x ½ ’ ’ (0,3 mm x 13 mm) igła iniekcyjnanp. BD, BD Microlance 3304000
Niekompletna średnica' s adiuwant (IFA)np. Santa Cruz Biotechnologysc-24648Sklep pod adresem 4° C
Żywność do konserwacji, np. PROVIMI KLIBA SA3436
PEPTYD MOGaa35-55np. GenScriptStore at -80 °
Szkiełka mikroskopowe C (Superfrost Plus )Thermo ScientificJ1800AMNZ
Mycobacterium tuberculosis H37RAnp. BD231141Przechowywać w temperaturze 4 stopni; C 
NaCl 0,9 %B. Braun3535789
Związek O.C.T. (Tissue-Tek)Sakura4583
Omnican 50 30G x ½ ’ 'B. Braun9151125S
ParaformaldehydMerck30525-89-4
Toksyna krztuścowa, np. Lista laboratoriów biologicznych, Inc.180Przechowywać pod adresem 4 & st.; C
poli(alkohol winylowy) (Mowiol 4-88)Sigma-Aldrich81381
Inhibitor proteazy wolny od EDTA (Roche)Sigma-Aldrich4693132001Przechowywać w temperaturze 4 stopni; C
długopis odstraszający, np. DAKO Pen. DAKOS2002
folia uszczelniająca, np. Parafilm M, np. Sigma-Aldrich,P7793
Żel krzemionkowy, np. Carl Roth GmbH + Co. KG9351.1
Nożyczki do ściegówFST15012-12
ml, np. PRIMO62.1002
strzykawka 10 ml, np. CODAN Medical System waporyzatorów ApS2022-05
Univentor 400UNO. Bv
, , , np, , strzykawka , 1 ,

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tietz, S., Engelhardt, B. Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions. Journal of Cell Biology. 209, 493-506 (2015).
  2. Wu, C., et al. Endothelial basement membrane laminin alpha5 selectively inhibits T lymphocyte extravasation into the brain. Nature Medicine. 15, 519-527 (2009).
  3. Hannocks, M. J., et al. Molecular characterization of perivascular drainage pathways in the murine brain. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 38, 669-686 (2018).
  4. Kermode, A. G., et al. Breakdown of the blood-brain barrier precedes symptoms and other MRI signs of new lesions in multiple sclerosis. Pathogenetic and clinical implications. Brain. 113 (Pt 5), 1477-1489 (1990).
  5. Tommasin, S., Gianni, C., De Giglio, L., Pantano, P. Neuroimaging techniques to assess inflammation in Multiple Sclerosis. Neuroscience. , (2017).
  6. Lopes Pinheiro, M. A., et al. Immune cell trafficking across the barriers of the central nervous system in multiple sclerosis and stroke. Biochimica Biophysica Acta. 1862, 461-471 (2016).
  7. Bartholomaus, I., et al. Effector T cell interactions with meningeal vascular structures in nascent autoimmune CNS lesions. Nature. 462, 94-98 (2009).
  8. Kyratsous, N. I., et al. Visualizing context-dependent calcium signaling in encephalitogenic T cells in vivo by two-photon microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, E6381-E6389 (2017).
  9. Lodygin, D., et al. A combination of fluorescent NFAT and H2B sensors uncovers dynamics of T cell activation in real time during CNS autoimmunity. Nature Medicine. 19, 784-790 (2013).
  10. Agrawal, S., et al. Dystroglycan is selectively cleaved at the parenchymal basement membrane at sites of leukocyte extravasation in experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Experimental Medicine. 203, 1007-1019 (2006).
  11. Song, J., et al. Focal MMP-2 and MMP-9 activity at the blood-brain barrier promotes chemokine-induced leukocyte migration. Cell Reports. 10, 1040-1054 (2015).
  12. Tietz, S., et al. Lack of junctional adhesion molecule (JAM)-B ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis. Brain, Behavior, and Immunity. 73, 3-20 (2018).
  13. Mähler Convenor, M., Berard, M., Feinstein, R., Gallagher, A., Illgen-Wilcke, B., Pritchett-Corning, K., Raspa, M. FELASA working group on revision of guidelines for health monitoring of rodents and rabbits. FELASA recommendations for the health monitoring of mouse, rat, hamster, guinea pig and rabbit colonies in breeding and experimental units. Lab Anim. 48 (3), 178-192 (2014).
  14. Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. Journal of Visual Experiments. , (2014).
  15. Tietz, S. M., et al. Refined clinical scoring in comparative EAE studies does not enhance the chance to observe statistically significant differences. European Journal of Immunology. 46, 2481-2483 (2016).
  16. Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells. European Journal of Immunology. 25, 1951-1959 (1995).
  17. Miller, S. D., Karpus, W. J. Experimental autoimmune encephalomyelitis in the mouse. Current Protocols in Immunology. 15, Chapter 15 Unit 14 (2007).
  18. Sobel, R. A., Tuohy, V. K., Lu, Z. J., Laursen, R. A., Lees, M. B. Acute experimental allergic encephalomyelitis in SJL/J mice induced by a synthetic peptide of myelin proteolipid protein. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 49, 468-479 (1990).
  19. Westarp, M. E., et al. T lymphocyte line-mediated experimental allergic encephalomyelitis--a pharmacologic model for testing of immunosuppressive agents for the treatment of autoimmune central nervous system disease. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 242, 614-620 (1987).
  20. Klotz, L., et al. B7-H1 shapes T-cell-mediated brain endothelial cell dysfunction and regional encephalitogenicity in spontaneous CNS autoimmunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, E6182-E6191 (2016).
  21. Tietz, S. M., et al. MK2 and Fas receptor contribute to the severity of CNS demyelination. PLoS One. 9, e100363(2014).
  22. Coisne, C., Mao, W., Engelhardt, B. Cutting edge: Natalizumab blocks adhesion but not initial contact of human T cells to the blood-brain barrier in vivo in an animal model of multiple sclerosis. Journal of Immunology. 182, 5909-5913 (2009).
  23. Korner, H., et al. Critical points of tumor necrosis factor action in central nervous system autoimmune inflammation defined by gene targeting. Journal of Experimental Medicine. 186, 1585-1590 (1997).
  24. Krueger, M., et al. Blood-brain barrier breakdown involves four distinct stages of vascular damage in various models of experimental focal cerebral ischemia. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 35, 292-303 (2015).
  25. Hawkins, B. T., Egleton, R. D. Fluorescence imaging of blood-brain barrier disruption. Journal of Neuroscience Methods. 151, 262-267 (2006).
  26. Graesser, D., et al. Altered vascular permeability and early onset of experimental autoimmune encephalomyelitis in PECAM-1-deficient mice. Journal of Clinical Investigation. 109, 383-392 (2002).
  27. Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Seminars in Immunopathology. 31, 497-511 (2009).
  28. Owens, T., Bechmann, I., Engelhardt, B. Perivascular spaces and the two steps to neuroinflammation. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 67, 1113-1121 (2008).
  29. Sixt, M., et al. Endothelial cell laminin isoforms, laminins 8 and 10, play decisive roles in T cell recruitment across the blood-brain barrier in experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Cell Biology. 153, 933-946 (2001).
  30. Grewal, I. S., et al. CD62L is required on effector cells for local interactions in the CNS to cause myelin damage in experimental allergic encephalomyelitis. Immunity. 14, 291-302 (2001).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Przepuszczalno bariery krew m zgwizualizacja aktywno ci elatynazyiniekcja znacznika fluorescencyjnegozymografia in situinfiltracja kom rek odporno ciowychanaliza jednostki neuronaczyniowejmodel myszy C57BL 6obrazowanie mi szu OUNocena stopnia ci ko ci choroby

Powiązane artykuły