Method Article

Metoda przygotowania próbki skaningowego i transmisyjnego mikroskopu elektronowego dla przydatków chrząszcza leśnego

DOI:

10.3791/59251

⸱

February 3rd, 2020

 ,  ,  ,  , 
1The Key Laboratory for Silviculture and Conservation of the Ministry of Education, School of Forestry, Beijing Forestry University, 2School of Forestry, Inner Mongolia Agricultural University, 3Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, 4School of Forestry, Fujian Agriculture and Forestry University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zaobserwować ultrastrukturę wrażliwości owadów, w badaniu przedstawiono protokół przygotowania próbki za pomocą skaningowej i transmisyjnej mikroskopii elektronowej (odpowiednio SEM i TEM). Tween 20 został dodany do utrwalacza, aby uniknąć deformacji próbki w SEM. Mikroskopia fluorescencyjna była pomocna w poprawie dokładności krojenia w TEM.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten raport opisuje metody przygotowania próbek, które skanują i transmitują obserwacje mikroskopu elektronowego, zademonstrowane przez przygotowanie przydatków chrząszcza drzewnego, Chlorophorus caragana Xie & Wang (2012), dla obu typów mikroskopii elektronowej. Protokół przygotowania próbki skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) opierał się na chemicznym utrwalaniu próbki, odwadnianiu w serii kąpieli etanolowych, suszeniu i napylaniu. Poprzez dodanie Tween 20 (laurynian polioksyetylenosorbitolu) do utrwalacza i roztworu myjącego, powierzchnia ciała owada chrząszcza drzewnego została czystsza w SEM. Przygotowanie próbki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) w tym badaniu obejmowało szereg etapów, w tym utrwalanie, odwadnianie etanolu, zatapianie w żywicy, pozycjonowanie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, cięcie i barwienie. Utrwalacz z Tween 20 umożliwił penetrację ścianki ciała owada chrząszcza drzewnego łatwiej niż byłoby to możliwe bez Tween 20, a następnie lepiej utrwalił tkanki i narządy w ciele, dając w ten sposób wyraźne obserwacje ultrastruktur czusów owadów za pomocą mikroskopu elektronowego. Kolejnym etapem tego przygotowania było wyznaczenie pozycji sensilli owadów w próbce osadzonej w bloku żywicy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w celu zwiększenia precyzji pozycjonowania sensoryki docelowej. Poprawiło to dokładność krojenia.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Skaningowa mikroskopia elektronowa jest ważnym narzędziem w wielu badaniach morfologicznych, które SEM pokazuje struktury powierzchniowe1,2. Atrakcyjność transmisyjnej mikroskopii elektronowej polega na tym, że można ją wykorzystać do badania szerokiego zakresu struktur biologicznych w skali nanometrowej, od architektury komórek i ultrastruktury organelli, po strukturę kompleksów makromolekularnych i białek. TEM pokazuje struktury wewnętrzne3,4,5.

Coleoptera to największa grupa owadów, obejmująca około 182 rodziny i 350 000 gatunków. Większość owadów chrząszczy (Coleoptera), w szczególności chrząszcz drzewny, żywi się roślinami, z których wiele jest ważnymi szkodnikami lasów i drzew owocowych, powodując niszczycielskie uszkodzenia drzew6. Obecnie coraz większą uwagę poświęca się zapobieganiu i kontroli populacji szkodników w oparciu o teorię ekologii chemicznej7. Skuteczne, niskotoksyczne, wolne od zanieczyszczeń metody kontroli feromonów stały się skutecznym sposobem8. Badanie morfologii i ultrastruktury owadów jest ważną częścią badań nad ekologią chemiczną owadów. Skaningowa i transmisyjna mikroskopia elektronowa (odpowiednio SEM i TEM) są wykorzystywane z dużym powodzeniem do badania ich morfologii i anatomii wewnętrznej. Jednak podczas przygotowywania próbek owadów do mikroskopii elektronowej (EM) obiektywność i autentyczność miejsca obserwacji może ulec pogorszeniu9. Ogólnie rzecz biorąc, przygotowanie próbek SEM owadów wymaga czyszczenia, utrwalania tkanek, odwodnienia, metatezy, suszenia i napylania10. Ze względu na złożone środowisko, w którym żyją chrząszcze drzewne, na powierzchni ciała często znajdują się różne zanieczyszczenia, a ich wyrostki często mają wiele delikatnych, długich czubek lub szczeciny. W szczególności niektóre świdry nie są dostępne z hodowli laboratoryjnej, które zbiera się bezpośrednio na polu, a następnie umieszcza w płynie utrwalającym, aby zapewnić świeżość, a następnie myje w laboratorium. Jeśli próbka jest najpierw utrwalana, a następnie myta, oczywiście znacznie trudniej jest usunąć zanieczyszczenia, ponieważ aldehyd glutarowy silnie wiąże je z próbką. Tween 20 to środek powierzchniowo czynny11,12,13,14, który odgrywa ważną rolę w procesie prania, w tym zmniejsza napięcie powierzchniowe wody i poprawia zwilżalność wody na powierzchni prania. W tym badaniu Tween 20 dodano do roztworu utrwalającego i roztworu czyszczącego PBS, aby zmniejszyć napięcie powierzchniowe cieczy i zapobiec osadzaniu się brudu na powierzchni ciała chrząszcza do drewna, co sprawiło, że powierzchnia ciała była czystsza w SEM.

Korzystając z TEM, sensilla na różnych organach owadów może być cięta, aby odsłonić wyraźne struktury w ich wnętrzu, co stanowi podstawę do analizy funkcji sensilla. Gdy badany owad, taki jak chrząszcz drzewny, jest duży, a jego ściana ciała ma znaczny stopień sklerotyzacji, więc utrwalacz może nie w pełni nasycić tkanek narządów wewnątrz ciała owada. Tween 20 może zwiększyć dyspersję i zdolność zawieszania brudu. W tym badaniu Tween 20 został dodany do utrwalacza, aby zwiększyć penetrację płynu utrwalającego do ściany ciała owada chrząszcza drzewnego, unikając deformacji i zapadania się epidermmi11,12,13. Ponadto, korzystając z ogólnej technologii krojenia, trudno jest dokładnie zlokalizować różne typy sensilli, w szczególności w przypadku niektórych małych sensilla15. Opierając się na tradycyjnym przygotowaniu próbki TEM, badanie to połączyło mikroskopię fluorescencyjną i SEM w celu określenia pozycji czułki owadów w osadzonym bloku, poprawiając w ten sposób dokładność krojenia.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Zapoznaj się z kartami charakterystyki odczynników przed ich użyciem. Niektóre substancje chemiczne używane podczas przygotowywania próbki są toksyczne, mutagenne, rakotwórcze i/lub działające szkodliwie na rozrodczość. Stosować środki ochrony osobistej (rękawice, fartuch laboratoryjny, długie spodnie i buty z zakrytymi palcami) i pracować pod wyciągiem podczas pracy z próbką.

1. Przygotowanie próbki SEM i obrazowanie

  1. Utrwalanie i czyszczenie próbek
    1. Pracując na obszarze, na którym występuje C. caragana, zwab dorosłe osobniki do pułapek polowych z przynętą z roślinnymi atraktantami, takimi jak isophorone16. Zachowaj czyste ciała dorosłego C. caragana w 0,1 mola L-1 buforowanym fosforanem soli fizjologicznej (PBS, pH 7,2), 2,5% (wt/vol) aldehydu glutarowego (bezwodny EM Grad) i 0,06% (vol/vol) Tween 20. Utrwalić próbkę w temperaturze 4 °C przez weekend.
    2. Wyjąć zwłoki z płynu konserwującego i spłukać w buforze fosforanowym. Za pomocą mikroskopu stereoskopowego usuń przydatki i wyczyść je ultradźwiękowo (40 kHz) w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem L-1 o mocy 0,1 mola (pH 7,2) z 0,06% (vol/vol) Tween 20 (PBST). Po czyszczeniu przez 100 s przenieś próbkę do mikroskopu, aby sprawdzić, czy jest czysta. W normalnych warunkach czyść przez 400 sekund, aby upewnić się, że próbka jest wystarczająco czysta do obserwacji i nie jest uszkodzona.
  2. Dehydratacja, montaż i suszenie próbki
    1. Odwodnić próbki, stosując 20-minutowe kolejne zabiegi w 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% i 100% (wszystkie obj./obj.) etanolu. Pod mikroskopem stereoskopowym użyj węglowej dwustronnej taśmy klejącej, aby oddzielnie przymocować 3 powierzchnie obserwacyjne (grzbietową, brzuszną i boczną) na kikutach. Należy pamiętać, że wszystkie powierzchnie viewmuszą być czyste i wolne od zanieczyszczeń. Umieścić stolik na próbkę na szalce Petriego zawierającej środek osuszający z żelem krzemionkowym na 48 godzin.
  3. Napylanie i wprowadzanie próbki
    1. Za pomocą przyrządu do napylania jonów Hitachi Koki (E-1010) obróć ZAWÓR GŁÓWNY do pozycji OTWARTE, zdejmij pokrywę komory próbki i włóż próbkę do komory. Włącz przełącznik POWER i zaświeciła się kontrolka READY. Ustaw czas rozpylania na 45 sekund, a grubość powłoki na 70,875 A. Gdy indeks tarczy podciśnienia pompy mechanicznej spadnie poniżej 7, naciśnij DISCHARGE i rozpocznij natryskiwanie platyny. Po zakończeniu eksperymentu wyłącz zasilanie i wyjmij próbkę z komory. Grubość warstwy natryskowej: d = KIVt ("d" jest grubością folii w jednostce " Å "; "K" jest stałą, w zależności od rozpylanego metalu i gazu. Na przykład K powietrza wynosi 0,07; "I" jest jednostką mA przepływu plazmy; "V" to napięcie przyłożone w jednostce "KV". "t" to czas w sekundach.
    2. Włóż króciec zawierający próbkę na stolik SEM. Upewnij się, że stolik próbki z odcinkiem próbki ma wystarczającą wysokość, aby umożliwić uzyskanie dobrego obrazu. Otwórz oprogramowanie SEM i wybierz żądane napięcie robocze, zaczynając od 20 kV.

2. Przygotowanie i obrazowanie próbki TEM

  1. Pobrać i utrwalić próbkę jak w krokach 1.1.1 i 1.1.2.
  2. Czyszczenie, wtórne utrwalanie i odwadnianie
    1. Usuń dorosłego C. caragana z płynu konserwującego. Za pomocą mikroskopu stereoskopowego usunąć przydatki, umyć próbki w PBST przez 3 godziny, a następnie utrwalić je w 1% (wagowo/obj.) tetratlenku osmu w PBS przez 1 godzinę w temperaturze 25 °C. Odwodnić próbki, stosując 20-minutowe kolejne zabiegi w 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% i 100% (wszystkie obj./obj.) etanolu w temperaturze pokojowej.
  3. Osadzanie i polimeryzacja żywicy
    1. Zanurzyć próbki w żywicy w płaskich formach do zatapiania. Próbka znajdowała się na dnie płytki i została umieszczona jak najbliżej krawędzi wgłębionego rowka. Umieścić etykietę w ślepej próbie, a następnie inkubować płytkę zawierającą próbkę w temperaturze 60 °C przez 72 godziny. Wyjąć kapsułkę z inkubatora i sprawdzić, czy żywica uległa polimeryzacji.
  4. Cięcie i barwienie próbek
    1. Po upewnieniu się, że próbka została zestalona, umieść każdy blok żywicy pod mikroskopem fluorescencyjnym i sfotografuj je w niebieskim świetle. Przesuń fluorescencyjne źródło światła mikroskopu tak, aby naświetlało próbkę od góry. Pozwól, aby sensilla w bloku żywicy była wyraźnie widoczna. Sfotografowane i zmierzone odległości, aby wycelować w sensillę (Rysunek 1).
    2. Zapoznaj się z obrazem SEM palps (Rysunek 2A) i przetnij z grubsza blok żywicy żyletką, aby zamknąć receptor docelowy ( Rysunek 2B).
    3. Następnie, za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w świetle niebieskim, sfotografuj z grubsza przycięty blok żywicy, dostosowując źródło światła od góry tak, aby sensilla była wyraźnie obserwowana. Zielone światło wzbudzone niebieskim światłem stworzyło korzystną obserwację. Podczas obrazowania mikrometr obiektywny (DIV 0,01 mm) został dodany do stolika mikroskopu fluorescencyjnego, a następnie odległość celu została zmierzona za pomocą oprogramowania ImageJ (U.S. National Institute of Health) (Rysunek 2C). Linijka obrazu została wykonana przez Adobe Photoshop CS5 (Adobe Systems, Inc., San Jose, CA, USA). Następnie, w przypadku krojenia ultramikrotomowego, ustaw odległość cięcia, używając grubości plastrów 50-60 nm, aż do osiągnięcia pozycji docelowej. Użyj mikroskopii fluorescencyjnej, aby wskazać receptor docelowy.
    4. Zamontuj sekcje na pokrytych Formvarem miedzianych siatkach o oczkach 100, podwójnie barwionych octanem uranylu i cytrynianem ołowiu.
      1. Po pierwsze, dodaj 3,75 g octanu uranylu do 50 ml 50% metanolu. Siatki barwiące za pomocą przefiltrowanej (0,45 μm) strzykawki z nasyconym roztworem octanu uranylu w temperaturze pokojowej przez 10 min. Zakryj sekcje podczas barwienia, aby zablokować osady wywołane światłem. Spłukać 2x w 50 % metanolu; 2x przefiltrowana woda odgazowana.
      2. Po drugie, dodać 0,02 g cytrynianu ołowiu do 10 ml odgazowanej wody destylowanej w probówce wirówkowej. Dodać 0,1 ml 10 N wodorotlenku sodu, zamknąć i wstrząsnąć do rozpuszczenia. Siatki barwić roztworem cytrynianu ołowiu przez 8 min. Odwirować przed użyciem. Barwienie należy wykonywać w środowisku wolnym od dwutlenku węgla, aby zapobiec tworzeniu się osadów węglanu ołowiu. Umieść krople plamy na kwadratach plastikowych szalek Petriego. Spłucz w odgazowanej, przefiltrowanej wodzie i wysusz17. Obserwuj je za pomocą TEM pracującego pod napięciem 80 kV.

figure-protocol-1
Ryc. 1: Mikroskop fluorescencyjny sfotografował blok żywicy otaczający wyrostek Chlorophorus caragana. (A) Blok żywicy anteny; (B) Blok żywicy na końcu pokładełka. Strzałka wskazywała krawędź bloku żywicy; Kropkowane kółko oznacza docelową sensillę. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-protocol-2
Rysunek 2: Procedury metody precyzyjnej lokalizacji sensilla. (A) Czwarty podsegment palpa szczękowego Chlorophorus caragana, przerywany okrąg pokazywał sensillę, do której dążył SEM. (B) Czwarty podsegment palpa szczękowego C. caragana oglądany za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Biała strzałka pokazywała z grubsza przyciętą krawędź bloku żywicy, a przerywane kółko wskazywało dokładną lokalizację. (C) Oznaczona odległość od krawędzi bloku żywicy do miejsca docelowego palpa szczęki (28 μm w tej próbce). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Używając roztworu czyszczącego i utrwalającego z Tween 20, zaobserwowano czystszy obraz SEM niż bez Tween 20 (Rysunek 3). Roztwór utrwalający Tween 20 przenikał do tkanki roztwór utrwalający aldehyd glutarowy. Struktura mikrotubul była wyraźnie widoczna. Obraz TEM wewnętrznej struktury próbki był rozmazany bez animacji 20 (Rysunek 4).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W artykule przedstawiono przykładowy schemat przygotowania skaningowej i transmisyjnej mikroskopii elektronowej dla chrząszcza drzewnego. Wykorzystując wyrostek owadów jako reprezentatywny obiekt badania, wykazaliśmy kilka ulepszeń w porównaniu z tradycyjnymi metodami przygotowywania próbek.

Ciekły olej oderwany od powierzchni ciała stałego jest emulgowany w małe kropelki, które można dobrze zdyspergować i zawiesić w medium myjącym, aby ograniczyć ponowne osadzanie się na powierzchni przedmiot...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie mamy do ujawnienia żadnego konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doceniamy hojną pomoc ze strony Pekińskiej Wyższej Szkoły Rolniczej, Instytutu Zastosowania Energii Atomowej (Chińskiej Akademii Nauk Rolniczych), Centrum Biobadań Pekińskiego Uniwersytetu Leśnego oraz profesora Shan-gan Zhanga z Instytutu Zoologii Chińskiej Akademii Nauk. Badania te były wspierane przez Narodowy Kluczowy Program Badawczo-Rozwojowy Chin (2017YFD0600103), Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (grant nr 31570643, 81774015), Leśne Badania Naukowe w Dobrobycie Publicznym Chin (201504304), Plan Start-upu Wysokiego Szczebla Badań nad Talentami Uniwersytetu Rolniczego Mongolii Wewnętrznej (203206038) oraz Projekt Badawczy Szkolnictwa Wyższego Regionu Autonomicznego Mongolii Wewnętrznej (NJZZ18047), Region Autonomiczny Mongolii Wewnętrznej Linxue "Podwójna Pierwszorzędna" Budowa projektu (170001).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Soczewka anatomicznaChongqing Auto Optical
spółka z ograniczoną odpowiedzialnością		1425277
Taśma samoprzylepna węglowaSPI Supplies, Oddział Sond Strukturalnych, Inc.7311
Czterochlorek węglaSigma56-23-5
Siatki miedzianeGilderGridsG300
Wodorofosforan disodowyOdczynnik chemiczny grupy Sinopharm co., LTD10039-32-4
EtanolJ.T. Baker64-17-5
Płaskie formy do zatapianiaHyde Venture (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.70900
Mikroskop fluorescencyjnyLEICADM2500
Aldehyd glutarowySigma-Aldrich111-30-8Bezwodny
izoforonklasy EM Sigma78-59-1
Cytrynian ołowiuSigma512-26-5
MetanolSigma67-56-1
Jednozasadowy fosforan soduJego grupa odczynnik chemiczny co., LTD7558-80-7
Mikrometr obiektywowyOlympus0-001-034
Tetroksyd osmuSigma541-09-3
szalkaPetriego Aldrich1998
ŻyletkaGillette
ŻywicaSpurrERL4221
SkalpelLianhuiGB/ T19001-2008
SEMHitachiS-3400
Osuszacz z żelem krzemionkowymSuzhou Longhui Desiccant Co., Ltd.112926-00-8
Małaszczotka MartolG1220
Wodorotlenek soduSigma1310-73-2
Przyrząd do rozpylania jonówHitachi Koki Co. Ltd., Tokio, JaponiaE-1010
Mikroskop stereoskopowyLeicaEZ4 HD
TEMHitachiH-7500
Tween 20Tianjin Damao Odczynnik chemiczny9005-64-5
UltramikrotomLeicaUC6
Myjka ultradźwiękowaGT SonicGT-X1
Octan uranyluSigma6159-44-0

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Song, Y. Q., Dong, J. F., Sun, H. Z. Scanning Electron Microscope Technology of Insect Material. Hubei Agricultural Sciences. 52, 1064-1065 (2013).
  2. Liu, C. The development of the scanning electron microscopy (sem) and its application in polymer materials research. Journal of the Graduates Sun Yat-Sen University (Natural Sciences Medicine). 34, 7-12 (2008).
  3. Gan, L., Jensen, G. J. Electron tomography of cells. Quarterly Reviews of Biophysics. 45, 27-56 (2011).
  4. Lucic, V., Rigort, A., Baumeister, W. Cryo-electron tomography: the challenge of doing structural biology in situ. The Journal of Cell Biology. 202, 407-419 (2013).
  5. Trepout, S., Bastin, P., Marco, S. Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography. Journal of Visualized Experiments. (121), e55215(2017).
  6. Zhang, X. J., Sun, W., Zhang, J., Zuo, T. T., Wang, Z. Q., Zhao, H. W. Research progress of coleopteran insect species antennal sensilla. Journal of Anhui Agricultural Sciences. 41, 2932-2935 (2013).
  7. Aldrich, J. R., Bartelt, R. J., Dickens, J. C., Knight, A. L., Light, D. M., Tumlinson, J. H. Insect chemical ecology research in the United States Department of Agriculture-Agricultural Research Service. Pest Management Science. 59, 777-787 (2003).
  8. Thomas, C. B., Marlin, E. R. Pheromone mating disruption: Novel, non-toxic control of the European corn borer. Leopold Center. 8, 57-60 (1999).
  9. Chen, X. F., Hu, M. Y. Studies on the specimen preparation techniques of scanning electron microscope of Ficus simplicissima Lour. Journal of Zhongkai Agrotechnical College. 14, 68-70 (2001).
  10. Zhou, W., Apkarian, R., Wang, Z. L., Joy, D. Fundamentals of Scanning Electron Microscopy (SEM). Scanning Microscopy for Nanotechnology. , Springer. 1-40 (2006).
  11. Kothekar, S. C., Ware, A. M., Waghmare, J. T., Momin, S. A. Comparative Analysis of the Properties of Tween-20, Tween-60, Tween-80, Arlacel-60, and Arlacel-80. Journal of Dispersion Science and Technology. 28, 477-484 (2007).
  12. Chai, J. L., Liu, N., Bai, T. T., Zhang, H. M., Liu, N. N., Wang, D. D. Compositions and Physicochemical Properties of Tween Type Surfactants-Based Microemulsions. Journal of Dispersion Science and Technology. 35, 441-447 (2014).
  13. Zhang, L. D., Zhao, L., Han, F., Xu, B. C. Performance and applications of surfactants (XV) Detergency of surfactants and its applications. China Surfactant Detergent and Cosmetics. 45, 132-137 (2015).
  14. Waghmare, P. R., Das, S., Mitra, S. K. Under-water superoleophobic glass: unexplored role of the surfactant-rich solvent. Scientific Reports. 3, 1-25 (2013).
  15. Zhang, Y. R., Ren, L. L., Luo, Y. Q. Microtomy of insect sensilla embedded in resin blocks for transmission electronic microscopy. Chinese Journal of Applied Entomology. 50, 1479-1483 (2013).
  16. Zong, S. X., Liu, X. H., Cao, C. J., Luo, Y. Q., Ren, L. L., Zhang, H. Development of semiochemical attractants for monitoring and controlling Chlorophorus caragana. Zeitschrift für Naturforschung. 68, 243-252 (2013).
  17. Sumner, M. J. Epoxy resins for light and transmission electron microscopy. Plant Microtechniques and Protocols. , 83-101 (2015).
  18. Schneider, D. Insect antennae. Annual Review of Entomology. 9, 103-122 (1964).
  19. Zacharuk, R. Antennae and sensilla. Comprehensive Insect Physiology, Biochemistry and Pharmacology. 6, Pergamon Press. Oxford. 1-69 (1985).
  20. Zacharuk, R., Albert, P., Bellamy, F. Ultrastructure and function of digitiform sensilla on the labial palp of a larval elaterid (Coleoptera). Canadian Journal of Zoology. 55, 569-578 (1977).
  21. Shanbhag, S., Müller, B., Steinbrecht, R. Atlas of olfactory organs of Drosophila melanogaster: 1, Types, external organization, innervation and distribution of olfactory sensilla. International Journal of Insect Morphology and Embryology. 28, 377-397 (1999).
  22. Tarumingkeng, R. C., Coppel, H. C., Matsumura, F. Morphology and ultrastructure of the antennal chemoreceptors and mechanoreceptors of worker Coptotermes formosanus Shiraki. Cell Tissue Res. 173, 173-178 (1976).
  23. Zacharuk, R. Y. Ultrastructure and function of insect chemosensilla. Annual Review of Entomology. 25, 27-47 (1980).
  24. Li, Y. Z., Zhong, G. Q. Screening of detergents and floating carriers for treating potato golden nematode cysts to improve the original appearance of electron microscopy. Plant quarantine. 8, 72-75 (1994).
  25. Marzio, L. D., Marianecci, C., Petrone, M., Rinaldi, F., Carafa, M. Novel pH-sensitive non-ionic surfactant vesicles: comparison between tween 21 and tween 20. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 82, 18-24 (2011).
  26. Ren, L. L., Wu, Y., Shi, J., Zhang, L., Luo, Y. Q. Antenna morphology and sensilla ultrastructure of Tetrigus lewisi Candèze (Coleoptera: Elateridae). Micron. 60, 29-38 (2014).
  27. Ren, L., Shi, J., Zhang, Y., Luo, Y. Antennal morphology and sensillar ultrastructure of Dastarcus helophoroides (Fairmaire) (Coleoptera: Bothrideridae). Micron. 43, 921-928 (2012).
  28. Teng, X. H., Liu, X. L., Xie, G. Y., Tang, Q. B., Li, W. Z., Zhao, X. C. Morphology and distribution of ovipositor sensilla of female Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae). The 11th Henan Plant Protection Society, the 10th Henan Insect Society, and the 5th Member Congress and Academic Symposium of Henan Plant Pathology Society. , 138-142 (2017).
  29. Yang, R., Zhang, L. N., Fan, J. W., Wang, J. L., Fang, K. F., Yu, T. Q., Wang, S. H., Du, Y. L. Insect specimens for scanning electron microscopy. Journal of Beijing University of Agriculture. 29, 33-36 (2014).
  30. Zhang, Y. R., Ren, L. L., Zhang, L., Wang, R., Yu, Y., Lu, P. F., Luo, Y. Q. Ultrastructure and distribution of sensilla on the maxillary and labial palps of Chlorophorus caragana (Coleoptera: Cerambycidae). Journal of Morphology. 279, 574-588 (2018).
  31. Harrison, J. D. G. Cleaning and preparing adult beetles (Coleoptera) for light and scanning electron microscopy. African Entomology. 20, 395-401 (2012).
  32. Xiao, Y., Liu, W., Wang, Y., Zuo, Y. X., Hu, R., Li, T. T., Cui, Z. B. Drying methods of biological sample preparation for scanning electron microscope. Research and Exploration Laboratory. 32, 46-53 (2013).
  33. Graef, M. D. Introduction to Conventional Transmission Electron Microscopy. , Cambridge University Press. Cambridge. 1(2003).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Scanning Electron MicroscopyTransmission Electron MicroscopySample PreparationTween 20 FixativeEthanol DehydrationFluorescence MicroscopyUltramicrotome SectioningUranyl Acetate StainingLead Citrate StainingIon Sputtering

Related Articles