Method Article

Metoda przygotowania próbki skaningowego i transmisyjnego mikroskopu elektronowego dla przydatków chrząszcza leśnego

DOI:

10.3791/59251

⸱

February 3rd, 2020

 ,  ,  ,  , 
1The Key Laboratory for Silviculture and Conservation of the Ministry of Education, School of Forestry, Beijing Forestry University, 2School of Forestry, Inner Mongolia Agricultural University, 3Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, 4School of Forestry, Fujian Agriculture and Forestry University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zaobserwować ultrastrukturę wrażliwości owadów, w badaniu przedstawiono protokół przygotowania próbki za pomocą skaningowej i transmisyjnej mikroskopii elektronowej (odpowiednio SEM i TEM). Tween 20 został dodany do utrwalacza, aby uniknąć deformacji próbki w SEM. Mikroskopia fluorescencyjna była pomocna w poprawie dokładności krojenia w TEM.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten raport opisuje metody przygotowania próbek, które skanują i transmitują obserwacje mikroskopu elektronowego, zademonstrowane przez przygotowanie przydatków chrząszcza drzewnego, Chlorophorus caragana Xie & Wang (2012), dla obu typów mikroskopii elektronowej. Protokół przygotowania próbki skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) opierał się na chemicznym utrwalaniu próbki, odwadnianiu w serii kąpieli etanolowych, suszeniu i napylaniu. Poprzez dodanie Tween 20 (laurynian polioksyetylenosorbitolu) do utrwalacza i roztworu myjącego, powierzchnia ciała owada chrząszcza drzewnego została czystsza w SEM. Przygotowanie próbki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) w tym badaniu obejmowało szereg etapów, w tym utrwalanie, odwadnianie etanolu, zatapianie w żywicy, pozycjonowanie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, cięcie i barwienie. Utrwalacz z Tween 20 umożliwił penetrację ścianki ciała owada chrząszcza drzewnego łatwiej niż byłoby to możliwe bez Tween 20, a następnie lepiej utrwalił tkanki i narządy w ciele, dając w ten sposób wyraźne obserwacje ultrastruktur czusów owadów za pomocą mikroskopu elektronowego. Kolejnym etapem tego przygotowania było wyznaczenie pozycji sensilli owadów w próbce osadzonej w bloku żywicy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w celu zwiększenia precyzji pozycjonowania sensoryki docelowej. Poprawiło to dokładność krojenia.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Skaningowa mikroskopia elektronowa jest ważnym narzędziem w wielu badaniach morfologicznych, które SEM pokazuje struktury powierzchniowe1,2. Atrakcyjność transmisyjnej mikroskopii elektronowej polega na tym, że można ją wykorzystać do badania szerokiego zakresu struktur biologicznych w skali nanometrowej, od architektury komórek i ultrastruktury organelli, po strukturę kompleksów makromolekularnych i białek. TEM pokazuje struktury wewnętrzne3,4,5.

Coleoptera to największa grupa owadów, obej....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Zapoznaj się z kartami charakterystyki odczynników przed ich użyciem. Niektóre substancje chemiczne używane podczas przygotowywania próbki są toksyczne, mutagenne, rakotwórcze i/lub działające szkodliwie na rozrodczość. Stosować środki ochrony osobistej (rękawice, fartuch laboratoryjny, długie spodnie i buty z zakrytymi palcami) i pracować pod wyciągiem podczas pracy z próbką.

1. Przygotowanie próbki SEM i obrazowanie

  1. Utrwalanie i czyszczenie próbek
    1. Pracując na obszarze, na którym występuje C. caragana, zwab dorosłe osobniki do pułapek polowych z przynętą z roślinnymi atraktantami, takimi jak isophoro....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Używając roztworu czyszczącego i utrwalającego z Tween 20, zaobserwowano czystszy obraz SEM niż bez Tween 20 (Rysunek 3). Roztwór utrwalający Tween 20 przenikał do tkanki roztwór utrwalający aldehyd glutarowy. Struktura mikrotubul była wyraźnie widoczna. Obraz TEM wewnętrznej struktury próbki był rozmazany bez animacji 20 (Rysunek 4).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W artykule przedstawiono przykładowy schemat przygotowania skaningowej i transmisyjnej mikroskopii elektronowej dla chrząszcza drzewnego. Wykorzystując wyrostek owadów jako reprezentatywny obiekt badania, wykazaliśmy kilka ulepszeń w porównaniu z tradycyjnymi metodami przygotowywania próbek.

Ciekły olej oderwany od powierzchni ciała stałego jest emulgowany w małe kropelki, które można dobrze zdyspergować i zawiesić w medium myjącym, aby ograniczyć ponowne osadzanie się na powierzchni przedmiot.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie mamy do ujawnienia żadnego konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doceniamy hojną pomoc ze strony Pekińskiej Wyższej Szkoły Rolniczej, Instytutu Zastosowania Energii Atomowej (Chińskiej Akademii Nauk Rolniczych), Centrum Biobadań Pekińskiego Uniwersytetu Leśnego oraz profesora Shan-gan Zhanga z Instytutu Zoologii Chińskiej Akademii Nauk. Badania te były wspierane przez Narodowy Kluczowy Program Badawczo-Rozwojowy Chin (2017YFD0600103), Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (grant nr 31570643, 81774015), Leśne Badania Naukowe w Dobrobycie Publicznym Chin (201504304), Plan Start-upu Wysokiego Szczebla Badań nad Talentami Uniwersytetu Rolniczego Mongolii Wewnętrznej (203206038) oraz Projekt Badawczy Szkolnictwa Wyższego Regionu Au....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Soczewka anatomicznaChongqing Auto Optical
spółka z ograniczoną odpowiedzialnością		1425277
Taśma samoprzylepna węglowaSPI Supplies, Oddział Sond Strukturalnych, Inc.7311
Czterochlorek węglaSigma56-23-5
Siatki miedzianeGilderGridsG300
Wodorofosforan disodowyOdczynnik chemiczny grupy Sinopharm co., LTD10039-32-4
EtanolJ.T. Baker64-17-5
Płaskie formy do zatapianiaHyde Venture (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.70900
Mikroskop fluorescencyjnyLEICADM2500
Aldehyd glutarowySigma-Aldrich111-30-8Bezwodny
izoforonklasy EM Sigma78-59-1
Cytrynian ołowiuSigma512-26-5
MetanolSigma67-56-1
Jednozasadowy fosforan soduJego grupa odczynnik chemiczny co., LTD7558-80-7
Mikrometr obiektywowyOlympus0-001-034
Tetroksyd osmuSigma541-09-3
szalkaPetriego Aldrich1998
ŻyletkaGillette
ŻywicaSpurrERL4221
SkalpelLianhuiGB/ T19001-2008
SEMHitachiS-3400
Osuszacz z żelem krzemionkowymSuzhou Longhui Desiccant Co., Ltd.112926-00-8
Małaszczotka MartolG1220
Wodorotlenek soduSigma1310-73-2
Przyrząd do rozpylania jonówHitachi Koki Co. Ltd., Tokio, JaponiaE-1010
Mikroskop stereoskopowyLeicaEZ4 HD
TEMHitachiH-7500
Tween 20Tianjin Damao Odczynnik chemiczny9005-64-5
UltramikrotomLeicaUC6
Myjka ultradźwiękowaGT SonicGT-X1
Octan uranyluSigma6159-44-0

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Song, Y. Q., Dong, J. F., Sun, H. Z. Scanning Electron Microscope Technology of Insect Material. Hubei Agricultural Sciences. 52, 1064-1065 (2013).
  2. Liu, C. The develo....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Scanning Electron MicroscopyTransmission Electron MicroscopySample PreparationTween 20 FixativeEthanol DehydrationFluorescence MicroscopyUltramicrotome SectioningUranyl Acetate StainingLead Citrate StainingIon Sputtering

Related Articles