Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Metoda przygotowania próbki skaningowego i transmisyjnego mikroskopu elektronowego dla przydatków chrząszcza leśnego

18K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59251

⸱

3 lutego 2020

 ,  ,  ,  , 
1The Key Laboratory for Silviculture and Conservation of the Ministry of Education, School of Forestry, Beijing Forestry University, 2School of Forestry, Inner Mongolia Agricultural University, 3Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, 4School of Forestry, Fujian Agriculture and Forestry University

W tym artykule

Podsumowanie

Aby zaobserwować ultrastrukturę wrażliwości owadów, w badaniu przedstawiono protokół przygotowania próbki za pomocą skaningowej i transmisyjnej mikroskopii elektronowej (odpowiednio SEM i TEM). Tween 20 został dodany do utrwalacza, aby uniknąć deformacji próbki w SEM. Mikroskopia fluorescencyjna była pomocna w poprawie dokładności krojenia w TEM.

Streszczenie

Ten raport opisuje metody przygotowania próbek, które skanują i transmitują obserwacje mikroskopu elektronowego, zademonstrowane przez przygotowanie przydatków chrząszcza drzewnego, Chlorophorus caragana Xie & Wang (2012), dla obu typów mikroskopii elektronowej. Protokół przygotowania próbki skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) opierał się na chemicznym utrwalaniu próbki, odwadnianiu w serii kąpieli etanolowych, suszeniu i napylaniu. Poprzez dodanie Tween 20 (laurynian polioksyetylenosorbitolu) do utrwalacza i roztworu myjącego, powierzchnia ciała owada chrząszcza drzewnego została czystsza w SEM. Przygotowanie próbki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) w tym badaniu obejmowało szereg etapów, w tym utrwalanie, odwadnianie etanolu, zatapianie w żywicy, pozycjonowanie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, cięcie i barwienie. Utrwalacz z Tween 20 umożliwił penetrację ścianki ciała owada chrząszcza drzewnego łatwiej niż byłoby to możliwe bez Tween 20, a następnie lepiej utrwalił tkanki i narządy w ciele, dając w ten sposób wyraźne obserwacje ultrastruktur czusów owadów za pomocą mikroskopu elektronowego. Kolejnym etapem tego przygotowania było wyznaczenie pozycji sensilli owadów w próbce osadzonej w bloku żywicy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w celu zwiększenia precyzji pozycjonowania sensoryki docelowej. Poprawiło to dokładność krojenia.

Wprowadzenie

Skaningowa mikroskopia elektronowa jest ważnym narzędziem w wielu badaniach morfologicznych, które SEM pokazuje struktury powierzchniowe1,2. Atrakcyjność transmisyjnej mikroskopii elektronowej polega na tym, że można ją wykorzystać do badania szerokiego zakresu struktur biologicznych w skali nanometrowej, od architektury komórek i ultrastruktury organelli, po strukturę kompleksów makromolekularnych i białek. TEM pokazuje struktury wewnętrzne3,4,5.

Coleoptera to największa grupa owadów, obejmująca około 182 rodziny i 350 000 gatunków. Większość owadów chrząszczy (Coleoptera), w szczególności chrząszcz drzewny, żywi się roślinami, z których wiele jest ważnymi szkodnikami lasów i drzew owocowych, powodując niszczycielskie uszkodzenia drzew6. Obecnie coraz większą uwagę poświęca się zapobieganiu i kontroli populacji szkodników w oparciu o teorię ekologii chemicznej7. Skuteczne, niskotoksyczne, wolne od zanieczyszczeń metody kontroli feromonów stały się skutecznym sposobem8. Badanie morfologii i ultrastruktury owadów jest ważną częścią badań nad ekologią chemiczną owadów. Skaningowa i transmisyjna mikroskopia elektronowa (odpowiednio SEM i TEM) są wykorzystywane z dużym powodzeniem do badania ich morfologii i anatomii wewnętrznej. Jednak podczas przygotowywania próbek owadów do mikroskopii elektronowej (EM) obiektywność i autentyczność miejsca obserwacji może ulec pogorszeniu9. Ogólnie rzecz biorąc, przygotowanie próbek SEM owadów wymaga czyszczenia, utrwalania tkanek, odwodnienia, metatezy, suszenia i napylania10. Ze względu na złożone środowisko, w którym żyją chrząszcze drzewne, na powierzchni ciała często znajdują się różne zanieczyszczenia, a ich wyrostki często mają wiele delikatnych, długich czubek lub szczeciny. W szczególności niektóre świdry nie są dostępne z hodowli laboratoryjnej, które zbiera się bezpośrednio na polu, a następnie umieszcza w płynie utrwalającym, aby zapewnić świeżość, a następnie myje w laboratorium. Jeśli próbka jest najpierw utrwalana, a następnie myta, oczywiście znacznie trudniej jest usunąć zanieczyszczenia, ponieważ aldehyd glutarowy silnie wiąże je z próbką. Tween 20 to środek powierzchniowo czynny11,12,13,14, który odgrywa ważną rolę w procesie prania, w tym zmniejsza napięcie powierzchniowe wody i poprawia zwilżalność wody na powierzchni prania. W tym badaniu Tween 20 dodano do roztworu utrwalającego i roztworu czyszczącego PBS, aby zmniejszyć napięcie powierzchniowe cieczy i zapobiec osadzaniu się brudu na powierzchni ciała chrząszcza do drewna, co sprawiło, że powierzchnia ciała była czystsza w SEM.

Korzystając z TEM, sensilla na różnych organach owadów może być cięta, aby odsłonić wyraźne struktury w ich wnętrzu, co stanowi podstawę do analizy funkcji sensilla. Gdy badany owad, taki jak chrząszcz drzewny, jest duży, a jego ściana ciała ma znaczny stopień sklerotyzacji, więc utrwalacz może nie w pełni nasycić tkanek narządów wewnątrz ciała owada. Tween 20 może zwiększyć dyspersję i zdolność zawieszania brudu. W tym badaniu Tween 20 został dodany do utrwalacza, aby zwiększyć penetrację płynu utrwalającego do ściany ciała owada chrząszcza drzewnego, unikając deformacji i zapadania się epidermmi11,12,13. Ponadto, korzystając z ogólnej technologii krojenia, trudno jest dokładnie zlokalizować różne typy sensilli, w szczególności w przypadku niektórych małych sensilla15. Opierając się na tradycyjnym przygotowaniu próbki TEM, badanie to połączyło mikroskopię fluorescencyjną i SEM w celu określenia pozycji czułki owadów w osadzonym bloku, poprawiając w ten sposób dokładność krojenia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Przed użyciem odczynników zapoznaj się z ich kartami charakterystyki. Wiele z chemikaliów stosowanych podczas przygotowywania próbek jest toksycznych, mutagennych, rakotwórczych i/lub reprotoksycznych. Podczas pracy z próbkami należy stosować środki ochrony osobistej (rękawiczki, fartuch laboratoryjny, długie spodnie i pełne obuwie) oraz pracować pod wyciągiem dyfuzyjnym.

1. Przygotowanie próbek i obrazowanie SEM

  1. Fiksacja i oczyszczanie próbek
    1. Pracując na obszarach, gdzie występuje C. caragana, należy zwabić osobniki dorosłe do pułapek terenowych z użyciem atraktantów roślinnych, takich jak izoforon16. Czyste ciała dorosłych C. caragana należy konserwować w 0,1 mol L-1 fosforanie buforze solnym (PBS, pH 7,2), 2,5% (masa/obj.) glutaraldehydzie (Anhydrous EM Grad) i 0,06% (obj./obj.) Tween 20. Próbkę utrwalać w temperaturze 4 °C przez weekend.
    2. Wyjąć ciała z cieczy konserwującej i opłukać w buforze fosforanowym. Używając stereomikroskopu, usunąć wyrostki i oczyścić je ultradźwiękowo (40 kHz) w 0,1 mol L-1 fosforanie buforze solnym (pH 7,2) z 0,06% (obj./obj.) Tween 20 (PBST). Po 10 s czyszczenia przenieść próbkę pod mikroskop, aby sprawdzić stopień czystości. W normalnych warunkach czyścić przez 400 s, aby upewnić się, że próbka jest wystarczająco czysta do obserwacji i nie została uszkodzona.
  2. Odwadnianie, montaż i suszenie próbek
    1. Odwodnić próbki, stosując następujące 20-minutowe inkubacje w szeregu stężeń etanolu: 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% i 10% (wszystkie obj./obj.). Pod stereomikroskopem, za pomocą dwustronnej taśmy węglowej, przymocować oddzielnie 3 powierzchnie obserwacyjne (grzbietową, brzuszną i boczną) do uchwytów (stubów). Należy pamiętać, aby wszystkie powierzchnie obserwacyjne pozostały czyste i wolne od zanieczyszczeń. Umieścić uchwyt z próbką w szalce Petriego zawierającej żel krzemionkowy jako środek osuszający na 48 h.
  3. Napylanie i umieszczenie próbki
    1. Używając urządzenia do napylania jonowego Hitachi Koki (E-1010), przekręcić MAIN VALVE do pozycji OPEN, zdjąć pokrywę komory próbek i umieścić próbkę w komorze. Włączyć przełącznik POWER, aż zapali się kontrolka READY. Ustawić czas napylania (Sputtering time) na 45 sekund, a grubość powłoki na 70,875 Å. Gdy wskaźnik próżni pompy mechanicznej spadnie poniżej 7, nacisnąć DISCHARGE i rozpocząć napylanie platyny. Po zakończeniu procedury wyłączyć zasilanie i wyjąć próbkę z komory. Grubość powłoki: d = KIVt (gdzie „d” to grubość filmu w jednostce „Å”; „K” to stała zależna od napylanego metalu i gazu; np. dla powietrza K wynosi 0,07; „I” to natężenie przepływu plazmy w mA; „V” to przyłożone napięcie w jednostce „kV”; „t” to czas w sekundach).
    2. Umieścić uchwyt z próbką na stole SEM. Upewnić się, że wysokość uchwytu z próbką jest wystarczająca do uzyskania dobrego obrazu. Uruchomić oprogramowanie SEM i wybrać pożądane napięcie robocze, zaczynając od 20 kV.

2. Przygotowywanie próbek i obrazowanie TEM

  1. Pobrać i utrwalić próbkę zgodnie z krokami 1.1.1 i 1.1.2.
  2. Oczyszczanie, utrwalanie wtórne i odwodnienie
    1. Wyjąć dorosłe osobniki C. caragana z płynu konserwującego. Za pomocą stereomikroskopu usunąć wyrostki, przemyć próbki w PBST przez 3 h, a następnie poddać utrwaleniu wtórnemu w 1% (mas/obj) czetrotlenku osmu w PBS przez 1 h w temperaturze 25 °C. Odwodnić próbki, stosując następujące 20-minutowe serie obróbek w etanolu o stężeniach 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 10% i 100% (wszystkie obj/obj) w temperaturze pokojowej.
  3. Zalewanie żywicą i polimeryzacja
    1. Zalać próbki żywicą w płaskich formach do zalewania. Próbkę umieścić na dnie płytki, jak najbliżej krawędzi wgłębienia. Włożyć etykietę w puste miejsce, a następnie inkubować płytkę z próbką w temperaturze 60 °C przez 72 h. Wyjąć kapsułkę z inkubatora i sprawdzić, czy żywica spolimeryzowała.
  4. Sekcjonowanie i barwienie próbek
    1. Po upewnieniu się, że próbka stwardniała, umieścić każdy blok żywicy pod mikroskopem fluorescencyjnym i sfotografować w świetle niebieskim. Przesunąć źródło światła fluorescencyjnego mikroskopu tak, aby naświetlało próbkę od góry. Umożliwi to wyraźną obserwację sensyll w bloku żywicy. Sfotografować i zmierzyć odległości, aby zlokalizować docelowe sensylle (Rycina 1).
    2. Opierając się na obrazie SEM palpów (Rycina 2A), naciąć zgrubnie blok żywicy ostrzem skalpela, aby zbliżyć się do docelowego receptora (Rycina 2B).
    3. Następnie, korzystając z mikroskopii fluorescencyjnej w świetle niebieskim, sfotografować zgrubnie nacięty blok żywicy, regulując źródło światła od góry tak, aby sensylle były wyraźnie widoczne. Światło zielone wzbudzone światłem niebieskim zapewniło optymalne warunki obserwacji. Podczas obrazowania do stolika mikroskopu fluorescencyjnego dodano mikrometr obiektywowy (DIV 0,01 mm), a następnie zmierzono odległość do celu za pomocą oprogramowania ImageJ (U.S. National Institute of Health) (Rycina 2C). Linijkę obrazu wykonano w programie Adobe Photoshop CS5 (Adobe Systems, Inc., San Jose, CA, USA). Następnie, podczas krojenia na ultramikrotomie, ustawiono dystans cięcia, stosując grubość plastrów 50-60 nm, aż do osiągnięcia pozycji celu. Do precyzyjnego zlokalizowania docelowego receptora wykorzystano mikroskopię fluorescencyjną.
    4. Zamocować sekcje na miedzianych siatkach o oczkach 10 mesh powlekanych Formvarem, poddając je podwójnemu barwieniu octanem uranylu i cytrynianem ołowiu.
      1. Najpierw dodać 3,75 g octanu uranylu do 50 mL 50% metanolu. Barwić siatki za pomocą strzykawki z przefiltrowanym (0,45 µm) nasyconym roztworem octanu uranylu w temperaturze pokojowej przez 10 min. Przykryć sekcje podczas barwienia, aby zapobiec wytrącaniu osadów indukowanych światłem. Płukać 2x w 50% metanolu oraz 2x w przefiltrowanej wodzie odgazowanej.
      2. Następnie dodać 0,02 g cytrynianu ołowiu do 10 mL odgazowanej wody destylowanej w probówce do wirowania. Dodać 0,1 mL 10 N wodorotlenku sodu, szczelnie zamknąć i wstrząsnąć do rozpuszczenia. Barwić siatki roztworem cytrynianu ołowiu przez 8 min. Wirować przed użyciem. Barwienie musi być przeprowadzone w środowisku wolnym od dwutlenku węgla, aby zapobiec tworzeniu się osadów węglanu ołowiu. Nanosić krople barwnika na kwadraty plastikowych naczyń Petri. Płukać w odgazowanej przefiltrowanej wodzie i wysuszyć17. Obserwować za pomocą TEM przy napięciu 80 kV.

Mikroskopowe porównanie wierzchołków korzeni roślin; widok szczegółowy; skala 70 µm; analiza struktur biologicznych.
Rysunek 1: Mikroskop fluorescencyjny sfotografował blok żywiczny zawierający wyrostek Chlorophorus caragana. (A) blok żywiczny anteny; (B) Blok żywicy na końcu pokładlicy. Strzałka wskazuje krawędź bloku żywicy; przerywany okrąg wskazuje docelowe sensylla. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Skaningowa mikroskopia elektronowa skrzydła owada; analiza strukturalna; porównanie mikrofotografii; pasy skali.
Rysunek 2: Procedury metody precyzyjnego lokalizowania sensylli. (A) czwarty podsegment palpa szczękowego Chlorophorus caraganalinie przerywane wyznaczały sensilla poddane analizie SEM. (B) 4. podsegment palpa szczękowego C. caragana obrazowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Biała strzałka wskazuje przybliżoną krawędź bloku żywicy, a przerywany okrąg wskazuje dokładną lokalizację. (C) zaznaczona odległość od krawędzi bloku żywicznego do docelowego miejsca położenia wyrostka podniebiennego szczęki (28 µm w tej próbce). Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zastosowanie roztworu czyszczącego i utrwalającego z dodatkiem Tween 20 pozwoliło uzyskać czystszy obraz SEM niż w przypadku próbek bez Tween 20 (Rycina 3). Roztwór utrwalający z Tween 20 ułatwił przenikanie glutaraldehydu do tkanki. Struktura mikrotubul była wyraźnie widoczna. Obraz TEM wewnętrznej struktury próbki bez Tween 20 był rozmyty (Rycina 4).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W artykule przedstawiono przykładowy schemat przygotowania skaningowej i transmisyjnej mikroskopii elektronowej dla chrząszcza drzewnego. Wykorzystując wyrostek owadów jako reprezentatywny obiekt badania, wykazaliśmy kilka ulepszeń w porównaniu z tradycyjnymi metodami przygotowywania próbek.

Ciekły olej oderwany od powierzchni ciała stałego jest emulgowany w małe kropelki, które można dobrze zdyspergować i zawiesić w medium myjącym, aby ograniczyć ponowne osadzanie się na powierzchni przedmiot...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie mamy do ujawnienia żadnego konfliktu interesów.

Podziękowania

Doceniamy hojną pomoc ze strony Pekińskiej Wyższej Szkoły Rolniczej, Instytutu Zastosowania Energii Atomowej (Chińskiej Akademii Nauk Rolniczych), Centrum Biobadań Pekińskiego Uniwersytetu Leśnego oraz profesora Shan-gan Zhanga z Instytutu Zoologii Chińskiej Akademii Nauk. Badania te były wspierane przez Narodowy Kluczowy Program Badawczo-Rozwojowy Chin (2017YFD0600103), Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (grant nr 31570643, 81774015), Leśne Badania Naukowe w Dobrobycie Publicznym Chin (201504304), Plan Start-upu Wysokiego Szczebla Badań nad Talentami Uniwersytetu Rolniczego Mongolii Wewnętrznej (203206038) oraz Projekt Badawczy Szkolnictwa Wyższego Regionu Autonomicznego Mongolii Wewnętrznej (NJZZ18047), Region Autonomiczny Mongolii Wewnętrznej Linxue "Podwójna Pierwszorzędna" Budowa projektu (170001).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Soczewka anatomicznaChongqing Auto Optical
spółka z ograniczoną odpowiedzialnością		1425277
Taśma samoprzylepna węglowaSPI Supplies, Oddział Sond Strukturalnych, Inc.7311
Czterochlorek węglaSigma56-23-5
Siatki miedzianeGilderGridsG300
Wodorofosforan disodowyOdczynnik chemiczny grupy Sinopharm co., LTD10039-32-4
EtanolJ.T. Baker64-17-5
Płaskie formy do zatapianiaHyde Venture (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.70900
Mikroskop fluorescencyjnyLEICADM2500
Aldehyd glutarowySigma-Aldrich111-30-8Bezwodny
izoforonklasy EM Sigma78-59-1
Cytrynian ołowiuSigma512-26-5
MetanolSigma67-56-1
Jednozasadowy fosforan soduJego grupa odczynnik chemiczny co., LTD7558-80-7
Mikrometr obiektywowyOlympus0-001-034
Tetroksyd osmuSigma541-09-3
szalkaPetriego Aldrich1998
ŻyletkaGillette
ŻywicaSpurrERL4221
SkalpelLianhuiGB/ T19001-2008
SEMHitachiS-3400
Osuszacz z żelem krzemionkowymSuzhou Longhui Desiccant Co., Ltd.112926-00-8
Małaszczotka MartolG1220
Wodorotlenek soduSigma1310-73-2
Przyrząd do rozpylania jonówHitachi Koki Co. Ltd., Tokio, JaponiaE-1010
Mikroskop stereoskopowyLeicaEZ4 HD
TEMHitachiH-7500
Tween 20Tianjin Damao Odczynnik chemiczny9005-64-5
UltramikrotomLeicaUC6
Myjka ultradźwiękowaGT SonicGT-X1
Octan uranyluSigma6159-44-0

Bibliografia

  1. Song, Y. Q., Dong, J. F., Sun, H. Z. Scanning Electron Microscope Technology of Insect Material. Hubei Agricultural Sciences. 52, 1064-1065 (2013).
  2. Liu, C. The development of the scanning electron microscopy (sem) and its application in polymer materials research. Journal of the Graduates Sun Yat-Sen University (Natural Sciences Medicine). 34, 7-12 (2008).
  3. Gan, L., Jensen, G. J. Electron tomography of cells. Quarterly Reviews of Biophysics. 45, 27-56 (2011).
  4. Lucic, V., Rigort, A., Baumeister, W. Cryo-electron tomography: the challenge of doing structural biology in situ. The Journal of Cell Biology. 202, 407-419 (2013).
  5. Trepout, S., Bastin, P., Marco, S. Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography. Journal of Visualized Experiments. (121), e55215(2017).
  6. Zhang, X. J., Sun, W., Zhang, J., Zuo, T. T., Wang, Z. Q., Zhao, H. W. Research progress of coleopteran insect species antennal sensilla. Journal of Anhui Agricultural Sciences. 41, 2932-2935 (2013).
  7. Aldrich, J. R., Bartelt, R. J., Dickens, J. C., Knight, A. L., Light, D. M., Tumlinson, J. H. Insect chemical ecology research in the United States Department of Agriculture-Agricultural Research Service. Pest Management Science. 59, 777-787 (2003).
  8. Thomas, C. B., Marlin, E. R. Pheromone mating disruption: Novel, non-toxic control of the European corn borer. Leopold Center. 8, 57-60 (1999).
  9. Chen, X. F., Hu, M. Y. Studies on the specimen preparation techniques of scanning electron microscope of Ficus simplicissima Lour. Journal of Zhongkai Agrotechnical College. 14, 68-70 (2001).
  10. Zhou, W., Apkarian, R., Wang, Z. L., Joy, D. Fundamentals of Scanning Electron Microscopy (SEM). Scanning Microscopy for Nanotechnology. , Springer. 1-40 (2006).
  11. Kothekar, S. C., Ware, A. M., Waghmare, J. T., Momin, S. A. Comparative Analysis of the Properties of Tween-20, Tween-60, Tween-80, Arlacel-60, and Arlacel-80. Journal of Dispersion Science and Technology. 28, 477-484 (2007).
  12. Chai, J. L., Liu, N., Bai, T. T., Zhang, H. M., Liu, N. N., Wang, D. D. Compositions and Physicochemical Properties of Tween Type Surfactants-Based Microemulsions. Journal of Dispersion Science and Technology. 35, 441-447 (2014).
  13. Zhang, L. D., Zhao, L., Han, F., Xu, B. C. Performance and applications of surfactants (XV) Detergency of surfactants and its applications. China Surfactant Detergent and Cosmetics. 45, 132-137 (2015).
  14. Waghmare, P. R., Das, S., Mitra, S. K. Under-water superoleophobic glass: unexplored role of the surfactant-rich solvent. Scientific Reports. 3, 1-25 (2013).
  15. Zhang, Y. R., Ren, L. L., Luo, Y. Q. Microtomy of insect sensilla embedded in resin blocks for transmission electronic microscopy. Chinese Journal of Applied Entomology. 50, 1479-1483 (2013).
  16. Zong, S. X., Liu, X. H., Cao, C. J., Luo, Y. Q., Ren, L. L., Zhang, H. Development of semiochemical attractants for monitoring and controlling Chlorophorus caragana. Zeitschrift für Naturforschung. 68, 243-252 (2013).
  17. Sumner, M. J. Epoxy resins for light and transmission electron microscopy. Plant Microtechniques and Protocols. , 83-101 (2015).
  18. Schneider, D. Insect antennae. Annual Review of Entomology. 9, 103-122 (1964).
  19. Zacharuk, R. Antennae and sensilla. Comprehensive Insect Physiology, Biochemistry and Pharmacology. 6, Pergamon Press. Oxford. 1-69 (1985).
  20. Zacharuk, R., Albert, P., Bellamy, F. Ultrastructure and function of digitiform sensilla on the labial palp of a larval elaterid (Coleoptera). Canadian Journal of Zoology. 55, 569-578 (1977).
  21. Shanbhag, S., Müller, B., Steinbrecht, R. Atlas of olfactory organs of Drosophila melanogaster: 1, Types, external organization, innervation and distribution of olfactory sensilla. International Journal of Insect Morphology and Embryology. 28, 377-397 (1999).
  22. Tarumingkeng, R. C., Coppel, H. C., Matsumura, F. Morphology and ultrastructure of the antennal chemoreceptors and mechanoreceptors of worker Coptotermes formosanus Shiraki. Cell Tissue Res. 173, 173-178 (1976).
  23. Zacharuk, R. Y. Ultrastructure and function of insect chemosensilla. Annual Review of Entomology. 25, 27-47 (1980).
  24. Li, Y. Z., Zhong, G. Q. Screening of detergents and floating carriers for treating potato golden nematode cysts to improve the original appearance of electron microscopy. Plant quarantine. 8, 72-75 (1994).
  25. Marzio, L. D., Marianecci, C., Petrone, M., Rinaldi, F., Carafa, M. Novel pH-sensitive non-ionic surfactant vesicles: comparison between tween 21 and tween 20. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 82, 18-24 (2011).
  26. Ren, L. L., Wu, Y., Shi, J., Zhang, L., Luo, Y. Q. Antenna morphology and sensilla ultrastructure of Tetrigus lewisi Candèze (Coleoptera: Elateridae). Micron. 60, 29-38 (2014).
  27. Ren, L., Shi, J., Zhang, Y., Luo, Y. Antennal morphology and sensillar ultrastructure of Dastarcus helophoroides (Fairmaire) (Coleoptera: Bothrideridae). Micron. 43, 921-928 (2012).
  28. Teng, X. H., Liu, X. L., Xie, G. Y., Tang, Q. B., Li, W. Z., Zhao, X. C. Morphology and distribution of ovipositor sensilla of female Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae). The 11th Henan Plant Protection Society, the 10th Henan Insect Society, and the 5th Member Congress and Academic Symposium of Henan Plant Pathology Society. , 138-142 (2017).
  29. Yang, R., Zhang, L. N., Fan, J. W., Wang, J. L., Fang, K. F., Yu, T. Q., Wang, S. H., Du, Y. L. Insect specimens for scanning electron microscopy. Journal of Beijing University of Agriculture. 29, 33-36 (2014).
  30. Zhang, Y. R., Ren, L. L., Zhang, L., Wang, R., Yu, Y., Lu, P. F., Luo, Y. Q. Ultrastructure and distribution of sensilla on the maxillary and labial palps of Chlorophorus caragana (Coleoptera: Cerambycidae). Journal of Morphology. 279, 574-588 (2018).
  31. Harrison, J. D. G. Cleaning and preparing adult beetles (Coleoptera) for light and scanning electron microscopy. African Entomology. 20, 395-401 (2012).
  32. Xiao, Y., Liu, W., Wang, Y., Zuo, Y. X., Hu, R., Li, T. T., Cui, Z. B. Drying methods of biological sample preparation for scanning electron microscope. Research and Exploration Laboratory. 32, 46-53 (2013).
  33. Graef, M. D. Introduction to Conventional Transmission Electron Microscopy. , Cambridge University Press. Cambridge. 1(2003).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Skaningowa mikroskopia elektronowatransmisyjna mikroskopia elektronowafiksatyw Tween-20odwodnienie etanolemmikroskopia fluorescencyjnacięcie ultramikrotomembarwienie octanem uranylubarwienie cytrynianem ołowiunapylanie jonowe
Metoda przygotowania próbki skaningowego i transmisyjnego mikroskopu elektronowego dla przydatków chrząszcza leśnego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.