Miniinwazyjna technika stabilizacji wewnętrznej do badania przykurczu zgięciowego kolana wywołanego unieruchomieniem u szczurów

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół opisujący minimalnie inwazyjną technikę unieruchomienia stawu kolanowego na modelu szczurzym. Ten powtarzalny protokół, oparty na sposobie separacji mięśni-szczelina i umiejętności mini-nacięcia, jest odpowiedni do badania mechanizmu molekularnego leżącego u podstaw nabytego przykurczu stawów.

Streszczenie

Przykurcz stawu, wynikający z długotrwałego unieruchomienia stawu, jest częstym powikłaniem w ortopedii. Obecnie wykorzystanie wewnętrznej fiksacji w celu ograniczenia ruchomości stawu kolanowego jest powszechnie akceptowanym modelem generowania eksperymentalnego przykurczu. Jednak wszczepienie implantu nieuchronnie spowoduje uraz chirurgiczny u zwierząt. Dążąc do opracowania mniej inwazyjnego podejścia, połączyliśmy tryb separacji mięśni-przerwa z wcześniej opisaną umiejętnością mini-nacięcia podczas zabiegu chirurgicznego: wykonano dwa mini nacięcia skóry po bocznej stronie uda i nogi, a następnie wykonaliśmy separację szczelin mięśniowych w celu odsłonięcia powierzchni kości. Staw kolanowy szczura był stopniowo unieruchamiany przez wcześniej skonstruowane wewnętrzne unieruchomienie przy zgięciu kolana pod kątem około 135° bez ingerencji w niezbędne nerwy lub naczynia krwionośne. Zgodnie z oczekiwaniami, ta prosta technika pozwala na szybką rehabilitację pooperacyjną u zwierząt. Prawidłowe położenie stabilizacji wewnętrznej potwierdzono analizą rentgenowską lub mikrotomografią komputerową. Zakres ruchu w unieruchomionym stawie kolanowym był znacznie ograniczony niż obserwowany w stawie kolanowym przeciwległym, co świadczy o skuteczności tego modelu. Poza tym analiza histologiczna wykazała rozwój osadzania się i adhezji włóknistej w torebce stawu kolanowego tylno-górnej w czasie. Tak więc ten miniinwazyjny model może być odpowiedni do naśladowania rozwoju unieruchomionego przykurczu stawu kolanowego.

Wprowadzenie

Przykurcze stawów są definiowane jako ograniczenie w pasywnym zakresie ruchu (ROM) stawu stawowego stawu diarthrodialnego^1,2. Obecne terapie mające na celu zapobieganie i leczenie przykurczów stawów osiągnęły pewien sukces^3,4. Jednak mechanizm molekularny leżący u podstaw nabytego przykurczu stawu pozostaje w dużej mierze nieznany⁵. Etiologia przykurczów stawowych w różnych społecznościach społecznych jest bardzo zróżnicowana i obejmuje czynniki genetyczne, stany pourazowe, choroby przewlekłe i przedłużający się bezruch⁶. Powszechnie przyjmuje się, że unieruchomienie jest krytyczną kwestią w rozwoju nabytego przykurczu stawowego⁷. Osoby, które cierpią na poważny przykurcz stawów, mogą ostatecznie doprowadzić do niepełnosprawności fizycznej⁸. W związku z tym stabilny i powtarzalny model zwierzęcy jest niezbędny do zbadania potencjalnych mechanizmów patofizjologicznych nabytego przykurczu stawowego.

Obecnie budowane modele przykurczu stawu kolanowego wywołanego unieruchomieniem są w większości osiągane dzięki zastosowaniu nieinwazyjnych gipsów, zewnętrznych fiksacji i wewnętrznych fiksacji. Watanabe i wsp. poinformowali o możliwości zastosowania unieruchomienia gipsowego na stawach kolanowych szczurów⁹. Zakładając specjalną kurtkę, jedna strona stawu kończyny dolnej szczura jest unieruchomiona przez gips. Staw kolanowy szczura może pozostać w pełni zgięty bez żadnego urazu chirurgicznego^10,11. Jednak zarówno ruchy stawu biodrowego, jak i skokowego są również dotknięte tą formą unieruchomienia, co może zwiększyć stopień zaniku mięśni w mięśniu czworogłowym uda lub brzuchatym łydce uda¹². Ponadto należy unikać obrzęków i przekrwienia kończyn tylnych poprzez wymianę gipsu w określonych momentach czasowych, co może wpływać na ciągłość bezruchu. Inną akceptowaną metodą ustalenia modelu przykurczu stawu kolanowego jest zastosowanie zewnętrznego mocowania chirurgicznego. Nagai i wsp. połączyli drut Kirschnera i drut stalowy w zewnętrzny stabilizator, który unieruchomił staw kolanowy do około 140° zgięcia¹³. W tej metodzie żywica jest używana do pokrycia powierzchni, aby zapobiec zadrapaniom skóry. Chociaż zewnętrzne unieruchomienie mocujące jest solidne i niezawodne^14,15, przezskórne druciane ścieżki kołków Kirschnera mogą zwiększać ryzyko infekcji¹⁶. Z naszego własnego doświadczenia wynika, że stosowanie techniki fiksacji zewnętrznej może zmniejszyć codzienną aktywność szczurów ze względu na wzrost uwarunkowanego lizania.

Alternatywnie, Trudel i in. opisali dobrze przyjęty model przykurczu stawu w stawie kolanowym szczura oparty na chirurgicznym wewnętrznym stabilizatorze¹⁷ (ta metoda została zmodyfikowana w stosunku do tej używanej przez Evansa i współpracowników¹⁸). Warto zauważyć, że ta metoda podkreśla znaczenie wykorzystania techniki mini-nacięcia w celu zminimalizowania ran chirurgicznych. Efektywny rozwój przykurczu stawowego został udowodniony w tym modelu¹⁹. Jednak protokół dotyczący wykonywania minimalnej sekcji w celu odsłonięcia powierzchni kości jest nadal niejasny²⁰. Również dokładna pozycja, w której wierci śruba, nie jest w pełni zrozumiała. Implantacja wewnętrznej fiksacji przez sposób podskórny lub podmięśniowy jest nadal kontrowersyjna²¹. Aby rozwiązać te problemy, zmodyfikowaliśmy tę metodę, włączając odpowiedni tryb separacji mięśni-szczelina, który umożliwia małoinwazyjne odsłonięcie powierzchni kości i umieszczenie implantacji przez kanał podmięśniowy. Protokół ten doprowadził do szybkiej rehabilitacji pooperacyjnej u szczurów po operacji. U zwierząt rozwinął się ograniczony zakres ruchomości stawów po unieruchomieniu stawu, co było zgodne ze zmianami morfologicznymi zrostu torebki uzyskanymi z analizy histologicznej. Opisujemy również dokładne możliwe położenie nawierconych potwierdzone analizą rentgenowską lub analizą mikro-CT. W związku z tym badanie to miało na celu szczegółowe opisanie minimalnie inwazyjnej techniki w modelu przykurczu stawu kolanowego, która została ustalona za pomocą trybu separacji mięśni-szczelina w połączeniu z metodą mini-nacięcia. Uważamy, że techniki małoinwazyjne mogą zarówno zmniejszyć traumę u zwierząt, jak i skutecznie naśladować patologiczny proces przykurczu zgięciowego stawu.

Protokół

Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych i zostały zatwierdzone przez Trzeci Szpital Stowarzyszony Uniwersytetu Sun Yat-sen instytucjonalny komitet opieki i użytkowania zwierząt (numer pozwolenia: 02-165-01). Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi ARRIVE.

1. Przygotowanie przedoperacyjne

UWAGA: Rysunek 1 przedstawia projekt zabiegu chirurgicznego.

1. Sztywno unieruchomić staw kolanowy za pomocą plastikowej płytki i dwóch metalowych przy zgięciu około 135°.
   UWAGA: Wykonaj operację na bliższej części kości udowej i dystalnej kości piszczelowej bez naruszania elementu stawowego.
2. Przygotuj materiały i narzędzia do mocowania wewnętrznego.
   1. Zbuduj plastikową płytkę z polipropylenu klasy medycznej, przecinając strzykawkę o pojemności 5 ml (Rysunek 2a) za pomocą nożyczek chirurgicznych, aby dopasować je do następujących wymiarów: długość, 25 mm; szerokość, 10 mm; grubość, 1 mm (Rysunek 2b). Wygładź obwód płytki skalpelem w pionie. Opłucz płytkę sterylnym roztworem soli fizjologicznej, aby trzykrotnie zmyć zanieczyszczenia.
      1. Sterylizować 75% etanolem przez 4 godziny, a następnie naświetlać światłem ultrafioletowym przez 3 godziny.
   2. Wstępne wiercenie otworów w plastikowej płycie: Przygotuj ręczną wiertarkę elektryczną wolnoobrotową o prędkości około 0-4000 obr./min (Rysunek 2c). Wywierć dwa otwory na obu końcach płytki, średnice wynoszą odpowiednio 1 mm i 0,9 mm (Rysunek 2d). Dopasuj oba końce płytki za pomocą stalowych M 1,4 mm x 8 mm i M 1,2 mm x 6 mm (Rysunek 2e).
      1. Przetrzyj 75% etanolem i sterylizuj światłem UV przez 3 godziny przed użyciem.
3. Przygotuj narzędzia chirurgiczne: 1 prosty zacisk hemostatyczny typu Mosquito, 1 gładkie zakrzywione kleszcze, 2 zwijacze powiek, 1 uchwyt na igłę, 1 kleszczyki do tkanek, 1 nożyczki do szwów, 1 nożyczki do mikrotkanek i 1 skalpel (Rysunek 2f). Wysterylizować narzędzia chirurgiczne przez autoklawowanie w temperaturze 121,3 °C przez 20 minut i suszenie.
4. Zwierzęta doświadczalne
   1. W doświadczeniu należy użyć dojrzałych szkieletowo samców szczurów Sprague-Dawley (lub Wistar) wolnych od specyficznych patogenów (SPF) o wadze od 250 do 350 g.
      UWAGA: Do eksperymentu wybierz samicę lub samca szczura.
   2. Umieść szczury w klatkach i trzymaj w pomieszczeniu laboratoryjnym o kontrolowanym cyklu 12 godzin światła/12 godzin ciemności. Zapewnij odpowiednią ilość jedzenia i wody.

2. Chirurgia

1. Dostosuj temperaturę. Umieść podkładkę rozgrzewającą na platformie operacyjnej w termostatycznej sali operacyjnej.
2. Znieczulenie i przygotowanie skóry
   1. Zważ szczura za pomocą wagi elektronicznej i zapisz.
   2. Unieruchomić szczura i wykonać dootrzewnowe wstrzyknięcie pentobarbitalu sodu (30 mg/kg) w celu znieczulenia indukowanego. Ocena, czy zwierzę jest wystarczająco znieczulone za pomocą szczypania palców u nóg ²². Podawaj oczy lubrykantem, aby chronić rogówkę przed wysuszeniem podczas operacji.
   3. Ogolić dolną część ciała szczura, w tym dwie tylne kończyny, za pomocą elektrycznej maszynki do strzyżenia i dwukrotnie zdezynfekować nalewką z jodu powidonu i trzykrotnie 75% etanolu.
   4. Ułóż szczura bokiem i przykryj serwetą chirurgiczną, odsłaniając jedną stronę tylnej nogi i biodra.
   5. Ponownie zdezynfekuj obszar operacyjny jodem powidonu.
3. Unieruchomić staw kolanowy z wewnętrzną stabilizacją za pomocą techniki małoinwazyjnej.
   UWAGA: Podczas operacji należy utrzymywać nacięcie odpowiednio wilgotne sterylnym roztworem soli fizjologicznej. Operacja zwykle wymaga dwóch chirurgów.
   1. Zaznacz kierunek nacięcia skóry. Na dystalnym końcu krętarza większego kości udowej narysuj linię wzdłuż rzutu powierzchni ciała szczeliny mięśniowej między mięśniem obszernym bocznym a bicepsem uda (Rysunek 3a). Naciąć skórę naskórka wzdłuż linii rysowania na około 1,5 cm (Rysunek 3b).
   2. Tępo rozetnij szczelinę mięśniową między mięśniem obszernym bocznym a mięśniem dwugłowym uda za pomocą kleszczyków tkankowych, aż trzon kości udowej zostanie odsłonięty o długości około 1 cm (Rysunek 3c). Użyj retraktora, aby ułatwić ciągłą separację przerwy mięśniowej.
   3. Naciąć skórę naskórka około 1 cm wzdłuż powierzchni ciała, rzutując szczelinę mięśniową między piszczelą przednią a strzałkową długą na dystalnej kończynie dolnej (Ryc. 3d). Tępo rozkrój przerwę mięśniową, aż kość piszczelowa zostanie odsłonięta o długości około 1 cm (Ryc. 3e).
   4. Oddziel tkanki miękkie za pomocą retraktora i gładkich kleszczy, trzymaj prostopadle i wywierć jeden otwór o średnicy 1,0 mm w trzonie kości udowej z prędkością 1,500 obr./min za pomocą wiertarki elektrycznej (Rysunek 3f). Właściwa pozycja wiercenia znajduje się około 8 mm poniżej dolnej krawędzi krętarza większego. Szybko uciskaj ranę, aby zatamować krwawienie.
      UWAGA: Właściwa średnica wiercenia pozwala uniknąć złamań śródoperacyjnych.
   5. Wywierć jeden otwór o średnicy 0,9 mm w kości piszczelowej około 4 mm poniżej krawędzi zrostu piszczelowo-strzałkowego (Rysunek 4a). Wykonuj wiercenie ostrożnie, aby zapobiec zmiażdżeniu mięśni lub ścięgien.
   6. Użyj prostego zacisku hemostatycznego typu Mosquito, aby utworzyć podmięśniowy przebieg od otworu piszczelowego do otworu kości udowej. Tunel podmięśniowy przechodzi poniżej mięśnia brzuchatego łydki na końcu kości piszczelowej i powyżej pośladka średniego, poniżej mięśnia dwugłowego uda na końcu kości udowej.
   7. Użyj jednej stalowej M 1,4 mm x 8 mm, aby zabezpieczyć jeden koniec plastikowej płytki (z otworem o średnicy 1,0 mm) w bliższej części kości udowej (Rysunek 4b). Użyj jednej stalowej M 1,2 mm x 6 mm, aby przymocować drugi koniec plastikowej płytki (z otworem o średnicy 0,9 mm) w dystalnej kości piszczelowej (Rysunek 4c). Upewnij się, że staw kolanowy jest wolny od szpotawości.
4. Zamknij ranę: Zszyj mięśniówkę powięziową, powięź głęboką i tkankę podskórną za pomocą wchłanialnych szwów 4-0 (Ryc. 4d). Zamknij skórę szwami poliamidowymi (Rysunek 4f).

3. Postępowanie pooperacyjne

1. Zastosować analgezję pooperacyjną poprzez podskórne wstrzyknięcie buprenorfiny (0,03 mg/ml) w dawce 0,05 mg/kg . Dodaj 5 mg/ml neomycyny do wody pitnej przez 5 dni po zabiegu.
2. Mieszaninę przeciwbólową (buprenorfinę i karprofen) należy wstrzykiwać odpowiednio w dawce 0,05 mg/kg i 5 mg/kg podskórnie dwa razy dziennie przez co najmniej 72 godziny po operacji.
3. Sprawdź, czy tylna kończyna nie ma nadmiernego obrzęku w przypadku urazu naczyniowego. Upewnij się, że szczury mogą normalnie chodzić w przypadku uszkodzenia nerwów podczas operacji.

4. Badanie pooperacyjne

1. Obserwuj gojenie się nacięcia chirurgicznego i fizycznie zbadaj staw kolanowy, aby ocenić wczesne oznaki infekcji co drugi dzień po operacji. Sprawdź stopień obrzęku stawu skokowego i śródręczno-paliczkowego w przypadku ciągłego obrzęku.
   UWAGA: Wczesna infekcja pooperacyjna może powodować wysięk z rany, obrzęk nóg i opóźnione gojenie się ran.
2. Wykonaj obrazowanie rentgenowskie kończyny tylnej, aby upewnić się, że zostały prawidłowo umieszczone w pierwszym dniu po operacji.
   UWAGA: Analiza mikrotomografii komputerowej to kolejna alternatywna opcja wyświetlania prawidłowego położenia i kierunku stalowych.
3. Zmierz bierny zakres ruchu (ROM), aby ocenić rozwój przykurczu. Wykonaj pomiar ROM stawu kolanowego w różnych kohortach czasowych po operacji, jak opisano wcześniej²⁰.
   1. Krótko mówiąc, poddaj szczury eutanazji i oskóruj tylne kończyny. Zdejmij immobilizer i zmierz kąt stawu kolanowego za pomocą mechanicznego artrometru z dwoma momentami obrotowymi (667 lub 1,060 g/cm)²³.
   2. Oblicz ROM jako wynik przykurczu całkowitego, przykurczu miogennego i przykurczu artrogennego oddzielnie na podstawie celów badania²⁴.
      UWAGA: Ustaw różne kohorty czasowe (tj. 1, 2, 4, 8, 16 i 32 tygodnie) zgodnie z celami badania. Przeciwległy staw kolanowy (nieoperacyjny lub operowany pozorowany) może służyć jako kontrola².
4. Analiza histologiczna tylnych torebek stawu kolanowego.
   1. Przygotuj tkanki stawowe. Wypreparuj tkankę stawu kolanowego i utrwal ją 4% paraformaldehydem. Odwapnić go i zanurzyć w parafinie, jak wcześniej informowaliśmy²⁵. Przeciąć odcinki (5 μm) na przyśrodkowym poziomie kłykcia w płaszczyźnie strzałkowej.
      UWAGA: Wybierz, czy chcesz wykonać różne barwienia oceniające, w tym HE, barwienie aldehydowo-fuksynowe-Massona Goldnera (AFMG), Elastica-Massona lub immunohistochemiczne do badania histologicznego w torebce stawowej w oparciu o cele badania^15,26.
   2. Obserwuj zmiany histomorfometryczne w tylnych torebkach stawu kolanowego. Sfotografuj tylną część stawu kolanowego. Obserwuj zmiany osadzania się włókien i adhezji między połączeniem trzon-błona maziowa a łąkotką⁶.
      UWAGA: Zmiany patologiczne torebki stawowej są uważane za czynnik chorobotwórczy przykurczu stawu kolanowego. Zmierz długość, grubość i obszary torebki tylnej torebki, jak opisano wcześniej, zgodnie z treścią badań²⁷.

Wyniki

Zaobserwowaliśmy, że szczury, które przeszły minimalnie inwazyjną operację, mogą powrócić do regularnej diety już jeden dzień po operacji. W szczególności nacięcie chirurgiczne ma blizny bez wysięku (Ryc. 5a). Obrzęk stawu skokowego i śródręczno-paliczkowego w operacyjnej kończynie tylnej prawie całkowicie zniknął dwa dni po operacji (Ryc. 5b) w porównaniu ze stroną przeciwległą (Ryc. 5c). U szczurów nie stwierdzono żadnych oznak...

Dyskusja

Badanie to miało na celu wyjaśnienie metody stopniowego unieruchamiania stawu kolanowego przy użyciu małoinwazyjnej techniki, która umożliwia szybką rehabilitację pooperacyjną u zwierząt po operacji. Konwencjonalnie uważa się, że metoda separacji mięśni-szczelin jest minimalnie inwazyjną techniką w chirurgii ortopedycznej. Zgodnie z oczekiwaniami odkryliśmy, że szczury mogą powrócić do normalnej diety i aktywności zaledwie jeden dzień po operacji, co było zgodne z poprzednim badaniem. Co więcej, po operacji nie doszło do...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Anerdian	Shanghai Likang Ltd.	310173	przeciwbakteryjna
buprenorfina	Szanghaj Shyndec Pharmaceutical Ltd.	/	przeciwbóle
Carprofen	MCE	HY-B1227	przeciwból
Śrubokręt krzyżowy	STANLEY	PH0*125mm	dokręcić
Wiertarka elektryczna	WEGO	185	wiercić otwory (z wiertłem ze stali nierdzewnej 0,9 mm; 1,0 mm)
Instrumenty mikrochirurgiczne	RWD	/	Ortopedyczne narzędzia chirurgiczne dla zwierząt
Neomycyna	Sigma	N6386	antybakteryjna
Pentobarbital sodu	Sigma	P3761	znieczulenie
ze stali nierdzewnej	WEGO	m1,4 * 8; śruba m1,2 * 6	(część mocowania wewnętrznego)
Strzykawka	WEGO	3151474	użycia do plastikowej płyty (część wewnętrznego mocowania)
μ-CT	ALOKA	Tokarka LCT-200	in vivo