Analiza mitochondrialnych kompleksów łańcuchów oddechowych w hodowanych komórkach ludzkich przy użyciu elektroforezy w żelu Blue Native Polyacrylamide i immunoblottingu

Podsumowanie

Ten protokół demonstruje analizę mitochondrialnych kompleksów łańcuchów oddechowych za pomocą elektroforezy w natywnym żelu poliakrylamidowym niebieskim. W tym miejscu opisano metodę zastosowaną do hodowanych komórek ludzkich.

Streszczenie

Oddychanie mitochondrialne odbywa się za pomocą kompleksów fosforylacji oksydacyjnej (OXPHOS) w mitochondriach. Czynniki wewnętrzne i środowiskowe mogą zaburzać montaż i stabilność kompleksów OXPHOS. Protokół ten opisuje analizę mitochondrialnych kompleksów łańcuchów oddechowych za pomocą niebieskiej natywnej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (BN-PAGE) w zastosowaniu do hodowanych komórek ludzkich. Najpierw mitochondria są ekstrahowane z komórek za pomocą digitoniny, a następnie za pomocą maltozydu laurylowego izolowane są nienaruszone kompleksy OXPHOS z błon mitochondrialnych. Kompleksy OXPHOS są następnie rozpuszczane przez gradientową elektroforezę żelową w obecności ujemnie naładowanego barwnika, błękitu Coomassie, który zapobiega agregacji białek i zapewnia elektroforetyczną ruchliwość kompleksów białkowych w kierunku katody. Wreszcie, kompleksy OXPHOS są wykrywane za pomocą standardowego immunoblottingu. W związku z tym BN-PAGE jest wygodną i niedrogą techniką, która może być stosowana do oceny montażu całych kompleksów OXPHOS, w przeciwieństwie do podstawowej SDS-PAGE pozwalającej na badanie tylko pojedynczych podjednostek kompleksu OXPHOS.

Wprowadzenie

Mitochondria to wielofunkcyjne organelle odgrywające ważną rolę w produkcji energii, regulacji metabolizmu komórkowego, sygnalizacji, apoptozie, starzeniu się itd.^1,2,3. Produkcja energii w mitochondriach opiera się na funkcji fosforylacji oksydacyjnej, która łączy oddychanie z syntezą ATP. W komórkach ludzkich mitochondrialny system fosforylacji oksydacyjnej (OXPHOS) składa się z pięciu kompleksów. Kompleksy I-IV tworzą elektrochemiczny gradient protonów w mitochondrialnej przestrzeni międzybłonowej, który jest wykorzystywany przez kompleks V do produkcji ATP. Każdy kompleks OXPHOS jest multimeryczny i, z wyjątkiem kompleksu II, składa się z podjednostek kodowanych zarówno przez geny jądrowe, jak i mitochondrialne. Wszelkie defekty w podstawowych składnikach kompleksów OXPHOS spowodowane mutacjami lub stresem środowiskowym mogą zaburzać montaż i funkcjonalność systemu fosforylacji oksydacyjnej. Ponadto prawidłowy montaż funkcjonalnych kompleksów OXPHOS wymaga dużej liczby czynników montażowych^4,5,6.

Naturalna elektroforeza w żelu poliakrylamidowym (BN-PAGE) jest podstawową techniką umożliwiającą analizę nienaruszonych kompleksów białkowych i może być wykorzystana do badania składania kompleksów OXPHOS. Po pierwsze, mitochondria są izolowane od komórek przez digitoninę, która jest łagodnym detergentem, który przenika przez błonę plazmatyczną komórek. Następnie, za pomocą maltozydu laurylowego, kompleksy OXPHOS są uwalniane z błon mitochondrialnych. Za pomocą gradientowej elektroforezy żelowej kompleksy OXPHOS są rozdzielane ze względu na ich masę. Coomassie blue G-250 (nie R-250) dodany do buforu próbki i niebieski bufor katodowy dysocjuje związki detergentowo-labilne, ale zachowuje nienaruszone poszczególne kompleksy łańcuchów oddechowych⁸. Podczas elektroforezy bufor z niebieską katodą zawierający barwnik jest zastępowany buforem katodowym bez barwnika, co zapewnia wydajny transfer kompleksów OXPHOS do membrany PVDF⁸. Aby uwidocznić kompleksy OXPHOS, błonę PVDF inkubuje się sekwencyjnie z przeciwciałami odpowiadającymi wybranym podjednostkom pięciu kompleksów OXPHOS.

Opisana tutaj metoda, z pewnymi modyfikacjami, może być zastosowana do dowolnych hodowanych komórek. Ponadto metoda ta może być stosowana do analizy kompleksów OXPHOS w mitochondriach wyizolowanych z próbek tkanek ⁹. BN-PAGE wymaga co najmniej 5-10 μg mitochondriów dla każdej próbki na serię. Korzystając z opisanej tutaj metody, 500 000 hodowanych komórek, takich jak HEK293, SH-SY5Y lub komórki 143B, może wytworzyć około 10 μg mitochondriów. Jednak wystarczająca ilość komórek do analizy BN zależy od konkretnego typu komórki.

Najczęstszą metodą badania mitochondrialnych białek OXPHOS jest SDS-PAGE i western blotting. Jednak SDS-PAGE umożliwia badanie tylko pojedynczych podjednostek OXPHOS i, w przeciwieństwie do BN-PAGE, nie może być używany do oceny montażu całych kompleksów OXPHOS. Clear native-PAGE rozdziela kompleksy białkowe w warunkach natywnych bez obecności ujemnie naładowanego barwnika i ma znacznie niższą rozdzielczość w porównaniu do BN-PAGE. Jednak clear native-PAGE jest łagodniejszy niż BN-PAGE, dzięki czemu może zachować labilne supramolekularne zespoły kompleksów białkowych, takich jak superkompleksy OXPHOS, które są dysocjowane w warunkach BN-PAGE¹⁰. W tym protokole żel gradientowy służy do oddzielania kompleksów; Alternatywnie, separacja bez gradientu może być użyta, jeśli stosunkowo drogi kreator gradientów nie jest dostępny¹¹.

Ważne, opisana tutaj metoda pozwala na analizę montażu kompleksów OXPHOS, podczas gdy funkcjonalność kompleksów nie jest oceniana. Wysokowydajny BN-PAGE, a następnie test aktywności w żelu¹¹, a także spektrofotometryczny test aktywności enzymatycznej kompleksów mitochondrialnych¹² są skutecznymi technikami analizy funkcjonalnej kompleksów OXPHOS. Jednak obie te metody nie oznaczają składania kompleksów OXPHOS.

Tak więc, BN-PAGE jest optymalną metodą do badania montażu poszczególnych kompleksów OXPHOS. Na przykład niektóre zaburzenia mitochondrialne, takie jak dziedziczna neuropatia nerwu wzrokowego Lebera (LHON), encefalopatia mitochondrialna z kwasicą mleczanową i epizody podobne do udaru (MELAS), są związane ze zmienionym montażem jednego lub więcej składników systemu OXPHOS⁵. Za pomocą opisanej tu metody BN-PAGE można badać mechanizmy molekularne chorób mitochondrialnych.

Protokół

spaUWAGA: Ten protokół jest oparty na powiązanej publikacji Hilander et al.¹³ .

1. Przygotowanie i roztworów

UWAGA: Wszystkie i rozwiązania użyte w protokole są podsumowane w Tabeli 1. Podane objętości są wystarczające do przygotowania i przeprowadzenia 10 próbek. Wszystkie mogą być przechowywane w temperaturze +4 °C przez okres do jednego roku.

1. Przygotować 20 ml 3x buforu żelowego zawierającego 1,5 M kwasu aminokapronowego, 150 mM Bis-tris w wodzie destylowanej (dH₂O). Dostosuj pH do 7,0.
2. Przygotować 10 ml 2 M kwasu aminokapronowego w dH₂O.
3. Przygotuj 1 ml buforu mitochondrialnego, łącząc następujące elementy: 0,5 ml 3x buforu żelowego, 0,5 ml 2 M kwasu aminokapronowego i 4 μl 500 mM EDTA.
4. Przygotować 1 000 ml buforu katodowego zawierającego 15 mM Bis-tris i 50 mM trycyny w dH₂O. Dostosować pH do 7,0.
   1. Przygotować 200 ml buforu z niebieską katodą, dodając 0,04 g niebieskiego G-250 Coomassie do 200 ml buforu katodowego.
5. Przygotować 1 000 ml buforu anodowego zawierającego 50 mM Bis-tris w dH₂O. Dostosować pH do 7,0.
6. Przygotować 2,5 ml buforu do próbek zawierającego 750 mM kwasu aminokapronowego i 5% błękitu Coomassie G-250 w dH₂O.

2. Przygotowanie lizatów mitochondrialnych

1. Umieść komórki na płytce dzień przed pobraniem. W przypadku komórek HEK293 lub 143B należy użyć zmodyfikowanej pożywki Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco z 10% płodową surowicą bydlęcą, 1% L-glutaminą, 100 mg/ml penicyliny i 100 mg/ml streptomycyny. Hodować komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze +37 °C w atmosferze nawilżonej 5% CO_{2 .} Upewnij się, że w dniu pobrania na każdą próbkę przypada co najmniej 500 000 komórek.
2. Delikatnie umyj komórki raz lodowatym PBS. Unikaj odrywania komórek od płytki. Zeskrobać komórki i granulować je w temperaturze 800 x g przez 10 minut w temperaturze +4 °C.
3. Przemyć osad komórkowy dwukrotnie lodowatym PBS i odwirować jak w kroku 2.2. Zmierz stężenie białka metodą Bradforda za pomocą komercyjnego zestawu. Granulować komórki w temperaturze 800 x g przez 10 minut w temperaturze +4 °C.
   UWAGA: Po pobraniu komórek wykonaj wszystkie kroki w temperaturze +4 °C i nie wiruj.
4. Przygotuj 20 ml PBS z inhibitorem proteazy, dodając 200 μl 100x inhibitora proteazy do 20 ml PBS. Trzymaj na lodzie. Zawiesić komórki w PBS z inhibitorem proteazy do końcowego stężenia białka 5 mg / ml.
   1. Aby obliczyć objętość PBS z inhibitorem proteazy potrzebną do ponownego zawieszenia komórek w dawce 5 mg/ml, należy obliczyć ilość białka w każdej próbce. Do tego obliczenia należy wykorzystać stężenie białka zmierzone w kroku 2.3 oraz objętość PBS użytą do ponownego zawieszenia komórek po myciu w kroku 2.3.
5. Przygotuj 1 ml 3,3 mM digitoniny w PBS z inhibitorem proteazy. Dodać 3,3 mM digitoniny do końcowego stężenia 1,65 mM. Dobrze wymieszaj i inkubuj na lodzie przez 5 minut.
   1. Aby przygotować 1 ml 3,3 mM digitoniny w PBS z inhibitorem proteazy, rozpuścić 4 mg digitoniny w 1 ml PBS w temperaturze 100 °C do momentu, gdy nie będzie widoczny osad i natychmiast schłodzić na lodzie. Dodać 10 μl 100x inhibitora proteazy do 1 ml roztworu digitoniny.
      UWAGA: Stosować wyłącznie świeży roztwór digitoniny.
      UWAGA: Digitonina jest toksyczna! Używaj maski na twarz, rękawiczek i fartucha laboratoryjnego.
6. Dodać PBS z inhibitorem proteinazy (przygotowanym w kroku 2.4) do końcowej objętości 1,5 ml. Wirować przy 10 000 x g przez 10 minut w temperaturze +4 °C. Usunąć supernatant. Na tym etapie mitochondria są granulowane.
7. Ponownie zawiesić osad mitochondrialny w buforze mitochondrialnym. Objętość buforu mitochondrialnego stanowi połowę objętości PBS w kroku 2.4.
8. Przygotować świeży 10% maltozyd laurylowy w PBS zawierający inhibitor proteazy (przygotowany w kroku 2.4). 1 ml wystarcza na 10 próbek. Dodać 10% maltozydu laurylu do końcowego stężenia 1%. Inkubuj na lodzie przez 15 minut (ten krok może być dłuższy do kilku godzin).
9. Wirować przy 20 000 x g przez 20 minut w temperaturze +4 °C. Zebrać supernatant do nowej probówki. Zmierz stężenie białka metodą Bradforda za pomocą zestawu. Dodać bufor próbki, objętość stanowiącą połowę objętości maltozydu laurylowego użytego w kroku 2.8. Próbki można przechowywać w temperaturze -80 °C przez okres do 6 miesięcy.

3. Przygotowanie żelu gradientowego dla BN-PAGE

1. Wlać żel gradientowy do BN-PAGE w temperaturze pokojowej. Umieść ekspres do gradientu na płytce mieszającej i podłącz go elastyczną rurką do pompy perystaltycznej. Podłączyć zestaw do infuzji z igłą do rurki. Umieść mieszadło magnetyczne w proksymalnej komorze ekspresu gradientu. Myć rurki za pomocą_dH2O przy maksymalnej prędkości obrotowej pompy przez 10 minut.
2. Opróżnij rurkę i ekspres do gradientów. Za pomocą pipety usunąć resztki dH₂O w kanale między komorami urządzenia do tworzenia gradientów. Zamknij kanał i rurkę za pomocą zaworu.
3. Za pomocą ramy odlewniczej i zacisków zmontuj dwie szklane płytki w uchwycie, który ma otwór na dole, i umieść go na stojaku. Upewnij się, że znajduje się mniej więcej na prostej powierzchni z bilansem wodnym. Umieść igłę podłączoną do rurki między szklanymi płytkami.
4. Przygotować 6% i 15% roztwory żelu (Tabela 2). Trzymaj na lodzie. Na końcu dodać nadsiarczan amonu (APS) i tetrametylenodiaminę (TEMED) (rozpoczynają polimeryzację). Delikatnie wymieszaj, aby uniknąć powstawania pęcherzyków powietrza.
5. Załaduj proksymalny koniec komory rurkowej mieszalnika z gradientowym żelem 6% żelu, a dystalny koniec 15% żelu. Całkowita objętość żelu powinna być równa objętości żelu rozdzielającego między szklanymi płytkami. Dlatego użyj 2,6 ml 6% żelu i 2,1 ml 15% żelu do gradientowego miksera do żelu na jeden żel o wymiarach 8,3 cm x 7,3 cm.
6. Włącz mieszadło magnetyczne i otwórz rurkę i kanał między komorami ekspresu gradientów. Natychmiast włączyć pompę perystaltyczną na 5 ml/min. Napełnij szklane płytki i nie pozwól, aby bąbelki dostały się do żelu. Wyjmij igłę, gdy w rurki nie ma żelu.
7. Delikatnie nałożyć na żel dH₂O. Żel należy przechowywać w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 godzinę w celu polimeryzacji.
8. Natychmiast po nalaniu żelu należy umyć rurkę wypełniając komory gradientowe_dH2Oi używając pompy perystaltycznej na maksymalnych obrotach. Przygotowując dwa i więcej żeli, zawsze czyść system pomiędzy nimi.
9. Przygotować 1x bufor żelowy, mieszając 3 ml 3x buforu żelowego i dodać 6 ml dH₂O. Delikatnie usuń dH₂O z powierzchni żelu bibułą filtracyjną. Umyj powierzchnię żelu 1x buforem żelowym. Delikatnie usuń 1x bufor żelowy bibułą filtracyjną.
   1. Unikaj włókien z bibuły filtracyjnej na żelu. Aby to zapewnić, pokrój papier na małe kawałki nożyczkami, ale nie rozdzieraj papieru.
10. Umieść grzebień między szklanymi płytkami, ale nie zanurzaj go całkowicie, aby móc wlać żel do układania pod grzebieniem. Przygotować 4% żel do układania w stos (Tabela 2). Dodaj APS i TEMED na końcu, ponieważ łatwo rozpoczynają polimeryzację. Mieszaj delikatnie, unikając pęcherzyków powietrza.
11. Nałóż żel do układania, unikając pęcherzyków pod grzebieniem, i całkowicie zanurz grzebień. Pozwól żelowi do układania polimeryzować przez co najmniej 30 minut. Wyjmij grzebień i umyj studzienki 1x buforem żelowym za pomocą pipety.
    1. Po polimeryzacji żel można przechowywać w temperaturze +4 °C przez kilka dni. Aby przechowywać żel, zawiń żel w papier nasączony_dH2Oi folią z tworzywa sztucznego, aby zapobiec wysychaniu żelu.

4. Niebieska elektroforeza w natywnym żelu

UWAGA: Aby zapobiec degradacji kompleksów OXPHOS, uruchom elektroforezę w temperaturze +4 °C. Użyj wstępnie schłodzonych.

1. Załaduj kasetę z żelem buforem z niebieską katodą aż do dna studzienek. Ładowanie próbek jest łatwiejsze, gdy kaseta nie jest wypełniona do góry. Umyj studzienki buforem z niebieską katodą, a następnie napełnij studzienki buforem z niebieską katodą za pomocą pipety.
2. Załaduj próbki (5-30 μg białka) do studzienek. Delikatnie napełnij kasetę żelową do góry niebieskim buforem katodowym, a zbiornik z buforem anodowym.
3. Uruchom żel na 15 minut przy stałym napięciu 40 V. Następnie zwiększ napięcie do 80 V (lub użyj stałego prądu 6 mA), nie przekraczaj 10 mA. Uruchom żel, aż barwnik osiągnie 2/3 długości żelu.
4. Zastąp bufor niebieskiej katody buforem katodowym i kontynuuj elektroforezę, aż skończy się czoło barwnika. W sumie elektroforeza trwa około 3 godzin.
5. Pobrać szklane płytki i przenieść białka do membrany z polifluorku winylidenu (PVDF) za pomocą półsuchego blottingu. Używaj stałego napięcia 25 V i prądu ograniczonego do 1,0 A przez 30 minut.
   1. Alternatywnie, użyj mokrego blottingu, aby przenieść kompleksy OXPHOS do membrany PVDF.
6. Kontynuuj blokowanie błony i inkubację przeciwciał zgodnie ze standardowym protokołem immunoblottingu. Pierwszorzędowe przeciwciała przeciwko podjednostkom kompleksów OXPHOS należy stosować sekwencyjnie.
   UWAGA: Na przykład należy użyć przeciwciała anty-NDUFA9 (1:2000) dla kompleksu I, przeciwciała anty-SDHA (1:2000) dla kompleksu II, przeciwciała anty-UQCRC2 (1:1000) dla kompleksu III, przeciwciała anty-COX1 (1:2000) dla kompleksu IV i przeciwciała anty-ATP5A (1:2000) dla kompleksu V. Wykaz przeciwciał znajduje się w Tabeli Materiałów.

Wyniki

Za pomocą BN-PAGE można badać defekty w tworzeniu mitochondrialnych kompleksów OXPHOS. Rycina 1A przedstawia tworzenie kompleksów łańcucha oddechowego w ludzkich komórkach nerwiaka zarodkowego (SH-SY5Y) traktowanych chloramfenikolem, który specyficznie hamuje translację podjednostek OXPHOS kodowanych przez mtDNA. Chloramfenikol zubożał kompleksy OXPHOS, które zawierały podjednostki kodowane mitochondrialnie (kompleks I, III, IV; Figura 1A), podczas gdy kompleks II, który jest kodowany wyłącznie przez geny jądrowe, był kompensacyjnie regulowany w górę. Kompleks V nie został tutaj poddany immunofloty.

Wielokrotne cykle zamrażania i rozmrażania niszczą kompleksy OXPHOS. Rysunek 1B przedstawia degradację kompleksów OXPHOS w cyklach zamrażania i rozmrażania. Mitochondrialne kompleksy oddechowe w próbce 3, które przeszły wiele cykli zamrażania i rozmrażania, mają mniejszą intensywność pasma i są przesunięte w porównaniu z tymi samymi próbkami, które zostały zamrożone tylko raz. Nieprzycięty obraz western blot na rysunku 1B pokazano na rysunku uzupełniającym 1.

Jakość żelu jest ważna dla ostrych i wyraźnych pasm. Rycina 1C przedstawia immunoblot z żelu, który nie polimeryzował dobrze. Usuwanie membrany może również wpływać na wykrywanie kompleksów OXPHOS. Na rycinie 1D kompleks I został wykryty przed lub po rozbieraniu. Stosunek sygnału do szumu jest znacznie niższy po zdzierganiu.

Rysunek 1. BN-PAGE immunobloty z udanych i nieoptymalnych eksperymentów. (A) Zubożenie kompleksów OXPHOS przez inhibitor translacji mitochondrialnej. Ludzkie komórki nerwiaka zarodkowego (SH-SY5Y) leczono chloramfenikolem (CAP) przez 48 godzin. CTRL, komórki kontrolne bez leczenia chloramfenikolem. Dolny panel pokazuje kwantyfikację immunoplamy. Wartość formantu jest przyjmowana jako 1 (pokazana jako linia przerywana). Dane przedstawiono jako średnią ± SD, n = 3, *P < 0,0001 w porównaniu z kontrolą za pomocą niesparowanych testów t-Studenta. (B) Rozbijanie kompleksów OXPHOS przez wielokrotne cykle zamrażania i rozmrażania. Próbki 1-3 przygotowano z ludzkich komórek kostniakomięsaka (143B) w tych samych warunkach. Próbki numer 1 i 2 zostały zamrożone i stopione tylko raz, podczas gdy próbka numer 3 przeszła cztery cykle zamrażania i rozmrażania. (C) Immunobloty BN-Page kompleksów OXPHOS wyizolowanych z komórek HEK293. Rozmazywanie się opasek jest spowodowane niską jakością żelu. (D) Wpływ strippingu na wykrywanie kompleksów OXPHOS. Wykrywanie kompleksu I w ludzkich komórkach nerwiaka zarodkowego (SH-SY5Y) przed i po usunięciu tej samej błony. Kompleksy OXPHOS wykryto przy użyciu przeciwciała anty-NDUFA9 (kompleks I), przeciwciała anty-SDHA (kompleks II), przeciwciała anty-UQCRC2 (kompleks III) i przeciwciała anty-COX1 (kompleks IV). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Bufor lub roztwór	kompozycja	przepis
3 x bufor żelowy	1,5 M kwas aminokapronowy	3,94 g kwasu aminokapronowego
	150 mM Bis-tris	0,63 g Bis-tris
	dH2O	Dodać dH2O do 20 ml
	Odczyn pH 7,0	Dostosuj pH do 7,0
Bufor katodowy	15 mM Bis-tris	3,14 g bis-trisu
	50 mM trycyna	8,96 g trycyny
	dH2O	Dodać dH2O do 1000 ml
	Odczyn pH 7,0	Dostosuj pH do 7,0
Bufor z niebieską katodą	0,02% błękit coomassie G	0,04 g Serva blue G
	15 mM Bis-tris	200 ml buforu katodowego
	50 mM trycyna
	dH2O
	Odczyn pH 7,0
Bufor anodowy	50 mM Bis-tris	20,93 gr
	dH2O	Dodać dH2O do 2000 ml
	Odczyn pH 7,0	Dostosuj pH do 7,0
Bufor mitochondrialny	1,75 M kwas aminokapronowy	0,5 ml 3 x bufor żelowy
	75 mM Bis-tris	0,5 ml 2 M kwasu aminokapronowego
	2 mM EDTA	4 μl 500 mM EDTA
	dH2O	-
	Odczyn pH 7,0	-
Przykładowy bufor	750 mM kwas aminokapronowy	0,94 ml 2 M kwasu aminokapronowego
	5% niebieski comassie G	0,125 g Serva blue G
	dH2O	Dodać dH2O do 2,5 ml
2M kwas aminokapronowy	2 M kwas aminokapronowy	2,62 g kwasu aminokapronowego
	dH2O	Dodać dH2O do 10 ml

Tabela 1. i roztwory stosowane w BN-PAGE.

Niebieskie żele natywne	Rozdzielający żel 6%	Rozdzielający żel 15%	Układanie w stos 4% żelu
3 x bufor żelowy	3,3 ml	3,3 ml	1,64 ml
40% Akrylamid/Bis 37,5:1	1,5 ml	3,75 ml	0,5 ml
dH2O	5,14 ml	0,93 ml	2,77 ml
glicerol	0	2 ml	0
10% nadsiarczan amonu*	60 μL	10 μL	60 μL
TEMED	4 μl	2 μl	6 μL
Całkowita objętość	10 ml	10 ml	5 ml
*Spraw, aby zawsze był świeży 10% nadsiarczan amonu w dH2O

Tabela 2. Receptury żelu dla BN-PAGE.

Rysunek uzupełniający 1. Nieprzycięty obraz western blot na rysunku 1B. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Dyskusja

Jedną z najbardziej krytycznych części protokołu jest zachowanie nienaruszonych kompleksów OXPHOS podczas przygotowywania, przechowywania i elektroforezy żelowej. W związku z tym mitochondria należy wyizolować w temperaturze +4 °C, a próbki nie powinny być poddawane cyklom zamrażania i rozmrażania. Kompleksy OXPHOS tolerują tylko jeden cykl zamrażania i rozmrażania podczas całej procedury. Wielokrotne cykle zamrażania i rozmrażania niszczą kompleksy OXPHOS (ryc. 1B). Próbki kontrolne i doświadczalne, które mają być porównywane, powinny być przygotowywane równolegle, aby uniknąć jakichkolwiek różnic w warunkach przechowywania, które mogłyby dać mylące wyniki. Jeżeli nie jest możliwe wykonanie wszystkich etapów protokołu równolegle ze wszystkimi próbkami, zalecamy zamrożenie umytych granulek komórek w temperaturze -80 °C (krok 1.4 w niniejszym protokole), a następnie przeprowadzenie pozostałej części protokołu dla wszystkich próbek razem, co najmniej do momentu elektroforezy żelowej. Szczególną uwagę należy zwrócić na czystość aparatu do elektroforezy (zbiornik, kaseta). Jeśli ten sam aparat jest używany do SDS-PAGE, umyj go bardzo dobrze przed BN-PAGE. Wszelkie resztki SDS mogą powodować dysocjację kompleksów OXPHOS podczas elektroforezy.

Wysokiej jakości żele gradientowe to kolejna krytyczna część protokołu. Prefabrykaty żelowe dla niebieskiej natywnej strony są dostępne na rynku; Nie zaleca się jednak ich stosowania, ponieważ stosowane w żelach dostępnych na rynku mogą mieć skład inny niż do próbek. Gradient zastosowanego żelu (6-15%) jest optymalny do separacji poszczególnych kompleksów OXPHOS. Aby wykryć struktury supramolekularne wyższego rzędu OXPHOS, znane również jako superkompleksy łańcucha oddechowego¹⁴, wymagana jest pewna optymalizacja¹¹.

Do wizualizacji kompleksów OXPHOS należy stosować specyficzne przeciwciała sekwencyjnie, w oparciu o ich właściwości. Na przykład najpierw użyj przeciwciała, które daje najsłabszy sygnał, a przeciwciała z najsilniejszym sygnałem na końcu. Jest to ważne, ponieważ usuwanie osłabia detekcję (rysunek 1D). Skład kompleksów łańcuchów oddechowych można zbadać, jeśli po BN-PAGE żel zostanie poddany działaniu drugiego wymiaru SDS-PAGE¹⁵.

Opisany tutaj protokół sugeruje sekwencyjne stosowanie przeciwciał przeciwko poszczególnym kompleksom OXPHOS. Jednak dostępny na rynku koktajl przeciwciał OXPHOS może być używany do jednoczesnego wykrywania wszystkich pięciu kompleksów OXPHOS. Niemniej jednak, aby móc wykryć niekompletnie złożone kompleksy OXPHOS i określić ich tożsamość, przeciwciała przeciwko poszczególnym kompleksom OXPHOS powinny być stosowane sekwencyjnie. Ten krok jest czasochłonny; Może to być jednak niezbędne do testowania nowych warunków i modeli eksperymentalnych.

Stężenie digitoniny stosowanej do izolacji mitochondriów powinno być zoptymalizowane dla określonego typu komórki. Jako detergent digitonina przenika przez błony komórkowe. Optymalne stężenie digitoniny skutecznie przenika przez błonę plazmatyczną komórek, pozostawiając nienaruszone błony mitochondrialne. Zbyt niskie stężenie digitoniny powoduje duże zanieczyszczenie ekstraktów mitochondrialnych, natomiast zbyt wysokie stężenie uszkadza błony mitochondrialne i zmniejsza całkowitą wydajność mitochondriów. Optymalny stosunek digitoniny do białka (g/g) waha się od 0,3 do 1. Analiza Western blot białek ekstrahowanych z osadów i supernatantów może być wykorzystana do zbadania optymalnego stężenia digitoniny¹⁶.

Protokół ten nie obejmuje kontroli obciążenia białka na immunoblot; W związku z tym stężenie białka w ekstrahowanych kompleksach powinno być dokładnie mierzone co najmniej w trzech egzemplarzach, aby zapewnić równe obciążenie. Ponadto próbki mogą być uruchamiane w BN-PAGE w replikacjach. Jeśli montaż selektywnych kompleksów OXPHOS jest zaburzony, nienaruszone kompleksy mogą służyć jako kontrole obciążenia.

Oszacowanie masy cząsteczkowej kompleksów białkowych w BN-PAGE jest trudne¹⁸. Obecny protokół nie obejmuje markera masy cząsteczkowej; w związku z tym, aby oszacować składanie się kompleksów OXPHOS, do analizy należy zawsze włączyć próbki kontrolne zawierające nienaruszone kompleksy. Próbkami kontrolnymi dla BN-PAGE są zwykle komórki niepoddane działaniu substancji lub komórki typu dzikiego.

Przedstawiona tutaj metoda jest zoptymalizowana pod kątem wykrywania mitochondrialnych kompleksów łańcucha oddechowego; Można go jednak również zastosować do oceny oligomeryzacji białek mitochondrialnych¹⁹. Ponadto szybkość składania kompleksów OXPHOS można badać, najpierw zubożając kodowaną przez mitochondria podjednostkę zawierającą kompleksy przez chloramfenikol, a następnie po ich odzyskaniu po usunięciu chloramfenikolu¹⁰. W związku z tym BN-PAGE może być wykorzystywany do oceny poziomów w stanie ustalonym i składania OXPHOS do różnych zastosowań, w tym do diagnostyki molekularnej ludzkich zaburzeń mitochondrialnych ^9,11.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Płytki komórkowe 100 mm	Thermo Fisher Scientific	130182
40% Akrylamid/Bis 37,5:1	Bio-Rad	161-0148
Kwas aminokapronowy	Sigma	A2504
Nadsiarczan amonu	Sigma	A3678
Anty-ATP5A	Abcam	14748	Kompleks V podjednostka
Anty-MTCOI	Abcam	14705	Podjednostka kompleksu VI
Anty-NDUFA9	Abcam	14713	Podjednostka
Anty-SDHA	Abcam	14715	Podjednostka kompleksu II
Anty-UQCRC2	Abcam	14745	Podjednostka kompleksu III
Bis-tris	Sigma	B7535
Zestaw do oznaczania białek Bradford	Skrobaki do komórek BioRad	5000006
	Fisher	11597692
Coomassie blue G250 (Serva Blue G)	Serva	35050
Digitonina	Sigma	D141
DMEM	Lonza	12-614F/12
EDTA	Life Technologies	15575-038
FBS	Life Technologies	10270106
Płodowa surowica bydlęca	Life Technologie	10270106
Glycerol	(Sigma	G5516
Gradient maker	Bio-Rad	1654120
Lauryl maltoside (n-Dodecyl β-D-maltoside)	Sigma	D4641
L-glutamina	Life Technologies	25030024
L-glutamina	Gibco	25030
N,N,N′,N′-tetrametyloetylenodiamina (TEMED)	Sigma	T9281
PBS	Life Technologies	BE17-516F
Penicylina/Streptomycyna	Lonza	17-602E
Penicylina/streptomycyna	Gibco	15140
Zasilacz	GE Healthcare	EPS 301
Inhibitory proteazy	Thermo Scientific 10137963
Trans-blot turbo mini PVDF	BioRad	1704156
Tricine	Sigma	T9784
Trypsin-EDTA	Gibco	15400054
Pionowy aparat do elektroforezy	BioRad	1658004