Trójwymiarowy model macierzy zewnątrzkomórkowej kości dla kostniakomięsaka

Summary

Model kostnoszkieletowego mięsaka (BEM) dla kostniakomięsaka (OS) jest dobrze znany i pokazany tutaj. Może być używany jako odpowiednie rusztowanie do naśladowania wzrostu guza pierwotnego in vitro i stanowi idealny model do badania histologicznej i cytogennej heterogeniczności OS.

Abstract

Kostniakomięsak (OS) jest najczęstszym i bardzo agresywnym pierwotnym guzem kości. Charakteryzuje się zmiennościami anatomicznymi i histologicznymi oraz trudnościami diagnostycznymi lub prognostycznymi. OS składa się z genotypowo i fenotypowo heterogennych komórek nowotworowych. Udowodniono, że elementy mikrośrodowiska kości odpowiadają za niejednorodność guza i postęp choroby. Macierz zewnątrzkomórkowa kości (BEM) zachowuje matryce mikrostrukturalne i składniki biochemiczne natywnej macierzy zewnątrzkomórkowej. Ta specyficzna tkankowo nisza stanowi korzystne i długoterminowe rusztowanie do wysiewu i proliferacji komórek OS. W artykule przedstawiono protokół przygotowania modelu BEM i jego dalszego eksperymentalnego zastosowania. Komórki OS mogą rosnąć i różnicować się w wiele fenotypów zgodnych ze złożonością histopatologiczną próbek klinicznych OS. Model umożliwia również wizualizację różnych morfologii i ich związku ze zmianami genetycznymi i leżącymi u ich podstaw mechanizmami regulacyjnymi. Jako homologiczny do ludzkiego systemu operacyjnego, ten model BEM-OS może być opracowywany i stosowany w patologii i badaniach klinicznych systemu operacyjnego.

Introduction

Kostniakomięsak (OS) zwykle występuje w aktywnie rosnących obszarach, metaprzynadzie kości długich, w okresie dojrzewania. Ponad 80% miejsc dotkniętych systemem operacyjnym preferuje metaprzynasadę bliższej części kości piszczelowej i bliższej kości ramiennej, a także zarówno dystalnej, jak i bliższej kości udowej, co odpowiada lokalizacji płytki wzrostu¹. OS składa się z wielu podtypów komórek o właściwościach mezenchymalnych i znacznej różnorodności cech histologicznych i stopnia. Dowody potwierdzają, że mezenchymalne komórki macierzyste (MSC), prekursory i perycyty są komórkami pochodzenia^2,3,4,5. Komórki te mogą gromadzić zmiany genetyczne lub epigenetyczne i powodować OS pod wpływem niektórych sygnałów mikrośrodowiskowych kości. Zarówno mechanizmy wewnętrzne, jak i zewnętrzne skutkują niestabilnością genomową i heterogenicznością OS, z wieloma fenotypami morfologicznymi i klinicznymi^6,7. W przypadku zindywidualizowanych terapii lub badań przesiewowych nowych leków konieczne jest wygenerowanie nowych modeli w celu przeciwdziałania heterogeniczności lub innym zaburzeniom klinicznym.

OS to złośliwy nowotwór lity wewnątrzkostny. Złożoność i aktywność otaczających elementów mikrośrodowiska nadaje komórkom OS różnice fenotypowe i funkcjonalne w różnych lokalizacjach guza. Macierz zewnątrzkomórkowa kości (BEM) stanowi strukturalne i biochemiczne rusztowanie do odkładania się minerałów i przebudowy kości. Organiczna część macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) składa się głównie z kolagenu typu I wydzielanego przez komórki linii osteoblastycznej, podczas gdy jego zmineralizowana część składa się z fosforanu wapnia w postaci hydroksyapatytu⁸. Dynamiczna rola sieci ECM polega na regulowaniu adhezji, różnicowania, przesłuchów i utrzymania funkcji komórek⁹.

Demineralizowane hydrożele BEM i ECM zostały z powodzeniem wykorzystane w hodowlach komórkowych i mogą zwiększyć proliferację komórek^10,11. Zsyntetyzowany, przypominający kość ECM może regulować wielkość puli, decyzje dotyczące losu i postęp linii MSCs^12,13,14. Co więcej, wyniki potwierdzają jego kliniczne znaczenie dla zapewnienia aktywności osteogennej poprzez stymulację procesów komórkowych podczas tworzenia i regeneracji kości^15,16,17.

W tym artykule nasza grupa przedstawia zmodyfikowany model i korzystną alternatywę dla trójwymiarowej kultury długoterminowej. Komórki OS wstrzyknięte do BEM pochodzącego z tkanek łatwo wykazują niejednorodny fenotyp mezenchymalny w porównaniu z dwuwymiarowymi hodowlami plastycznymi. BEM pochodzący z tkanki homologicznej specyficznej dla miejsca wykazuje swoją ogromną przewagę jako natywna nisza dla komórek OS in vitro i ma ogromny potencjał w badaniach teoretycznych i klinicznych OS. Ta scharakteryzowana platforma BEM jest prosta, ale skuteczna w badaniach in vitro i może zostać rozszerzona o modelowanie wielu nowotworów.

Protocol

Opieka nad zwierzętami i ich użytkowanie są prowadzone zgodnie z Przewodnikiem National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (publikacja NIH nr 80-23, poprawiona w 1996 roku) po zatwierdzeniu przez Komitet Etyki Zwierząt Uniwersytetu Sun Yat-sen.

1. Przygotowanie kości

1. Uzyskaj od 4 do 6 tygodniowych myszy BALB/c (bez wymagań dotyczących płci). Poddaj mysz eutanazji aseptycznie przez zwichnięcie szyjki macicy i odetnij świeżą kość strzałkową, piszczelową i kość udową od tylnej kończyny sterylnymi nożyczkami chirurgicznymi. Oderwij tkankę nabłonkową, a następnie usuń jak najwięcej tkanki miękkiej za pomocą nożyczek i pęsety.
2. Opłucz kości nóg sterylnym 10 mM soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) dwukrotnie, aby usunąć krew z naczynia o średnicy 6 cm. Zanurz kości w 75% etanolu na 3 minuty, a następnie dwukrotnie spłucz PBS. Czyste kości można przechowywać w sterylnej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml ze sterylnym PBS w temperaturze -80 °C przez miesiące, aż będą potrzebne.
   UWAGA: PBS używany we wszystkich poniższych krokach ma 10 mM PO₄³⁻.

2. Demineralizacja kości i decelularyzacja

1. Zamrożone kości należy rozmrozić w temperaturze pokojowej, a następnie ponownie zamrozić w temperaturze -80 °C przez 1 godzinę. Kości należy poddać więcej niż 2–3 cyklom zamrażania i rozmrażania w celu lizy komórek i rozpadu tkanek.
2. Inkubować kości w sterylnej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml z 0,5 N HCl przez noc w temperaturze pokojowej na platformie bujanej lub wytrząsarce orbitalnej z delikatnym kołysaniem/potrząsaniem, aby zapewnić całkowite i równomierne pokrycie kości.
   UWAGA: Upewnij się, że kości są całkowicie zanurzone podczas ruchu w kwasie i nie osiadają podczas procesu. Objętość roztworu HCl powinna być ponad dziesięciokrotnie większa niż objętości kości.
3. Po odwapnieniu całkowicie zdekantować roztwór HCl i płukać pod bieżącą wodą przez 1 godzinę. Następnie umyj kości dwukrotnie przez 15 minut na każde mycie wodą destylowaną na platformie bujanej lub wytrząsarce orbitalnej.
   UWAGA: Upewnij się, że całkowicie usunąłeś roztwór lub wodę między praniami i po ostatnim umyciu wodą destylowaną.
4. Ekstrahuj lipidy w zdemineralizowanych kościach za pomocą mieszaniny metanolu i chloroformu w proporcji 1:1 w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml owiniętej folią aluminiową przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej¹⁰.
5. Następnie przenieś kości do innej probówki z metanolem owiniętej folią aluminiową na 30 minut. Całkowicie usuń metanol i płucz wodą destylowaną dwukrotnie przez 15 minut, delikatnie wstrząsając. Zdekantuj wodę do mycia końcowego i wykonaj następujące czynności w sterylnych warunkach.
   UWAGA: Podczas etapu ekstrakcji należy unikać światła, aby zapobiec rozkładowi chloroformu. Mieszaninę można przechowywać w odpornym na światło pojemniku lub probówce wirówkowej owiniętej folią aluminiową. Wszystkie czynności związane z obróbką i myciem należy wykonywać przy umiarkowanym ruchu obrotowym lub kołysaniu.
6. Opłucz kości w 6 cm naczyniu sterylnym PBS przez 3 minuty, a następnie przenieś kości do nowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Dodać 40 ml sterylnej 0,05% trypsyny-EDTA (TE) do probówki i inkubować kości przez 23 godziny w inkubatorze CO₂ w temperaturze 37 °C¹⁸.
7. Roztwór TE należy wyrzucić i dwukrotnie przepłukać sterylnym PBS uzupełnionym 90 μg/ml ampicyliny i 90 μg/ml kanamycyny. Po całkowitym zdekantowaniu PBS z mycia końcowego uzupełnij go 40 ml sterylnego PBS. Dokładnie prać przez 24 godziny w temperaturze pokojowej, delikatnie kołysząc lub potrząsając w celu nasączenia antybiotykiem.
   UWAGA: Wszystkie sterylne PBS użyte w tym i następnych krokach zawierają 90 μg/ml ampicyliny i 90 μg/ml kanamycyny. Mycie przez noc w ruchu rotacyjnym lub kołyszącym wykonuje się przez długi czas, dokładnie zanurzając w antybiotykach, aby uzyskać skuteczną sterylizację przestrzeni porowych.
8. Wyjąć PBS i przenieść kości do świeżej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml wypełnionej sterylnym PBS. Przygotowane kości zdemineralizowane i pozbawione komórek nazywane są macierzą zewnątrzkomórkową kości (BEM) i mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez 2 miesiące, aż będą potrzebne.

3. Sadzenie komórek i hodowla

1. Wyjąć BEM z lodówki o temperaturze 4 °C i zanurzyć go w 75% etanolu na 30 s, a następnie dwukrotnie spłukać PBS. Przenieść BEM na czystą 6-dołkową płytkę do hodowli komórkowej. Dodać 2 ml kompletnej pożywki hodowlanej (zmodyfikowana pożywka Eagle's Eagle's Plant/F12 (DF12) firmy Dulbecco zawierająca 5% płodowej surowicy bydlęcej, 90 μg/ml ampicyliny i 90 μg/ml kanamycyny). Inkubować BEM przez noc w inkubatorze CO₂ w temperaturze 37 °C.
2. Uzyskać ludzkie linie komórkowe OS (MNNG / HOS i MG-63). Zawiesić około 1,0 x 10⁵ komórek OS ze 100 μl PBS zawierającego czerwień fenolową jako wskaźnik.
   UWAGA: Aby lepiej śledzić i obserwować komórki wielowarstwowe w trójwymiarowym modelu BEM, MNNG / HOS i MG-63 są zakażone wektorem lentiwirusowym wykazującym ekspresję fluorescencyjnego mCherry i białka zielonej fluorescencji (GFP).
3. Po całkowitym nasączeniu BEM w pożywce, wstrzyknąć komórki OS do BEM z bliższej lub dalszej nasady, gdy igła dotrze do jamy szpikowej BEM. Inkubować model OS-BEM przez co najmniej 2 godziny w wilgotnej atmosferze 5% CO₂ w temperaturze 37 °C, aby upewnić się, że wstrzykiwane komórki ściśle przylegają do BEM.
   UWAGA: Podgrzej wstępnie wszystkie podłoża używane do hodowli komórkowych. Inkubator używany do hodowli komórkowych ma nawilżoną atmosferę o stężeniu 5%_{CO2 w} temperaturze 37 °C.
4. Dodać 1 ml kompletnej pożywki hodowlanej do płytki, aby całkowicie pokryć powierzchnię kultury BEM przez noc w inkubatorze CO₂ w temperaturze 37 °C.
5. Delikatnie przenieś model OS-BEM do nowego dołka na 6-dołkowej płytce za pomocą sterylnej pęsety i ponownie nałóż 1 ml świeżej pożywki hodowlanej. Hodować model przez 14 dni w inkubatorze CO₂ w temperaturze 37 °C i odświeżyć pożywkę hodowlaną zgodnie z sytuacją proliferacji komórek OS.
6. Monitoruj kolor pożywki i stan komórek pod odwróconym mikroskopem fluorescencyjnym podczas procesu hodowli. Gdy komórki OS rozprężą się na płytkę, delikatnie przenieś model OS-BEM do innego nowego dołka za pomocą sterylnej pęsety.
   UWAGA: Pożywka hodowlana jest jaskrawoczerwona przy pH 7,4, co jest optymalną wartością pH dla większości hodowli komórkowych ssaków. Jeśli podłoże zmieni kolor na pomarańczowy lub nawet żółty, natychmiast odśwież pożywkę, aby utrzymać zdrowe środowisko dla komórek systemu operacyjnego.
7. Przenieś model OS-BEM do nowej studzienki za pomocą pęsety i delikatnie spłucz PBS, aby usunąć pożywkę hodowlaną. Następnie przenieść do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i utrwalić 10% buforowaną formaliną w celu identyfikacji histologicznej.

Results

Po demineralizacji i decelularyzacji, BEM wydaje się być przezroczysty z większą odpornością i wytrzymałością w porównaniu do rodzimej kości myszy. Wyraźnie można zaobserwować niewielką pozostałość mięśniową i przestrzeń jamy szpikowej (Rysunek 1A, B). Aby określić skuteczną decelularyzację BEM, BEM jest zatapiany w parafinie po utrwaleniu, a następnie krojony na odcinki 3–5 μm w celu barwienia hematoksylino-eozyny (H&E). Dokładne usunięcie jąder komórkowych pokazuje obrazowanie w...

Discussion

Ogólnie rzecz biorąc, OS można podzielić na podtypy osteoblastyczne, chondroblastyczne i fibroblastyczne w zależności od dominującego komponentu histologicznego. Jego rokowanie zależy nie tylko od parametrów histologicznych, ale także od jego anatomicznego położenia. Może wystąpić wewnątrz kości (w przedziale śródszpikowym lub śródkorowym), na powierzchni kości oraz w miejscach pozakostnych¹⁹. Pojawienie się i niejednorodność OS można wyjaśnić jako koniugację zdarzeń onkogennych i odpowiedniego bo...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Probówka wirówkowa 15 ml	Greiner	188271
Probówka wirówkowa 50 ml	Greiner	227270
Naczynie do hodowli komórkowych 6 cm	Greiner	628160
Płytka 6-dołkowa	Greiner	657160
Ampicillin	Sigma-Aldrich	A9393
C57-BL/6J mysz	Laboratorium Uniwersyteckie Sun Yat-sen Inkubator
	SHEL LAB	SCO5A
	odczynników chemicznych	BE14-GR-500G
DMEM/F12	Sigma-Aldrich	D0547
Płodowa surowica bydlęca	Hyklon	SH30084.03
Hemocytometr	BLAU	717805
Kanamycyna	Sigma-Aldrich	PHR1487
MG-63 Chińska	Akademia Nauk, Bank Komórek w Szanghaju Linia	komórkowa ludzkiego kostniakomięsaka
			Roztwór czerwieni fenolowej jest używany jako wskaźnik pH: jego kolor wykazuje stopniowe przejście od żółtego do czerwonego w zakresie pH od 6,6 do 8,0.
Chlorek potasu	Sangon Biotech	A100395
Fosforan potasu Monobasic	Sangon Biotech A501211
Chlorek sodu	Sangon Biotech	A501218