Artykuł metodologiczny

Ponowne badanie komórek nowotworowych in vitro w celu predykcyjnej oceny funkcji przeciwnowotworowej komórek T receptora antygenu chimerycznego

14.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59275

⸱

27 lutego 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Hematology & Hematopoietic Cell Transplantation, T Cell Therapeutics Research Laboratory, City of Hope Beckman Research Institute and Medical Center, 2Irell and Manella Graduate School of Biological Sciences, City of Hope Beckman Research Institute and Medical Center

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy metodę wspólnej hodowli in vitro do rekurencyjnego wyzwania limfocytów T ukierunkowanych na nowotwór, co pozwala na fenotypową i funkcjonalną analizę aktywności przeciwnowotworowych limfocytów T.

Streszczenie

Dziedzina terapii limfocytami T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) szybko się rozwija dzięki ulepszeniom w projektowaniu CAR, metodach inżynierii genetycznej i optymalizacjach produkcji. Jednym z wyzwań dla tych wysiłków rozwojowych było jednak opracowanie testów in vitro, które mogą dostarczyć solidnych informacji na temat wyboru optymalnych produktów z komórek CAR T w celu osiągnięcia sukcesu terapeutycznego in vivo. Standardowe testy lizy guza in vitro często nie odzwierciedlają prawdziwego potencjału przeciwnowotworowego limfocytów CAR T ze względu na stosunkowo krótki czas kohodowli i wysoki stosunek limfocytów T do guza. W tym miejscu opisujemy metodę kohodowli in vitro w celu oceny potencjału rekurencyjnego zabijania komórek CAR T przy wysokim obciążeniu komórkami nowotworowymi. W tym teście długoterminowa funkcja cytotoksyczna i zdolność proliferacyjna komórek CAR T jest badana in vitro przez 7 dni z dodatkowymi celami nowotworowymi podawanymi do kokultury co drugi dzień. Test ten można połączyć z profilowaniem aktywacji limfocytów T, wyczerpania i fenotypów pamięci. Za pomocą tego testu z powodzeniem wyodrębniliśmy funkcjonalne i fenotypowe różnice między limfocytami T CD4 + i CD8 + CAR a komórkami glejaka (GBM), odzwierciedlając ich zróżnicowaną aktywność przeciwnowotworową in vivo w ortotopowych modelach ksenoprzeszczepów. Metoda ta zapewnia łatwe podejście do oceny siły działania limfocytów CAR T i wyjaśnienia różnic funkcjonalnych między różnymi produktami z komórek CAR T.

Wprowadzenie

Immunoterapia z wykorzystaniem limfocytów T zmodyfikowanych przez chimeryczny receptor antygenowy (CAR) przyniosła obiecujące wyniki w walce z nowotworami złośliwymi komórek B1,2,3,4, podczas gdy potencjał celowania w inne nowotwory jest nadal przedmiotem rygorystycznych badań5,6,7. Poczyniono znaczne postępy w zakresie optymalizacji konstrukcji CAR, procesu produkcyjnego i schematów wstępnego podawania pacjentom6,7,8, a nowe podejścia do biologii syntetycznej mają zwiększyć ich trwałość, bezpieczeństwo i swoistość dla nowotworów9,10. Jednak właściwa ocena potencjału terapeutycznego limfocytów CAR T w celu dokonania najlepszego wyboru do translacji klinicznej była trudna i pracochłonna. Najbardziej znanym do tej pory modelem oceny funkcji limfocytów CAR T jest model u myszy z niedoborem odporności z ludzkimi ksenoprzeszczepami nowotworowymi, przy czym limfocyty CAR T są badane pod kątem skuteczności przeciwnowotworowej i porównywane przy miareczkowanych dawkach komórek11,12,13,14,15. Te mysie badania in vivo są pracochłonne i czasochłonne, zwłaszcza w przypadku badań przesiewowych dużej liczby parametrów. Co więcej, badania in vivo mogą być ograniczone ze względu na dostępność szczepów myszy, ośrodków opieki nad zwierzętami i technik obchodzenia się ze zwierzętami. W związku z tym istnieje potrzeba opracowania wygodniejszych testów in vitro, pozwalających na szybkie odczyty aktywności efektorowej, które również wiernie odzwierciedlają funkcję przeciwnowotworową tych limfocytów T in vivo.

Konwencjonalne metody określania cytotoksyczności limfocytów T in vitro skupiały się na wykrywaniu degranulacji, produkcji cytokin i zdolności do lizy komórek docelowych znakowanych radioizotopami (tj. testy uwalniania chromu). Chociaż testy te są pouczające w określaniu swoistości limfocytów CAR T i rozpoznawaniu przekierowanego celu, często nie odzwierciedlają one potencjału przeciwnowotworowego in vivo zmodyfikowanych limfocytów T12,13,16. W niektórych przypadkach zabijanie in vitro w krótkoterminowych testach wykazało odwrotną korelację z funkcją przeciwnowotworową in vivo16. Taka niespójność jest prawdopodobnie wynikiem wysokich proporcji efektor-cel (E:T) stosowanych w tych testach in vitro, a tym samym niemożności różnicowania produktów z komórek CAR T, które są podatne na wyczerpanie17. W przeciwieństwie do tego, podczas eradykacji guza in vivo limfocyty T zwykle reagują na duże obciążenia guza, co wymaga wielu rund zabijania, a następnie prowadzi do różnicowania i wyczerpania limfocytów T18,19,20, co jest jedną z głównych barier dla skutecznego usuwania guza przez limfocyty CAR T12,13. Tymczasem większość krótkoterminowych testów zabijania in vitro również nie odczytuje różnic w proliferacji limfocytów T, podczas gdy u pacjentów leczonych limfocytami CAR T zdolność do ekspansji limfocytów CAR T jest silnie skorelowana z odpowiedziami klinicznymi4. W związku z tym odpowiedni test in vitro musiałby podsumować warunki dużego obciążenia guza, indukcji wyczerpania limfocytów T i umożliwić odczyt ekspansji limfocytów T.

Tutaj opisujemy strategię oceny komórek CAR T pod kątem powtarzalnego potencjału zabijania nowotworów, za pomocą prostego testu in vitro na wspólnej hodowli. Jednocześnie można badać różne parametry aktywności efektorowej limfocytów T, w tym zabijanie komórek docelowych, ekspansję limfocytów T CAR oraz fenotypy związane z pamięcią lub wyczerpaniem. Wyniki uzyskane w tym teście dobrze korelują z działaniem przeciwnowotworowym komórek CAR T in vivo i mogą być wykorzystane do oceny siły działania produktów z komórek CAR T. Chociaż opisujemy test do oceny komórek CAR T ukierunkowanych na IL13Ra2 w stosunku do pierwotnych linii GBM21, można go łatwo dostosować do dowolnej platformy komórek CAR T.

Protokół

Nasz IRB nie wymaga przeglądu tego protokołu. Z Wydziału Patologii Miasta Nadziei otrzymujemy wyrzucone świeże próbki guza glejaka, które są zakodowane, a nasze laboratorium nie może uzyskać dostępu do klucza. Otrzymujemy próbki z danymi dotyczącymi jedynie wcześniejszego leczenia i stanu choroby w momencie biopsji/resekcji, bez danych identyfikujących.

1. Przygotowanie mediów

  1. Przygotuj pożywkę z nerwowych komórek macierzystych do hodowli pierwotnych linii komórkowych GBM: DEM:F12, 1:50 B27, 5 μg/ml heparyny i 2 mmol/L L-glutaminy; uzupełnione 20 ng/ml naskórkowym czynnikiem wzrostu (EGF) i 20 ng/ml zasadowego czynnika wzrostu fibroblastów (FGF) dwa razy w tygodniu (patrz tabela materiałów).
  2. Przygotować pożywkę z limfocytów T: X-VIVO 15 zawierającą 10% płodową surowicę cielęcą (FCS); uzupełnioną 70 j.m./ml rhIL-2 i 0,5 ng/ml rhIL-15 co 48 godzin (patrz tabela materiałów).
  3. Przygotuj pożywki do wspólnej hodowli: weź pożywkę z neuronalnych komórek macierzystych bez suplementu EGF i FGF i dodaj 10% FCS.
  4. Przygotować roztwór barwiący FACS (FSS): HBSS, 2% FCS, NaN3 (0,5 g/500 ml).

2. Przygotowanie komórek nowotworowych GBM

  1. Zebrać kulki nowotworowe GBM o niskim pasażu (TS) przez odwirowanie przy 300 x g przez 4 minuty i odrzucić supernatant.
    nuta: Kule nowotworowe GBM (TS) są generowane z wyciętych guzów, jak opisano wcześniej22,23,24 i utrzymywane w pożywkach z neuronalnymi komórkami macierzystymi, w inkubatorach z 5% CO2 w temperaturze 37 °C.
  2. Wstępnie ogrzać pożywki do kohodowli w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
  3. Dodać 1 ml zimnej akutazy do GBM TS, zdysocjować TS przez pipetowanie przez 30-60 s i zatrzymać dysocjację przez dodanie 5 ml ciepłej pożywki do współhodowli.
    nuta: GBM TS nie powinny być utrzymywane w akutazie dłużej niż 5 minut.
  4. Zebrać komórki GBM przez odwirowanie przy 300 x g przez 4 minuty, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 2 ml pożywki do kohodowli.
  5. Określ stężenie komórek za pomocą licznika żywotności komórek.
    nuta: Żywotność komórek musi wynosić >70%.

3. Przygotowanie limfocytów CAR T

  1. Mniej niż 24 godziny przed testem pobrać 100 μl hodowanych limfocytów CAR T do probówki do cytometrii przepływowej i dodać 2 ml FSS.
    nuta: Limfocyty CAR T zostały wygenerowane zgodnie z wcześniejszym opisem11,21 i hodowane w pożywce z komórek T.
  2. Odwirowywać przy 300 x g przez 4 minuty i odrzucić supernatant.
  3. Dodać 2 ml FSS do przemycia komórek, odwirować przy 300 x g przez 4 minuty i odrzucić supernatant.
  4. Wybarwić komórki odpowiednim przeciwciałem, aby wskazać ekspresję CAR w temperaturze 4 °C przez 30 min.
    nuta: Na przykład, jeśli używany jest CAR ukierunkowany na IL13Rα2 opisany wcześniej25, należy wybarwić przeciwciałem anty-IL13.
  5. Przemyć dwukrotnie 2 ml FSS i przeanalizować CAR exn za pomocą cytometru przepływowego.
  6. Określ CAR% na limfocytach T, korzystając ze strategii bramkowania pokazanej w Rysunek 1B.
  7. W dniu kohodowli zebrać wszystkie limfocyty CAR T przez odwirowanie przy 300 x g przez 4 minuty, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 2 ml pożywki do kohodowli.
  8. Określ stężenie komórek za pomocą licznika żywotności komórek.
    nuta: Żywotność komórek musi wynosić >70%.

4. Konfiguracja guza — kohodowla limfocytów T

  1. Rozcieńczyć komórki nowotworowe do stężenia 0,16 miliona/ml za pomocą pożywki do kohodowli.
  2. Na podstawie CAR%, rozcieńczyć limfocyty CAR T do stężenia 0,04 miliona komórek CAR+/ml z pożywkami do kohodowli.
    nuta: Na przykład, jeśli CAR wynosi 50%, a stężenie limfocytów T wynosi 0,4 miliona/ml, wykonaj rozcieńczenie 1:5, aby uzyskać końcowe stężenie 0,04 miliona komórek CAR+/ml.
  3. Odpipetować 100 μl rozcieńczonych komórek nowotworowych do każdego dołka 96-dołkowej płytki do hodowli tkankowej z płaskim dnem.
  4. Odpipetować 100 μl rozcieńczonych limfocytów T CAR do każdej studzienki zawierającej komórki nowotworowe i dobrze wymieszać.
    nuta: Każda kohodowla komórek nowotworowych T będzie analizowana w 4 punktach czasowych. Na podstawie różnych analiz może być wymagane 4-6 powtórzeń w każdym punkcie czasowym, ale <3 powtórzenia na punkt czasowy nie są zalecane; zob. tabela 1 w celu zapoznania się z reprezentatywną mapą tablic.
  5. Przechowywać płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 .

5. Ponowne wyzwanie dla komórek nowotworowych

UWAGA: Ponowne wyzwanie odbywa się po 2, 4 i 6 dniach od początkowej konfiguracji wspólnej kultury (Rysunek 1A).

  1. Zbierz i oddziel GBM TS zgodnie z powyższym opisem (kroki 2.1-2.6).
  2. Ponownie zawiesić komórki GBM w stężeniu 0,64 miliona/ml.
  3. Określić studzienki do kohodowli, które wymagają ponownego wyzwania (patrz Tabela 1) i ostrożnie usunąć 50 μl pożywki z górnej części każdego dołka.
  4. Dodać 50 μl zawiesiny komórek GBM do każdej studzienki i dobrze wymieszać, a następnie umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 .

6. Pobieranie próbek i analiza cytometryczna przepływowa

UWAGA: Próbki zostaną pobrane po 1, 3, 5 i 7 dniach od początkowej konfiguracji wspólnej hodowli, z odpowiednio 1, 2, 3 i 4 rundami prowokacji nowotworowej.

  1. Wstępnie podgrzać 0,05% roztwór trypsyny-EDTA w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
  2. Określ studzienki, które wymagają zbioru i przenieś pożywkę do nowej 96-dołkowej płytki z okrągłym dnem.
  3. Pobrać pipetą 50 μl trypsyny-EDTA do studzienek, aby trawić pozostałe komórki nowotworowe w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
  4. Pod mikroskopem upewnij się, że komórki oderwały się od dna.
  5. Pipetować wokół dna studzienki w celu ponownego zawieszenia oderwanych komórek, a następnie przenieść odłączone komórki zawierające trypsynę-EDTA do odpowiednich dołków 96-dołkowej płytki okrągłodennej.
  6. Odwirować okrągłodenną 96-dołkową płytkę w temperaturze 300 x g, w temperaturze 4 °C przez 4 minuty, a następnie odrzucić supernatant.
  7. Dodać 200 μl/basenik FSS do przemycia komórek, odwirować w temperaturze 300 x g, 4 °C przez 4 minuty, a następnie odrzucić supernatant.
  8. Zawiesić komórki w 100 μl/baseniku FSS zawierającym przeciwciała (patrz tabela materiałów) i wybarwić komórki w temperaturze 4 °C przez 30 minut.
  9. Dodać 100 μl/basenik FSS do komórek, odwirować przy 300 x g, 4 °C przez 4 minuty, a następnie odrzucić supernatant.
  10. Dodać 200 μl/basenik FSS do przemycia komórek, odwirować w temperaturze 300 x g, 4 °C przez 4 minuty, a następnie odrzucić supernatant.
  11. Ponownie zawiesić komórki z 100-200 μl / studzienkę FSS z 500 ng / ml DAPI, a następnie przeanalizować próbki za pomocą cytometrii przepływowej.

7. Analiza funkcjonalna i fenotypowa limfocytów CAR T

  1. Pobierz pliki danych z cytometru przepływowego i bramuj wszystkie żywe komórki (DAPI-) ( Rysunek 1C).
  2. Określ ilościowo komórki nowotworowe przez bramkowanie populacji CD45- i limfocytów CAR T przez bramkowanie populacji CD45 +, CAR+ (Rysunek 1C).
    nuta: Jeśli komórki nowotworowe wyrażają CD45 (np. Komórki chłoniaka Rajiego), barwienie anty-CD3 można zastosować do różnicowania limfocytów T od komórek nowotworowych.
  3. Wykreśl liczbę komórek nowotworowych i komórek CAR T w czasie trwania filmu.
  4. Zidentyfikuj aktywację limfocytów T przez koekspresję 4-1BB i CD69.
    nuta: Te markery powierzchniowe można wykorzystać do analizy aktywacji limfocytów T 6-24 godziny po początkowej kohodowli.
  5. Zidentyfikuj wyczerpanie limfocytów T przez ekspresję PD-1, LAG-3 i TIM-3.
  6. Zidentyfikuj stan pamięci limfocytów T na podstawie ekspresji CD45RO i CD62L.

Wyniki

Korzystając z opisanego powyżej testu, rozróżniliśmy różnicową siłę efektorową i dynamikę zabijania, w której pośredniczą limfocyty T CD4+ i CD8+. Przedstawione tutaj wyniki ilustrują różnicę między limfocytami T CAR CD4+ i CD8+, wygenerowanymi od zdrowego dawcy niezależnie od naszej poprzedniej publikacji21.

Dzięki standardowemu testowi degranulacji udało nam się zaobserwować, że zarówno limfocyty T CD4+, jak i CD8+ CAR stały się jednakowo aktywowane przeciwko komórkom GBM, które wyrażają docelowy antygen, na co wskazuje ekspresja CD107a i cytokiny wewnątrzkomórkowej (Rysunek 2A). Jednak korzystając z powtarzalnego testu prowokacji nowotworu, stwierdziliśmy, że limfocyty T CD4 +, ale nie CD8 + + CAR wykazywały zdolność do zabijania w wielu rundach (Figura 2B). Limfocyty T CD4 + CAR osiągnęły również lepszą ekspansję w porównaniu z komórkami CD8 + podczas tego testu (Figura 2C). Różnicę w ekspansji między podzbiorami komórek CAR T zaobserwowano dopiero od D3 po dwóch rundach prowokacji guzem (1:12 E:T), podczas gdy różnicę cytotoksyczności zaobserwowano począwszy od D5 po trzech rundach prowokacji guzem (1:20 E:T), co wskazuje, że testy krótkoterminowe nie wyjaśniły różnic w sile działania różnych produktów z komórek CAR T. Kiedy do tego testu zastosowano mieszane limfocyty T CD4 + i CD8 + CAR 1: 1, okazało się, że przewyższają one limfocyty T CD8 +, ale nie CD4 + CAR pod względem długoterminowej cytotoksyczności (Figura 2B). Ekspansja limfocytów T CD8 + CAR została wywołana przez współstosowane komórki CD4 +, podczas gdy ekspansja komórek T CD4 + CAR została zahamowana w obecności komórek CD8 + (Figura 2C).

Aby wyjaśnić mechanizm, który odróżnia aktywność efektorową między komórkami T CD4+ i CD8+, najpierw potwierdzamy, że 24 godziny po początkowej kohodowli, zarówno limfocyty T CAR CD4+, jak i CD8+ były porównywalnie aktywowane (Rysunek 3A). Tymczasem, jak wskazuje ekspresja CD45RO i CD62L, zarówno limfocyty T CAR CD4 +, jak i CD8 + wykazały przejście z fenotypu pamięci centralnej (CD45RO +, CD62L +) do pamięci efektorowej (CD45RO +, CD62L-) podczas powtarzającego się prowokacji guza (Figura 3B). Następnie scharakteryzowaliśmy komórki w D3 tego testu, na czas przed tym, jak podzbiory komórek CAR T zaczęły wykazywać różnice funkcjonalne. Wyczerpanie limfocytów T było zaznaczone przez koekspresję receptorów hamujących PD-1, LAG-3 i TIM-315,21, co wykazało, że limfocyty T CD8 + CAR były bardziej podatne na wyczerpanie w porównaniu z limfocytami T CD4 + CAR (Figura 3C). Co więcej, nie zaobserwowano różnicy w wyczerpaniu limfocytów T CD8 + CAR w obecności / braku współstosowanych komórek CD4 + (Figura 3C), co wskazuje, że indukowana przez CD4 ekspansja limfocytów T CD8 + CAR nie jest związana z lepszą funkcją efektorową.

Łącznie, wyniki tego testu wykazały, że limfocyty T CD4+ CAR przewyższały komórki CD8+ szczególnie w długoterminowej cytotoksyczności. Pomimo podobnej krótkotrwałej cytotoksyczności (1-3 dni, po ponownym podjęciu), limfocyty T CD4 + CAR utrzymywały funkcję efektorową po powtarzającym się prowokowaniu guza, podczas gdy komórki CD8 + zostały wyczerpane i nie kontrolowały wzrostu komórek nowotworowych. Gdy dwie podgrupy zostały zmieszane, limfocyty T CD4 + CAR ułatwiły ekspansję limfocytów T CD8 + CAR, ale stan wyczerpania komórek CD8 + nie uległ poprawie, co spowodowało brak efektu synergicznego między dwiema grupami. Podobną różnicę między limfocytami T CAR CD4 + i CD8 + zaobserwowano w modelu in vivo, jak opisano wcześniej21. Rzeczywiście, limfocyty T CD8 + CAR były w stanie pośredniczyć w krótkoterminowym usuwaniu guza, ale następował po nich nawrót antygenu; w przeciwieństwie do tego, leczenie limfocytami T CD4 + CAR skutkowało długotrwałym eradykacją nowotworu21, co przypomina ich powtarzalny potencjał zabijania przy użyciu testu ponownego wyzwania in vitro.

figure-results-1
Rysunek 1: Schemat i strategia analizy powtarzalnego testu prowokacyjnego. (A) Schemat i oś czasu powtarzalnego testu prowokacyjnego nowotworu. Dla każdej studzienki limfocyty CAR T najpierw hodowano wspólnie z komórkami PBT030-2 GBM (4 000 komórek CAR+, 16 000 komórek nowotworowych) i ponownie prowokowano 32 000 komórek nowotworowych co drugi dzień (D2, D4 i D6). Analizę liczby komórek nowotworowych i limfocytów CAR T, a także fenotypu limfocytów CAR T przeprowadza się w D1, D3, D5 i D7. (B) Strategia bramkowania w celu określenia CAR% w limfocytach T przed założeniem kohodowli. (C) Strategia bramkowania żywych komórek, komórek nowotworowych i limfocytów CAR T z powtarzalnego testu prowokacyjnego. (D) Liczba komórek nowotworowych w różnych momentach testu ponownego prowokacji, hodowanych wspólnie z nietransdukowanymi limfocytami T. Słupki błędów = ±SEM. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Powtarzalne badanie prowokacyjne ujawnia różnice w zabijaniu i sile proliferacji między limfocytami T CD4+ i CD8+. (A) Degranulacja i wewnątrzkomórkowe barwienie cytokiny limfocytów T CD4+ i CD8+ CAR po 5 godzinach kohodowli z komórkami GBM (E:T=1:1). (B) Limfocyty T CAR CD4 +, CD8 + lub mieszane (CD4: CD8 = 1: 1) zastosowano do powtarzalnego testu prowokacyjnego, a żywotne komórki nowotworowe oznaczono ilościowo. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 w porównaniu z CD4+, przy użyciu jednoczynnikowej ANOVA z wielokrotnymi testami porównawczymi Bonferroniego. (C) Ekspansja limfocytów T CD4 + i CD8 + CAR podczas powtarzalnego testu prowokacyjnego guza. Porównanie (od lewej do prawej) CD4+ i CD8+, pojedynczy podzbiór; CD4+ vs CD8+, w grupie "mieszanej"; CD4+, pojedynczy vs mieszany; CD8+, pojedynczy vs miksowany. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 przy użyciu niesparowanego testu t Studenta. Słupki błędów = ±SEM. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Analiza fenotypu limfocytów T podczas powtarzalnego testu prowokacyjnego. (A) Barwienie 4-1BB i CD69 na limfocytach CAR T w D1 testu. (B) Barwienie limfocytów CAR T CD45RO i CD62L przed zastosowaniem do ponownego testu prowokacyjnego (wejście) oraz w D3 i D7 testu. (C) Koekspresja PD-1, LAG-3 i TIM-3 na limfocytach CAR T w D3 testu. (Góra) Strategie bramkowania w celu identyfikacji limfocytów T wykazujących ekspresję 1, 2 lub 3 receptorów hamujących. (Na dole) Porównanie: komórek CD4+ (pojedynczy podzbiór), komórek CD8+ (pojedynczy podzbiór), komórek CD8+ (w grupie "mieszanej"). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Tabela 1: Reprezentatywna mapa tablicowa konfiguracji ponownego wyzwania.

Dyskusja

Ten powtarzalny test prowokacyjny komórek nowotworowych stanowi wygodne podejście do oceny siły działania komórek CAR T, przy użyciu konfiguracji in vitro, która podsumowuje wysokie obciążenie guza związane z modelami nowotworów in vivo. Podczas tego 7-dniowego testu limfocyty CAR T przechodzą cztery rundy prowokacji guza (początkowa kohodowla i 3-krotna reprowokacja), tworząc środowisko, w którym wyczerpane limfocyty T mogą stracić zdolność do reagowania na prowokację guza pomimo silnej początkowej odpowiedzi. Eliminacja komórek nowotworowych i ekspansja limfocytów CAR T stanowią dwa podstawowe odczyty, które można uzyskać z tego testu, podczas gdy fenotypy komórek CAR T można łatwo przeanalizować, barwiąc markery powierzchniowe lub wewnątrzkomórkowe, które wskazują na aktywację, wyczerpanie i / lub pamięć limfocytów T. Test ten jest również wygodny do połączenia z bezstronną analizą transkryptomu komórek CAR T, proteomu lub proteomu fosforu21,26 oraz polifunkcjonalności limfocytów T, która została przyjęta do przewidywania odpowiedzi klinicznych27. Co więcej, komórki nowotworowe mogą być również testowane pod kątem ich odpowiedzi adaptacyjnej przeciwko odporności limfocytów T, takiej jak wydzielanie cytokin28. Ponieważ próbki są pobierane w wielu punktach czasowych, test ten pozwala nie tylko na statyczną, ale także dynamiczną analizę zachowania komórek CAR T podczas reagowania na nadmierną liczbę komórek nowotworowych.

Test ten jest szczególnie skuteczny w porównywaniu siły efektorowej limfocytów CAR T ukierunkowanych na ten sam antygen, ale o różnych konstrukcjach i/lub procesach produkcyjnych. Użyliśmy tego testu, aby zidentyfikować, że limfocyty T CD4 + CAR były w stanie pośredniczyć w lepszej długoterminowej funkcji efektorowej niż komórki CD8 + 21. Wykazano również, że skuteczność CAR in vivo była skorelowana z cytotoksycznością w późniejszych punktach czasowych (D5-D7) podczas tego testu, co dodatkowo podkreśla konieczność stosowania powtarzalnego prowokacji guza do oceny in vitro limfocytów T CAR. Chociaż komórki GBM zostały tutaj użyte jako przykład komórek docelowych, test ten można łatwo zaadaptować do innej kombinacji limfocytów T i guza. Warto zauważyć, że zachowanie limfocytów CAR T może się również różnić w zależności od gęstości antygenu, a inżynieria komórek rakowych w celu ekspresji różnych poziomów docelowych antygenów zapewniła narzędzie do badania sekwencyjnych zdarzeń molekularnych po rozpoznaniu CAR29. Dlatego test ten można również wykorzystać do zbadania wzorca aktywacji niektórych limfocytów CAR T przeciwko różnym celom.

Ponieważ żywotność komórek docelowych i ekspansja limfocytów CAR T to dwa wstępne odczyty tego testu, bardzo ważne jest, aby wszystkie kokultury rozpoczynały się od żywotnych (>70%) komórek nowotworowych i limfocytów T. Podczas wykonywania procesów ponownego naruszania działanie pożywki aspirującej (krok 5.3) nie powinno zakłócać komórek nowotworowych i limfocytów T na dnie studzienek, aby nie wprowadzać niepotrzebnych zmian w liczbie komórek. Podczas wykonywania tego testu na docelowych liniach komórkowych zawiesiny zaleca się zebranie pozostałych komórek przez odwirowanie przed ponownym wyzwaniem komórek nowotworowych.

Jednym z ograniczeń tego testu jest to, że parametry konfiguracji (stosunek E:T początkowej kohodowli i ponownego wyzwania) muszą być dostosowane w oparciu o różne kombinacje CAR-guza. Na przykład, jeśli komórki nowotworowe wyrażają znaczny poziom cząsteczek hamujących działanie układu odpornościowego (np. PD-L1), zaleca się wyższy stosunek E:T, biorąc pod uwagę, że ogólna skuteczność zabijania jest upośledzona w porównaniu z komórkami nowotworowymi o niskim poziomie PD-L1. Przed zastosowaniem testu do nowych kombinacji CAR-guz zaleca się przeprowadzenie badania pilotażowego w celu określenia optymalnych warunków, które zwykle pozwalają najsilniejszym limfocytom CAR T testowanym w teście wyeliminować >80% komórek nowotworowych w punkcie końcowym. Ponieważ do zabijania za pośrednictwem limfocytów CAR T potrzebny jest bezpośredni kontakt komórka-komórka, jeśli komórki nowotworowe były znakowane fluorescencyjnie, wówczas panel analizy cytometrii przepływowej musi być odpowiednio dostosowany (np. jeśli komórki nowotworowe były znakowane GFP, nie należy stosować żadnych przeciwciał sprzężonych z FITC).

Aktywność kliniczna limfocytów CAR T przeciwko nowotworom złośliwym komórek B doprowadziła do powstania dwóch leków zatwierdzonych przez FDA. Jednak odpowiedź wykazała znaczne różnice u różnych pacjentów 27,30,31, co zostało wyjaśnione w celu skorelowania z właściwościami fenotypowymi produktów CAR 30. Ten test in vitro repetitive tum challenge zapewnia ponadto podejście do funkcjonalnego testowania siły działania efektora CAR oprócz charakterystyki fenotypowej i produkcji cytokin wielofunkcyjnych, a także pozwala na bardziej przepustowe badania przesiewowe produktów klinicznych w porównaniu z modelami nowotworów in vivo, przy jednoczesnym zachowaniu wierności predykcyjnej. Ogólnie rzecz biorąc, test ten może być stosowany do testów funkcjonalnych limfocytów T w celu projektowania limfocytów CAR T, rozwoju przedklinicznego i klinicznego.

Oświadczenia

Konstrukcja CAR opisana w tej pracy została licencjonowana przez Mustang Bio., Inc., za co S.J.F. i C.E.B. otrzymują opłaty licencyjne. Wszyscy pozostali autorzy deklarują brak potencjalnego konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty z California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) grant TR3-05641 i granty NIH P30 CA33572 (rdzenie). D.W. jest wspierany przez stypendium NCI 1F99CA234923-01.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,05% trypsyna/0,53 mM EDTA w HBSS bez wapnia i magnezuCorningMT25051CI
1 M HepesIrvine Scientific9319
200 mM L-glutaminaCambrex Bio Science17-605E
4',6-diamidino-2-fenyloindol, dichlorowodorek (DAPI) - FluoroPure gradeInvitrogenD21490
AccutaseInnowacyjne technologie komórkoweAT104
Aldesleukin Proleukin (rhIL-2)Novartis OncologyNDC 0078-0495-61
Anty-CD137, PEBD Biosciences5559564B4-1
Anty-CD19, PE-Cy7BD Biosciences557835SJ25C1
Anty-CD3, PERCPBD Biosciences340663SK7
Anty-CD4, FITCBD Biosciences340133SK3
Anti-CD45, PERCPBD Biosciences3406652D1
Anti-CD45RO, PEBD Biosciences561137UCHL1
Anti-CD62L, APCBD Biosciences559772DREG-56
Anti-CD69, APCBD Biosciences340560L78
Anti-CD8, APC-Cy7BD Biosciences348793SK1
Anti-IL-13, PEBD Biosciences340508JES10-5A2
Anti-LAG-3, PEeBiosciences12-2239-413DS223H
Anti-PD-1, APC-Cy7BioLegend329921EH12.2H7
Anti-TIM-3, APCeBiosciences17-3109-42F38-2E2
B-27 Suplement bez serum (50x)Invitrogen17504-044
Corning 96 Well Clear Płaskie dno polistyrenu poddane działaniu TC, pakowane pojedynczo, z pokrywką, sterylne (produkt #3596)Corning Life Sciences3596
Zdefiniowana płodowa surowica bydlęca, HI IRHyclone LabsSH30070.03IH
DMEM F-12 50:50 (1x) bez glutaminyMediaTech, Inc.15-090-CV
DMEM High Gluc bez L-Glu, na 1 lInvitrogen11960051
DMEM-Ham's F12 50:50 Mieszanina z L-glutaminą i 15 mM HEPESFisher ScientificMT10092CV
HBSSIrvine Scientific9224
Inaktywowany termiczniehyklonSH30070.03
Heparyna sodowa (1,000 U / ml)American Farmaceutyczny401811B
MACSQuantMilteni Biotech Inc.BIS013220 
PBS 1x W/CA & MGIrvine Scientific9236
PBS z 1 mM EDTA (bez Ca2+ lub Mg2+)VWR Scientific ProductsPB15009A
Rekombinowany ludzki EGFR& D Systems236-EG-200
Rekombinowany ludzki FGFR& D Systems233-FB
rhIL-15 Rozcieńczenie robocze (10 ng/&mikro; L)CellGenix, US OperationstF0297
Azydek sodu (NaN3)SigmaS8032
Sorvall ST40RThermo Scientific41693700
TC-HEPES BUFFER (1 M) SOLN 100ML IRVINE SCIENTIFIC CORP6472
Maska zabiegowa TecnolKimberly-Clark47117
X-VIVO 15LonzaBW04-744Q
FCS

Bibliografia

  1. Porter, D. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia. Science Translational Medicine. 7 (303), (2015).
  2. Brentjens, R. J., et al. CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia. Science Translational Medicine. 5 (177), (2013).
  3. Grupp, S. A., et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia. The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).
  4. Lee, D. W., et al. T cells expressing CD19 chimeric antigen receptors for acute lymphoblastic leukaemia in children and young adults: a phase 1 dose-escalation trial. The Lancet. 385 (9967), 517-528 (2015).
  5. Yong, C. S. M., et al. CAR T-cell therapy of solid tumors. Immunology and Cell Biology. 95 (4), 356-363 (2017).
  6. Barrett, D. M., Singh, N., Porter, D. L., Grupp, S. A., June, C. H. Chimeric antigen receptor therapy for cancer. Annual Review of Medicine. 65, 333-347 (2014).
  7. Priceman, S. J., Forman, S. J., Brown, C. E. Smart CARs engineered for cancer immunotherapy. Current Opinion in Oncology. 27 (6), 466-474 (2015).
  8. Fesnak, A. D., June, C. H., Levine, B. L. Engineered T cells: the promise and challenges of cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer. 16 (9), 566-581 (2016).
  9. Esensten, J. H., Bluestone, J. A., Lim, W. A. Engineering Therapeutic T Cells: From Synthetic Biology to Clinical Trials. Annual Review of Pathology. 12, 305-330 (2017).
  10. Lim, W. A., June, C. H. The Principles of Engineering Immune Cells to Treat Cancer. Cell. 168 (4), 724-740 (2017).
  11. Brown, C. E., et al. Optimization of IL13Ralpha2-Targeted Chimeric Antigen Receptor T Cells for Improved Anti-tumor Efficacy against Glioblastoma. Molecular Therapy. , (2017).
  12. Long, A. H., et al. 4-1BB costimulation ameliorates T cell exhaustion induced by tonic signaling of chimeric antigen receptors. Nature Medicine. 21 (6), 581-590 (2015).
  13. Cherkassky, L., et al. Human CAR T cells with cell-intrinsic PD-1 checkpoint blockade resist tumor-mediated inhibition. The Journal of Clinical Investigation. 126 (8), 3130-3144 (2016).
  14. Priceman, S. J., et al. Co-stimulatory signaling determines tumor antigen sensitivity and persistence of CAR T cells targeting PSCA+ metastatic prostate cancer. Oncoimmunology. 7 (2), 1380764(2018).
  15. Eyquem, J., et al. Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection. Nature. 543 (7643), 113-117 (2017).
  16. Gattinoni, L., et al. Acquisition of full effector function in vitro paradoxically impairs the in vivo antitumor efficacy of adoptively transferred CD8+ T cells. The Journal of Clinical Investigation. 115 (6), 1616-1626 (2005).
  17. Malandro, N., et al. Clonal Abundance of Tumor-Specific CD4(+) T Cells Potentiates Efficacy and Alters Susceptibility to Exhaustion. Immunity. 44 (1), 179-193 (2016).
  18. Gattinoni, L., et al. Wnt signaling arrests effector T cell differentiation and generates CD8+ memory stem cells. Nature Medicine. 15 (7), 808-813 (2009).
  19. Klebanoff, C. A., et al. Central memory self/tumor-reactive CD8+ T cells confer superior antitumor immunity compared with effector memory T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (27), 9571-9576 (2005).
  20. Gattinoni, L., Klebanoff, C. A., Restifo, N. P. Paths to stemness: building the ultimate antitumour T cell. Nature Reviews Cancer. 12 (10), 671-684 (2012).
  21. Wang, D., et al. Glioblastoma-targeted CD4+ CAR T cells mediate superior antitumor activity. JCI Insight. 3 (10), (2018).
  22. Kahlon, K. S., et al. Specific recognition and killing of glioblastoma multiforme by interleukin 13-zetakine redirected cytolytic T cells. Cancer Research. 64 (24), 9160-9166 (2004).
  23. Brown, C. E., et al. Recognition and killing of brain tumor stem-like initiating cells by CD8+ cytolytic T cells. Cancer Research. 69 (23), 8886-8893 (2009).
  24. Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
  25. Brown, C. E., et al. Regression of Glioblastoma after Chimeric Antigen Receptor T-Cell Therapy. The New England Journal of Medicine. 375 (26), 2561-2569 (2016).
  26. Salter, A. I., et al. Phosphoproteomic analysis of chimeric antigen receptor signaling reveals kinetic and quantitative differences that affect cell function. Science Signaling. 11 (544), (2018).
  27. Rossi, J., et al. Preinfusion polyfunctional anti-CD19 chimeric antigen receptor T cells are associated with clinical outcomes in NHL. Blood. 132 (8), 804-814 (2018).
  28. Garcia-Diaz, A., et al. Interferon Receptor Signaling Pathways Regulating PD-L1 and PD-L2 Expression. Cell Reports. 19 (6), 1189-1201 (2017).
  29. Walker, A. J., et al. Tumor Antigen and Receptor Densities Regulate Efficacy of a Chimeric Antigen Receptor Targeting Anaplastic Lymphoma Kinase. Molecular Therapy. 25 (9), 2189-2201 (2017).
  30. Fraietta, J. A., et al. Determinants of response and resistance to CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy of chronic lymphocytic leukemia. Nature Medicine. 24 (5), 563-571 (2018).
  31. Fraietta, J. A., et al. Disruption of TET2 promotes the therapeutic efficacy of CD19-targeted T cells. Nature. 558 (7709), 307-312 (2018).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Terapia kom rkami CAR Tkom rki glejaka wielopostaciowegoanaliza cytometrycznaaktywacja limfocyt w Twyczerpanie limfocyt w Tfenotypy pami ci limfocyt w Tkokultura in vitropowtarzalna stymulacja nowotworowapotencja kom rek CAR T

Powiązane artykuły