Artykuł metodologiczny

Podłużne obrazowanie przyżyciowe zachowania komórek guza mózgu w odpowiedzi na inwazyjną biopsję chirurgiczną

10K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59278

⸱

3 maja 2019

 , 
1Cancer Genomics Netherlands, Prinses Máxima Center for Pediatric Oncology

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy metodę wielofotonowego obrazowania poklatkowego komórek mózgu w wysokiej rozdzielczości przed i po inwazyjnej interwencji chirurgicznej (np. biopsji) u tego samego żywego zwierzęcia. Metoda ta pozwala na badanie wpływu tych inwazyjnych zabiegów chirurgicznych na zachowanie migracyjne, inwazyjne i proliferacyjne komórek nowotworowych na poziomie pojedynczej komórki.

Streszczenie

Biopsje są standardem leczenia raka i są klinicznie korzystne, ponieważ pozwalają na diagnozę guza litego, rokowanie i spersonalizowane określenie leczenia. Jednak zaburzenie architektury guza przez biopsję i inne inwazyjne procedury wiąże się z niepożądanym wpływem na progresję guza, który należy dogłębnie zbadać, aby jeszcze bardziej poprawić korzyści kliniczne tych procedur. Konwencjonalne podejścia statyczne, które zapewniają jedynie migawkę guza, mają ograniczoną zdolność do ujawnienia wpływu biopsji na zachowanie komórek nowotworowych, takie jak migracja, proces ściśle związany z nowotworem złośliwym. W szczególności migracja komórek nowotworowych jest kluczem do wysoce agresywnych guzów mózgu, w których miejscowe rozsiew guza praktycznie uniemożliwia całkowitą resekcję guza. Rozwój obrazowania wielofotonowego i okien obrazowania przewlekłego pozwala naukowcom badać ten dynamiczny proces u żywych zwierząt w czasie. W tym miejscu opisujemy metodę obrazowania podłużnego komórek guza mózgu w wysokiej rozdzielczości przed i po biopsji u tego samego żywego zwierzęcia. Takie podejście umożliwia zbadanie wpływu tej procedury na zachowanie komórek nowotworowych (migracja, inwazja i proliferacja). Ponadto omawiamy zalety i ograniczenia tej techniki, a także zdolność tej metodologii do badania zmian w zachowaniu komórek nowotworowych w przypadku innych interwencji chirurgicznych, w tym resekcji guza lub implantacji wafli chemioterapeutycznych.

Wprowadzenie

Standard opieki nad większością guzów litych obejmuje biopsję tkanek w celu diagnozy, prognozowania i spersonalizowanego określenia leczenia1,2. Ogólnie rzecz biorąc, procedury te przynoszą korzyści kliniczne, ale ostatnie dowody wskazują, że biopsja i inne bardziej inwazyjne procedury, takie jak resekcja guza, mogą również negatywnie wpływać na progresję guza3,4,5,6. Chociaż procedury te pozostają nieodzowną opieką szpitalną, a ich korzyści przewyższają ich negatywne skutki, konieczne jest pełne zrozumienie mechanizmów stojących za tymi negatywnymi skutkami, aby zmaksymalizować bezpieczeństwo pacjentów i pozytywny wpływ tych procedur oraz uczynić je jeszcze bardziej korzystnymi klinicznie.

Niepożądane efekty na progresję nowotworu wywołane przez biopsję są wywoływane przez ogólnoustrojowe zmiany i zmiany w mikrośrodowisku guza w odpowiedzi na uszkodzenie tkanki4,5. Dlatego konieczne jest zbadanie tego procesu na żywych zwierzętach. Jednak subtelne konsekwencje tych minimalnie inwazyjnych procedur mogą być często zamaskowane przez duże różnice między osobami. Konwencjonalne metody oparte na immunohistochemii lub analizie ekspresji transkrypcyjnej mogą pomijać te efekty lub wymagać dużej liczby zwierząt do ich identyfikacji. Co więcej, te statyczne podejścia nie są w stanie zidentyfikować zmian w zachowaniu komórek nowotworowych, takich jak migracja i inwazja, dynamiczne procesy, które korelują ze złośliwością nowotworu. Te cechy komórek nowotworowych mają szczególne znaczenie w przypadku bardzo agresywnych guzów mózgu, takich jak glejak wielopostaciowy (GBM), gdzie miejscowe rozprzestrzenianie się komórek nowotworowych ogranicza resekcję chirurgiczną i zmniejsza przeżywalność pacjenta7. Aby w pełni zrozumieć, w jaki sposób biopsje wpływają na zachowanie komórek GBM, potrzebne jest podejście podłużne, które umożliwia wizualizację tych komórek w kontekście fizjologicznym organizmów żywych.

Niedawny rozwój obrazowania przyżyciowego o wysokiej rozdzielczości w połączeniu z chirurgicznie wszczepionymi przewlekłymi oknami obrazowania pozwala naukowcom badać dynamiczne zachowanie komórek nowotworowych u żywych myszy przez wiele dni8,9. Korzystając z tego potężnego podejścia, możemy zbadać, w jaki sposób zachowanie proliferacyjne, migracyjne i naciekające komórek nowotworowych zmienia się w ciągu kilku dni w odpowiedzi na biopsję u tej samej myszy. W porównaniu z innymi technikami, które umożliwiają wielodniowe monitorowanie nowotworów u żywych myszy, takimi jak obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MRI)10, pozytonowa tomografia emisyjna/tomografia komputerowa (PET/CT)11, lub obrazowanie bioluminescencyjne12, podejście to w unikalny sposób oferuje możliwość badania zachowania komórek nowotworowych na poziomie pojedynczej komórki i odkrywania subtelnych zmian zachodzących w obrębie guza.

Tutaj opisujemy szczegółową metodę wykonywania urazów podobnych do biopsji oraz podłużnego obrazowania intrażyciowego przed i po biopsji w mózgu myszy z nowotworem. Metoda ta może być potencjalnie zastosowana do badania innych interwencji chirurgicznych, takich jak częściowa resekcja guza lub implantacja płytek chemioterapeutycznych.

Protokół

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Komitetu ds. Dobrostanu Zwierząt Królewskiej Holenderskiej Akademii Sztuk i Nauk w Holandii. Protokoły eksperymentalne użyte w tym manuskrypcie zostały zatwierdzone przez Centrale Commissie Dierproeven (CCD) i Instantie voor Dierenwelzijn (IvD).

1. Implantacja komórek nowotworowych i przygotowanie okna obrazowania czaszki

  1. Przygotowanie chirurgiczne
    1. Używaj dorosłych myszy (w wieku >6 tygodni) dowolnej odmiany i płci. Uspokoić mysz przez wstrzyknięcie (fluanizon [neuroleptyk] + fentanyl [opioid]) (0,4 ml / kg) + benzodiazepinowy środek uspokajający (2 mg / kg) w dawce 1:1:2 w sterylnej wodzie. Oceń stan uspokojenia zwierzęcia za pomocą uszczypnięcia palca.
      UWAGA: W tym protokole wykorzystano zarówno samice, jak i samce myszy C57BL / 6 ze względu na to samo tło genetyczne linii komórek nowotworowych użytej w tych eksperymentach (GL261). Mysz pozostanie w pełni uspokojona przez 1,5 godziny. Alternatywnie można zastosować znieczulenie wziewne, takie jak izofluran (mieszanina 1,5%-2% izofluranu/O2).
    2. Zamontuj mysz na ramie stereotaktycznej i zabezpiecz głowę za pomocą zacisku na nos i dwóch nauszników.
    3. Użyj lampy grzewczej, aby utrzymać temperaturę ciała. Lampa grzewcza powinna być używana ostrożnie, alternatywnie można użyć poduszek grzewczych z recyrkulacją wody.
    4. Nałóż maść do oczu, aby chronić rogówki myszy przed wysuszeniem.
    5. Użyj ostrych nożyczek, aby ogolić futro na czaszce (obszar grzbietowy od oczu myszy do podstawy czaszki) i zdezynfekuj odsłoniętą skórę 70% etanolem.
    6. Przetnij skórę w okrężny sposób ostrymi nożyczkami i zeskrob okostną pod spodem bawełnianym wacikiem. Nałóż kroplę lidokainy 1% + epinefryny 1:100 000 na 5 minut, a nadmiar usuń wacikiem.
    7. Przyklej krawędzie skóry do czaszki za pomocą kleju cyjanoakrylowego.
    8. Umieść ramkę stereotaktyczną pod mikroskopem stereoskopowym o 4-krotnym powiększeniu.
    9. Wizualizuj czaszkę przez mikroskop preparacyjny i wywierć okrągły rowek o średnicy 5 mm nad prawą kością ciemieniową. Wykonaj ten krok ostrożnie i tylko powierzchownie, unikając jakiegokolwiek nacisku na czaszkę.
    10. Zastosuj kroplę buforu kory mózgowej (125 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM glukozy, 10 mM buforu HEPES, 2 mMMgSO4 i 2 mM CaCl2 [pH 7,4]) i unieś płat kostny za pomocą cienkich kleszczy.
    11. W kolejnych krokach utrzymuj powierzchnię mózgu pokrytą buforem kory, chyba że wskazano inaczej.
    12. Pod mikroskopem preparacyjnym uwidocznij powierzchnię mózgu i usuń oponę twardą za pomocą zakrzywionej, zwężającej się, bardzo cienkiej pęsety. Jeśli na tym etapie wystąpi krwawienie, użyj wchłanialnej gąbki żelatynowej, aby je zatrzymać.
  2. Iniekcja komórek nowotworowych
    1. Ponownie zawiesić żądaną ilość fluorescencyjnych komórek nowotworowych w ~ 3 μL PBS (np. W eksperymentach pokazanych w tym protokole wstrzyknięto 1 x 105 komórek GL261).
      UWAGA: Chociaż można użyć dowolnego markera fluorescencyjnego, zdecydowanie zaleca się marker jądrowy do śledzenia poszczególnych komórek nowotworowych podczas analizy. Dodatkowo, marker fluorescencyjny związany z histonami, taki jak H2B, może być wykorzystany do wizualizacji kondensacji chromosomów, a tym samym do monitorowania podziału komórek. Użycie markera z możliwością przełączania zdjęć, takiego jak Dendra2, umożliwia fotooznaczanie i śledzenie komórek nowotworowych przez kilka dni4,13.
    2. Załaduj komórki nowotworowe do gazoszczelnej strzykawki o pojemności 10 μl z igłą typu punktowego 2 i przymocuj ją do ramienia manipulatora stereotaktycznego.
    3. Usuń bufor kory mózgowej. Umieść końcówkę strzykawki na środku kraniotomii i włóż ją na głębokość 0,5 mm od powierzchni czaszki. Opcjonalnie stwórz małą przestrzeń w mózgu, aby pomieścić zawiesinę komórek nowotworowych. W tym celu należy wprowadzić strzykawkę na głębokość 1 mm, a następnie pobrać ją do 0,5 mm przed wstrzyknięciem.
    4. Zastosuj kroplę bufora kory mózgowej.
    5. Powoli wstrzykiwać zawiesinę komórkową za pomocą iniektora z pompką mikrostrzykawkową (250–400 nL/min). Wyjąć strzykawkę i w razie potrzeby zatamować krwawienie za pomocą wchłanialnej gąbki żelatynowej.
  3. Przygotowanie okna obrazowania czaszki
    1. Usuń bufor kory i umieść kroplę oleju silikonowego w miejscu kraniotomii, aby uniknąć pęcherzyków powietrza pod oknem.
    2. Uszczelnij odsłonięty mózg szkiełkiem nakrywkowym o średnicy 6 mm. Nałóż klej cyjanoakrylowy między szkiełko nakrywkowe a czaszkę. Delikatnie dociśnij szkiełko nakrywkowe do czaszki za pomocą cienkiej pęsety, aby zapewnić minimalną odległość między mózgiem a szkiełkiem nakrywkowym.
    3. Nałóż dentystyczny cement akrylowy na powierzchnię czaszki, zakrywając krawędź szkiełka nakrywkowego. Umieść cienki pierścień ze stali nierdzewnej (1,5 mm średnicy zewnętrznej, 1 mm średnicy wewnętrznej) wokół kraniotomii i pozwól cementowi dentystycznemu wyschnąć. Opcjonalnie dodaj trochę kleju na obramowaniu, aby zabezpieczyć pierścień na czubku głowy.
      UWAGA: Ten system mocowania głowy jest optymalny do obrazowania pod mikroskopem odwróconym: małe magnesy osadzone w pudełku do obrazowania ułatwiają fiksację okna obrazowania czaszki (CIW). W eksperymentach przedstawionych w tym protokole użyto mikroskopu odwróconego. W przypadku mikroskopów pionowych mocowanie można uzyskać za pomocą pręta lub pierścienia z rowkami, które można przymocować do mikroskopu za pomocą lub płytki pasującej do pierścienia.
    4. W celu złagodzenia bólu należy wstrzyknąć podskórnie pojedynczą dawkę 100 μg/kg buprenorfiny i pozwolić zwierzęciu dojść do siebie na poduszce grzewczej.
    5. Umieść mysz w osobnej klatce z rozdrobnionym papierem w celu wzbogacenia. Uważnie monitoruj mysz codziennie przez pierwsze kilka dni, a następnie 2 razy w tygodniu, pod kątem normalnego zachowania, reaktywności i wyglądu.

2. Obrazowanie przyżyciowe

UWAGA: Odstęp czasu między wstrzyknięciem komórki nowotworowej a pierwszą sesją obrazowania przyżyciowego zależy od rodzaju użytej linii komórek nowotworowych. W eksperymentach pokazanych w tym protokole wstrzyknięto 1x 105 komórek GL261 i zobrazowano je 10 dni później.

  1. Przygotowanie do obrazowania
    1. Uspokoić mysz za pomocą znieczulenia wziewnego izofluranem przez maskę na twarz (1,5%-2% mieszanina izofluranu/O2).
    2. Wstrzyknąć mysz podskórnie 100 μl buforu soli fizjologicznej, aby zapobiec odwodnieniu.
      UWAGA: W przypadku długotrwałego obrazowania mysz może być nawodniona za pomocą podskórnej pompy infuzyjnej.
    3. Umieść mysz ekranem do góry w pudełku do obrazowania. Użyj metalowej płytki z otworem o średnicy 1 mm i małymi magnesami osadzonymi wokół otworu, aby zapewnić mocowanie CIW do pudełka obrazowania. Wprowadzić izofluran przez maskę na twarz i przewietrzyć przez wylot po drugiej stronie pudełka (mieszanina 0,8%-1,5% izofluranu/O2). Opcjonalnie użyj taśmy, aby przymocować korpus myszy.
      UWAGA: W tym momencie można wstrzyknąć dożylnie znakowany fluorescencyjnie dekstran do wizualizacji naczyń krwionośnych lub inne barwniki.
    4. Opcjonalnie użyj pulsoksymetru i sondy grzewczej, aby monitorować parametry życiowe myszy.
      UWAGA: W tym eksperymencie nie było konieczne użycie pulsoksymetru i sondy grzewczej, ponieważ mysz była stabilna przez cały okres obrazowania (2-3 godziny). Jednak w przypadku dłuższych czasów obrazowania może być konieczne dokładniejsze monitorowanie.
    5. Ustaw obiektyw wodny 25x (np. HCX IRAPO NA0.95 WD 2.5 mm) w najniższym położeniu z i dodaj dużą kroplę wody.
      UWAGA: Stosowanie mikrodozownika zanurzonego w wodzie jest wysoce zalecane w przypadku długotrwałych eksperymentów, ponieważ pozwala naukowcom na dodawanie wody podczas eksperymentu. Alternatywnie można użyć suchego obiektywu.
    6. Przenieść pudełko do obrazowania do mikroskopu wyposażonego w ciemną komorę klimatyczną o temperaturze 37 °C. Przyłóż obiektyw do szkiełka nakrywkowego CIW, aż dotknie go kropla wody.
    7. Korzystając z trybu epifluorescencji, obserwuj guz przez okular i ustaw ostrość komórek.
  2. Akwizycja zdjęć poklatkowych
    1. Wybierz kilka interesujących pozycji do zobrazowania i zapisz ich współrzędne w oprogramowaniu. Upewnij się, że wybrane pozycje są reprezentatywnymi pozycjami z różnych miejsc guza (każdy guz może być inny, ale aby zapewnić spójność, wybierz tę samą liczbę pozycji, które są centralne dla rdzenia guza i krawędzi u wszystkich myszy).
      UWAGA: Można wykonać skan płytki części guza lub całego widocznego guza; Jeśli jednak guz jest duży, ta metoda wydłuży czas poklatkowy między obrazami. Ponadto, jeśli komórki nowotworowe poruszają się szybko, śledzenie tych samych komórek w czasie może być trudne.
    2. Przełącz się w tryb wielofotonowy i dostrój laser do odpowiedniej długości fali. Należy pamiętać, że aby uniknąć fotouszkodzeń, pożądane są wyższe długości fal.
      UWAGA: Do obrazowania Dendra2 użyto długości fali 960 nm. Przy celu zastosowanym w tych eksperymentach powiększenie 1,3 było wystarczające, aby uzyskać dobrą rozdzielczość jąder guza i zeskanować reprezentatywny obszar guza.
    3. Przejdź do trybu na żywo i zdefiniuj stos z dla każdej pozycji, aby uzyskać maksymalną objętość komórek nowotworowych bez uszczerbku dla rozdzielczości komórek nowotworowych. Określ rozmiar kroku między obrazami jako 3 μm.
    4. Użyj trybu dwukierunkowego, aby zwiększyć szybkość skanowania. Rozdzielczość obrazu powinna wynosić co najmniej 512 x 512 pikseli.
    5. Rób zdjęcia objętości guza w różnych pozycjach co 20 minut przez 2 godziny. Dodaj wodę do obiektywu przed każdym akwizycją obrazu.
      UWAGA: Zdjęcia poklatkowe mogą być automatycznie uzyskiwane po ustawieniu odpowiedniego filmu poklatkowego w oprogramowaniu. Jednak mysz może się poruszać, a pozycja lub stos z mogą się zmieniać w czasie, powodując utratę danych. Dlatego zaleca się ręczne wykonanie time-lapse oraz sprawdzenie i dostosowanie do przesunięć xyz między przejęciami.
    6. Na tym etapie, opcjonalnie, należy dokonać fotoprzełącznika markera fluorescencyjnego Dendra2.
      UWAGA: W przeciwieństwie do obrazowania poklatkowego (które pozwala na badanie właściwości poszczególnych komórek nowotworowych i ich zmian w czasie), pozwoli to na badanie obszaru naciekania komórek nowotworowych w mózgu przez kilka dni4. Szczegółowe wyjaśnienie tego kroku zostało opisane przez Gligorijevic et al.13.
    7. Po uzyskaniu ostatniego obrazu zdejmij mysz ze stołu montażowego i pozwól jej odzyskać na poduszce grzewczej. Aby zapobiec odwodnieniu, 100 μl soli fizjologicznej można podać podskórnie. Umieść mysz w klatce, dopóki nie zostanie wykonany uraz podobny do biopsji.

3. Uraz podobny do biopsji i wymiana CIW

  1. Stworzyć uraz podobny do biopsji w miejscu guza 1 dzień po pierwszej sesji obrazowania.
    UWAGA: Alternatywnie można wykonać inną procedurę, taką jak częściowe usunięcie guza.
    1. Uspokoić mysz za pomocą znieczulenia wziewnego izofluranem, jak opisano wcześniej w kroku 2.1.1.
      UWAGA: Chociaż można zastosować znieczulenie iniekcyjne, procedura ta jest krótsza niż implantacja CIW, a znieczulenie wziewne umożliwia precyzyjną kontrolę i skrócenie czasu, w którym mysz pozostaje w sedacji.
    2. Umieść mysz na ramie stereotaktycznej i zabezpiecz jej głowę dwoma nausznikami i zaciskiem na nos. Sprawdź głębokość znieczulenia przez brak odruchów pedałowania. Użyj maski anestezjologicznej do chirurgii stereotaktycznej, aby utrzymać mysz w stanie sedacji podczas zabiegu.
    3. Namocz bawełniany wacik w acetonie i rozprowadź go wokół krawędzi szkiełka nakrywkowego, aby zmiękczyć klej, który utrzymuje szkiełko nakrywkowe przy mózgu.
    4. Wsuń cienkie kleszcze punktowe pod szkiełko nakrywkowe, aby je podnieść. Jeśli szkiełko nakrywkowe pęknie w tym momencie, użyj kleszczy, aby usunąć kawałki szkła.
    5. Zastosuj bufor kory mózgowej, aby utrzymać wilgotność mózgu.
    6. Zanurz igłę 25 G w guzie na głębokość 1 mm. Wyjąć igłę i w razie potrzeby zatamować krwawienie, przykładając sterylną gąbkę żelatynową.
      UWAGA: Ten krok można wykonać pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym, aby dokładniej zidentyfikować obszar guza (jeśli guz jest zbyt mały). Dodatkowo podczas nakłuwania można wstrzyknąć 1 μl roztworu fluorescencyjnego polistyrenu 1 μm w celu zidentyfikowania obszaru biopsji.
    7. Uszczelnij powierzchnię mózgu olejem silikonowym i przyklej 6 mm szkiełko nakrywkowe na górze.

4. Powtarzane obrazowanie

  1. Jednego dnia po zadaniu urazu podobnego do biopsji (i w kolejnych dniach, jeśli to konieczne), powtórz obrazowanie przyżyciowe, jak opisano w kroku 2 powyżej, aby ocenić, jak zmienia się zachowanie komórek nowotworowych w czasie. Wybierz kilka pozycji guza, które byłyby reprezentatywne dla całego obszaru guza.
    UWAGA: Jeśli do identyfikacji obszaru poddanego biopsji użyto kulek fluorescencyjnych, zlokalizuj je, aby zobrazować zachowanie komórek nowotworowych w regionach poddanych biopsji w porównaniu z regionami bez biopsji.

5. Analiza obrazu

  1. Jeśli zdjęcia poklatkowe zostały uzyskane ręcznie, połącz je w jeden folder.
    1. Otwórz plik poklatkowy LIF w komercyjnym oprogramowaniu powiązanym z mikroskopem (np. LasX lub LAS AF). Wybierz zakładkę Proces > Narzędzia procesów > Scal. Zaznacz pierwszy obraz sekwencji czasowej i kliknij przycisk Pierwszy. Wybierz drugi obraz sekwencji czasowej i kliknij przycisk Drugi. W polu Scal wymiary wybierz t dla czasu. Kliknij przycisk Zastosuj. Zostanie wygenerowany nowy plik z dwoma punktami czasowymi. Powtórz ten proces dla wszystkich punktów czasowych, używając nowo wygenerowanego pliku jako pierwszego obrazu sekwencji.
  2. Popraw uzyskane stosy z dla dowolnego xyz shift.
    UWAGA: W przypadku eksperymentów opisanych w tym protokole do korekcji użyto specjalnie zaprojektowanego programu Visual Basic. Alternatywnie można użyć innego dostępnego oprogramowania, takiego jak ImageJ lub Imaris.
    1. Wyeksportuj pliki TIFF z oprogramowania, klikając prawym przyciskiem myszy scalony plik poklatkowy. Wybierz opcję Zapisz dane RAW. Wyeksportowane pliki zostaną wyeksportowane do jednego folderu o nazwie zgodnej z kanałem, czasem i pozycją z.
    2. Otwórz pliki TIFF w specjalnie zaprojektowanym programie Visual Basic.
    3. Zdefiniuj liczbę punktów czasowych, stosów z i kanałów.
    4. Przypisz kolor do każdego kanału zgodnie z kolejnością pojawiania się.
    5. W panelu Pokaz formularza dla każdego punktu czasu popraw przesunięcie w osi z, klikając przycisk w górę (U) lub w dół (D).
    6. W panelu Budowanie obrazu Intravital wybierz kanał, który ma być używany do korekcji przesunięcia xy. Wybierz zielony kanał do korekty, na podstawie sygnału z komórek nowotworowych. Kliknij opcję Automatycznie, aby uzyskać korektę xy.
    7. Eksportuj poprawione obrazy jako maksymalną projekcję trzech kolejnych stosów z. W panelu Wybór wprowadź numery pierwszego (Początek) i ostatniego (Koniec) plasterka Z, który ma zostać wyeksportowany. Wybierz opcję Maks. Wybierz opcję Oddzielne foldery dla Z. Kliknij przycisk Do. Dla każdego z nich trzy obrazy poklatkowe z z zostaną wyeksportowane do osobnego folderu.
  3. Opcjonalnie skorygować odkształcenie elastyczne tkanki.
    UWAGA: W eksperymentach z deformacją sprężystą tkanek użyto oprogramowania do kompensacji ruchu dopasowanego do korekcji sztywnych i elastycznych deformacji tkanek 14.
  4. Śledź pojedyncze komórki w całym stosie z w filmie poklatkowym.
    UWAGA: Komórki nowotworowe można śledzić ręcznie za pomocą, na przykład, wtyczki ImageJ (MTrackJ). Chociaż jest to dokładne, jest ograniczone do płaszczyzny xy i jest bardzo czasochłonne. Alternatywnie, komórki nowotworowe mogą być śledzone automatycznie przez całą objętość z, za pomocą segmentacji komórek nowotworowych (np. oprogramowanie Imaris). Jednak w przypadku bardzo gęstych guzów automatyczne śledzenie jest mniej dokładne i może powodować więcej błędów śledzenia.
    1. Otwórz i śledź każdą serię poklatkową (dla trzech kolejnych stosów z) osobno. Przeciągnij folder zawierający obrazy poklatkowe do ImageJ.
    2. Wybierz zakładkę Wtyczki > Śledzenie > MtrackJ. Śledź każdą pojedynczą komórkę, wybierając pozycję Dodaj i klikając każdą komórkę w każdym punkcie czasu.
    3. Wyodrębnij miarę ścieżek, klikając Zmierz i zapisując plik.

Wyniki

Aby ocenić wpływ biopsji na zachowanie komórek guza mózgu, przeprowadzono procedurę opisaną w niniejszym protokole. Komórki glejaka — GL261 — wykazujące ekspresję fluorescencyjnego białka jądrowego (H2B-Dendra2) wstrzyknięto do mózgu myszy C57BL/6 i wszczepiono chroniczne okno czaszkowe (CIW). Wykonano obrazowanie intravitalne w trybie time-lapse u tego samego zwierzęcia przed i po urazie przypominającym biopsję guza (Rycina 1A,B). Migrację poszczególnych komórek nowotworowych określono poprzez śledzenie ścieżki migracji w czasie w różnych płaszczyznach xy stosu z (Rycina 1C) i przedstawiono jako procent komórek migrujących przed i po biopsji (Rycina 1F). Szybkość proliferacji komórek nowotworowych określono na podstawie kondensacji H2B-Dendra2 podczas mitozy (Rycina 1D) i przedstawiono jako procent komórek dzielących się przed i po biopsji (Rycina 1E). Porównano rozkład prędkości migracji przed i po biopsji w tym samym guzie i stwierdzono, że liczba komórek migrujących (prędkość > 4 µm/h) wzrosła po interwencji, czemu towarzyszył spadek liczby komórek wolno migrujących lub niemigrujących (prędkość < 4 µm/h) (Rycina 2A). Średnio na jeden guz zaobserwowano 1,75 (SD = 0,16)-krotny wzrost procentu komórek migrujących w przypadku wykonania urazu przypominającego biopsję w porównaniu z myszami kontrolnymi, u których nie wykonano biopsji (Rycina 2B). Monitorowano zachowanie komórek nowotworowych przez kolejny tydzień i stwierdzono, że choć procent migrujących komórek nowotworowych ostatecznie spadł zarówno w grupie kontrolnej, jak i u myszy poddanych biopsji, myszy po biopsji nadal wykazywały wyższą zdolność do migracji niż myszy kontrolne (Rycina 2C). Analiza zachowania proliferacyjnego komórek nowotworowych w czasie wykazała 1,52 (SD = 0,26)-krotny wzrost liczby zdarzeń mitotycznych po biopsji w stosunku do niebiopsjowanych myszy kontrolnych (Rycina 2D).

Aby sprawdzić, czy obserwowane efekty biopsji na zachowanie proliferacyjne i migracyjne komórek nowotworowych nie były artefaktem wynikającym z operacji wymiany CIW (niezbędnej do wywołania urazu przypominającego biopsję), monitorowano zachowanie komórek nowotworowych w grupie myszy, które przeszły wymianę CIW bez biopsji. W tej grupie nie zaobserwowano indukcji migracji ani proliferacji komórek nowotworowych, co wskazuje, że wzrost tempa proliferacji i migracji komórek nowotworowych został wywołany specyficznie przez uraz przypominający biopsję (Rysunek 3A, B).

Stabilna fotokonwertybilność białka fluorescencyjnego Dendra2 umożliwia badanie infiltracji komórek nowotworowych przez kilka dni. Po ekspozycji na światło ultrafioletowe/niebieskie, Dendra2 ulega nieodwracalnej zmianie z koloru zielonego na czerwony. Wykorzystując tę właściwość, oświetlono kwadratowy obszar guza i poddano fotoznakowaniu około 20 wykazujących ekspresję Dendra2 komórek nowotworowych przed biopsją (Rysunek 4). Jeden dzień po biopsji ponownie zlokalizowano obszar poddany fotoprzekształceniu i zmierzono objętość komórek nowotworowych, które zinfiltrowały otaczającą tkankę guza. Stwierdzono, że obszar infiltracji był 1,72 (SD = 0,41) raza większy w guzach po urazie przypominającym biopsję w porównaniu z guzami kontrolnymi, których nie poddano biopsji (Rysunek 4). Choć podejście to dostarcza informacji jedynie o masowym zachowaniu infiltracyjnym komórek nowotworowych, a nie na poziomie pojedynczych komórek, jest ono mniej czasochłonne niż obrazowanie typu time-lapse i może być metodą z wyboru dla pytań badawczych skupionych wyłącznie na badaniu zachowań infiltracyjnych.

Obrazowanie intravitalne myszy; śledzenie komórek nowotworowych; mikroskopia poklatkowa; efekty biopsji; migracja komórek.
Rycina 1: Układ eksperymentalny do podłużnego obrazowania intravitalnego wpływu biopsji na zachowanie komórek nowotworowych. (A) Schemat przedstawiający konstrukcję pierścienia i uchwytu magnetycznego. (B) Schematyczny przebieg procesu eksperymentalnego. Komórki nowotworowe są wstrzykiwane do mózgów myszy i tworzone jest okno czaszkowe (CIW). Po rozwoju guza przeprowadzana jest pierwsza sesja obrazowania poklatkowego (przedbioptycznego). Następnego dnia wykonuje się biopsję i ponowne zamknięcie okna czaszkowego. Dzień po obrazowaniu (pobioptycznym) przeprowadzana jest druga sesja obrazowania poklatkowego. W celu oceny długofalowych efektów można przeprowadzić kolejne sesje obrazowania. (C) Obrazy przedstawiają reprezentatywne klatki z filmu time-lapse, na którym śledzono komórki nowotworowe GL261 H2B-Dendra2. Czerwone linie przedstawiają trajektorie poszczególnych komórek nowotworowych. Pasek skali = 50 µm. (D) Reprezentatywne obrazy time-lapse in vivo przedstawiające dzielące się komórki w guzach GL261 H2B-Dendra2. Oznaczono poszczególne stadia mitozy: profazę (P), prometafazę (Pm), metafazę (M), anafazę (A) oraz telofazę (T). Pasek skali = 50 µmWykresy przedstawiają procentowy udział (E) migrujące i (F) komórki w podziale przed i po biopsji. Każda kropka oznacza odsetek komórek migrujących we wszystkich pomiarach przeprowadzonych u poszczególnych zwierząt. Dane przedstawiono jako średnia ± S.E.M. dla sześciu myszy (**P < 0,01, sparowane t-test). Rysunek ten został zmodyfikowany na podstawie pracy Alieva i wsp.4. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza migracji komórek; wykresy porównawcze; biopsja a kontrola; istotność statystyczna; zmiana prędkości.
Rysunek 2: Reprezentatywne wyniki pokazujące wpływ biopsji na tempo migracji i proliferacji komórek nowotworowych. (A) Wykresy kaskadowe przedstawiające zmianę rozkładu prędkości komórek w stosunku do migracji podstawowej u poszczególnych myszy. Dane przedstawiono jako średnia ± S.E.M. dla pięciu myszy. (B) Liczba komórek migrujących u zwierząt kontrolnych (niebieski) i biopsjowanych (czerwony), znormalizowana do liczby komórek migrujących przed interwencją (n = 6 myszy, ***P < 0,001, t-Studenta t-test). (C) Zachowanie komórek nowotworowych śledzono przez kilka dni. Przedstawiono znormalizowaną (w stosunku do stanu przed interwencją) liczbę komórek migrujących u poszczególnych myszy w czasie (n > 4 myszy na grupę, ***P < 0,001, dwuczynnikowa analiza wariancji [ANOVA]). (D) Znormalizowana liczba dzielących się komórek u zwierząt w grupie kontrolnej (niebieski) i biopsjowanej (czerwony). Dla każdego osobnika wartości po interwencji znormalizowano względem wartości przed interwencją (n = 5 myszy, **P < 0,01, t-Studenta t-test). Rysunek ten został zmodyfikowany na podstawie pracy Alieva i wsp.4. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykresy słupkowe krotności zmian (fold change) porównujące liczbę komórek migrujących i podział komórek w grupie kontrolnej, po zastąpieniu CIW oraz w biopsji.
Rysunek 3: Zastąpienie CIW nie wpływa na zachowanie komórek nowotworowych. Podłużne obrazowanie intravitalne wykazuje, że wymiana CIW bez biopsji nie wpływa na tempo migracji i proliferacji. (A) Wzrost liczby komórek migrujących dla wskazanych warunków. Każdy symbol reprezentuje średnią dla pojedynczej myszy, a n≥ 4 myszy. (B) Wzrost liczby komórek proliferujących dla wskazanych warunków. Każdy symbol reprezentuje średnią dla poszczególnych myszy (n≥ 4 myszy, **P < 0.01,***P < 0,01, ns = brak istotności statystycznej, jednoczynnikowa analiza wariancji ANOVA z testem post hoc Newmana-Keulsa). Rysunek zmodyfikowano na podstawie pracy Alieva i wsp.4. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Analiza przełączania fotochemicznego w guzie mysim; migawki przed i po biopsji, naświetlanie promieniami UV, wykres wyników.
Rysunek 4: Schemat przedstawiający układ eksperymentalny oraz reprezentatywne wyniki uzyskane dzięki fotoprzełączaniu Dendra2. Aby monitorować infiltrację komórek nowotworowych po biopsji, na jeden dzień przed biopsją komórki nowotworowe wykazujące ekspresję Dendra2 zostają poddane przełączeniu fotochemicznemu w obszarze kwadratowym poprzez naświetlanie światłem UV/niebieskim, a następnie obrazowane. Jeden dzień po biopsji obszar poddany przełączeniu fotochemicznemu zostaje ponownie zlokalizowany i obrazowany. Przedstawiono reprezentatywne obrazy Dendra2 obrazujące infiltrację komórek nowotworowych, skorygowane przy użyciu odejmowania kanałów. Biała przerywana linia wyznacza obszar infiltracji. Pasek skali = 50 µmWykres przedstawia zwiększony obszar przełączany fotochemicznie dla myszy z pobraniem biopsji (kolor czerwony) oraz grupy kontrolnej (kolor niebieski). Każda kropka reprezentuje wartość średnią dla poszczególnych myszy (n≥ 5 myszy, *P < 0,05, t-Studenta t-test). Rycina ta została zmodyfikowana na podstawie pracy Alieva i wsp.4. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Dyskusja

Tutaj opisujemy metodę badania zmian w zachowaniu komórek nowotworowych na poziomie pojedynczej komórki w odpowiedzi na inwazyjne zabiegi chirurgiczne, takie jak biopsja, w mózgu żywego zwierzęcia. Połączenie podłużnego obrazowania wielofotonowego z chirurgiczną implantacją przewlekłego CIW umożliwia ilościowe określenie migracji, inwazji i proliferacji komórek nowotworowych przed i po biopsji u tego samego zwierzęcia4. W porównaniu z innymi podejściami stosowanymi do wielodniowego monitorowania guza, takimi jak obrazowanie bioluminescencyjne12, MRI10 lub PET/CT11, metoda ta w unikalny sposób wizualizuje guzy na poziomie pojedynczej komórki, a tym samym zapewnia wgląd w zachowanie komórkowe leżące u podstaw progresji guza.

Aby skutecznie wykonać tę metodę, należy opanować kilka procedur. Najbardziej krytycznymi etapami tego protokołu są implantacja i wymiana CIW. Techniczna złożoność tych etapów wymaga precyzji i umiejętności chirurgicznych, które można nabyć dzięki stałemu treningowi. Powikłania podczas operacji CIW, takie jak krwawienie, które może pokrywać powierzchnię mózgu, mogą okazać się wyzwaniem dla późniejszego obrazowania. Brak sterylnych narzędzi lub środowiska, a także brak całkowitego uszczelnienia powierzchni mózgu, może spowodować infekcję na powierzchni mózgu (biały płyn pod szkiełkiem nakrywkowym), co sprawi, że obrazowanie będzie problematyczne i mocno zagrozi uzyskanej interpretacji. Innym częstym problemem związanym z tym protokołem jest ruch zwierząt podczas obrazowania poklatkowego. Chociaż każde przesunięcie xyz można skorygować po eksperymencie, zaleca się skorygowanie współrzędnych każdej pozycji przed każdym punktem czasowym, aby zapobiec utracie informacji. Deformacja tkanek jest dodatkowym problemem występującym podczas obrazowania pod mikroskopem odwróconym. Tkanka mózgowa cierpi z powodu kompresji, gdy mysz jest umieszczona w pozycji leżącej. W zależności od stopnia deformacji tkanki, śledzenie komórek nowotworowych może prowadzić do błędnej kwantyfikacji przemieszczenia komórek. Aby temu zapobiec, można zastosować oprogramowanie do odkształceń sztywnych i sprężystych14.

Chociaż procedura ta oferuje szerokie zastosowanie do badania zmian w zachowaniu guza, należy wziąć pod uwagę pewne ograniczenia. Metoda ta pozwala naukowcom na obrazowanie do głębokości 1,6 mm (przy użyciu optycznego oscylatora parametrycznego); Oznacza to jednak, że obrazowanie jest ograniczone do powierzchownych obszarów kory mózgowej15. W związku z tym niektóre guzy mózgu zlokalizowane w głębokich strukturach mózgu, w tym rozlane glejaki mostu zlokalizowane w okolicy pnia mózgu, nie mogą być badane w ich pierwotnym środowisku mózgowym za pomocą tego protokołu. Kolejnym ograniczeniem tego protokołu jest objętość guza, którą można zobrazować. Chociaż skanowanie całkowitej objętości guza jest pożądane w celu uzyskania maksymalnych informacji, często wielkość guza i szybkość migrujących komórek mogą być czynnikami ograniczającymi. Dla każdego typu nowotworu należy rozważyć optymalny czas poklatkowy do obrazowania. Jeśli ramy czasowe między obrazami są zbyt długie, śledzenie komórek nowotworowych może być trudne. Zastosowanie skanera rezonansowego może znacznie skrócić czas skanowania, umożliwiając obrazowanie większego guza16. Wreszcie, ręczna analiza obrazu tego protokołu może być bardzo czasochłonna, dlatego zamiast tego można użyć programów do automatycznego śledzenia 3D. Jednak wynik śledzenia powinien być zawsze nadzorowany wizualnie, ponieważ algorytmy automatycznego śledzenia komórek rzadko są zaprojektowane tak, aby dokładnie odwzorowywać migrację komórek będących przedmiotem zainteresowania.

Niewielkie adaptacje opisanego tutaj protokołu mogą umożliwić jeszcze szerszy zakres zastosowań. Zamiast wykonywania biopsji można zastosować inne interwencje (chirurgiczne), takie jak częściowa resekcja guza lub dostarczenie wafli do chemioterapii. Dodawanie związków przez chirurgicznie wszczepioną mikroprobówkę można połączyć z tym protokołem, aby farmakologicznie celować w określone cząsteczki będące przedmiotem zainteresowania. Spodziewamy się, że model ten będzie przydatny w badaniach mających na celu analizę wpływu określonej interwencji na zachowanie komórek nowotworowych. Możliwość wykonywania powtarzających się pomiarów na tym samym zwierzęciu nie tylko zapewnia dokładniejsze dane na temat zmian zachodzących w guzie, ale także znacznie zmniejsza liczbę zwierząt doświadczalnych potrzebnych na badanie.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują Anko de Graaff i Hubrecht Imaging Center za wsparcie w zakresie obrazowania oraz Ellen Wehrens i Hannah Johnson za korektę i redakcję manuskryptu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Igły podskórne 25g x 16 mmBD Microlance300600
701 RN 10uL SYR BEZ IGŁYHamilton7635-01
Wchłanialna gąbka żelatynowaPfizerGelfoam
Szkiełka nakrywkowe okrągłe 6 mmVWR international631-0168
Klej cyjanoakrylowyPattex PattexUltra żel
dentystyczny cementVertex DentalVertex Wiertło samoutwardzalne
DremelDremel 3000 (wiertło dentystyczne może być wygodniejsze) + 105 Frez
Drobnie zakrzywione PęsetyDumontAGT508
HypnormVetaPharma LtdHypnorm (cytrynian fentanylu 0,315 mg/ml+ Fluanison 10 mg/ml)
MidazolamActavisMidazolam Actavis 5mg/ml
Maść okulistycznaKela VeterinariaDuodrops veter kela 10 m
Kwintesencja wtryskiwacza stereotaktycznego (QSI)Stoelting53311
Olej silikonowySigma Aldrich181838
Ramka stereotaktycznaStoeltingLab standard stereotaktyczny, szczur i mysz
Chirurgiczny mikroskop stereoskopowyOlympus
Temgesic (0,3 mg/ml)BD Pharmaceuticals283732
Vannas Tü Nożyczki sprężynowe bingenAparat Harvarda72-8508
Ksylokaina (Lidokaina 1% + Epinefryna 1:100,000) Znieczulenie miejscoweAstrazenecaXylocaine (Lidokaina 1% + Epinefryna 1:100,000)
do grawerowania

Bibliografia

  1. Heuckmann, J. M., Thomas, R. K. A new generation of cancer genome diagnostics for routine clinical use: overcoming the roadblocks to personalized cancer medicine. Annals of Oncology. 26, 1830-1837 (2015).
  2. van Malenstein, H., et al. Histology obtained by needle biopsy gives additional information on the prognosis of hepatocellular carcinoma. Hepatology Research. 42, 990-998 (2012).
  3. Kretschmer, L., et al. High incidence of in-transit metastases after sentinel node biopsy in patients with melanoma (Br J Surg 2004; 91: 1370-1371). British Journal of Surgery. 92, 253-254 (2005).
  4. Alieva, M., et al. Preventing inflammation inhibits biopsy-mediated changes in tumor cell behavior. Scientific Reports. 7, 7529(2017).
  5. Hobson, J., et al. Acute inflammation induced by the biopsy of mouse mammary tumors promotes the development of metastasis. Breast Cancer Research Treatment. 139, 391-401 (2013).
  6. Weil, S., et al. Tumor microtubes convey resistance to surgical lesions and chemotherapy in gliomas. Neuro-Oncology. 19, 1316-1326 (2017).
  7. Parsa, A. T., et al. Prognostic significance of intracranial dissemination of glioblastoma multiforme in adults. Journal of Neurosurgery. 102, 622-628 (2005).
  8. Zomer, A., et al. Intravital imaging of cancer stem cell plasticity in mammary tumors. Stem Cells. 31, 602-606 (2013).
  9. Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Science Translational Medicine. 4, 158ra145(2012).
  10. Schreurs, T. J., et al. Quantitative Multi-Parametric Magnetic Resonance Imaging of Tumor Response to Photodynamic Therapy. PLOS ONE. 11, e0165759(2016).
  11. Nielsen, C. H., et al. PET imaging of tumor neovascularization in a transgenic mouse model with a novel 64Cu-DOTA-knottin peptide. Cancer Research. 70, 9022-9030 (2010).
  12. Alieva, M., et al. Glioblastoma therapy with cytotoxic mesenchymal stromal cells optimized by bioluminescence imaging of tumor and therapeutic cell response. PLOS ONE. 7, e35148(2012).
  13. Gligorijevic, B., Kedrin, D., Segall, J. E., Condeelis, J., van Rheenen, J. Dendra2 photoswitching through the Mammary Imaging Window. Journal of Visualized Experiment. (28), e1278(2009).
  14. Noordmans, H. J., Roode, R. d, Staring, M., Verdaasdonk, R. Registration and analysis of in vivo multispectral images for correction of motion and comparison in time. , Vol. 6081 PWB SPIE (2006).
  15. Kobat, D., Horton, N. G., Xu, C. In vivo two-photon microscopy to 1.6-mm depth in mouse cortex. Journal of Biomedical Optics. 16, 106014(2011).
  16. Kirkpatrick, N. D., et al. Video-rate resonant scanning multiphoton microscopy: An emerging technique for intravital imaging of the tumor microenvironment. IntraVital. 1, (2012).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Obrazowanie guz w m zgumikroskopia intravitalnamigracja kom rek nowotworowychobrazowanie pod u neokno czaszkoweobrazowanie wielofotonoweproliferacja kom rekinwazja nowotworowaanaliza obrazu
Podłużne obrazowanie przyżyciowe zachowania komórek guza mózgu w odpowiedzi na inwazyjną biopsję chirurgiczną
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.